Isolamento, purificazione e identificazione del Bacillus licheniformis produttore di bacitracina da feci fresche di suini sani

Sommario

Questo protocollo fornisce una descrizione completa ed esaustiva del processo dettagliato per l'isolamento, la purificazione e l'identificazione del Bacillus licheniformis produttore di bacitracina da feci suine sane.

Abstract

Il Bacillus licheniformis e la bacitracina hanno un enorme mercato applicativo e valore nei settori della medicina, della chimica, dell'acquacoltura, dell'agricoltura e dei prodotti secondari. Pertanto, la selezione di B. licheniformis con un'elevata produzione di bacitracina è di grande importanza. In questo protocollo sperimentale, il Bacillus con un'alta resa di bacitracina è stato isolato, purificato e identificato dalle feci fresche di suini sani. È stato inoltre testato l'effetto inibitorio del metabolita secondario bacitracina su Micrococcus luteus . La cromatografia su strato sottile e la cromatografia liquida ad alte prestazioni sono state utilizzate per la rilevazione qualitativa e quantitativa della bacitracina. Le caratteristiche fisiologiche e biochimiche di B. licheniformis sono state determinate mediante appositi kit. Le relazioni filogenetiche di B. licheniformis sono state determinate e costruite utilizzando il rilevamento della sequenza genica. Questo protocollo descrive e introduce il processo standard di isolamento, purificazione e identificazione di B. licheniformis da feci fresche animali da molteplici prospettive, fornendo un metodo per l'utilizzo su larga scala di B. licheniformis e bacitracina nelle fabbriche.

Introduzione

Il Bacillus licheniformis è una specie di Bacillus della famiglia Firmicutes, ampiamente distribuita in vari ambienti come l'acqua, il suolo e l'intestino degli animali¹. B. licheniformis ha una struttura corta e robusta simile a un bastoncino e si muove individualmente². La colonia è quasi rotonda e opaca, con un rigonfiamento centrale e bordi puliti di colore bianco grigiastro³. Ha una forte capacità di crescita e riproduzione e può assorbire e utilizzare nutrienti da varie fonti di carbonio, come monosaccaridi, polisaccaridi, chetoso e acidi organici⁴. Nella fase successiva della crescita e dello sviluppo, B. licheniformis può esistere sotto forma di spore dormienti e produrre sostanze antibatteriche come bacitracina, lichenisina e surfactina. Può anche resistere a carenze nutrizionali e all'ambiente esterno estremo⁵. Non c'è un'evidente preferenza per il codone e l'efficiente sistema di secrezione determina la secrezione proteica eterologa di B. licheniformis, che è il doppio di quella di Bacillus subtilis⁶. Viene spesso utilizzato per produrre preparati enzimatici come la proteasi, l'amilasi e la cellulasi⁷. A causa della sua assenza di tossine endogene, è certificato come ceppo sicuro per gli alimenti ed elencato nell'indice QPS dell'EFSA⁸. Pertanto, ci sono diversi potenziali usi, tra cui la produzione di composti bioattivi, che hanno una vasta gamma di applicazioni nell'acquacoltura, nell'agricoltura, nell'alimentazione, nella biomedicina e nelle industrie farmaceutiche. Inoltre, B. licheniformis è un componente importante della flora intestinale animale, che può promuovere gli animali per migliorare le prestazioni produttive, migliorare l'equilibrio della flora intestinale e prevenire le malattie. L'intero genoma di B. licheniformis ATCC14580 è stato analizzato nel 2004 e le informazioni di base sulla traduzione della trascrizione, il ripiegamento delle proteine e il meccanismo di secrezione sono state gradualmente comprese⁹. Queste informazioni genetiche lo rendono favorevole alla modificazione genetica a livello molecolare, contribuendo a facilitare la produzione su larga scala di B. licheniformis.

La bacitracina è un antibiotico peptidico dodecaciclico prodotto dalla peptide sintetasi non ribosomiale mediante metabolismo secondario in B. subtilis e B. licheniformis. La bacitracina è una miscela composta da vari componenti come la bacitracina A, B e C, in cui uno o due amminoacidi differiscono tra ciascun componente; tra queste, la bacitracina A ha la più forte attività biologica¹⁰. La bacitracina può inibire i batteri gram-positivi come lo Staphylococcus e il Micrococcus luteus e alcuni batteri gram-negativi inibendo la formazione della parete cellulare e interagendo con le proteine leganti la membrana¹¹. Nel frattempo, la bacitracina è sicura e stabile, non è facile produrre resistenza ai farmaci e può essere compatibile con altri farmaci antibatterici¹². Pertanto, la bacitracina viene utilizzata nella pratica medica e veterinaria. Inoltre, grazie al suo rapido tasso di eliminazione e al basso tasso di assorbimento, può essere utilizzato anche come additivo per l'alimentazione animale¹³.

B. licheniformis può colonizzare l'intestino e migliorare il microambiente gastrointestinale. L'adesione e la capacità riproduttiva e le relative funzioni fisiologiche del Bacillus da diverse fonti nel tratto gastrointestinale di diversi animali sono diverse. Il B. licheniformis derivato dal maiale è più favorevole alla colonizzazione nell'intestino dei suini e di altri animali da reddito. Esiste una stretta relazione tra la relativa abbondanza di probiotici intestinali e lo stato di salute dell'ospite¹⁴. L'integrazione alimentare con la miscela di B. licheniformis nei suinetti svezzati migliora l'ecosistema intestinale modificando la composizione del microbiota e l'attività metabolica e influisce anche sulla mucosa intestinale¹⁵. Le feci animali possono riflettere il tipo e la quantità di flora intestinale animale. Questo protocollo descrive l'isolamento e la purificazione del Bacillus spp. produttore di bacitracina da feci suine sane. Le feci derivano da scrofe Taihu che non vengono alimentate con mangimi composti e hanno eccellenti prestazioni produttive negli allevamenti di suini. Gli isolati sono stati identificati come B. licheniformis in base alle loro caratteristiche morfologiche, proprietà fisico-chimiche e identificazione biochimica.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state documentate e approvate dal Comitato Etico della Nanjing Tech University. Le feci sono state ricavate da scrofe Taihu di circa 2 anni (vedi Tabella dei materiali), che sono state allevate in allevamenti di maiali professionali e standard.

1. Preparazione dei terreni

1. Terreno liquido Luria-Bertani (LB): Aggiungere 10 g di NaCl, 5 g di estratto di lievito in polvere e 10 g di triptone in una bottiglia conica, aggiungere acqua distillata a 1 L, mescolare e sciogliere con una bacchetta di vetro. Trasferire 100 ml di terreno in un flacone conico da 500 ml e legarlo strettamente con una pellicola sigillante traspirante. Sterilizzare a 121 °C in autoclave per 20 minuti (vedi Tabella dei Materiali).
2. LB terreno solido: aggiungere 10 g di NaCl, 5 g di estratto di lievito in polvere, 10 g di triptone, 20 g di agar in polvere in una bottiglia conica, aggiungere acqua distillata a 1 L, sciogliere con una bacchetta di vetro e legare strettamente con una pellicola sigillante traspirante. Sterilizzare a 121 °C in autoclave per 20 min. Quando il terreno si è raffreddato a 50 °C, versare 20 ml di terreno nelle piastre di Petri, lasciarle raffreddare e poi conservarle capovolte.
3. Terreno di fermentazione della bacitracina: aggiungere 8 g di farina di soia, 4 g di amido solubile, 0,1 g (NH₄)₂SO₄, 0,6 g di CaCO₃ e 100 ml di acqua distillata in una bottiglia conica da 500 ml, mescolare con una bacchetta di vetro per sciogliere completamente e legare strettamente con una pellicola sigillante traspirante. Sterilizzare a 121 °C in autoclave per 20 minuti (vedi Tabella dei Materiali).
4. Sospensione di M. luteus : selezionare un anello di M. luteus e inoculare su una piastra di coltura LB, preparata al punto 1.2 (vedi Tabella dei materiali). Coltura in incubatore a temperatura costante a 37 °C per 16 ore (vedi Tabella dei materiali). Aggiungere 5 mL di soluzione fisiologica normale alla piastra e agitare delicatamente per eluire le colonie. Misurare l'OD600 e diluire la soluzione in una provetta per ottenere una sospensione con OD600 di 0,3-0,7. Conservare la sospensione di M. luteus a 4 °C per un uso successivo.
5. Terreno di prova dell'attività antibatterica: aggiungere 1 mL di sospensione di M. luteus , preparata nella fase 1.4, a 100 mL di terreno solido LB liquido preparato nella fase 1.2 e agitare leggermente. Prelevare immediatamente 5 mL di questa soluzione contenente M. luteus e distribuirla uniformemente sulla piastra di coltura LB.

2. Isolamento e purificazione del Bacillus da feci fresche di suini sani

1. Aggiungere 9 ml di soluzione fisiologica normale e 1,0 g di feci di maiale fresche in un pallone da 150 ml. Mescolare con un agitatore magnetico (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente a 60 giri/min per 15 minuti.
2. Mettere l'estratto fecale in un bagnomaria termostatico a 80 °C (vedi Tabella dei materiali) per 20 minuti per uccidere i batteri non produttori di spore.
3. Aggiungere la sospensione a 100 mL di terreno liquido LB in un pallone di Erlenmeyer da 250 mL e la coltura in un agitatore (vedere la Tabella dei materiali) a 180 giri/min/min a 37 °C per 8 ore.
4. Eseguire la diluizione seriale della soluzione batterica coltivata con soluzione fisiologica normale da ^10-1 a ^10-8. Applicare 0,1 ml di diluente batterico ^10-6, ^10-7 e ^10-8 sulle singole piastre di coltura LB e lasciare asciugare. Dopo 10 minuti, posizionare le piastre capovolte in un'incubatrice a temperatura costante a 37 °C per 48 ore.
5. Utilizzare l'anello di inoculazione per raccogliere le colonie che sembrano simili a B. licheniformis (colore bianco crema, consistenza morbida, aspetto mucoide, elevazione convessa e piatta e forma irregolare)¹⁶e striarle utilizzando un modello a zigzag sul terreno di saggio dell'attività antibatterica preparato al passaggio 1.5 (vedere la Figura 1).
6. Mettere le piastre nell'incubatrice a 37 °C per 48 ore e osservare se c'è una zona di inibizione intorno alla colonia.

3. Screening per l'inibizione dell'attività di M. luteus

1. Selezionare una singola colonia che ha generato una zona inibitoria e aggiungere a 100 mL di terreno liquido LB, coltura nell'agitatore a 37 °C e 180 giri/min per 12 ore.
2. Inoculare 5 mL del terreno di coltura nel terreno di fermentazione della bacitracina preparato nella fase 1.3 e fermentare a 37 °C per 48 ore.
3. Raccogliere il brodo di fermentazione in una provetta da centrifuga e centrifugare a 13.400 x g a 4 °C per 15 minuti, quindi filtrare con una membrana filtrante microporosa da 0,22 μm (vedi Tabella dei materiali).
4. Aggiungere una tazza Oxford a una piastra media per il saggio di attività antibatterica fresca, quindi aggiungere 50 μl di filtrato (surnatante di fermentazione) alla tazza Oxford (vedere la tabella dei materiali). Coltura in incubatore a 37 °C per 12 h. Dopo l'incubazione, misurare il diametro della zona inibitoria con un calibro a corsoio (vedi Tabella dei materiali).
5. Selezionare i ceppi e il corrispondente surnatante di fermentazione con un diametro della zona inibitoria superiore a 15 mm per gli esperimenti successivi.

4. Identificazione della bacitracina mediante cromatografia su strato sottile

1. Aggiungere 60 mg di bacitracina standard e sciogliere in EDTA-2Na all'1% (vedere la Tabella dei materiali) in un flacone tarato da 10 mL per ottenere una soluzione di bacitracina da 6,0 mg/mL.
2. Diluire 1 mL del surnatante di fermentazione a 10 mL con EDTA-2Na all'1%. Posizionare 5 μl di campione e 5 μl di soluzione standard di bacitracina sulla piastra a strato sottile di gel di silice attivato (vedere la tabella dei materiali).
3. Aggiungere 100 mL di acido n-butanolo-acetico-acqua-piridina-etanolo (60:15:10:6:5) al serbatoio cromatografico (vedere la Tabella dei materiali). Posizionare la lastra a strato sottile di gel di silice nella vasca cromatografica. Coprite e lasciate riposare a temperatura ambiente per 30 min.
4. Estrarre la piastra a strato sottile in gel di silice, spruzzare la soluzione di butanolo-piridina (99:1) contenente l'1% di ninidrina (vedere la Tabella dei materiali) e riscaldare a 105 °C per 5 minuti fino a quando non compaiono macchie rosso brunastre. Calcolare R_f (Retention Factor Value) per lo standard e il campione secondo la seguente formula:
   R_f = Corsa del punto/Corsa del solvente.

5. Rilevamento della bacitracina mediante HPLC

1. Aggiungere 0,3 mL di surnatante di fermentazione e 1,2 mL di etanolo al 50% in una provetta da microcentrifuga da 2 mL, agitare per 5 minuti a mano e lasciare riposare a 4 °C per 12 ore.
2. Centrifugare a 13.400 x g per 15 minuti e filtrare in un flacone per campioni etichettato come S1 con una membrana filtrante microporosa da 0,22 μm (vedere la tabella dei materiali).
3. Preparazione della soluzione madre di bacitracina: aggiungere 0,4 g di bacitracina standard (60 U/mg; vedere la Tabella dei Materiali), 100 mL di EDTA-2Na da 40 g/L (vedere la Tabella dei Materiali) in un matraccio tarato da 100 mL per preparare 240 U/mL di soluzione madre di bacitracina.
4. Aggiungere 3 mL di soluzione madre di bacitracina e 21, 9, 3, 1 e 0 mL di acqua ultrapura alle provette etichettate rispettivamente A1, B1, C1, D1 ed E1. Dopo la filtrazione con membrana filtrante microporosa da 0,22 μm, inserire il filtrato in flaconi per campioni etichettati A2, B2, C2, D2 ed E2.
   NOTA: Le concentrazioni della soluzione standard di bacitracina sono 30, 60, 120, 180 e 240 U/mL.
5. Posizionare A2, B2, C2, D2, E2 e S1 nel vassoio di prova dello strumento HPLC. Introdurre 1000 mL di 50 mM/L di formiato di ammonio e 1000 mL di acetonitrile nella vaschetta di fase mobile e impostarli rispettivamente come fasi mobili A e B.
   NOTA: Il pH del formiato di ammonio deve essere regolato a 4,0 con acido formico.
6. Installare la colonna HPLC C18 (5 μm, 4,6 mm x 250 mm) nella direzione indicata sulla colonna (vedere la tabella dei materiali).
7. Impostare i parametri della fase mobile su 0 min, 77% A e 23% B; 30 min, 70% A e 30% B; 40 min, 60% A e 40% B; 50 min, 60% A e 40% B; 51 min, 77% A e 23% B; 58 min, 77% A e 23% B. Impostare la dimensione del campione a 100 μL; Portata, 1,0 mL/min; Temperatura della colonna, 30 °C.
8. Fare clic sul pulsante Esegui per eseguire il programma.

6. Identificazione morfologica

1. Diluire e rivestire il ceppo con il titolo più alto di bacitracina su una piastra di coltura LB e coltura in un'incubatrice a 37 °C per 48 ore. Colorare e osservare la morfologia della colonia come descritto di seguito.
2. Aggiungere una goccia di acqua purificata sterile allo scivolo, raccogliere una piccola quantità di colonie e aggiungere alla goccia d'acqua. Spalmare uniformemente, lasciare asciugare naturalmente il vetrino e poi fissarlo sul fuoco.
3. Aggiungere il cristallovioletto per 1 minuto per colorare il campione, quindi risciacquare con acqua di rubinetto. Aggiungere iodio per 1 minuto per colorare il campione e quindi risciacquare con acqua distillata.
4. Aggiungere il 95% di alcol, agitare il vetrino per decolorare per 1 minuto, quindi risciacquare con acqua distillata.
5. Aggiungere lo zafferano per 1 minuto per macchiare il campione, quindi risciacquare con acqua distillata. Lasciare asciugare naturalmente il vetrino e osservare la morfologia della colonia al microscopio con immersione in olio (vedi Tabella dei Materiali).

7. Identificazione fisiologica e biochimica

1. Aggiungere 2 ml di soluzione fisiologica sterile nella provetta e inoculare una singola colonia dalla piastra nella soluzione salina sterile utilizzando un anello di inoculazione per ottenere una sospensione batterica.
2. Aggiungere 100 μl di sospensione batterica in ciascun foro per misurare V-P, citrato, gelatina, cloruro di sodio al 7%, pH 5,7, riduzione dei nitrati e idrolisi dell'amido sulla striscia di identificazione biochimica del Bacillus (vedere la Tabella dei materiali).
3. Usa l'anello di inoculazione per prelevare un'altra singola colonia e striarla a zigzag sul tubo biochimico di crescita anaerobica della striscia di identificazione biochimica del Bacillus .
4. Usa l'anello di inoculazione per raccogliere le altre colonie e perforarle verticalmente nei pori per l'identificazione di propionato, D-xilosio, L-arabinosio e D-mannitolo sulla striscia di identificazione biochimica del Bacillus .

8. Determinazione della sequenza genica del ceppo

1. Estrarre il DNA del ceppo utilizzando un kit per l'estrazione del DNA batterico (vedi Tabella dei materiali): aggiungere 2 ml di liquido di semi in una provetta da microcentrifuga da 5 ml e centrifugare a 11.500 x g per 1 minuto. Scartare il surnatante e aggiungere 110 μL di tampone (contenente 20 mM di Tris, pH8,0; 2 mM di Na 2-EDTA e 1,2% di Triton) e 70 μL di soluzione di lisozima da 50 mg/mL al pellet e incubare a 37 °C per 30 minuti.
2. Aggiungere 4 μL di 100 mg/mL di RNasi A per 15 s e lasciare agire per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 20 μL di soluzione di proteinasi K e mescolare bene.
3. Aggiungere 220 μl di tampone GB, agitare per 15 s fino a quando il pellet è sospeso, porre a 70 °C per 10 minuti per rendere la soluzione limpida ed eseguire una breve centrifuga per rimuovere le perle d'acqua sulla parete del tubo.
4. Aggiungere 220 μl di etanolo anidro, ammortizzare completamente per 15 s, breve separazione. Trasferire la soluzione e la precipitazione di flocculazione nella colonna di adsorbimento CB3 della provetta di raccolta, centrifugare a 13.400 x g per 30 s e scartare il surnatante.
5. Aggiungere 500 μl di tampone GD nella colonna di adsorbimento, centrifugare per 30 s a 13.400 x g ed eliminare il surnatante. Aggiungere 600 μl di PW alla colonna, centrifugare per 30 s a 13.400 x g ed eliminare il surnatante.
6. Reinserire la colonna di adsorbimento nella provetta di raccolta, centrifugare per 2 minuti a 13.400 x g ed eliminare il surnatante.
7. Posizionare la colonna di adsorbimento a temperatura ambiente per 10 minuti per asciugare. Trasferire la colonna nella provetta da centrifuga e aggiungere 100 μl di tampone di eluizione TE al centro della membrana di adsorbimento.
8. Lasciare a temperatura ambiente per 5 minuti per raccogliere il flusso nella provetta da centrifuga e centrifugare per 2 minuti a 13.400 x g.
9. Aggiungere 25 μl di miscela master 2x (vedere la tabella dei materiali), 2,5 μl di campione di DNA ottenuto nella fase 8.8, 2 μl di primer 27F, 2 μl di primer inverso 1492R e 18,5 μl di H₂O a doppia distillazione a una provetta PCR da 0,1 mL.
   NOTA: Le sequenze geniche dei primer sono 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' e 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
10. Posizionare la provetta per PCR nella macchina per PCR (vedi Tabella dei materiali) nelle seguenti condizioni: pre-denaturazione a 95 °C per 10 min, denaturazione a 95 °C per 30 s, ricottura a 55 °C per 30 s, estensione a 72 °C per 90 s, estensione a 72 °C per 7 min. Eseguire il ciclo di denaturazione, ricottura ed estensione in tre fasi per 32x.
11. Prelevare 5 μL di prodotto ed eseguire l'elettroforesi con gel di agarosio all'1% a 120 V per 30 min.
    1. Sciogliere 500 mg di agarosio in 50 mL di 1x tampone TAE. Scaldare la soluzione nel microonde per 1-2 minuti fino a quando l'agarosio non si sarà completamente sciolto. Aggiungere 5 μl di colorante per la colorazione del DNA, quindi versare in una vaschetta per gel e inserire la piastra dell'orifizio. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 min fino a quando non si solidifica; mettere il gel nel serbatoio dell'elettroforesi e aggiungere 1x tampone TAE per immergere il gel. Aggiungere 2 μL di DNA ladder da 2 kb (10 mg/μL) nel primo pozzetto e 5 μL di prodotto PCR miscelato con 1 μL di colorante di carico nei pozzetti rimanenti nel gel.
12. Posiziona il gel nel sistema di imaging su gel e scatta una foto. Tagliare rapidamente le strisce di DNA sotto la luce ultravioletta e pesarle.
13. Aggiungere le strisce a una provetta da microcentrifuga e aggiungere un volume uguale di soluzione di PN. Tenere il tubo a bagnomaria a 50 °C fino a quando il gel non si sarà completamente sciolto.
14. Aggiungere 500 μl di BL liquido di equilibrio alla colonna di adsorbimento CA2, centrifugare a 13.400 x g per 1 minuto ed eliminare il surnatante.
15. Aggiungere la soluzione di gel disciolto alla colonna di adsorbimento CA2 e metterla a temperatura ambiente per 2 minuti, centrifugarla a 13.400 x g per 30 s ed eliminare il surnatante.
16. Aggiungere 600 μl di PW alla colonna di adsorbimento CA2, centrifugare a 13.400 x g per 1 minuto, scartare il surnatante e ripetere 1 volta.
17. Posizionare la colonna di adsorbimento CA2 in una provetta di raccolta, centrifugare a 13.400 x g per 2 minuti ed eliminare il surnatante.
18. Posizionare la colonna di adsorbimento CA2 a temperatura ambiente per 10 minuti per asciugarla completamente, quindi metterla in una provetta da centrifuga pulita.
19. Aggiungere 50 μl di tampone di eluizione EB al film di adsorbimento sospeso a temperatura ambiente per 2 minuti e raccogliere la soluzione di DNA mediante centrifugazione a 13.400 x g per 2 minuti.
    NOTA: Le soluzioni o i reagenti sopra menzionati sono inclusi nel Kit di Purificazione (vedi Tabella dei Materiali).
    1. Inviare la soluzione di DNA raccolta a un'azienda di sequenziamento professionale (vedere la tabella dei materiali) per il sequenziamento. Confronta i risultati del sequenziamento di Blast nel database GenBank di NCBI. In base all'omologia di sequenza, selezionare diversi ceppi e costruire alberi filogenetici con il metodo della massima verosimiglianza in MEGA-X per determinare le relazioni tra le specie dei ceppi.

Risultati

In questo esperimento, 48 ceppi di Bacillus sono stati isolati da feci fresche di suini sani, in numero da 1001 a 1048. Tra questi, 15 ceppi avevano attività antibatterica contro M. luteus. Dei 15 ceppi, i titoli di bacitracina sono stati misurati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione, come mostrato nella Tabella 1. Tra questi, B. licheniformis n. 1026 aveva il titolo di bacitracina più alto, 456,35 ± 21,75 U/mL, quindi il n. 1026 è stato selezionato per gli esperimenti successivi.

I risultati dell'identificazione da parte delle TLC sono mostrati nella Figura 2A. La posizione dei punti principali nel brodo di fermentazione del ceppo n. 1026 e nella soluzione standard di bacitracina era la stessa e il valore R_f era 0,61. Per l'analisi HPLC, l'equazione della curva standard della bacitracina è y = 50,287x - 250,55 e il coefficiente di correlazione R² = 0,9968 (Figura 2B). Il tempo di picco del surnatante di fermentazione era coerente con lo standard della bacitracina (Figura 2C), quindi la sostanza batteriostatica è stata identificata come bacitracina e il titolo di bacitracina era 456,35 ± 21,75 U/mL.

La colonia del ceppo n. 1026 è stata coltivata su terreno LB per 12 ore, come mostrato nella Figura 3A. La colonia era rotonda e trasparente a forma di goccioline d'acqua, con sporgenze complete e bordi netti. Da 12 h a 24 h, i batteri sono entrati nelle fasi successive della crescita. Come mostrato nella Figura 3B, le colonie si sono diffuse a forma di prugna, il centro si è piegato e il colore è gradualmente diventato bianco latte. È coerente con la descrizione della morfologia della colonia di B. licheniformis¹⁶. C'era un muco trasparente sul bordo. Dopo la colorazione di Gram, il ceppo n. 1026 è stato osservato al microscopio, come mostrato nella Figura 3C. Le cellule erano bastoncelli viola, che indicavano batteri Gram-positivi.

Come mostrato nella Tabella 2, il ceppo n. 1026 potrebbe crescere in un ambiente anaerobico. Il ceppo è risultato positivo al test V-P, all'utilizzo del citrato, alla riduzione dei nitrati e all'idrolisi dell'amido. Il ceppo è stato in grado di decomporsi e utilizzare la maggior parte delle fonti di carbonio. Aveva le stesse caratteristiche fisiologiche e biochimiche di B. licheniformis.

La dimensione del frammento di rDNA 16S del ceppo n. 1026 era di circa 1400 bp (Figura 4A). I risultati del sequenziamento del ceppo n. 1026 hanno mostrato una somiglianza del 99,58% con quelli di B. licheniformis DSM 13 in GenBank. L'albero filogenetico è stato quindi costruito, come mostrato nella Figura 4B. La lunghezza del ramo evolutivo di B. licheniformis DSM 13 è 0,000, indicando che si tratta di B. licheniformis.

Sulla base delle caratteristiche morfologiche, fisiologiche e biochimiche del ceppo n. 1026 e dell'analisi dell'omologia della sequenza genica dell'rDNA 16S, il ceppo n. 1026 è stato identificato come B. licheniformis.

Figura 1: Diagramma schematico dell'inoculazione del ceppo. L'anello di inoculazione è stato utilizzato per prelevare le colonie e per contrassegnarle a zig-zag sul terreno di prova dell'attività antibatterica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Identificazione delle sostanze batteriostatiche. (A) Cromatografia su strato sottile. (B) Curva standard HPLC della bacitracina. (C) Cromatogramma HPLC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Caratteristiche morfologiche e colorazione di Gram del ceppo n. 1026. Morfologia della colonia a (A) 12 h e (B) 24 h. (C) Colorazione di Gram. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Identificazione biologica molecolare del ceppo n. 1026. (A) Amplificazione genica del ceppo n. 1026 16S rDNA. (B) Albero filogenetico del ceppo n. 1026. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NO.	Titolo di bacitracina (U/mL)	NO.	Titolo di bacitracina (U/mL)
1003	423,57±18,62	1021	317.46±13.46
1004	325.82±13.23	1026	456,35±21,75
1009	326.26±14.52	1027	435.57±19.18
1011	376.65±16.11	1030	382,48±17,64
1015	325.27±12.37	1031	215.37±11.73
1016	256.56±15.37	1039	353.67±16.16
1017	352.47±16.47	1041	342.36±14.36
1018	328.73±16.12

Tabella 1: Il titolo di bacitracina dei ceppi di attività antibatterica.

Elementi	Risultati	Elementi	Risultati
Test di crescita anaerobica	+	Test del D-mannitolo	+
Saggio V.P	+	Test della gelatina	+
Test di utilizzo del citrato	+	Test del 7% di NaCl	+
Test del propionato	+	Test del pH 5,7	+
Test del D-xilosio	+	Test di riduzione dei nitrati	+
L-arabinosio	+	Test di idrolisi dell'amido	+

Tabella 2: Identificazione fisiologica e biochimica del ceppo n. 1026.

Discussione

B. licheniformis cresce rapidamente con condizioni di coltura semplici e un rapido consumo di zucchero, e la tecnologia di fermentazione matura è utile per risparmiare sui costi di produzione industriale¹³. L'ampia applicazione di B. licheniformis e delle sue secrezioni, la bacitracina, ha determinato il suo promettente valore di mercato. In agricoltura, B. licheniformis è impiegato come biofertilizzante per migliorare la crescita delle piante e l'assorbimento dei nutrienti migliorando la fertilità del suolo, promuovendo lo sviluppo delle radici e aiutando la degradazione della materia organica¹⁵. Per la produzione industriale di enzimi, B. licheniformis produce una gamma di enzimi come proteasi, amilasi, cellulasi e lipasi, che determinano il suo insostituibile valore di mercato nella lavorazione degli alimenti, nella produzione di detersivi, nella lavorazione del cuoio e nell'industria tessile¹⁶. In considerazione della superiore attività farmacologica antibatterica di B. licheniformis e bacitracina, è stato utilizzato in campo medico per trattare una varietà di malattie infettive indotte da batteri e funghi¹. Nel frattempo, considerando la crescita delle piante erbacee e l'accumulo di ingredienti farmacologicamente attivi nelle piante, B. licheniformis è un potenziale potenziatore della crescita delle piante nonché utile per la produzione di composti come il salidroside^17,18 derivato dalla rodiola. I vantaggi di cui sopra di B. licheniformis e bacitracina li rendono ampiamente utili nell'industria, nell'agricoltura, nell'acquacoltura, nelle biotecnologie e nelle industrie mediche. Pertanto, la separazione e la purificazione di B. licheniformis con un'alta resa di bacitracina è un fattore decisivo per garantire la successiva produzione e applicazione su larga scala.

Sebbene la bacitracina possa essere preparata per sintesi chimica, i passaggi sono ingombranti e ci sono molti sottoprodotti. Nell'industria, la bacitracina è prodotta principalmente dal processo metabolico secondario della farina di mais e della farina di soia fermentata da B. licheniformis. Nella moderna produzione industriale di bacitracina, l'alto costo e la bassa resa ne ostacolano l'ulteriore applicazione¹⁰. Pertanto, lo screening dei ceppi di bacitracina ad alto rendimento e il miglioramento del tasso di utilizzo delle materie prime sono la chiave per migliorare la produzione di bacitracina.

Attualmente, l'allevamento di ceppi di bacitracina ad alto rendimento avviene principalmente attraverso l'allevamento naturale dal suolo e da altri ambienti, l'allevamento per mutazione utilizzando ceppi esistenti che producono bacitracina o l'allevamento basato sull'ingegneria genetica. L'operazione di allevamento naturale è semplice e i ceppi selezionati hanno una capacità di produzione stabile, ma il processo richiede molto tempo e il carico di lavoro è elevato. L'allevamento per mutazione ha un alto tasso di mutazione e riduce il tempo di riproduzione, ma la mutazione potrebbe non essere in grado di essere ereditata stabilmente nelle generazioni successive¹⁶. L'allevamento basato sull'ingegneria genetica è più mirato per ottenere ceppi ad alto rendimento¹⁰, ma ci sono problemi di sicurezza causati dall'introduzione di geni esogeni. Le feci sane degli animali adulti contengono abbondanti risorse probiotiche in grado di mantenere l'equilibrio della flora.

In questo articolo, basato sulle caratteristiche di B. licheniformis di produrre spore dormienti in ambienti estremi¹⁹, la diluizione di feci di maiale sane è stata posta in un ambiente ad alta temperatura per uccidere i batteri e i funghi resistenti al calore che non producono spore. Poiché M. luteus è sensibile alla produzione di peptidi batteriostatici da parte di B. licheniformis nella fase avanzata della crescita e produce un pigmento giallo per una facile osservazione, viene utilizzato per lo screening dell'attività antibatterica in base alla valutazione della zona di inibizione. Secondo la morfologia della colonia simile alla morfologia di B. licheniformis, la morfologia cellulare è corta a forma di bastoncello, Gram-positivi, caratteristiche fisiologiche e biochimiche di B. licheniformis, l'RNA di 16 s è strettamente correlato a B. licheniformis, in modo da determinare che il ceppo n. 1026 è B. licheniformis. La sostanza batteriostatica è stata identificata da TLC e HPLC come bacitracina. Pertanto, è stato ottenuto B. licheniformis produttore di bacitracina. Questo metodo presenta anche dei difetti, come il processo di screening che richiede molto tempo e l'operazione che richiede una certa esperienza.

In sintesi, questo protocollo sperimentale ha introdotto in modo completo e dettagliato il processo di acquisizione e identificazione di laboratorio di routine di B. licheniformis, produttore di bacitracina, che ha un'ampia prospettiva di applicazione e un valore di mercato inestimabile²⁰. Questi metodi sono semplici, fattibili e facili da implementare, e senza dubbio saranno un riferimento efficace per la produzione su larga scala di B. licheniformis. Questo documento fornisce anche un'idea di screening per la produzione di ceppi per altri peptidi antimicrobici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2 &volte; Phanta Flash Master Mix	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanchino, Cina	P252-01
2kb Marcatore DNA	Beijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Pechino, Cina	BM121-01
Acetonitrile	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	A104443
Agar in polvere	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	A800730
Agarosio	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	A104062
Solfato di ammonio ((NH4)2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, Cina	10002917
sterilizzatore per autoclave	Zealway Instrument Inc., Xiamen, Cina	GI36DWS
Striscia di identificazione biochimica del bacillo	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, Cina	HBIG14
Bacitracin	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	B65740
	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pechino, Cina	DP209
Pellicola sigillante traspirante	Beijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.	BS-QM-01A
Butanolo	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	B433378
C18 (5 μ m, 4.6 & volte; 250 mm) Colonna HPLC	Rizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, Cina	C1805-462510
Carbonato di calcio (CaCO3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, Cina	10005717
Centrifuga	New Brunswick Scientific Co., Inc., Regno Unito	5452
Serbatoio cromatografico...	Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, Cina	P-1
Bottiglia conica	Sichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, Cina	18012
Incubatore a temperatura costante	Taist Instrument Co., Ltd., Tianjin, Cina	GH4500
Fosfato dipotassico (K2HPO4)	Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, Cina	XL0015
EDTA-2Na	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	E397526
Bilancia elettronica	Mettler Toledo International Co., Ltd.	FA2104
Alcool etilico	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	Kit di purificazione Midi E130059
Gel	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pechino, Cina	DP302
Asta di vetro	Chengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.	1294
Glucosio	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	di D823520
Gram	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, Cina	HB8278
Cromatografo liquido ad alte prestazioni	Agilent Technologies, Inc., California, America	1260
Apparecchio	per elettroforesi orizzontaleBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Pechino, Cina	DYCP-31DN BIOMATE
Anello di inoculazione	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Cina	3171026
Agitatore magnetico	Wiggens GmbH Co., Ltd., Germania	WH220 PLUS
Alcool metilico	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	M116115
Provetta per microcentrifuga	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Cina	1351171
Micrococcus luteus	Bena Culture Collection, Suzhou, Cina	BNCC102589
Membrana filtrante microporosa	Nantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.	PES0.22
Ninidrin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	N105629
Microscopio ottico	Strumento ottico Fabbrica, Shanghai, Cina	DYS-108
Feci di maiale	Nanjing Quanfu Pig Farm, Nanchino, Cina
Amplificatore di reazione a catena della polimerasi (PCR)	Suzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Suzhou, Cina	ETC811
Società di sequenziamento professionale	General Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, Cina
Piridina	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	P111516
Shaker	Taicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd., Taicang, Cina	Piastra
GF254	Yantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, Cina	HPT-HSGF5025023
Cloruro di sodio (NaCl)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	S805275
Citrato di sodio	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, Cina	C39197100001
Amido solubile	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	S817547
Termostato bagno d'acqua	Shanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Shanghai, Cina	DK-8D
Tryptone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	T139519
Ultra GelRed	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, Cina	GR501-01
Strumento per acqua ultra pura	Merck KGaA Co., Ltd., Germania	Milli Pulitore ad ultrasuoni Direct-Q8
	Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, Cina	SB-100DT
Calibro a corsoio.	Sanfeng Company, Giappone	N20P
Estratto di lievito in polvere	Vicbio Biotechnology Co., Ltd., Pechino, Cina	LP0021