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Isolamento dei mitocondri per l'analisi dei supercomplessi mitocondriali da piccoli campioni di tessuti e colture cellulari

DOI:

10.3791/66771

⸱

May 3rd, 2024

 , 
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive una tecnica per l'analisi dei supercomplessi respiratori quando sono disponibili solo piccole quantità di campioni.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negli ultimi decenni, le prove accumulate sull'esistenza di supercomplessi respiratori (SC) hanno cambiato la nostra comprensione dell'organizzazione della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali, dando origine alla proposta del "modello di plasticità". Questo modello postula la coesistenza di diverse proporzioni di SC e complessi a seconda del tessuto o dello stato metabolico cellulare. La natura dinamica dell'assemblaggio nelle SC consentirebbe alle celle di ottimizzare l'uso dei combustibili disponibili e l'efficienza del trasferimento di elettroni, minimizzando la generazione di specie reattive dell'ossigeno e favorendo la capacità delle celle di adattarsi ai cambiamenti ambientali.

Più recentemente, sono state riportate anomalie nell'assemblaggio SC in diverse malattie come le malattie neurodegenerative (morbo di Alzheimer e Parkinson), la sindrome di Barth, la sindrome di Leigh o il cancro. Il ruolo delle alterazioni dell'assemblaggio SC nella progressione della malattia deve ancora essere confermato. Tuttavia, la disponibilità di quantità sufficienti di campioni per determinare lo stato dell'assemblaggio SC è spesso una sfida. Questo accade con biopsie o campioni di tessuto che sono piccoli o devono essere divisi per analisi multiple, con colture cellulari che hanno una crescita lenta o provengono da dispositivi microfluidici, con alcune colture primarie o cellule rare, o quando si deve analizzare l'effetto di trattamenti particolarmente costosi (con nanoparticelle, composti molto costosi, ecc.). In questi casi, è necessario un metodo efficiente e facile da applicare. Questo articolo presenta un metodo adattato per ottenere frazioni mitocondriali arricchite da piccole quantità di cellule o tessuti per analizzare la struttura e la funzione delle SC mitocondriali mediante elettroforesi nativa seguita da saggi di attività in-gel o western blot.

Introduction

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I supercomplessi (SC) sono associazioni supramolecolari tra singoli complessi della catena respiratoria 1,2. Dall'identificazione iniziale delle SC e dalla descrizione della loro composizione da parte del gruppo di Schägger 2,3, successivamente confermata da altri gruppi, è stato stabilito che esse contengono i complessi respiratori I, III e IV (CI, CIII e CIV, rispettivamente) in diverse stechiometrie. Si possono definire due principali popolazioni di SC, quelle contenenti CI (e CIII da solo o CIII e CIV) e con peso molecolare molto elevato (MW, a partire da ~1,5 MDa per le SC più piccole: CI + CIII2) e quelle contenenti CIII e CIV ma non CI, con dimensioni molto più piccole (come CIII2 + CIV con ~680 kDa). Queste SC coesistono nella membrana mitocondriale interna con complessi liberi, anche in proporzioni diverse. Così, mentre l'IC si trova principalmente nelle sue forme associate (cioè nelle SC: ~80% nel cuore bovino e più del 90% in molti tipi di cellule umane)3, l'ICV è molto abbondante nella sua forma libera (più dell'80% nel cuore bovino), con CIII che mostra una distribuzione più equilibrata (~40% nella sua forma libera più abbondante, come un dimero, nel cuore bovino).

Mentre la loro esistenza è ora generalmente accettata, il loro ruolo preciso è ancora oggetto di dibattito 4,5,6,7,8,9,10. Secondo il modello di plasticità, possono esistere diverse proporzioni di SC e singoli complessi a seconda del tipo di cellula o dello stato metabolico 1,7,11. Questa natura dinamica dell'assemblaggio consentirebbe alle celle di regolare l'uso dei combustibili disponibili e l'efficienza del sistema di fosforilazione ossidativa (OXPHOS) in risposta ai cambiamenti ambientali 4,5,7. Le SC potrebbero anche contribuire a controllare il tasso di generazione delle specie reattive dell'ossigeno e partecipare alla stabilizzazione e al turnover dei singoli complessi 4,12,13,14. Sono state descritte modificazioni dello stato di assemblaggio delle SC in associazione con diverse situazioni fisiologiche e patologiche15,16 e con il processo di invecchiamento17.

Pertanto, sono stati descritti cambiamenti nei pattern SC nel lievito a seconda della fonte di carbonio utilizzata per la crescita2 e nelle cellule di mammifero in coltura quando il glucosio è sostituito dal galattosio4. Sono state riportate anche modifiche nel fegato di topo dopo il digiuno8 e negli astrociti quando l'ossidazione degli acidi grassi mitocondriali è bloccata18. Inoltre, una diminuzione o alterazioni delle SC e dell'OXPHOS sono state riscontrate nella sindrome di Barth19, nell'insufficienza cardiaca20, in diversi disturbi metabolici21 e neurologici 22,23,24 e in diversi tumori 25,26,27,28. Se queste alterazioni nell'assemblaggio e nei livelli di SC siano una causa primaria o rappresentino effetti secondari in queste situazioni patologiche è ancora oggetto di studio15,16. Diverse metodologie possono fornire informazioni sull'assemblaggio e la funzione delle SC; Questi includono le misurazioni dell'attività 8,29, l'analisi ultrastrutturale30,31 e la proteomica32,33. Un'alternativa utile che viene sempre più impiegata ed è il punto di partenza per alcune delle metodologie precedentemente menzionate è la determinazione diretta dello stato di assemblaggio SC mediante elettroforesi Blue native (BN) sviluppata a questo scopo dal gruppo di Schägger34,35.

Questo approccio richiede procedure riproducibili ed efficienti per ottenere e solubilizzare le membrane mitocondriali e può essere integrato da altre tecniche come l'analisi dell'attività in-gel (IGA), l'elettroforesi di seconda dimensione e il western blot (WB). Un limite negli studi sulla dinamica delle SC mediante elettroforesi BN può essere la quantità di cellule di partenza o campioni di tessuto. Presentiamo una serie di protocolli per l'analisi dell'assemblaggio e della funzione delle SC, adattati dai metodi di gruppo di Schägger, che possono essere applicati a campioni di cellule o tessuti freschi o congelati a partire da un minimo di 20 mg di tessuto.

Protocol

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NOTA: La composizione di tutti i terreni di coltura e dei tamponi è specificata nella Tabella 1 e i dettagli relativi a tutti i materiali e i reagenti utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Isolamento dei mitocondri da coltura cellulare

NOTA: Il volume minimo di cellule analizzate è stato di ~30-50 μL di celle impaccate (passaggio 1.4). Questo può corrispondere approssimativamente ad almeno due o tre piastre di coltura cellulare da 100 mm o a una piastra da 150 mm all'80-90% della confluenza, a seconda del tipo di cellula (tra 5 × 106 e 107 cellule in cellule derivate da L929 o MDA-MB-468). Un'efficiente rottura delle celle è un passaggio fondamentale.

  1. Far crescere le cellule aderenti a circa l'80% di confluenza o le cellule sospese a una densità adeguata.
  2. Prelevare le cellule mediante centrifugazione a 500 × g per 5 minuti (direttamente dalla sospensione cellulare nel caso di cellule non aderenti o dopo tripsinizzazione standard con una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% di tripsina e allo 0,02% di EDTA in 1x PBS, nel caso di cellule aderenti).
  3. Lavare le celle 2 volte con 1 PBS freddo e sedimentarle mediante centrifugazione a 500 × g per 5 minuti.
    NOTA: Da questo punto, tutti i passaggi devono essere eseguiti a 4 °C. Pertanto, tutti i reagenti devono essere freddi e le provette contenenti cellule o mitocondri devono essere mantenute in ghiaccio.
  4. Dopo la seconda centrifugazione, scartare il surnatante, stimare il volume del pellet cellulare (cpv) e congelare le cellule a -80 °C per almeno 15 minuti per facilitare la rottura della membrana nella fase 1.8.
    NOTA: A questo punto il protocollo può essere interrotto e le celle possono essere conservate a -80 °C per settimane. Di solito, sono appropriate provette graduate da 10 o 15 mL con fondo conico.
  5. Lascia che le cellule si scongelino lentamente con ghiaccio.
  6. Risospendere il pellet di cellule impaccate in un volume di tampone ipotonico pari a 7 volte il cpv (10 mM di MOPS, 83 mM di saccarosio, pH 7,2) (ad esempio, 100 μL di cellule impaccate in 700 μL di tampone).
    NOTA: Il volume deve essere sufficiente per ottenere pop efficienti (vedere NOTA al passaggio 1.8).
  7. Trasferire la sospensione cellulare in un omogeneizzatore Potter-Dounce di dimensioni adeguate e lasciare che le cellule si gonfino incubandole in ghiaccio per 2 minuti. Ad esempio, per un volume di 700-800 μL di sospensione cellulare, è sufficiente un omogeneizzatore con capacità di 1 mL.
  8. Rompi le membrane cellulari eseguendo da otto a dieci colpi nell'omogeneizzatore accoppiato a un pestello in teflon azionato a motore che ruota a 600 giri/min.
    NOTA: Quando si eseguono i colpi, è importante creare un vuoto che aumenti l'efficienza di rottura delle cellule insieme alle azioni ipotoniche e di congelamento per il gonfiore e la fragilizzazione delle membrane, rispettivamente. Se è ben cotto, si sentirà un suono "pop" quando si abbassa l'omogeneizzatore con un movimento rapido ad ogni colpo.
  9. Aggiungere lo stesso volume di tampone ipertonico alla sospensione cellulare (7 volte il cpv) (30 mM MOPS, 250 mM di saccarosio, pH 7,2) per generare un ambiente isotonico.
  10. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 10-15 mL e centrifugare in un rotore fisso a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
    NOTA: A questo scopo può essere utilizzata la provetta originale contenente le celle integre.
  11. Trasferire il surnatante, che contiene la frazione mitocondriale, in provette di polipropilene da 1,5 mL.
  12. OPZIONALE: Per aumentare la resa dei mitocondri, risospendere il pellet dal passaggio 1.10 in 7 volte il volume del pellet cellulare del tampone A (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M saccarosio, pH 7,4) pipettando su e giù e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C. Combina il nuovo surnatante con il precedente prima di procedere al passaggio 1.13.
  13. Centrifugare in microfuga a 16.000 × g per 2 minuti a 4 °C per raccogliere la frazione grezza mitocondriale.
  14. Scartare il surnatante e risospendere ogni pellet arricchito con mitocondri con 0,5 mL di tampone A, combinando il contenuto di due provette in una sola, e centrifugare nelle stesse condizioni descritte al punto 1.13. Ripetere lo stesso processo fino a quando tutto il materiale è in un solo tubo.
  15. Scartare il surnatante, risospendere il pellet finale con 300 μL di tampone A e quantificare la concentrazione di proteine mitocondriali utilizzando il saggio di Bradford. Centrifugare nuovamente come prima e procedere alla sezione 3.

2. Isolamento dei mitocondri da piccole quantità di tessuti animali

NOTA: La quantità minima di tessuto per applicare questo protocollo con una certa sicurezza dipende dal tipo di cellula e dalla sua abbondanza mitocondriale, ma potrebbe essere ~20-30 mg di tessuto per la maggior parte dei casi. I campioni di tessuto possono essere materiale fresco o campioni congelati. In quest'ultimo caso, lasciare scongelare i campioni in un tampone di omogeneizzazione posto su ghiaccio prima di iniziare la procedura.

  1. Pesare o stimare il più fedelmente possibile la quantità (mg) di tessuto.
  2. Tagliare il fazzoletto con un paio di forbici ed effettuare 3-4 lavaggi in tampone di omogeneizzazione con l'aiuto di un colino avendo cura di evitare di perdere i pezzi più piccoli.
    NOTA: Questo passaggio è più importante nei tessuti come il muscolo scheletrico o il cuore che nel cervello o nei tessuti più morbidi le cui cellule possono essere facilmente disaggregate direttamente dalla fase di omogeneizzazione.
  3. Aggiungere un terreno di omogeneizzazione fresco (4 ml per grammo di fegato, 10 ml per grammo di cuore, tessuto adiposo bruno (BAT) o muscolo e 5 ml per grammo di cervello o rene; vedere la composizione specifica del tampone per ciascun caso nella Tabella 1).
  4. Trasferire i pezzi di tessuto con tampone nell'omogeneizzatore e seguire il protocollo di omogeneizzazione e isolamento dei mitocondri ottimale a seconda del tessuto selezionato.
  5. Isolamento dei mitocondri dal fegato, dalla milza e dai reni
    1. Omogeneizzare con quattro o sei colpi su e giù nell'Elvehjem-Potter con un pestello in teflon azionato a motore a 600 giri/min.
    2. Trasferire il tessuto omogeneizzato in una provetta da centrifuga sterile. Centrifugare in un rotore oscillante a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Riempire le provette in polipropilene da 1,5 mL con il surnatante ottenuto nel passaggio precedente. Centrifugare per 2 minuti a 16.000 × g in microfuga a 4 °C e procedere come descritto in precedenza (passaggi da 1.13 a 1.15)
  6. Isolamento dei mitocondri da campioni di cuore e muscolo
    1. Omogeneizzare con sei-otto colpi nell'Elvehjem-Potter con un pestello in teflon azionato a motore a 600 giri/min. Trasferire il tessuto omogeneizzato in una provetta da centrifuga sterile.
    2. Centrifugare in un rotore oscillante a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C. Versare il surnatante in provette di polipropilene pulite da 1,5 mL.
      NOTA: Una seconda omogeneizzazione del pellet ottenuta nella fase 2.6.2 può essere eseguita con 4-5 colpi aggiuntivi e 1/2 volume di tampone di omogeneizzazione per aumentare la resa mitocondriale. Il nuovo surnatante (dopo la centrifugazione di nuovo a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C) può essere combinato con il precedente prima di procedere al passaggio 2.6.3. Un'alternativa per aumentare la resa grezza dei mitocondri è quella di dissociare campioni di tessuto cardiaco e muscolare in soluzione di tripsina prima dell'omogeneizzazione36,37. In questo caso, la tripsina deve essere inattivata/rimossa in modo efficiente prima che le membrane mitocondriali vengano solubilizzate con digitonina (passaggio 3.2).
    3. Centrifugare a 16.000 × g in microfuga per 2 minuti a 4 °C per ottenere la frazione mitocondriale grezza.
    4. Scartare il surnatante e risospendere ogni pellet arricchito con mitocondri con 0,5 mL di tampone AT, combinando il contenuto di due provette in una sola e centrifugare nelle stesse condizioni descritte al punto 2.6.3. Ripetere lo stesso processo fino a quando tutto il materiale è in un solo tubo.
    5. Scartare il surnatante, risospendere il pellet finale con 300 μL di tampone A (senza BSA) e quantificare la concentrazione di proteine mitocondriali utilizzando il test Bradford. Centrifugare nuovamente come prima e procedere alla sezione 3.
  7. Isolamento dei mitocondri dal cervello
    1. Omogeneizzare i pezzi del cervello con 10-15 colpi utilizzando un omogeneizzatore di vetro di tipo Dounce con un pestello di vetro azionato manualmente. Trasferire il tessuto omogeneizzato in una provetta da centrifuga sterile.
    2. Centrifugare in un rotore oscillante a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Raccogliere il surnatante in una provetta da centrifuga pulita.
    4. Risospendere il pellet ottenuto nella precedente fase di centrifugazione nello stesso volume di terreno AT utilizzato nella prima omogeneizzazione. Riomogeneizzare il pellet ripetendo il processo descritto al punto 2.7.1 utilizzando 5-10 passaggi e centrifugare la sospensione in un rotore oscillante a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
    5. Rimuovere il surnatante e aggiungerlo al tubo preparato al punto 2.7.3. Centrifugare a 10.000 × g in un rotore ad angolo fisso per 10 minuti a 4 °C per ottenere la frazione mitocondriale grezza.
    6. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1/2 del volume iniziale di omogeneizzazione (passaggio 2.7.1) del mezzo AT. Distribuire la sospensione mitocondriale in provette di polipropilene pulite da 1,5 mL e centrifugare a 16.000 × g in microfuge per 2 minuti a 4 °C.
    7. Scartare il surnatante e risospendere ogni pellet arricchito con mitocondri con 0,5 mL di tampone AT, combinando il contenuto di due provette in una sola e centrifugare nelle stesse condizioni descritte al punto 2.7.6. Ripetere lo stesso processo fino a quando tutto il materiale è in un solo tubo.
    8. Scartare il surnatante, risospendere il pellet finale con 300 μL di tampone A (senza BSA) e quantificare la concentrazione di proteine mitocondriali utilizzando il test Bradford. Centrifugare nuovamente come prima e procedere alla sezione 3.
  8. Isolamento dei mitocondri dal BAT
    1. Omogeneizzare con otto-dieci colpi su e giù nell'Elvehjem-Potter con un pestello in teflon azionato a motore a 600 giri/min. Trasferire il tessuto omogeneizzato in una provetta da centrifuga sterile.
    2. Centrifugare in un rotore oscillante a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Riempire le provette in polipropilene da 1,5 mL con il surnatante ottenuto nel passaggio precedente evitando lo strato di grasso superiore.
      NOTA: Una seconda omogeneizzazione del pellet ottenuto al punto 2.8.2 può essere eseguita per aumentare la resa mitocondriale. Il nuovo surnatante (dopo la centrifugazione di nuovo a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C) può essere combinato con il precedente prima di procedere al passaggio 2.8.4.
    4. Centrifugare per 2 min a 16.000 × g per 2 min in microfuga a 4 °C.
    5. Scartare il surnatante e risospendere ogni pellet arricchito con mitocondri con 0,5 mL di tampone AT2 combinando il contenuto di due provette in una sola e centrifugare nelle stesse condizioni descritte al punto 2.8.4. Ripetere lo stesso processo fino a quando tutto il materiale è in un solo tubo.
    6. Scartare il surnatante, risospendere il pellet finale con 300 μL di tampone A (senza BSA) e quantificare la concentrazione di proteine mitocondriali utilizzando il test Bradford. Centrifugare nuovamente come prima e procedere alla sezione 3.

3. Preparazione dei campioni per l'analisi Blue Native

  1. Risospendere le frazioni mitocondriali (ottenute da colture o tessuti cellulari di mammifero) in tampone per campioni BN (50 mM NaCl, 50 mM Imidazolo, 5 mM Acido aminocaproico, 4 mM PMSF) per ottenere una concentrazione proteica di circa 10 mg/mL. Vedere la Tabella 2 per le rese attese per i diversi tipi di campioni.
  2. Solubilizzare le membrane mitocondriali aggiungendo digitonina (soluzione madre al 10%) per ottenere un rapporto di 4 g di digitonina/g di proteina mitocondriale (4 μL di digitonina, 10% stock per 10 μL della sospensione mitocondriale preparata al punto 3.1).
    NOTA: Il rapporto detergente/proteine (g/g) deve essere ottimizzato per ogni tipo di campione per ottenere risultati riproducibili; 2-8 g di digitonina/g di proteina mitocondriale sono risultati ottimali per la maggior parte dei tessuti 34,35.
  3. Mescolare pipettando delicatamente su e giù. Incubare i campioni su ghiaccio per 5 minuti.
    NOTA: Dopo questo passaggio, la sospensione mitocondriale dovrebbe diventare più chiara (passare da opaca a traslucida); In caso contrario, potrebbe indicare che la quantità di detergente è insufficiente per una corretta solubilizzazione della membrana.
  4. Centrifugare alla massima velocità in microfuge (20.000 × g circa) per 25 minuti a 4 °C per rimuovere il materiale insolubile.
  5. Raccogliere il surnatante in un tubo nuovo. Aggiungere al surnatante un volume del 5% di G-250 (Coomassie Blue G-250 5% in acido 0,75 M aminocaproico) equivalente a 1/3 del volume iniziale di risospensione (passaggio 3.1, questo corrisponderebbe a una proporzione finale di 1,6 g di Coomassie/g di proteine) e mescolare mediante pipettaggio.
  6. Conservare in ghiaccio prima di caricare il gel o congelare le aliquote a -80 °C.

4. Elettroforesi su gel nativo blu

NOTA: L'elettroforesi viene eseguita nella cella frigorifera (4-8 °C). Se non è presente una cella frigorifera, è possibile introdurre un blocco di raffreddamento nella vasca di elettroforesi. Vengono utilizzati gel di poliacrilammide nativi commerciali al 3-13%29, ma possono essere utilizzati anche gel fatti in casa delle concentrazioni di gradiente desiderate38,39.

  1. Caricare le camere superiore e inferiore rispettivamente con il catodo freddo A e i tamponi anodici. In alternativa, caricare i campioni nei pozzetti prima di riempire accuratamente la camera superiore con il tampone catodico A.
    NOTA: Nel nostro laboratorio vengono utilizzati tamponi per elettroforesi commerciali, ma possono essere preparati come indicato nella Tabella 1.
  2. Carico compreso tra 30 e 100 μg di proteina mitocondriale.
    NOTA: Di solito, 30-50 μg di proteine (per WB) o 40-100 μg di proteine (per IGA) vengono caricati per pozzetto in un gel a 10 corsie (pozzetti 0,5 x 0,15 cm). Il tampone catodico A contiene Coomassie Blue G-250 e ha un colore blu intenso che rende difficile vedere i pozzetti del gel per il caricamento del campione. È conveniente contrassegnare il centro di ogni pozzetto, ad esempio con un pennarello rosso, per facilitare il posizionamento della punta della pipetta durante questa fase. I marcatori di peso molecolare nativi possono essere utili quando si imposta la tecnica BN-PAGE per confermare che i gel gradiente siano formati correttamente e che il modello di complessi e SC sia quello corretto.
  3. Far funzionare a 80-100 V per 25-30 minuti e poi a 160-180 V, limitando la corrente a 12 mA/gel, fino a quando il colorante raggiunge il fondo del gel (~125-165 minuti in totale).
  4. Se è necessario eseguire saggi di attività in gel (IGA), sostituire il tampone catodico A con il tampone catodico B quando il fronte del colorante si trova al centro del gel (~1 h dopo l'inizio della seduta).
    NOTA: Sebbene i gel possano essere documentati senza alcuna colorazione subito dopo la corsa poiché alcune bande sono visibili (principalmente il complesso V, che può essere considerato un produttore "interno" con un MW di ~600 kDa) a causa del loro legame con il colorante G-250, di solito, gli SC e i singoli complessi non saranno visibili senza colorazione o saggi IGA. I gel da utilizzare nei saggi IGA o per la WB non devono essere colorati o fissati.
  5. Smontare il gel dalla cassetta e continuare con la colorazione blu Coomassie (sezione 5), l'analisi IGA (sezione 6) o l'immunorilevazione WB (sezione 7).

5. Colorazione in gel

  1. Colorare il gel per 10-15 minuti a temperatura ambiente (RT) utilizzando soluzioni di colorante blu Coomassie (colorante Coomassie R-250 allo 0,25% in metanolo al 10%, acido acetico al 10%; colorare per 10-15 minuti).
  2. Decolorare con diversi lavaggi (in genere 4-5 x 15 minuti) in metanolo al 40% più acido acetico al 10% a RT.
  3. Documenta il gel.

6. Saggi di attività su gel (IGA)

  1. Preparare le soluzioni IGA per l'analisi dei diversi complessi respiratori prima della fine dell'elettroforesi e mantenerle al buio (utilizzando scatole di plastica di colore scuro o coprendole con un foglio di alluminio, ad esempio). La composizione di ciascun buffer è descritta in dettaglio nella Tabella 1.
  2. Posizionare il gel o le corsie da utilizzare in una scatola di plastica il più piccola possibile per accoglierlo.
  3. Aggiungere un volume sufficiente della soluzione appropriata per coprire il gel (di solito 5 o 10 ml per 5 o 10 corsie di gel, rispettivamente) e incubare a RT agitando delicatamente (60-80 giri/min) e al riparo dalla luce.
    NOTA: Il tempo di incubazione dipende dal complesso da analizzare e dalla natura e quantità di campione caricato; CI e CIV sono i risultati più facili e veloci da ottenere. Pertanto, l'attività della CI di solito inizia a diventare visibile dopo pochi minuti, mentre CII e CIV richiedono ~30 minuti per essere osservati e CV ~1,5-2 ore. La reazione può continuare per ore in tutti i casi e la velocità di intensificazione del segnale può essere ridotta spostando l'incubazione in una cella frigorifera (4-6 °C), ad esempio per un'incubazione notturna (ON). L'attività CIII funziona solo per l'elettroforesi nativa chiara (CN), non per BN34.
  4. Quando si sono sviluppate le bande appropriate, interrompere le reazioni rimuovendo le soluzioni di dosaggio, lavando 2 volte con acqua distillata e fissando il gel con il 40% di metanolo più il 10% di acido acetico (ad eccezione del CV che viene fissato solo con metanolo) per 30 minuti.
    1. Per analizzare l'attività CIV dopo il rilevamento di IC mediante IGA, lavare il gel 2 volte con acqua distillata, documentare l'attività CI, incubare il gel (senza fissarlo!) con 50 mM di tampone fosfato di potassio (pH 7,2) 2 volte per 30 minuti, quindi con il tampone di reazione CIV completo fino alla comparsa delle bande IV complesse (di solito incubando ON a RT o 4 °C).
  5. Documenta i gel.
    NOTA: Per l'attività dell'ATPasi, poiché le bande sviluppate sono bianche, quando si documenta il gel, posizionarlo su uno sfondo scuro in modo che le bande chiare siano visibili.

7. Analisi del Western blot

  1. Preparare il tampone di trasferimento secondo la Tabella 1 e mantenerlo a 4 °C fino alla fine dell'elettroforesi.
  2. Mettere il gel in un vassoio e aggiungere il tampone di trasferimento. Incubare a RT per 10-15 min.
  3. Tagliare un pezzo di membrana in PVDF della stessa dimensione del gel e attivarlo in metanolo per 10 s sotto agitazione. Lavare più volte con acqua distillata e aggiungere il tampone di trasferimento. Incubare a RT per 10-15 minuti agitando delicatamente.
  4. Preparare il sandwich di trasferimento, dal basso verso l'alto, evitando bolle tra il gel e la membrana, nel seguente ordine: lato nero della cassetta-spugna-carta assorbente-gel-membrana-carta assorbente- spugna-lato trasparente della cassetta.
  5. Chiudere e bloccare la cassetta e inserire il sandwich nel serbatoio di trasferimento con l'orientamento corretto per il trasferimento (lato nero verso il polo negativo).
  6. Riempire il serbatoio di trasferimento con il tampone di trasferimento, aggiungere un agitatore magnetico per agitare il tampone e collegare l'alimentazione a 80 V per 2 ore o a 100 V per 1 ora. Eseguire il trasferimento tra 4 e 8 °C (ad esempio nella cella frigorifera) e con un blocco di raffreddamento nel sistema di trasferimento.
  7. Recuperare la membrana e continuare con un protocollo standard di western blot, utilizzando anticorpi specifici per i diversi complessi respiratori da rilevare29.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le rese dei mitocondri ottenute seguendo i protocolli sopra descritti variano a seconda di diversi fattori come la linea cellulare o il tipo di tessuto, la natura dei campioni (ad esempio, se vengono utilizzati tessuti freschi o congelati) o l'efficienza del processo di omogeneizzazione. Le rese attese di mitocondri da diverse linee cellulari e tessuti sono raccolte nella Tabella 2. Una volta ottenute le frazioni mitocondriali, il passo successivo è l'analisi del pattern delle SC respiratorie, che viene eseguita dopo la solubilizzazione del campione mitocondriale grezzo e la separazione elettroforetica mediante BN-PAGE seguita da analisi IGA o immunorilevazione WB. La Figura 1 mostra l'aspetto delle corsie di gel non colorate subito dopo la corsa e il modello delle bande dopo la colorazione standard di Coomassie di una linea cellulare in coltura e di un campione mitocondriale di fegato di topo.

Nella Figura 2A, B, si possono osservare chiare differenze tra i modelli di assemblaggio SC nelle cellule umane e di topo dopo l'uso dei saggi IGA. Pertanto, il complesso I libero è osservato nelle cellule di topo mentre non è rilevabile nei mitocondri umani. Il pattern IV-IGA complesso è molto simile in entrambe le linee cellulari umane (Figura 2B) mentre presenta differenze tra le due linee cellulari di topo analizzate nella Figura 2A. Queste differenze sono dovute al fatto che le cellule BL6 esprimono una variante mutante di SCAF18.

I pattern SC, ottenuti con il protocollo per l'isolamento mitocondriale qui descritto per lavorare con piccoli campioni, sono mantenuti rispetto ai protocolli "convenzionali" utilizzati per campioni più grandi. Ciò può essere visto nella Figura 2C, confrontando le corsie 1 e 6 (ottenute dopo isolamento mitocondriale utilizzando un protocollo convenzionale da 3 g di fegato e 1,1 g di BAT) con, rispettivamente, le corsie 2 e 5 (ottenute utilizzando i protocolli qui presentati da circa 0,1 g di entrambi i tessuti). Come proposto nel modello di plasticità, la proporzione relativa di complessi respiratori e SC varia a seconda del tipo di cellula e dello stato metabolico. Come mostrato nella Figura 2C, D, i diversi tessuti mostrano diversi modelli di assemblaggio SC. Pertanto, i mitocondri cerebrali mostrano livelli molto bassi di complesso libero I e una percentuale più elevata di SC rispetto agli altri tessuti, e il BAT è caratterizzato da bassi livelli di CV (Figura 2A) e alte quantità di SC III + IV (Figura 2D). I mitocondri cardiaci presentano alti livelli di SC e CV. I modelli di assemblaggio CV sono molto simili tra la linea cellulare in coltura e un campione mitocondriale di fegato di topo (Figura 2E).

L'assemblaggio SC può anche essere analizzato mediante WB come mostrato nella Figura 3 per due campioni ottenuti dal controllo della milza e dalle cellule tumorali. In questo caso, 30-50 μg di proteina mitocondriale sono solitamente sufficienti per rilevare i diversi complessi e SC con gli anticorpi specifici. La Figura 4 mostra alcune delle principali insidie che possono verificarsi durante l'applicazione di questi protocolli. Gradienti di gel errati possono produrre modelli di migrazione anormali e indesiderati come nella Figura 4A, corsia 1, dove le SC rimangono vicine al pozzetto nella parte superiore della corsia a causa di una concentrazione di acrilammide superiore al normale nel gel. L'incubazione dei campioni, anche per tempi relativamente brevi, ad alte temperature (qui 37 °C e 40 °C per 10 min) provoca la degradazione di SC e CI (Figura 4A corsie 2-4). Allo stesso modo, il rapporto detergente/proteine è fondamentale per ottenere buoni risultati e un'adeguata risoluzione del gel. Al di sotto di un rapporto di 2 g di digitonina/g di proteine, la risoluzione della banda si riduce progressivamente e alla concentrazione più bassa (0,5 g/g) è visibile solo uno striscio nell'area corrispondente alle SC (Figura 4B).

figure-results-1
Figura 1: Pattern di complessi mitocondriali e supercomplessi dopo la separazione BNGE di mitocondri permeabilizzati con digitonina da una linea cellulare di coltura (L929Balbc) e fegato di topo. Le corsie a sinistra (1 e 2) rappresentano l'aspetto del gel non colorato subito dopo la corsa, dove è rilevabile solo CV, mentre le corsie a destra (3 e 4) mostrano lo schema delle bande dopo la colorazione di Coomassie. Abbreviazioni: BNGE = Elettroforesi su gel nativo blu; CV = complesso V; SC = supercomplessi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Analisi IGA di mitocondri isolati da diverse linee cellulari e tessuti di topo. (A,B) Attività in gel dei complessi indicati nei mitocondri isolati da (A) linee cellulari di topo o (B) umane. L929Balbc è una linea cellulare trasmettitocondriale generata nel nostro laboratorio trasferendo mitocondri da piastrine di topo Balb/cJ a cellule ρ°L929neo come descritto in precedenza40,41. I fibroblasti BL6 sono una linea cellulare immortalizzata generata nel nostro laboratorio da una biopsia dell'orecchio di un topo BL6. (C) Modelli CI-IGA da mitocondri di topo isolati utilizzando un metodo convenzionale a partire da 3 g di fegato (corsia 1) e con 1,1 g di BAT (corsia 6) o il protocollo qui presentato e iniziando con circa 0,1 g di tessuto in tutti i casi (corsia 2, fegato; corsia 3, cuore; corsia 4, cervello e corsia 5 BAT). (D) Modelli CIV-IGA (eseguiti dopo CI-IGA mostrato nel pannello 2C, corsie 2-5) nel fegato, nel cuore, nel cervello e nei mitocondri BAT di topo. (E) Attività CV-IGA analizzata in cellule di topo in coltura e fegato. Sono stati caricati circa 60-75 μg di proteina mitocondriale per corsia. Abbreviazioni: IGA = attività in-gel; SC = supercomplessi; CI = complesso I; BAT = tessuto adiposo bruno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Immunorilevazione WB dei diversi complessi mitocondriali e supercomplessi in campioni di milza. Dopo la separazione Blue Native PAGE dei complessi mitocondriali e delle SC ottenuti da campioni di controllo della milza (Milza M9) e del tumore (Tumore M9), questi sono stati trasferiti su una membrana PVDF e ibridati in sequenza con anticorpi che riconoscono le subunità CI, CIII, CIV e CII indicate (pannelli A-D, rispettivamente). Sono stati caricati circa 50 μg di proteina mitocondriale per corsia. Gli asterischi indicano il segnale rimasto da un precedente western blot. Abbreviazioni: SC = supercomplesso; CI = complesso I; CIII = complesso III; CIV = complesso IV; CII = complesso II. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Insidie nell'analisi SC di Blue-Native PAGE. Analisi CI IGA di mitocondri isolati da (A) fegato di topo fresco e (B) fegato di ratto congelato in diverse condizioni di solubilizzazione. (A) Corsia 1, concentrazione del gradiente di gel errata (8-13% invece del normale 3-13%). Corsie 2-4, campioni incubati per 10 minuti su ghiaccio o rispettivamente a 37 °C e 40 °C prima del caricamento. (B) Pattern dopo IGA per IC di mitocondri ottenuti da fegato di ratto congelato utilizzando diversi rapporti digitonina/proteina per la solubilizzazione. Abbreviazioni: SC = supercomplesso; PAGE = elettroforesi su gel di poliacrilammide; CI = complesso I; IGA = attività in gel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

MedioComposizione
Tampone ipotonico10 mM MOPS, 83 mM saccarosio, pH 7,2
Tampone ipertonico30 mM MOPS, 250 mM saccarosio, pH 7,2
Tampone di omogeneizzazione A10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M saccarosio, pH 7,4
tampone di omogeneizzazione AT225 mM di mannitolo, 1 mM di EGTA, 75 mM di saccarosio, 0,01% BSA pH 7,4
tampone di omogeneizzazione AT2225 mM di mannitolo, 1 mM di EGTA, 75 mM di saccarosio, 0,02% BSA pH 7,4
Tampone di campionamento BN50 mM di NaCl, 50 mM di imidazolo, 2 mM di acido aminocaproico, 1 mM di EDTA pH 7,0
Soluzione di digitonina10% di digitonina in 50 mM di NaCl, 50 mM di imidazolo, 5 mM di aminocaproico, 4 mM di PMSF
Buffer di caricamento BN5% Coomassie Blue G in acido 0,75 M aminocaproico
tampone catodico BN A50 mM di tritina, 15 mM di Bis-Tris pH =7,0 (4 °C), 0,02% G-250 (blu brillante di Coomassie G-250)
tampone catodico BN B50 mM di tricina, 15 mM di Bis-Tris pH=7,0 (4 °C), 0,002% G-250
Tampone anodico BN50 mM Bis-Tris, pH=7,0
Substrato IGA complesso I5 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1 mg/mL NADH, 2,5 mg/mL Nitroblue Tetrazolium (NBT)
Substrato IGA del complesso II50 mM di tampone fosfato di potassio pH 7,4, 20 mM di sodio succinato, 0,2 mM di fenazina metosolfato (PMS), 2,5 mg/mL di NBT
Substrato IGA del complesso III50 mM Tampone fosfato di potassio pH 7,2, 0,05% diaminobenzidina (DAB)
Substrato IGA del complesso IVStessa soluzione di CIII più 50 μM di citocromo c
Substrato IGA complesso V35 mM Tris, 270 mM glicina pH 8,3, 14 mM MgSO4, 0,2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP
Soluzione coloranteColorante Coomassie R-250 allo 0,25% in metanolo al 40% e acido acetico al 10%
Soluzione decolorante/fissante40% metanolo, 10% acido acetico
Buffer di trasferimento48 mM Tris, 39 mM Glicina, 20% metanolo

Tabella 1: Buffer e composizione dei media.

Tipo di cellula/tessutoImporto di partenzaResa prevista (μg di proteina mitocondriale)Numero di corsie (50-60 μg/corsia)
Cellule in coltura
MDA-MB-468100 μL vpc300-400 μg6-9
Derivato da 143B100 μL vpc200-350 μg4-7
Fibroblasti di topo100 μL vpc150-200 μg3-5
Cuore100 mg400-500 μg10-12*
Muscolo scheletrico100 mg300-400 μg8-10*
Fegato100 mg400-500 μg8-10
Milza50 mg150-250 μg3-5
PIPISTRELLO100 mg200-300 μg4-6
Cervello100 mg250-300 μg5-8

Tabella 2: Rese attese di mitocondri da diversi tipi di cellule e tessuti di topo. Le frazioni mitocondriali ottenute dal cuore o dal muscolo scheletrico sono più pure di quelle ottenute da altri tessuti. Pertanto, è possibile caricare quantità minori nei gel (*).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli adattamenti metodologici introdotti nei protocolli qui descritti hanno lo scopo di evitare perdite e aumentare la resa mantenendo le attività del complesso mitocondriale (che è cruciale quando la disponibilità di quantità sufficienti di campioni è compromessa) e riprodurre il modello atteso di SC del tessuto o della linea cellulare (vedi Figura 2C). A questo scopo e poiché non è richiesta un'elevata purezza mitocondriale per rilevare correttamente le SC, il numero di passaggi, tempi e volumi è stato ridotto ogni volta che ciò è stato possibile.

Pertanto, dopo l'omogeneizzazione e la rimozione dei nuclei e delle cellule integre mediante centrifugazione a bassa velocità, i surnatanti contenenti i mitocondri vengono trasferiti in provette di polipropilene da 1,5 mL e le successive centrifugazioni per ottenere le frazioni mitocondriali grezze vengono eseguite in microfuga aumentando la velocità e riducendo i tempi e i volumi rispetto ai protocolli convenzionali. Ciò consente l'elaborazione di diversi campioni in un tempo relativamente breve: una stima precisa è che 10 campioni possono essere processati in ~2-2,5 ore (dall'inizio dell'omogeneizzazione (fase del protocollo 1.6. o equivalente per i tessuti) all'ottenimento della frazione SCs pronta per essere caricata in un gel (fase del protocollo 3.7) e minimizza le perdite pur mantenendo le attività. Un'altra modifica rispetto ai protocolli originali dei gruppi di Schägger consiste nel sostituire, dopo la solubilizzazione della membrana per l'ottenimento della frazione SCs, una fase di ultracentrifugazione con una semplice centrifugazione in microfuga (fase del protocollo 3.4).

Ci sono alcuni passaggi critici nella procedura. In primo luogo, l'efficienza della rottura cellulare, specialmente nel caso di cellule in coltura (vedi nota dopo la fase 1.8 del protocollo) e in particolare nel caso di piccole cellule. I tessuti e le linee cellulari presentano un grado di difficoltà variabile nella rottura cellulare: ad esempio, nel cuore e nel muscolo, questo passaggio è solitamente meno efficiente che nel fegato o nella milza, ma è compensato in resa perché i primi hanno un contenuto mitocondriale più elevato. Un'alternativa per migliorare la resa mitocondriale quando isolati dal muscolo o dal cuore sarebbe il trattamento di campioni con tripsina prima dell'omogeneizzazione. Il cervello è un altro tessuto che presenta una bassa efficienza nella rottura cellulare a causa dell'omogeneizzazione manuale, che è più lieve e meno efficiente, e probabilmente anche a causa della maggiore variazione nei tipi di cellule in questo tessuto, come è stato riportato in precedenza 42. Questo può essere parzialmente compensato da una seconda fase di omogeneizzazione come suggerito nel nostro protocollo (fase 2.7.4). D'altra parte, se la rottura cellulare è eccessiva, il campione finale contenente SC potrebbe essere contaminato da frammenti di DNA nucleare che potrebbero interferire con il funzionamento elettroforetico. Questo problema si manifesta come un aumento della viscosità del campione quando viene aggiunta digitonina per solubilizzare le membrane mitocondriali e può essere risolto mediante trattamento con DNAsi I.

In secondo luogo, se il rapporto detergente/proteina è troppo basso, ciò comporterebbe una solubilizzazione della membrana meno efficiente e la possibilità di formazione di aggregati. Ciò potrebbe manifestarsi nei gel come scarsa risoluzione nelle SC ad alto peso molecolare (vedi Figura 4) o come CIV che fornisce bande multiple corrispondenti agli oligomeri43. Se il rapporto è troppo elevato, potrebbe portare alla disaggregazione delle SC (principalmente CI-SC). In terzo luogo, è importante evitare di riscaldare i campioni durante l'intera procedura (vedere la Figura 4) ed evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento poiché possono influire sullo stato di assemblaggio SC.

Nella Tabella 2, viene presentato un riepilogo delle rese attese per diversi tipi di cellule e campioni di tessuto. I valori sono approssimativi e dipenderanno dall'efficienza di rottura della cella e dalla natura della fonte. Nel caso dei tessuti, se il materiale di partenza è congelato tende a dare una resa maggiore rispetto ai campioni freschi. Viene presentata una stima del numero di corsie (considerando un carico compreso tra 50 e 60 μg di proteina mitocondriale per corsia) che possono essere caricate.

I protocolli qui presentati coprono una varietà di tessuti e tipi di cellule con piccole variazioni, possono essere utilizzati con campioni freschi o congelati e richiedono attrezzature semplici e un costo relativamente basso, non comportando l'uso di costosi kit di purificazione o gradienti. Tuttavia, potrebbero richiedere alcuni adattamenti per essere utilizzati con particolari tipi di cellule o campioni, nonché quando specifiche popolazioni mitocondriali, come i mitocondri sinaptici cerebrali o i mitocondri subsarcolemmali muscolari, ad esempio, sono oggetto di analisi.

Poiché i ruoli fisiologici precisi e il potenziale coinvolgimento delle SC in situazioni patologiche devono ancora essere definiti, è necessaria l'analisi della loro dinamica e dei fattori che ne influenzano l'assemblaggio, la stabilità e la funzione. I nostri protocolli possono rappresentare strumenti preziosi che consentono di ottenere risultati riproducibili su pattern di SC con campioni di piccole dimensioni e da una varietà di tipi cellulari e tessuti, in particolare quando è necessario confrontare più condizioni sperimentali29.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione numero "PGC2018-095795-B-I00" dal Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) e dalle sovvenzioni "Grupo de Referencia: E35_17R" e dalla sovvenzione numero "LMP220_21" dalla Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) a PF-S e RM-L.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acido aceticoPanReac131008
Acido aminocaproicoFluka Analytical7260
ATPSigma-AldrichA2383
Bis TrisAcrons Organics327721000
Bradford assayBiorad5000002
Coomassie Blue G-250Serva17524
Coomassie Blue R-250Merck1125530025
Citocromo cSigma-AldrichC2506
Diamino  benzidina (DAB)Sigma-AldrichD5637
DigitoninSigma-AldrichD5628
EDTAPanReac131669
EGTASigma-AldrichE3889
Senza acidi grassi BSARoche10775835001
GlicinaPanReacA1067
Omogeneizzatore Pestello in teflonDeltalab196102
ImidazoleSigma-AldrichI2399
K2HPO4PanReac121512
KH2PO4PanReac121509
MannitoloSigma-AldrichM4125
MetanoloLabkemMTOL-P0P
MgSO4PanReac131404
Mini Trans-Blot CellBioRad1703930
MOPSSigma-AldrichM1254
MTCO1 Anticorpo monoclonaleInvitrogen459600
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE Da 3 a 12% Mini Protein GelsInvitrogenBN1001BOX
NativePAGE Additivo per tampone catodico (20x)InvitrogenBN2002
NativePAGE Running Buffer (20x) InvitrogenBN2001
NDUFA9 Anticorpo monoclonaleInvitrogen459100
Nitroblue tetrazolium sale (NBT)Sigma-AldrichN6876
Pb(NO3)2Sigma-Aldrich228621
PDVF MembranaAmersham10600023
Fenazina metasolfato (PMS)Sigma-AldrichP9625
Pierce ECL SubstratoThermo Scientific32106
PMSFMerckPMSF-RO
SDHA Anticorpo monoclonaleInvitrogen459200
Succinato di sodioSigma-AldrichS2378
Streptomicina/penicillinaPAN biotechP06-07100
SaccarosioSigma-AldrichS3089
TrisPanReacA2264
UQCRC1 Anticorpo monoclonaleInvitrogen459140
XCell  SureLock Mini-CellInvitrogen  EI0001

References

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