Valutazione dinamica della funzione piastrinica multiparametrica mediante un biosensore capacitivo

Summary

Qui viene presentato un protocollo per un nuovo saggio funzionale dinamico multiparametrico delle piastrine utilizzando un biosensore capacitivo. Questo approccio, progettato all'interno di un microambiente semirigido per migliorare la rilevanza fisiologica, fornisce tre parametri di output sensibili alla conta piastrinica, alla forza di stimolazione e alle vie di attivazione.

Abstract

Le piastrine svolgono un ruolo fondamentale nella coagulazione del sangue attraverso una serie di risposte regolate, tra cui l'adesione, la diffusione, la secrezione granulare, l'aggregazione e la contrazione del citoscheletro. Tuttavia, i test attuali sono limitati all'analisi parziale della funzione piastrinica in condizioni non fisiologiche. Pertanto, è necessario un test migliorato che rifletta la natura dinamica e sfaccettata della funzione piastrinica in contesti fisiologici. In questo contesto, viene introdotto un nuovo approccio per misurare diversi parametri chiave relativi alla funzione piastrinica in un microambiente semirigido ex vivo fisiologicamente più rilevante rispetto ai saggi tradizionali. Questo metodo utilizza un biosensore elettrico avanzato, il sensore di capacità a membrana (MCS), che fornisce informazioni uniche sul processo di coagulazione attraverso tre letture distinte. Queste letture sono altamente sensibili alle variazioni della conta piastrinica, dell'intensità della stimolazione e di specifiche vie di attivazione. Come piattaforma di rilevamento puramente elettrico, l'MCS dimostra un potenziale significativo come strumento diagnostico per rilevare i disturbi della funzione emostatica primaria, valutare l'efficacia dei trattamenti terapeutici e far progredire la più ampia comprensione dei ruoli delle piastrine nell'emostasi e nella trombosi.

Introduction

Le piastrine, cellule del sangue specializzate, sono fondamentali nell'orchestrare la risposta emostatica per arrestare l'emorragia a seguito di una lesione e nel facilitare la guarigione dei vasi sanguigni¹. Inoltre, fungono anche da mediatori cruciali nella trombosi, una delle principali cause di decessi correlati alla malattia tromboembolica a livello globale 2,3,4,5,6. Quando si verifica una lesione vascolare, le piastrine subiscono una serie di ....

Protocol

La proposta di studio è stata approvata dalla Human Subjects Division (HSD) presso l'Internal Review Board dell'Università di Washington (UW-IRB; ID studio: STUDY00005211). Tutti i soggetti volontari che hanno partecipato allo studio hanno fornito il consenso informato scritto. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Fasi di fabbricazione del sensore capacitivo a membrana (MCS)

NOTA: Il sensore MCS è stato fabbricato utilizzando tecniche di microfabbricazione tradizional....

Results

Questo studio mira a condurre una valutazione dinamica della funzione piastrinica. Seguendo il protocollo sopra descritto, è stata preparata la soluzione di c-PRP e le piastrine sono state seminate sull'elettrodo rivestito di Fn in T-MCC. Le piastrine libere sono state lavate via dalla fase di lavaggio ed è stato aggiunto un agonista per attivare le piastrine attaccate. I risultati dettagliati e le discussioni sono disponibili nel nostro precedente rapporto²⁸.

Discussion

Questo studio ha aperto la strada a un nuovo metodo basato sulla capacità per valutare la funzione piastrinica, che valuta sia l'adesione che la dinamica piastrinica post-attivazione all'interno di un singolo dispositivo, segnando il primo esempio riportato di un tale approccio. Il nuovo protocollo sperimentale introduce una tecnica relativamente semplice per contrastare gli impatti della formazione di fibrina e dei fattori di coagulazione del plasma attraverso una procedura di wash-out........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Dodecanetiol	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	471364-100ML	1 mM
200-proof etanolo	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	EX0276-1
stampante 3D	Shenzhen Creality 3D Technology Co, Ltd.	Ender-3 V3
materiale per la stampa 3D	HATCHBOX 3D, CA, U.S.A	3D PLA-1KG-1.75
Adenosina 5′-difosfato	Sigma Aldrich, U.S.A	01905-250MG-F
ADP Aspirina	Sigma-Aldrich, MO, Stati Uniti	A2093-100G
Incisione ionica reattiva profonda	Omega Engineering, Inc.	SPTS Rapier DRIE
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	D8418-50ML	DMSO
Sistemi di deposizione ad alto vuoto	CHA	SEC-600
Fibronectina umana	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	CLS356008-1EA	Fn
KOH	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P1767-250G
LCR meter	Keithley Instruments, Inc., OH, U.S.A	Keithley EL 4980AL
LCR portametri	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCA-50-4
Mask Aligner System	ABM, U.S.A, Inc.	ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
Micro-posizionatori	Signatone, CA, U.S.A	S-725
sonda ad ago	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCAT5T-4	12.5 μ m
radius Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P4474-1L	PBS, pH 7.4
Reactive Ion Etching	Plasma-Therm, U.S.A	RIE Vision 320
substrato di silicio	Wafer World Inc	SKU# 1766
Provette standard al 3,2% di citrato	Tiger Medical, NJ, U.S.A.	Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
Thrombin	Enzyme Research Laboratories, U.S.A	HT 1002a
Ticagrelor	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	PHR2788-400MG
Tyrode' s tampone	Boston Bioproducts, U.S.A	BSS-375
UV fotoresist	AZ materiali elettronici, NC, U.S.A.	AZ 9260	15um