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Articolo metodologico

Isolamento delle cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton e dei loro esosomi derivati/piccole vescicole extracellulari

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DOI:

10.3791/66778

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11 novembre 2025

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1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

In questo articolo

Sommario

Il tessuto del cordone ombelicale è una fonte ricca, prontamente disponibile e non invasiva di cellule staminali mesenchimali (MSC). In questo protocollo, vengono forniti passaggi dettagliati per l'isolamento e la caratterizzazione delle MSC della gelatina di Wharton umana (WJ-MSC), seguite da un semplice protocollo breve per isolare i loro esosomi derivati o piccole vescicole extracellulari.

Abstract

Nel campo della medicina rigenerativa, le cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno suscitato particolare attenzione. Le MSC del tessuto del cordone ombelicale (UC), note come gelatina di Wharton, sono state particolarmente ben consolidate in una varietà di applicazioni. Rispetto ad altre fonti di MSC, le MSC gelatinose di Wharton (WJ-MSC) offrono una serie di vantaggi e sono isolate dalla colite ulcerosa, che viene tipicamente smaltita come rifiuto sanitario. Le WJ-MSC, quindi, non sollevano alcuna questione etica simile a quelle relative alle cellule staminali embrionali. Una tecnica di espianto semplice e riproducibile è stata utilizzata per isolare le WJ-MSC dal tessuto UC. Entro cinque-dieci giorni dall'isolamento, le WJ-MSC emergono come cellule aderenti con una forma fibroblastica. Dopo essere state isolate, le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza in 14-18 giorni. Successivamente, nel passaggio 3, le WJ-MSC isolate sono state completamente caratterizzate inducendole a differenziarsi lungo le linee mesenchimali adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche. Inoltre, sono stati testati l'immunofenotipizzazione per i marcatori di superficie negativi del cluster di differenziazione (CD), tra cui CD34, CD14 e HLA-DR, nonché i marcatori distintivi della superficie MSC come CD105, CD90, CD73 e CD44. Inoltre, il reagente precipitante è stato utilizzato in un approccio semplice per isolare esosomi/piccole vescicole extracellulari (sEV) dal mezzo condizionato di quelle WJ-MSC. Dopo essere stati isolati, gli esosomi/sEV sono stati osservati al microscopio elettronico a trasmissione e l'analisi delle dimensioni delle particelle è stata utilizzata per calcolare la loro dimensione media. In sintesi, le WJ-MSC forniscono una fornitura prontamente disponibile, non invasiva e rinnovabile di cellule staminali che possono essere utilizzate come fabbriche per produrre esosomi/sEV. Queste WJ-MSC e i loro esosomi/sEV derivati possono essere utilizzati in un'ampia gamma di applicazioni terapeutiche e di ricerca a valle.

Introduzione

Solo pochi anni fa, si pensava che le cellule staminali avessero il ruolo principale in medicina 1,2. Tuttavia, la preoccupazione etica posta dalle cellule staminali embrionali (ESC) è stata un enorme ostacolo che ha ostacolato un rapido progresso nel campo3. Ciò ha suscitato molto interesse verso l'esplorazione di fonti rinnovabili alternative per le cellule staminali, in particolare quelle che possono essere isolate dopo la nascita dal cordone ombelicale (UC)4. La colite ulcerosa si unisce naturalmente alla placenta e al feto all'interno di una madre incinta. Il ruolo innato della CU è quello di nutrire il feto in crescita con un apporto di sangue continuo e sufficiente attraverso i vasi sanguigni e di garantire la protezione di questi vasi evitando ogni possibile torsione, compressione o attorcigliamento del feto durante il suo movimento5. Anatomicamente, la CU umana è costituita da due arterie e una vena che sono incorporate all'interno di un tessuto connettivo mucoide e racchiuse all'interno di uno strato esterno di epitelio amniotico6. La matrice UC, o il tessuto connettivo mucoide che racchiude i tre vasi ombelicali, è nota come "gelatina di Wharton" (WJ) ed è composta principalmente da proteoglicani e collagene7.

Recentemente, le cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno attirato molta attenzione essendo una nuova modalità terapeutica efficace per un'ampia gamma di applicazioni di medicina rigenerativa 7,8,9,10,11,12. Ciò che è più intrigante delle MSC è la loro facilità di isolamento, così come le dimostrate attività immunomodulatorie e la multipotenza 13,14,15. Altri vantaggi superiori delle MSC in generale, e di quelle derivate da WJ in particolare, sono che nessun teratomo si manifesta al momento del trapianto, a differenza delle ESC, e il fatto che mantengono la loro proprietà di staminalità anche dopo diversi passaggi cellulari16,17. Pertanto, ora si ritiene che le MSC potrebbero effettivamente fornire interventi terapeutici rivoluzionari per varie malattie 8,18,19. È importante sottolineare che nel 2006, l'International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) ha definito criteri minimi specifici per una corretta caratterizzazione delle MSC20. In primo luogo, quando vengono coltivate/coltivate in condizioni di coltura standard, le MSC dovrebbero essere aderenti alla plastica. In secondo luogo, le MSC devono esprimere alcuni marcatori caratteristici della superficie di differenziazione (CD) come CD90, CD105 e CD73 e non devono mostrare l'espressione di altri come CD14, CD34 e CD45. In terzo luogo, le MSC devono differenziarsi in linee osteogeniche, adipogeniche e condrogeniche in vitro20. Fino ad oggi, le MSC sono state isolate da più fonti, tra cui tessuti adulti come il midollo osseo (BM), il tessuto adiposo21, nonché fonti fetali/perinatali come la placenta, il sangue UC (UCB) e la matrice UC22,23. È interessante notare che, confrontando il tasso di successo per il prelievo di MSC, è stato riportato che raggiunge quasi il 100% dal tessuto WJ rispetto a solo il 6% circa da UCB24,25. Pertanto, sebbene l'UCB sia effettivamente una ricca fonte di cellule staminali ematopoietiche, è anche considerata una buona fonte di MSC, tuttavia significativamente inferiore a WJ 26,27,28.

Le WJ-MSC sono eccezionali se confrontate con altri tipi di MSC perché, sebbene siano vere e proprie (tipiche) MSCs, possedendo proprietà simili alle loro controparti adulte, possiedono anche l'espressione di vari marcatori di pluripotenza/ESC17,29. Di conseguenza, si ritiene che le WJ-MSC siano da qualche parte tra le cellule staminali adulte ed embrionali17. È interessante notare che è stato scoperto che le WJ-MSC esprimono sia marcatori di MSC umane che di ESC e sono in grado di mantenere la staminalità per diversi passaggi16. Fortunatamente, al momento del trapianto, non formano teratomi17. Ciò può essere chiarito dal loro profilo trascrittomico unico rispetto alle ESC, così come ad altre MSC29,30. Le WJ-MSC presentano vari vantaggi rispetto alle MSC adulte e persino rispetto ad altri tipi di cellule staminali in generale. I loro mezzi di isolamento sono prontamente disponibili, attraverso la UC che viene regolarmente scartata alla nascita, e quindi è considerata un rifiuto sanitario. Pertanto, a differenza delle ESC, le WJ-MSC non hanno preoccupazioni etiche e, a differenza delle BM-MSC, vengono isolate tramite una tecnica invasiva31. Inoltre, come altri tipi di MSC, le WJ-MSC mancano dell'espressione dell'antigene-D dei leucociti umani (HLA-DR), e in particolare è stato scoperto che esprimono l'antigene-G DEI LEUCOCITI umani (HLA-G), che fornisce loro un privilegio immunitario extra32. Ciò suggerisce che le WJ-MSC mostrano un ruolo immunosoppressivo simulando ciò che di solito avviene all'interfaccia feto-madre in vivo 33,34,35. Infine, come i loro analoghi isolati da UCB, le WJ-MSC hanno un grande potenziale per il settore bancario36. Alla luce di tutti questi vantaggi, le WJ-MSC sono quindi sostenute come il nuovo standard d'oro per le terapie basate sulle MSC30.

È interessante notare che molte ricerche hanno rivelato che le MSC mostrano i loro effetti terapeutici principalmente attraverso la segnalazione paracrina. In molti casi, è stato riportato che tali effetti si verificano in risposta a esosomi/piccole vescicole extracellulari (sEV) secrete dalle MSC37. Gli esosomi/sEV sono noti come vescicole bioattive di dimensioni nanometriche che vengono acquisite dal sistema endomembrana della cellula. Agiscono come navette trasferendo carichi specifici di proteine, mRNA, nonché RNA non codificanti come microRNA e RNA lunghi non codificanti (LncRNA), come un messaggio in bottiglia38. Di conseguenza, possono riprogrammare le cellule riceventi e sono indicati come "segnalomi" che manipolano le funzioni cellulari essenziali39. Gli esosomi/sEV derivati dalle MSC hanno dimostrato la loro superiorità rispetto alle terapie con MSC nell'essere una possibile alternativa priva di cellule. Analogamente alle MSC madri, è stato scoperto che gli esosomi/sEV suscitano effetti terapeutici e rigenerazione cellulare in diverse malattie. Tuttavia, a differenza delle loro cellule madri, possono attraversare più facilmente le barriere biologiche. Inoltre, sono privi di problemi critici per la sicurezza; Non comportano alcun rischio di rigetto immunitario o di formazione tumorale a lungo termine40. Inoltre, gli esosomi/sEV possono essere impiegati per applicazioni di terapia genica come mezzo di un sistema di somministrazione di farmaci, essendo naturalmente attrezzati per trasferire informazioni genetiche41. Pertanto, gli esosomi/sEV hanno effettivamente aperto nuove entusiasmanti strade per nuovi interventi terapeutici di varie malattie 42,43,44.

In questo protocollo, viene presentato un protocollo approfondito basato sull'espiante graduale per l'isolamento e la caratterizzazione di WJ-MSC da tessuto UC. Questo sarà seguito da un protocollo conciso per l'isolamento di esosomi/sEV da terreni condizionati di queste WJ-MSC.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti e le procedure sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate e sono stati approvati dai Comitati Etici sia della Facoltà di Farmacia, Università di Ain Shams, Cairo, Egitto (ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC# 220) che della Facoltà di Farmacia, The British University in Egypt, Cairo, Egitto (CL-2309). Le UC sono state ottenute dopo aver ottenuto il consenso informato firmato dai genitori.

1. Isolamento di WJ-MSC dal cordone ombelicale umano

  1. Mettere circa 30-40 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un contenitore (sacca di raccolta sigillata) per la raccolta del cordone ombelicale (UC) (lungo circa 15 cm) subito dopo il parto. Mantenere la UC raccolta su ghiaccio e lavorarla entro un massimo di 4-5 ore dalla raccolta.
    NOTA: Il campione non può essere processato dopo 4-5 ore, poiché ciò ridurrà notevolmente la resa delle MSC. Assicurarsi che il PBS e il contenitore siano sterili.
  2. Preparare terreni di coltura completi per WJ-MSC composti da Dulbecco's Modified Eagle Medium (LG-DMEM) a basso contenuto di glucosio integrati con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 2 mM di L-glutammina e 0,25 μg/mL di amfotericina B.
  3. Posizionare 3 mL di terreno completo per pozzetto in piastre a 6 pozzetti, quindi posizionare le piastre a 6 pozzetti con terreno in un incubatore di CO2 impostato a 37 °C e CO2 al 5% per riscaldarlo e prepararlo.
  4. Nella cabina di biosicurezza, preparare otto piastre per colture cellulari da 10 cm, ciascuna delle quali riempita con 10 ml di PBS sterile.
  5. Con attenzione, utilizzando una pinza sterilizzata, trasferire la colite ulcerosa dal sacchetto di plastica sigillato nella prima capsula di Petri contenente PBS per lavare via il sangue (ripetere questo passaggio fino a quando tutto il sangue non è stato lavato via dal campione).
  6. Spruzzare etanolo al 70% su un tampone sterile e utilizzarlo per pulire la colite ulcerosa per 30 secondi.
  7. Trasferire la UC in una nuova capsula di Petri riempita con PBS sterile per rimuovere eventuali residui di etanolo.
  8. Trasferire la UC in un'altra capsula di Petri precedentemente riempita con PBS sterile e usando le forbici sterili, tagliare la UC in pezzi più piccoli (circa 3 cm ciascuno). Quindi, sposta quei pezzi lunghi 3 cm in un'altra capsula di Petri con PBS sterile fresco per evitare il rilascio di sangue durante il processo di taglio.
    NOTA: Da questo momento in poi, i pezzi UC devono essere mantenuti sul ghiaccio, così come tutte le successive fasi di lavorazione. Questo è molto importante per evitare il rilascio di materia gelatinosa e garantire il successo della procedura di isolamento delle WJ-MSC dal tessuto UC. L'elaborazione delle UC raccolte entro un massimo di 4-5 ore è fondamentale per il successo del processo di isolamento. In precedenza, la UC veniva elaborata entro periodi più lunghi dopo la raccolta e, sfortunatamente, la procedura non mostrava risultati positivi (dati non mostrati).
  9. Inizia a lavorare i pezzi di UC uno per uno (con ghiaccio) in una capsula di Petri riempita con PBS sterile. Usa forbici e pinze sterili per tagliare i vasi sanguigni e isolare il tessuto gelatinoso di Wharton (WJ). Quindi posizionare i pezzi chiari di WJ in un'altra capsula di Petri riempita con PBS sterile su ghiaccio.
    NOTA: Durante l'isolamento del tessuto WJ dal pezzo di CU, la prima incisione viene eseguita sul lato chiaro del pezzo di CU, lontano dai vasi sanguigni, per evitare di tagliare il vaso. Successivamente, i vasi sanguigni vengono bloccati, tagliati e tirati via.
  10. Ripetere il passaggio precedente su tutti i pezzi di CU per ottenere un tessuto WJ chiaro senza vasi sanguigni.
    NOTA: Sostituire la capsula di Petri PBS, se necessario, durante l'elaborazione dei pezzi di colite ulcerosa e la rimozione dei vasi sanguigni, se la soluzione di PBS diventa sanguinolenta o poco chiara durante l'isolamento del tessuto WJ.
  11. Lavare i pezzi di WJ raccolti con PBS trasferendoli in una fresca piastra di coltura cellulare da 10 cm riempita con PBS sterile.
  12. Usa un bisturi sterile e affilato e una pinza per tagliare i tessuti WJ raccolti in piccoli pezzi lunghi 10 mm.
  13. Trasferire i pezzi WJ nelle piastre a 6 pozzetti precedentemente preparate al punto 1.3. Posizionare 5-6 pezzi di WJ per pozzetto, quindi incubare le piastre a 6 pozzetti contenenti espianti di tessuto WJ in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 a 37 °C nell'incubatore di CO2 e lasciare indisturbate per 3 giorni.
  14. Il 4° giorno dall'inserimento degli espianti di tessuto WJ, aggiungere con cura 1 mL di terreno per pozzetto, facendo attenzione a non disturbare gli espianti.
    NOTA: Evitare di toccare o graffiare la parte inferiore della piastra dove sono fissati i pezzi WJ.
  15. Ripetere il passaggio precedente il 6° giorno dopo aver posizionato gli espianti di tessuto WJ.
  16. L'8° giorno dopo il posizionamento degli espianti di tessuto WJ (cioè quasi 1 settimana dopo il posizionamento dell'espianto), iniziare a cambiare metà del terreno per pozzetto a giorni alterni fino al 12°-14° giorno dopo il posizionamento dell'espianto. Riposizionare metà del terreno di coltura da ciascun pozzetto rimuovendo circa 2,5 ml da ogni pozzetto e aggiungendo 2,5 ml freschi di terreno caldo completo (37 °C).
    NOTA: Estrarre il supporto dalla superficie del pozzetto ed evitare di toccare o graffiare il fondo della piastra dove sono attaccati i pezzi WJ. Le WJ-MSC di solito compaiono sotto e intorno agli espianti di tessuto WJ entro 5-10 giorni dopo il posizionamento degli espianti.
  17. Osservare regolarmente le piastre a 6 pozzetti al microscopio invertito (ingrandimento 10x) e, se le cellule rilasciate proliferano e la loro confluenza aumenta, raggiungendo il 50-60%, procedere al passaggio successivo; In caso contrario, ripetere il passaggio 1.16. di nuovo. I pezzi WJ si riducono significativamente di dimensioni nel tempo.
  18. Rimuovere delicatamente gli espianti di WJ attaccati al fondo dei pozzetti e rimuovere tutto il terreno. La rimozione dei pezzi di espianti WJ viene solitamente eseguita il 12-14° giorno dal loro posizionamento iniziale.
    NOTA: Inclinare leggermente le piastre con un angolo di 45° durante la rimozione del supporto per assicurarsi che tutti i supporti vengano rimossi.
  19. Lavare ogni pozzetto con 2 ml di PBS, agitare delicatamente la piastra e quindi scartare PBS. Ripetere questa fase di lavaggio due volte.
    NOTA: Aggiungere delicatamente PBS alla parete del pozzetto ed evitare di toccare il fondo dei pozzetti per garantire che le celle non disturbino affatto.
  20. Aggiungere delicatamente 2 mL di terreno completo caldo per pozzetto (terreno con composizione esatta come quella descritta al punto 1.2) e incubare le piastre a 6 pozzetti in condizioni umidificate con il 5% di CO2 a 37 °C.
  21. Cambiare completamente il terreno a giorni alterni (2 mL di terreno completo per pozzetto) fino a quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza.
  22. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, passare le cellule utilizzando tripsina-EDTA a fiasche di coltura cellulare T25 (le cellule totali ottenute da una piastra a 6 pozzetti possono essere passate a una fiaschetta di coltura T25, utilizzare 8-9 ml di terreno completo per fiaschetta T25). Queste WJ-MSC sono indicate come cellule P1.
    NOTA: Non lasciare le cellule troppo a lungo con Tripsina-EDTA per evitare effetti tossici; Di solito, 3 minuti sono sufficienti per il distacco delle cellule. Diversi fornitori possono fornire tripsina-EDTA con potenza variabile. Di conseguenza, questo deve essere considerato quando si specifica il tempo di incubazione.
  23. Cambia i media a giorni alterni. Una volta che le cellule hanno raggiunto circa l'80% di confluenza, passare le cellule utilizzando tripsina-EDTA a fiasche di coltura cellulare T75 (le cellule totali ottenute da una fiaschetta di coltura T25 possono essere passate a una fiaschetta di coltura T75; utilizzare 15-18 mL di terreno completo per pallone T75); queste WJ-MSC sono indicate come cellule P2.
  24. Cambia i media a giorni alterni. Una volta che le cellule hanno raggiunto circa l'80% di confluenza, staccare le cellule usando tripsina-EDTA, quindi seminare le WJ-MSC a una densità di circa 0,75 x 106-1 x 106 cellule per matraccio T75. Queste WJ-MSC sono indicate come cellule P3.
    NOTA: Utilizzare le celle tra P3 e P5 per esperimenti futuri descritti in questo protocollo.
  25. Crioconservare le WJ-MSC isolate in azoto liquido utilizzando terreni di crioconservazione composti per l'80% da FBS, per il 10% da terreni completi (come descritto al passaggio 1.2) e per il 10% da dimetilsolfossido (DMSO).
    NOTA: Nella Figura 1 viene fornita una presentazione schematica di tutti i passaggi per l'isolamento delle WJ-MSC.

2. Caratterizzazione di WJ-MSC isolate mediante immunofenotipizzazione mediante analisi citofluorimetrica per vari marcatori di superficie di CD

  1. Staccare le cellule utilizzando la tripsina-EDTA al passaggio 4. Lavare due volte le cellule con PBS e contarne il numero utilizzando un emocitometro.
    NOTA: Un tempo di incubazione minimo (per 3 minuti) durante la tripsinizzazione è fondamentale per staccare con successo le cellule senza esercitare alcun danno. L'incubazione prolungata con tripsina-EDTA potrebbe danneggiare i marcatori della superficie cellulare e influenzare negativamente i risultati del test di immunofenotipizzazione.
  2. Incubare circa 100.000 cellule (in condizioni di oscurità) per 20 minuti a 4 °C con anticorpi monoclonali umani marcati con ficoeritrina (PE) o isotiocianato di fluoresceina (FITC) come segue: Anti-CD90 PE, Anti-CD73 PE, Anti-CD105 FITC, Anti-CD44 PE, Anti-CD34 PE, Anti-CD14 PE e Anti-HLA-DR FITC e utilizzare cellule non colorate come controlli
  3. Sciacquare le cellule con PBS e risospenderle successivamente in 500 μL di tampone FACS; Analisi mediante citometria a flusso45.

3. Valutazione del potenziale di differenziamento di WJ-MSC isolate verso varie linee mesenchimali

  1. Differenziazione adipogenica
    1. Risospendere le cellule in un mezzo di proliferazione completo (come descritto al punto 1.2). Successivamente, coltivare le cellule a una densità di 3,7 x 104 cellule/pozzetto (0,5 mL di terreno/pozzetto) in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Quindi, incubare in condizioni umidificate al 5% di CO2 a 37 °C. Successivamente, a giorni alterni, cambia il mezzo fino a quando le celle raggiungono quasi il 100% di confluenza; Questo di solito richiede circa 3-4 giorni.
    2. Rimuovere il mezzo di proliferazione e sostituirlo con un mezzo di differenziazione adipogenico per indurre l'adipogenesi. Completare il terreno LG-DMEM con 100 μg/mL di streptomicina, 100 U/mL di penicillina, 0,25 μg/mL di amfotericina B e l'integratore adipogenico fornito nel kit di identificazione funzionale delle cellule staminali mesenchimali. Successivamente, cambiare delicatamente il terreno (0,5 mL/pozzetto) ogni 3 giorni ed evitare l'interruzione dei vacuoli lipidici.
    3. Dopo circa 21 giorni, mediante esame microscopico, colorare i vacuoli lipidici con Oil Red per valutare la differenziazione adipogenica.
    4. Preparare una soluzione madre fresca di Olio Rosso; sciogliere 30 mg di Olio Rosso colorante in 10 mL di isopropanolo e riposare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, preparare una soluzione di lavoro mescolando 2 parti di acqua a doppia distillazione (ddH2O) con 3 parti di soluzione madre, mescolandole bene e lasciandole riposare per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, filtrare con un filtro da 0,22 o 0,45 μm.
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati di colorazione, preparare nuovamente la macchia Oil Red.
    5. Per una corretta documentazione della differenziazione adipogenica, lavare le cellule due volte con PBS e fissarle con formalina al 10% tamponata neutra (0,75 mL/pozzetto) per 15 minuti. Successivamente, lavare le cellule due volte con PBS utilizzando 1 mL/pozzetto (prima di scartare il PBS dopo ogni lavaggio, incubare le cellule per circa 5 minuti).
      NOTA: Le cellule mantenute nei mezzi di proliferazione (descritte nella fase 1.2) sono utilizzate come cellule di controllo, non indotte. Aggiungere lentamente formalina tamponata neutra alle pareti, non direttamente sulle cellule, per evitare danni cellulari. Dopo il lavaggio finale con PBS, l'aspirazione completa di PBS è fondamentale prima di aggiungere la soluzione di lavoro per la colorazione Oil Red per evitare macchie inefficienti.
    6. Dopo il lavaggio finale, colorare le cellule (1 mL/pozzetto) con la soluzione di lavoro Oil Red e incubarle per 60 minuti a 37 °C. Successivamente, prelevare e scartare la soluzione colorante e sciacquare delicatamente le cellule due volte con PBS. Quindi, al microscopio, osservare le goccioline lipidiche colorate.
  2. Differenziamento osteogenico
    1. Risospendere le cellule in un mezzo di proliferazione completo (come descritto al punto 1.2). Successivamente, in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti, seminare 7,4 x103 cellule/pozzetto (aggiungere 0,5 mL di terreno/pozzetto) e incubarle per 3 giorni in condizioni umide al 5% di CO2 a 37 °C per raggiungere quasi il 70% di confluenza.
    2. A circa il 70% di confluenza, sostituire i terreni di proliferazione con terreni di induzione della differenziazione che incorporano l'integratore osteogenico - fornito nel kit di identificazione funzionale delle cellule staminali mesenchimali - in terreni LG-DMEM integrati con il 10% di FBS, insieme a 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 2 mM di L-glutammina e 0,25 μg/mL di amfotericina B.
    3. Sostituire il mezzo di differenziazione una volta ogni 3 giorni e continuare l'induzione osteogenica per circa 21 giorni.
    4. Preparare una soluzione funzionante di colorazione rosso alizarina S; portare 9 mL di ddH2O e sciogliervi 200 mg di colorante Alizarin Red S, quindi utilizzare idrossido di ammonio e HCl per regolare il pH a 4,1-4,3. Quindi, completare il volume a 10 mL con ddH2O. Successivamente, filtrare la soluzione utilizzando un filtro (0,22 o 0,45 μm) per rimuovere eventuali precipitati.
    5. Al termine del periodo di induzione, sciacquare due volte le cellule con PBS, quindi fissarle con formalina neutra tamponata al 10% (0,75 mL/pozzetto) e lasciarle riposare per 15 minuti. Successivamente, sciacquare le cellule due volte utilizzando PBS (1 ml/pozzetto) e assicurarsi di incubare le cellule per 5 minuti ad ogni risciacquo.
      NOTA: Le cellule mantenute nei mezzi di proliferazione (descritte nella fase 1.2) sono utilizzate come cellule di controllo, non indotte.
    6. Aggiungere la soluzione di lavoro al 2% di Alizarina-Rosso S preparata al punto 3.2.4 alle cellule fissate del passaggio precedente e incubare al buio per circa 45-60 minuti a temperatura ambiente.
    7. Successivamente, scartare la soluzione colorante e sciacquare le cellule con ddH2O due volte e poi con PBS una volta, quindi valutare il successo della differenziazione osteogenica al microscopio osservando la matrice extracellulare ricca di calcio colorata.
  3. Differenziazione condrogenica
    1. Risospendere le cellule in un mezzo di proliferazione completo (come descritto al punto 1.2). Successivamente, in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti, seminare 7,4 x 103 cellule/pozzetto (aggiungere 0,5 mL di terreno/pozzetto) e incubarle in condizioni umide al 5% di CO2 a 37 °C per 3 giorni per raggiungere quasi il 90% di confluenza.
    2. A circa il 90% di confluenza, iniziare a indurre la differenziazione condrogenica utilizzando DMEM/F12 privo di siero integrato con insulina-transferrina selenio (ITS) e integratore condrogenico - fornito con il kit di identificazione funzionale delle cellule staminali mesenchimali - insieme a 0,25 μg/mL di amfotericina B, 100 U/mL di penicillina, 2 mM di L-glutammina e 100 μg/mL di streptomicina46.
      NOTA: Il mezzo di induzione della differenziazione condrogenica completo viene mantenuto al buio a 2-8 °C.
    3. Continuare l'induzione della differenziazione condrogenica per circa 21 giorni; Nel frattempo, cambia i media ogni 3 giorni.
    4. Preparare la soluzione di lavoro per la colorazione Alcian Blue come segue: Innanzitutto, preparare acido acetico glaciale al 3% in ddH2O (aggiungere 3 mL di acido acetico glaciale e riempire fino a 100 mL con ddH2O). Quindi, preparare una soluzione di lavoro per colorante Alcian Blue aggiungendo da 20 mg a 20 mL di soluzione di acido glaciale al 3%, mantenendola ferma per circa 30 minuti e successivamente filtrando con un filtro da 0,22 μm o 0,45 μm per rimuovere eventuali precipitati.
    5. Al termine del periodo di induzione, sciacquare due volte le cellule con PBS, quindi fissarle con formalina tamponata neutra al 10% (0,75 mL/pozzetto) e lasciarle riposare per 15 minuti. Successivamente, lavare le cellule due volte utilizzando PBS (1 mL/pozzetto). Assicurarsi di incubare le cellule per 5 minuti ogni volta.
      NOTA: Le cellule mantenute nei mezzi di proliferazione (come descritto nella fase 1.2) sono utilizzate come cellule di controllo, non indotte.
    6. Incubare le cellule fissate nella soluzione di lavoro preparata con blu di Alciano allo 0,1% per circa 60 minuti a 37 °C. Sciacquare le celle con ddH2O due volte e con PBS una volta per rimuovere la macchia residua. Quindi, utilizzando l'esame microscopico, osservare i proteoglicani solfatati colorati.

4. Isolamento di esosomi/sEV da terreni condizionati WJ-MSC

  1. Risospendere le WJ-MSC in un terreno di proliferazione completo (come descritto nella fase 1.2) e seminare piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti con queste WJ-MSC a una densità di 150.000 cellule/pozzetto (2 mL di terreno/pozzetto) e incubarle a 37 °C in condizioni umide al 5% di CO2.
  2. Preparare i terreni di raccolta degli esosomi privi di siero (SF) come segue: Dulbecco's Modified Eagle Medium (LG-DMEM) a basso contenuto di glucosio integrato con 2 mM di L-glutammina, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 0,25 μg/mL di amfotericina B.
    NOTA: Il terreno di raccolta degli esosomi ha la stessa composizione del terreno di proliferazione completo (descritto nel passaggio 1.2) ma senza FBS.
  3. Seguire le piastre a 6 pozzetti (preparate al punto 4.1) e sostituire il terreno a giorni alterni utilizzando il mezzo di proliferazione (come descritto nel passaggio 1.2). Osservare le cellule al microscopio fino a raggiungere circa il 75-80% di confluenza.
  4. Quando si raggiunge la confluenza del 70%, lavare le cellule due volte con PBS (1 mL/pozzetto), quindi aggiungere terreni di raccolta degli esosomi privi di siero (SF) (1,5 mL/pozzetto) (descritti al punto 4.2) e incubare per 48 ore a 37 °C in condizioni umide al 5% di CO2.
  5. Dopo 48 ore, raccogliere i terreni condizionati con WJ-MSC dalle piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti posizionate nella fase precedente in provette di raccolta per centrifugazione da 15 mL. Quindi, eseguire le seguenti fasi sequenziali di centrifugazione e filtrazione per eliminare il mezzo condizionato raccolto47.
    NOTA: Utilizzando il colorante di esclusione blu di tripano seguito dal conteggio delle cellule utilizzando l'emocitometro, valutare la percentuale di vitalità delle cellule inizialmente utilizzate per derivare i terreni condizionati raccolti; Le cellule vitali dovrebbero idealmente essere superiori al 90%. Successivamente, conservare il pellet di cella raccolto a -80 °C nel caso in cui sia necessario per eventuali indagini future.
    1. Centrifugare il terreno condizionato raccolto a 300 x g per 10 minuti a 4 °C per eliminare eventuali celle sospese. Quindi, raccogliere il surnatante ed eseguire la fase successiva di centrifugazione per questo surnatante raccolto (terreno condizionato).
    2. Centrifugare il terreno condizionato ottenuto dalla fase 4.5.1 a 3000 x g per 15 minuti a 4 °C per eliminare le cellule necrotiche e i detriti cellulari.
      NOTA: Le fasi di centrifugazione vengono eseguite preferibilmente a 4 °C, ma possono essere eseguite anche a temperatura ambiente con risultati simili.
    3. Filtrare il surnatante ottenuto dal passaggio precedente facendolo passare attraverso un filtro da 0,22 μm in una nuova provetta di polipropilene da 50 mL per eliminare eventuali detriti cellulari residui e vescicole extracellulari di grandi dimensioni.
      NOTA: Il terreno condizionato filtrato può essere immediatamente utilizzato per le fasi successive per isolare gli esosomi/sEV, conservato in frigorifero a 4 °C e utilizzato per non più di 3 giorni, oppure conservato a -80 °C per la conservazione a lungo termine fino a quando non è necessario isolare gli esosomi/sEV. Si preferisce trattare il terreno condizionato chiarificato conservato a -80 °C entro una durata massima di 1-3 mesi; Prima è, meglio è.
  6. Introdurre 7,5 mL di terreno condizionato chiarificato (ottenuto dal passaggio 4.5) in una provetta da centrifuga da 15 mL e aggiungere 1,5 mL di reagente. Aggiungere il reagente al terreno in un rapporto 1:5 (ad esempio, 1 mL di reagente precipitante Exoquick-TC per ogni 5 mL di terreno). Successivamente, capovolgere il tubo su e giù e sbatterlo più volte per garantire una corretta miscelazione del reagente precipitante con il fluido.
    NOTA: Il reagente precipitante è un reagente pesante e viscoso. In tal modo, il volume richiesto deve essere prelevato lentamente e con attenzione per garantire che il volume previsto venga trasferito completamente.
  7. Conservare la provetta con il mezzo con il reagente precipitante a 4 °C in posizione eretta per una notte per circa 16 ore (almeno 12 ore).
  8. Il giorno successivo, centrifugare la miscela di terreno/reagente precipitante a 1500 x g per 30 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, il pellet di esosomi/sEVs appare come un pellet bianco o beige molto piccolo che si è depositato sul fondo della provetta.
    NOTA: Questa fase di centrifugazione può essere eseguita anche a temperatura ambiente con risultati simili. Nel caso in cui il pellet di esosoma/sEVs non sia visibile alla fine di questa fase di centrifugazione, è possibile aggiungere un ulteriore tempo di centrifugazione a 3000 x g per ulteriori 20-30 minuti a 4 °C. A volte il pellet di esosomi/EV rimane invisibile anche dopo il tempo di centrifugazione prolungato, il che significa che c'è una piccola quantità di esosomi/sEV. In questo caso, procedere con il protocollo lasciando i 5-10 μL inferiori della provetta.
  9. Aspirare il surnatante e centrifugare la miscela di terreno residuo/reagente precipitante a 1500 x g per 5 minuti a 4 °C. Quindi, con molta attenzione, aspirare le tracce rimanenti di liquido senza disturbare il pellet di esosomi/sEVs precipitato.
  10. Sospendere il pellet di esosomi/sEVs in 100-300 μL di PBS sterile in base alle dimensioni e alla visibilità del pellet. Successivamente, questi esosomi/sEV possono essere immediatamente utilizzati o conservati in un ultra-congelatore a -80 °C per esperimenti successivi.
    NOTA: Nel caso in cui si inizi con più di una provetta da centrifuga per lo stesso terreno (descritto al punto 4.9) e gli esosomi/pellet di sEV (ottenuti al punto 4.10) siano invisibili, gli esosomi/pellet di sEV raccolti da tutti possono essere raggruppati utilizzando circa 100-300 μL di PBS sterile per sospenderli tutti raggruppati insieme.
  11. Quantificare gli esosomi/sEV raccolti in relazione al loro contenuto proteico utilizzando un kit di quantificazione proteica dell'acido bicinconninico (BCA) disponibile in commercio, come dichiarato dal produttore.
    NOTA: Nella Figura 2 viene fornita una presentazione schematica di tutte le fasi di isolamento degli esosomi/sEV derivati da WJ-MSCs.

5. Imaging di esosomi/sEV isolati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

  1. Sospendere gli esosomi/sEV appena isolati in 100-300 μL di PBS sterile in base alle dimensioni e alla visibilità del pellet (come descritto in precedenza al punto 4.11).
    NOTA: È di gran lunga preferibile utilizzare esosomi/sEV appena isolati piuttosto che congelati per l'imaging TEM
  2. Pipettare 20 μl di sospensione di esosomi/sEVs su una griglia rivestita di carbonio e lasciare asciugare per 10 minuti.
  3. Fissare gli esosomi/sEV posizionati utilizzando una soluzione di glutaraldeide (2% in acqua distillata) per circa 15 minuti.
  4. Successivamente, colorare gli esosomi/sEV fissati con acetato di uranile al 2% e lasciarli per circa 3 minuti al buio, quindi esaminarli al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) (ingrandimento 20000) utilizzando le impostazioni TEM predefinite.

6. Determinazione della dimensione media di esosomi/sEV isolati utilizzando un analizzatore granulometrico

  1. Diluire gli esosomi/sEV appena isolati con PBS sterile pH 7,4 in un rapporto di 1:250.
  2. Misurare la distribuzione granulometrica media di esosomi/sEV isolati utilizzando un analizzatore granulometrico a 25 °C.

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Risultati

Isolamento e caratterizzazione di WJ-MSCs

Come dimostrato nella Figura 3, piccole cellule simili a fibroblasti sono apparse inizialmente sotto e intorno ai tessuti di espianti di WJ entro 5-10 giorni dalla semina di tali espianti (Figura 3A). Queste WJ-MSC rilasciate continuano a proliferare e di solito raggiungono circ...

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Discussione

In questo protocollo, siamo stati in grado di presentare passaggi dettagliati per isolare le WJ-MSC dal tessuto UC umano e anche per isolare i loro esosomi/sEV derivati. L'UC è una fonte non invasiva facilmente raggiungibile e non sfruttata per ottenere MSC e non sono necessarie attrezzature speciali per la raccolta o l'elaborazione 11,15,30,32,48.

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Dichiarazioni

Tutti i coautori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi associato a questo lavoro.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dall'Università di Ain Shams - Strategic Plan Research Support Grant (2024/2025), Egitto, e dal Nanotechnology Research Center (NTRC) - Access Award (2019/2020), The British University in Egypt (BUE), Cairo, Egitto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, USAA3157
Alizarin Red SSigma-Aldrich, USAA5533
Idrossido di ammonioFisher Scientific, Germania1336-21-6
Anticorpo per CD-105 umano, FITCR& D systems Inc., MN, USAFAB10971F
Anticorpi per CD-14, PE umanoBeckman Coulter, USAIM0650U
Anticorpo per l'umano CD-34, PEBeckman Coulter, USAIM1420
Anticorpo per CD-44 umano, PEBeckman Coulter, USAA32537
Anticorpi per CD-73, PE umanoR& D systems Inc., MN, USAFAB5795P
Anticorpo per l'umano CD-90, PER& D systems Inc., MN, USAFAB2067P
Anticorpo per l'HLA-DR UMANO, FITCBeckman Coulter, USAIM1638U
Kit di quantificazione delle proteine dell'acido bicinconinico (BCA)Thermofisher23227
Cabina di biosicurezza, flusso laminare, MSC AdvantageThermo Scientific, USA
CO2 Incubatore, Forma DirettaThermo Scientific, USA
Centrifuga di raffreddamentoSigma, Germania
Centrifuga di raffreddamentoEppendorf, Germania
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman Coulter, FL, USA
Dimetilsolossido (DMSO)Fisher Scientific, GermaniaBP231-100
DMEM - Glucosio basso 1 g/LLonza, Svizzera12-707F
DMEM/F12 Lonza, Svizzera12-719F
Acqua senza DNAsi/RNAsiGibco Thermo Fisher, USA10977-035
Etanolo assoluto, grado biologia molecolareSigma-Aldrich, Germania24103
ExoQuick-TCBioscienze dei Sistemi (SBI), USAEXOTC50A-1Agente precipitante
Siero Fetale Bovino (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brasile10270-106
Formaldeide 37%Fisher ScientificBP531-500
Acido acetico glacialeSigma Aldrich, GermaniaA38S-500
Soluzione di glutaraldeide  SigmaG7776
Acido cloridrico (HCl)Fisher Scientific, GermaniaA144-212
Microscopio rovesciatoOlympus, Giappone
L-GlutamminaGibco Thermo Fisher, USA25030-024
Kit di identificazione funzionale delle cellule staminali mesenchimali  R& D systems Inc., MN, USASC006
Lettore di microplaccheCromate, Awareness Technologies, USA
Macchia Rossa OliosaSigma-Aldrich, USAO0625
Penicillina-Streptomicina-AnfotericinaGibco Thermo Fisher, USA15240062
Soluzione salina tamponata con fosfato, 1x, senza Ca/MgLonza, SvizzeraBE17-516F
Bagno d'acqua scuotendoDaihan Wisebath, Corea
Filtro a siringa, 0,2 micronCorning, USA431224
Microscopio elettronico a trasmissioneJEM-1200EX II, Jeol, Germania
Trippan blu & nbsp;Gibco Thermo Fisher, USA15250061
Tripsina-Versene-EDTA, 1xLonza, SvizzeraCC-5012
Soluzione di acetato di uranile (2%)Electron Microsopy Sciences, USA22400-2
Spettrofotometro UV-VisibileShimadzu, Giappone
VorticeSciLogex
Zeta-sizer Nano ZNMalvern Panalytical Ltd, Regno Unito & nbsp;Analizzatore delle dimensioni delle particelle

Riferimenti

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