Questo articolo descrive un protocollo sperimentale dettagliato per misurare il contenuto di carbonio dei macrofagi delle vie aeree con l'obiettivo di valutare la dose di esposizione interna a livello di esposizione individuale al particolato.
Articolo metodologico
Misurazione del contenuto di carbonio nei macrofagi delle vie aeree esposti a particelle contenenti carbonio
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I macrofagi polmonari mostrano un pattern dose-dipendente nelle particelle fagocitanti. Dopo l'inghiottimento, questi macrofagi vengono successivamente escreti con l'espettorato, rendendo i macrofagi e le particelle visibili e quantificabili al microscopio ottico. In particolare, il carbonio elementare all'interno del corpo dei mammiferi proviene esclusivamente da contaminanti esterni. Di conseguenza, il contenuto di carbonio nei macrofagi delle vie aeree (CCAM) funge da valido biomarcatore di esposizione, stimando con precisione l'esposizione individuale al particolato (PM) contenente carbonio. Questo articolo delinea un protocollo che coinvolge la raccolta, la conservazione, l'elaborazione, la preparazione e la colorazione dei vetrini dell'espettorato, nonché l'acquisizione e l'analisi delle foto dei macrofagi. Dopo aver rimosso i nuclei dei macrofagi, è stata calcolata la proporzione di area del citoplasma occupata dalle particelle di carbonio (PCOC) per quantificare il contenuto di carbonio in ciascun macrofago. I risultati indicano un aumento dei livelli di CCAM dopo l'esposizione a PM contenente carbonio. In sintesi, questo metodo non invasivo, preciso, affidabile e standardizzato consente la misurazione diretta di particelle di carbonio all'interno di cellule bersaglio e viene utilizzato per la quantificazione su larga scala di singole CCAM attraverso l'espettorato indotto.
Introduzione
L'inquinamento atmosferico è associato a decessi dovuti a malattie respiratorie e cardiovascolari, che rappresentano una grave minaccia per la salute umana 1,2. I dati epidemiologici indicano che l'esposizione cronica al particolato ambientale di diametro inferiore o uguale a 2,5 μm (PM2,5) è responsabile della morte prematura di 4-9 milioni di persone in tutto il mondo. Il PM2,5 è stato classificato come il quinto fattore di rischio più importante per la mortalità globale nel 2015 Global Burden of Disease, Injuries, and Risk Factors Study (GBD)3,4,5,6. Gli studi hanno scoperto che l'adesione alle linee guida dell'OMS sull'inquinamento atmosferico potrebbe prevenire 51.213 decessi all'anno per esposizione al PM2,53. Attualmente, la maggior parte degli studi non ha la valutazione dell'esposizione intra-individuale e si basa solo su valutazioni grezze in siti di monitoraggio regionali più grandi, che sono lontani dai livelli di esposizione individuale. I biomarcatori disponibili dell'esposizione interna, come gli IPA urinari e il benzo(a)pirene, non riflettono le associazioni tra l'esposizione al particolato e gli effetti sulla salute 7,8,9. Ciò porta all'incapacità di stabilire una relazione accurata con gli effetti sulla salute. Pertanto, la ricerca di marcatori che riflettano il livello di esposizione al particolato in un individuo è una delle chiavi per una valutazione accurata dell'esposizione per gli individui.
Le particelle inalate nei bronchi possono essere espulse con l'espettorato attraverso le oscillazioni ciliari nei bronchi. La mancanza di un sistema di trasporto del flusso mucoso ciliato negli alveoli significa che la via primaria di eliminazione per le particelle che entrano negli alveoli avviene attraverso la fagocitosi e la traslocazione da parte dei macrofagi10,11. In base alla struttura anatomica del polmone, la sua eliminazione dal particolato estraneo insolubile è lenta. Ciò consente al particolato di interagire con le cellule polmonari per periodi prolungati e di avviare vari effetti biologici, causando danni al tessuto polmonare e ad altri organi12,13. La stimolazione da parte del particolato porta all'attivazione dei macrofagi, innescando una cascata di fattori infiammatori nei polmoni che possono causare una risposta infiammatoria sistemica14. Considerando il ruolo cruciale della citofagia dei macrofagi nell'elicitamento di tempeste di citochine nei polmoni, si teorizza che le particelle di carbonio dei macrofagi polmonari potrebbero riflettere la dose biologicamente efficace di esposizione al particolato nucleato di carbonio nell'aria15. Inoltre, poiché non vi è aggregazione di carbonio elementare nelle cellule di mammifero e le particelle contenenti carbonio possono essere osservate come particolato nero al microscopio ottico, la raccolta di macrofagi alveolari e bronchiali e la misurazione del contenuto di carbonio in essi contenuti possono fungere da marcatore per valutare l'esposizione al particolato16.
Questo studio ha identificato un metodo per valutare con precisione i livelli di esposizione individuale al particolato, noto come contenuto di carbonio dei macrofagi delle vie aeree (CCAM). In particolare, i campioni di espettorato della popolazione sono stati raccolti dopo che i partecipanti hanno inalato la soluzione salina ipertonica generata da un nebulizzatore a ultrasuoni. Questi campioni sono stati poi conservati utilizzando una soluzione fissativa. I macrofagi delle vie aeree sono stati isolati, colorati e fotografati al microscopio ottico per identificare i macrofagi contenenti particelle contenenti carbonio, che sono state poi quantificate. Questo metodo fornisce un marcatore biologico per valutare con precisione i livelli di esposizione individuale al particolato. Stabilisce una base metodologica per studiare la relazione tra l'esposizione al particolato e gli effetti sulla salute, fungendo da base di ricerca per esplorare le associazioni tra l'esposizione al particolato e gli esiti sulla salute come le malattie polmonari.
Protocollo
Lo studio ha ricevuto l'approvazione dal Comitato etico medico dell'Istituto per la salute sul lavoro e il controllo dei veleni, Centro cinese per il controllo e la prevenzione delle malattie (NIOHP201604), con il consenso informato scritto ottenuto da tutti i soggetti prima dello studio e la raccolta di campioni biologici. Per questo studio, sono stati selezionati imballatori di nerofumo che avevano lavorato in una fabbrica di nerofumo per più di 1 anno e sono stati esposti ad aerosol di nerofumo. I lavoratori di una fabbrica di acquedotti senza una significativa esposizione professionale a fattori dannosi sono stati reclutati nell'area locale come popolazione di controllo per stabilire lo studio. I criteri di inclusione ed esclusione sono stati selezionati per la popolazione in studio: I criteri di inclusione per i packer di nerofumo includevano il contatto diretto con il nerofumo durante la maggior parte dei turni e un minimo di un anno di lavoro nell'area di esposizione al nerofumo. I lavoratori dell'acquedotto sono stati inclusi se non avevano avuto un'esposizione professionale al nerofumo o ad altri inquinanti nel loro ambiente di lavoro. I criteri di esclusione comprendevano i lavoratori con malattie croniche come il cancro, coloro che erano stati sottoposti a esposizione ai raggi X negli ultimi tre mesi, individui con una storia di tubercolosi polmonare, chirurgia polmonare, miocardite virale, cardiopatia congenita, febbre recente o infiammazione e lavoratori che avevano assunto antibiotici di recente. I reagenti e le attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Conservazione dell'espettorato
- Preparare la soluzione fissativa seguendo i passaggi seguenti:
- Sciogliere il 2% di polietilenglicole (PEG1500) a bagnomaria. Prelevare 20 ml di PEG1500 fuso in una provetta da centrifuga. Aggiungere 20 ml di etanolo al 50% nella provetta da centrifuga e agitare accuratamente la miscela per creare il liquore madre.
- Versare gradualmente 40 ml di liquore madre in 960 ml di etanolo al 50%. Agitare bene la soluzione per formare la soluzione di fissazione Saccomanno. Conservare la soluzione in un luogo fresco e buio.
- Aggiungere 20-30 mL della soluzione fissativa preparata in una provetta da centrifuga contenente circa 2 mL di espettorato. Mescolare accuratamente il contenuto.
NOTA: Assicurarsi che il volume totale non superi i 40 ml. - Sigillare la provetta da centrifuga con una pellicola sigillante. Conservalo in un luogo fresco e buio. Trasportare la provetta in laboratorio per un'ulteriore lavorazione quando è pronta.
NOTA: Sciogliere sempre PEG1500 a bagnomaria e utilizzare secondo il dosaggio prescritto.
2. Preparazione della sospensione cellulare nell'espettorato
- Preparare la soluzione digestiva sciogliendo 0,1 g di ditiotreitolo in 100 ml di soluzione fisiologica secondo il dosaggio effettivo. Conservare la soluzione preparata a 4 °C per un massimo di 48 ore.
- Centrifugare la provetta contenente l'espettorato a 1,998 x g per 30 minuti a 4 °C.
- Scartare il surnatante. Aggiungere un volume uguale di digestato di espettorato al precipitato. Agitare e agitare bene il composto.
- Porre la provetta in un bagnomaria a 37 °C fino alla completa liquefazione (10-15 min).
NOTA: Agitare continuamente il tubo durante il processo di liquefazione.
- Porre la provetta in un bagnomaria a 37 °C fino alla completa liquefazione (10-15 min).
- Filtrare la miscela liquefatta con una membrana filtrante da 70 μm.
- Centrifugare la soluzione filtrata a 500 x g per 7 minuti a 4 °C.
- Scartare il surnatante, trattenendo il precipitato cellulare.
- Risospendere il precipitato cellulare nel tampone fosfato di Duchenne. Centrifugare la soluzione risospesa a 500 x g per 7 minuti a 4 °C per ottenere un precipitato cellulare puro.
3. Preparazione dello striscio cellulare
- Aggiungere 200-600 μl di tampone fosfato al sedimento cellulare. Mescolare accuratamente il contenuto; Regolare il volume del tampone in base ai risultati del conteggio delle celle (puntare a >1,0 × 105 celle).
- Prelevare 20 μl della sospensione cellulare e creare uno striscio cellulare utilizzando il metodo dell'ematocrito17.
- Lasciare asciugare lo striscio all'aria in modo naturale (entro 48 ore). Fissare lo striscio con una soluzione colorante disponibile in commercio per 10 s.
- Immergere lo striscio in una soluzione colorante per 8 s. Durante la colorazione, sollevare delicatamente il vetrino su e giù e risciacquare la macchia in eccesso con acqua corrente.
- Macchiare lo striscio con la soluzione colorante B per 8 s. Sollevare il vetrino durante la colorazione e sciacquare la macchia in eccesso sotto l'acqua corrente.
NOTA: Le soluzioni coloranti A e B sono disponibili nel kit di colorazione disponibile in commercio. - Immergere il vetrino in etanolo anidro due volte, ogni volta per 2-3 s.
- Una volta asciutto, applicare una quantità adeguata di gomma neutra. Sigillare il vetrino con vetrini.
4. Analisi quantitativa della CCAM
- Utilizzare un microscopio ottico con un obiettivo a olio 100x. Cattura immagini di macrofagi selezionati casualmente, ben colorati e morfologicamente intatti. Scatta 50 immagini di macrofagi in modo casuale per ogni campione.
- Eseguire l'analisi delle immagini nel software Image J seguendo i passaggi seguenti:
- Misura la scala e determina la lunghezza effettiva e la conversione da pixel a pixel (282 pixel = 10 μm). Impostare la scala nell'immagine J (Analizza > Imposta scala), inserire la distanza in pixel, la lunghezza effettiva, l'unità di lunghezza (μm) e selezionare Globale.
- Usa una forma irregolare per delineare le celle. Rimuovi lo sfondo (selezioni a mano libera, Modifica > Cancella esterno). Misurare l'area totale delle celle (Analisi > misurazione).
- Ritaglia il nucleo (Modifica > Taglia). Converti l'immagine in scala di grigi in bianco e nero (Tipo di > immagine > 8 bit).
- Regolare il valore della scala di grigi specifico per ogni colorazione delle celle per un conteggio accurato delle particelle di carbonio (Immagine > Regola > soglia > Applica, Analizza >> Misura).
- Calcola il contenuto di carbonio di 50 macrofagi per campione in base all'area misurata e all'analisi dell'immagine nel software Image J.
Risultati
L'espettorato, conservato e lavorato con la soluzione fissativa, ha mostrato una morfologia macrofagica intatta al microscopio ottico durante l'esame morfologico. I macrofagi mostravano nuclei cellulari chiari, rotondi o a forma di rene, facilmente colorabili. Dopo la colorazione, i nuclei cellulari apparivano bluastri-violacei, mentre il citoplasma era rosa chiaro o azzurro. Il campo microscopico ha mostrato impurità minime, il che ha facilitato una facile identificazione delle cellule. All'interno delle celle, le particelle di black carbon erano distintamente visibili in piccoli aggregati, consentendo l'analisi quantitativa delle particelle di carbonio.
Nella Figura 1 sono presentate immagini rappresentative dei macrofagi dell'espettorato, che raffigurano un numero variabile di particelle di carbonio in celle diverse. Ad esempio, la Figura 1A non mostra particelle di carbonio, mentre la Figura 1D mostra la concentrazione più alta. I valori di CCAM sono stati misurati rispettivamente come 0,00%, 2,24%, 6,64% e 34,61% per i macrofagi (A-D). Durante il processo di determinazione dei parametri CCAM, è stata condotta una valutazione quantitativa del contenuto di carbonio in ciascun macrofago per mitigare le distorsioni derivanti dalle variazioni delle dimensioni dei macrofagi e dalla sovrapposizione delle particelle di carbonio con i nuclei cellulari. Il calcolo e l'analisi della CCAM sono stati eseguiti per 50 macrofagi per soggetto dello studio, come mostrato nella Figura 2.
Lo studio ha selezionato come gruppo esposto i packer di nerofumo (CBP) di una specifica fabbrica di acetilene nerofumo e ha reclutato lavoratori delle pompe dell'acqua dagli impianti idrici locali, che non avevano alcuna esposizione professionale apparente a fattori dannosi, come gruppo di controllo (Non-CBP). I risultati presentati nella Figura 2 indicano un CCAM più elevato negli addetti al packaging del nerofumo rispetto al gruppo di controllo.
Figura 1: Immagine al microscopio ottico che mostra le particelle di carbonio all'interno dei macrofagi delle vie aeree. Il colore nero nel citoplasma rappresenta le particelle di carbonio. I pannelli (A-D) raffigurano immagini rappresentative dei macrofagi delle vie aeree, ciascuno dei quali mostra vari livelli di CCAM. I valori di CCAM per i macrofagi in (A-D) erano rispettivamente dello 0,00%, 2,24%, 6,64% e 34,61%. Il livello più alto di CCAM è stato osservato in (D). Barre di scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Livelli quantitativi di CCAM nella popolazione. Cinquanta macrofagi citoplasmaticamente intatti e ben colorati sono stati selezionati in modo casuale per l'analisi e la quantificazione per ogni soggetto dello studio. I dati sono stati analizzati utilizzando il test t di Student: *P < 0,05. CBP: imballatori di nerofumo; Non CBP: gruppo di controllo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussione
Questo studio presenta un protocollo sperimentale dettagliato per l'utilizzo della CCAM derivata dall'espettorato indotto come marcatore biologico per l'esposizione interna al particolato atmosferico. La CCAM può essere rilevata e quantificata attraverso la microscopia ottica, fungendo da preciso biomarcatore di esposizione interna che riflette la relazione con gli effetti sulla salute. Pertanto, è necessario stabilire e ottimizzare un metodo di conservazione dell'espettorato indotto conveniente, affidabile ed efficiente e un metodo di quantificazione CCAM per standardizzare le procedure metodologiche.
La determinazione del contenuto di carbonio dei macrofagi polmonari prevede diverse fasi, tra cui la raccolta dei macrofagi polmonari, lo striscio, la colorazione, la fotografia e l'analisi delle immagini. Attualmente, esistono due metodi per la raccolta dei macrofagi polmonari: l'espettorato indotto e il lavaggio polmonare, ciascuno con i propri vantaggi e limiti18,19. Il lavaggio polmonare può produrre molti macrofagi polmonari omogenei, ma è un metodo di campionamento traumatico che richiede anestesia e altre condizioni mediche. Pertanto, non è adatto per il campionamento su larga scala della popolazione generale. Al contrario, l'espettorato indotto è facile da eseguire, non invasivo e adatto per il campionamento su larga scala della popolazione generale. Consente inoltre di ottenere campioni ripetuti. Il lavaggio polmonare ottiene macrofagi dagli alveoli o dai bronchioli distali, mentre l'espettorato indotto ottiene macrofagi che possono originare dalle vie aeree. In questo studio, abbiamo eseguito l'espettorato indotto seguendo il protocollo standard pubblicato dalla European Respiratory Society20.
Il tasso di successo dell'espettorato indotto è influenzato da vari fattori, tra cui la concentrazione di soluzione salina inalatoria nebulizzata e la presenza di malattie respiratorie nel paziente 21,22,23. I campioni di espettorato possono anche contenere saliva, che può interferire con la misurazione del contenuto di carbonio dei macrofagi, riducendo potenzialmente il numero di macrofagi delle vie aeree nel campione24. Le procedure operative in questo studio erano standardizzate, i metodi erano semplici e la riproducibilità era elevata. È stato osservato che fattori come l'entità della portata di inalazione nebulizzata, l'adeguatezza del tempo di induzione e la presenza di intervalli durante l'induzione hanno influenzato il tasso di successo dell'espettorato indotto. Queste considerazioni sono importanti per garantire una misurazione accurata e affidabile della CCAM come biomarcatore per l'esposizione al particolato.
La soluzione fissativa Saccomanno, composta per il 50% da etanolo e per il 2% da polietilenglicole, è tipicamente utilizzata come fissativo per la conservazione di campioni biologici come il liquido di lavaggio broncoalveolare. In questo studio, per la prima volta, questa soluzione fissativa è stata utilizzata per preservare l'espettorato ottenuto da indagini epidemiologiche sul campo. I risultati hanno soddisfatto la successiva quantificazione del carbonio nei macrofagi, simile alla conservazione delle cellule dell'espettorato al mattino per ottenere strisci di cellule tumorali chiare25. Le procedure operative erano standardizzate, i metodi semplici e la riproducibilità elevata. I vantaggi della conservazione indotta dell'espettorato in questo studio includono (1) una facile configurazione del fissativo, (2) non è necessaria alcuna refrigerazione per la conservazione, il che è conveniente per indagini epidemiologiche su larga scala, e (3) i campioni possono essere conservati in un luogo fresco e lontano dalla luce. Visione chiara al microscopio dopo la colorazione, con nuclei identificabili, impurità minime e morfologia cellulare completa. Questo è superiore al processamento diretto dell'espettorato e all'applicazione dello striscio in termini di morfologia26.
Per quanto riguarda i metodi sperimentali, sono stati notati i seguenti dettagli: L'espettorato è stato periodicamente agitato durante la digestione in un bagno d'acqua a 37 °C fino a quando non è stato completamente liquefatto. Dopo la liquefazione, la filtrazione su una membrana da 70 μm è stata eseguita prima della centrifugazione per rimuovere le impurità e ottenere un fondo di colorazione più chiaro. I precipitati cellulari sono stati nuovamente lavati con DPBS prima di spalmarli sui vetrini. Il liquido in eccesso è stato rimosso durante la colorazione lavando i vetrini con acqua corrente. I supporti dei vetrini sono stati sostituiti tra la colorazione I e la colorazione II per evitare residui. Per la fotografia, sono stati selezionati casualmente macrofagi con morfologia completa e buona colorazione, influenzando la quantificazione CCAM27.
Le opzioni del software di analisi quantitativa per questo studio includono Image SXM e Image J28. Image SXM richiede la modifica manuale delle immagini prima dell'analisi per migliorare la precisione, il che prolunga significativamente il tempo richiesto. È inoltre limitato all'elaborazione di un singolo tipo di cellula. Al contrario, il software Image J utilizzato in questo studio offre una migliore specificità nell'elaborazione delle immagini e una più ampia compatibilità. In altre discipline, sono stati impiegati metodi di microscopia di screening ad alto contenuto per la selezione e la successiva analisi di cellule marcate in fluorescenza, ottenendo operazioni automatizzate ad alto rendimento. La direzione futura della ricerca metodologica potrebbe comportare lo sviluppo di marcature automatizzate dei macrofagi nell'espettorato e procedure di screening29. Durante l'elaborazione dell'immagine J, i fattori che influenzano la misurazione CCAM includono la conoscenza da parte del misuratore delle informazioni sul campione e la determinazione delle soglie dei valori della scala di grigi. L'adozione di un approccio alla cieca può ridurre la distorsione dell'osservatore e potrebbe essere necessario misurare ripetutamente alcuni campioni per valutarne la riproducibilità. L'acquisizione e l'analisi indipendente delle immagini da parte di due persone con competenze di alto livello possono migliorare l'accuratezza dell'identificazione dei macrofagi.
Lo studio ha utilizzato i metodi standard dell'Istituto nazionale per la sicurezza e la salute sul lavoro (NIOSH) per valutare l'esposizione dei soggetti al particolato professionale. Sono state condotte diverse valutazioni sui livelli di particolato fine (PM2,5) e sul contenuto di carbonio elementare (EC) correlato al PM2,5 nell'area di imballaggio del nerofumo e nelle aree di lavoro dei lavoratori dell'impianto idrico del gruppo di controllo. Fino al 99,6% delle particelle di nerofumo (CB) aveva un diametro aerodinamico inferiore a 2,5 μm e il 96,7% era inferiore a 1,0 μm. Nell'autunno del 2012, il livello medio di PM2,5 nell'impianto di confezionamento CB era di 800 microgrammi per metro cubo, con un livello di EC correlato al PM2,5 di 657,0 microgrammi per metro cubo30,31. Nell'autunno del 2018, la media geometrica del CB era di 637,4 μg/m3 e il livello di EC correlato al PM2,5 era di 364,6 μg/m3. In entrambe le osservazioni, il rapporto EC/TC ha superato il 92,5%, coerentemente con il fatto che il CB è quasi puro EC. Pertanto, da questo studio si può dedurre che le particelle di carbonio nei macrofagi derivano principalmente dall'esposizione al nerofumo30,31. Di conseguenza, la concentrazione di PM2,5 nell'ambiente di lavoro della popolazione esposta al nerofumo in questo studio era di 637,4 μg/m3, significativamente superiore alla concentrazione di PM2,5 nell'ambiente di lavoro della popolazione di controllo (130,0 μg/m3) e circa cinque volte superiore a quella della popolazione di controllo. I livelli di carbonio elementare nella popolazione esposta al nerofumo erano di 364,6 μg/m3, molto più alti dei 2,0 μg/m3 nella popolazione di controllo.
In sintesi, questo studio ha utilizzato l'espettorato ipertonico indotto da soluzione salina per raccogliere campioni, ha ottenuto macrofagi polmonari, ha realizzato strisci cellulari e ha quantificato il contenuto di carbonio all'interno di 50 macrofagi, utilizzando il numero mediano per rappresentare il livello di contenuto di carbonio dei macrofagi per ciascun individuo. Questa metodologia di ricerca può essere adattata per campioni di popolazione su larga scala e utilizzata per valutare con precisione il livello di esposizione interna di un individuo al particolato.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (82273669, 82241086, 42207488), dal Taishan Scholars Program della provincia di Shandong (n. tsqn202211121) e dal programma di innovazione e tecnologia per gli eccellenti giovani studiosi dell'istruzione superiore della provincia di Shandong (2022KJ295).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Paillettes sterili da 3 ml | Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD | 84202ES03 | |
| Provetta da centrifuga da 50 ml | Thermo Fisher Scientific, USA | 339652 | |
| Alcol etilico assoluto | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD | 64-17-5 | |
| Olio di cedro | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LTD | C805296 | |
| Colorazione rapida con diff | soluzione Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD | 40748ES76 | |
| Ditiotreitolo | Solebo Bio Co., LTD | D8220 | |
| Tampone fosfato di Duchenne (DPBS) | Thermo Fisher Scientific, USA | 14190144 Fotocamera per | |
| microscopio | Olympus Corporation of Japan | DP72 | |
| Gomma d'albero neutra | Solebo Bio Co., LTD | G8590 | |
| Membrana filtrante in nylon 70um | BD Falcon Bioscience, USA | 211755 | |
| Microscopio ottico | Olympus Corporation of Japan | BX60 | |
| Polietilenglicole | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD | 25322-68-3 | |
| Ultracentrifuga | Thermo Fisher Scientific, USA | SL40R | |
| Vetrino viscoso | Jiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD |
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