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Articolo metodologico

Crescita di un biofilm polimicrobico rilevante per la fibrosi cistica per sondare i fenotipi della comunità

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DOI:

10.3791/66785

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19 aprile 2024

 , 
1Département de Biologie, Université de Sherbrooke

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un modello di biofilm polimicrobico a quattro specie rilevante per la fibrosi cistica (FC) polmonare che può essere utilizzato per esplorare l'impatto delle interazioni batteriche interspecie.

Abstract

La maggior parte dei modelli in vitro non ha la capacità di sondare completamente i fenotipi batterici che emergono dalle complesse interazioni osservate in ambienti di vita reale. Ciò è particolarmente vero nel contesto di infezioni croniche e polimicrobiche difficili da trattare, rilevate nelle vie aeree di individui affetti da fibrosi cistica (FC), una malattia genetica multiorgano. Sebbene diversi studi sul microbioma abbiano definito le composizioni microbiche rilevate nelle vie aeree delle persone con FC (pwCF), finora nessun modello in vitro ha completamente integrato le caratteristiche polmonari critiche rilevanti per la FC. Pertanto, esiste una significativa lacuna di conoscenza nella capacità di studiare i meccanismi che guidano la patogenesi delle infezioni polmonari da FC di specie miste. Qui, descriviamo un modello di comunità microbica di quattro specie recentemente sviluppato, tra cui Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis e Prevotella melaninogenica cresciuti in condizioni simili alla FC. Attraverso l'utilizzo di questo sistema, sono stati osservati ed esplorati fenotipi clinicamente rilevanti come la recalcitranza antimicrobica di diversi patogeni a livello molecolare. L'utilità di questo modello in vitro risiede nel suo flusso di lavoro standardizzato che può facilitare lo studio delle interazioni interspecie nel contesto delle infezioni polmonari croniche da FC.

Introduzione

Le strategie volte a sradicare i microbi che causano malattie come quelli rilevati nelle vie aeree della fibrosi cistica (FC), una malattia genetica multiorgano, spesso falliscono1. Cioè, la presenza di comunità microbiche resilienti simili al biofilm che crescono nell'ambiente polmonare della FC ricco di muco può causare infezioni croniche che si estendono per più decenni2. Inoltre, sebbene l'utilizzo di antimicrobici di prima linea (Abx) e modulatori abbia portato a risultati migliori nelle persone con FC (pwCF), l'approccio clinico "un bug, un'infezione" tipicamente impiegato contro i patogeni canonici della FC come Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus è stato inefficace nel risolvere le infezioni difficili da trattare rilevate nei polmoni di questi individui 3,4, 5,6,7.

Negli ultimi due decenni, diversi studi hanno cambiato la nostra comprensione della malattia polmonare cronicaFC 8. Cioè, i rapporti indicano che le infezioni rilevate nelle vie aeree di pwCF non sono causate esclusivamente da un singolo agente patogeno, ma sono piuttosto di natura polimicrobica8. Inoltre, sebbene la patogenesi delle infezioni polmonari da FC di specie miste sia ancora poco conosciuta, l'evidenza clinica mostra che le pwCF che sono co-infettate sia da S. aureus che da P. aeruginosa nelle loro vie aeree hanno peggiorato la funzione polmonare rispetto agli individui colonizzati da uno di questi due patogeni9.

Si ipotizza che le interazioni interspecie tra i patogeni della FC siano una delle ragioni per cui le infezioni polimicrobiche basate sul biofilm non vengono prontamente sradicate attraverso l'utilizzo di terapie per la FC, influenzando in ultima analisi gli esiti dei pazienti3. A sostegno di ciò, studi in vitro hanno dimostrato che le interazioni tra microbi come P. aeruginosa, S. aureus e altri possono avere un impatto su fenotipi clinicamente rilevanti come la risposta Abx ai farmaci FC di prima linea, tra cui vancomicina e tobramicina 6,10,11. Pertanto, resta da riesaminare le attuali strategie di trattamento volte a eradicare i patogeni della FC nel contesto delle infezioni da specie miste.

Il gold standard nella gestione delle infezioni polmonari da FC su base microbica si basa fortemente sull'utilizzo dei test di suscettibilità antimicrobica (AST) per guidare gli interventi clinici12. Tuttavia, l'AST viene tipicamente eseguita utilizzando monocolture batteriche coltivate in colture ricche e ben miscelate, il che non riflette le condizioni di crescita microbica rilevate nelle vie aeree FC 3,13. Data la significativa discrepanza tra gli esiti dei pazienti e il successo del trattamento, i rapporti clinici ora sostengono lo sviluppo di nuovi approcci che integrino le caratteristiche critiche del polmone FC12,14.

Pochi studi hanno sviluppato sistemi in vitro multispecie batteriche rilevanti per la FC contenenti più di due patogeni15,16. Tuttavia, questi modelli (1) non riflettono interamente la natura polimicrobica e simile al biofilm del polmone FC e (2) non utilizzano condizioni nutrizionali e ambientali che si avvicinino a quelle rilevate nelle vie aeree FC15,16. Attraverso l'estrazione di grandi set di dati e il calcolo del gene 16S rRNA derivato da CF-lung, Jean-Pierre e colleghi hanno recentemente sviluppato un modello di co-coltura in vitro che integra le caratteristiche sopra menzionate10. Questo sistema comprende P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. e Prevotella spp. cresciuti in condizioni simili alle vie aeree FC e stabili fino a 14 giorni. Gli autori hanno anche riportato una crescita specifica della comunità di Prevotella spp. e diversi cambiamenti nella risposta Abx di questi patogeni FC attraverso meccanismi che rimangono da identificare10. Questo sistema trattabile in vitro ha anche offerto la possibilità di approfondire questioni focalizzate meccanicisticamente relative alla recalcitranza Abx di una variante comune di P. aeruginosa frequentemente rilevata nelle vie aeree di pwCF10. Pertanto, l'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire alla comunità di ricerca sulla fibrosi cistica un flusso di lavoro sperimentale standardizzato per far crescere un biofilm in vitro che ha il potenziale per essere ulteriormente ampliato per affrontare una serie di domande rilevanti per la fibrosi cistica.

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Protocollo

I dettagli di tutti i reagenti e le attrezzature sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del terreno di espettorato artificiale

NOTA: In tutto questo protocollo, il terreno di espettorato artificiale (ASM) è definito come il mezzo rilevante per la fibrosi cistica modificato da SCFM2, precedentemente pubblicato da Turner e colleghi17. Di seguito è riportata una descrizione dei passaggi per preparare questo mezzo. Vedere la tabella dei materiali per creare soluzioni di riserva e condizioni di conservazione. Questa versione di ASM differisce da Turner et al.,17 in quanto la capacità tampone nella versione originale non consente un pH stabile nel tempo. Cioè, l'attività fermentativa svolta da Streptococcus spp. e anaerobi come Prevotella spp. provoca l'acidificazione del terreno di coltura (osservazioni non pubblicate). Pertanto, la concentrazione di acido 3-morfolinopropano-1-solfonico (MOPS) è stata regolata da 10 mM a 100 mM.

NOTA: La preparazione di una soluzione madre di base ASM 2x (ASMb) facilita l'aggiunta di componenti come mucina, agar, acqua, ecc., senza influire sulla concentrazione finale di molecole presenti in ASM 10,18. Il 2x ASMb può essere preparato in anticipo e conservato a 4 °C per un massimo di due settimane in un luogo buio. Se il mezzo diventa giallo, scartarlo.

  1. Per preparare 2 brodi base ASM, in un becher pulito contenente 400 mL di diH2O, aggiungere mescolando:
    1. Aggiungere 6,50 mL di 0,2 M NaH2PO4. H2O calcio; 6,25 mL di un stock 0,2 M Na2HPO4 ; 348 μl di un stock KNO3 da 1 M; 1,084 mL di un stock 0,25 M K2SO4 .
    2. Aggiungere 4,0 g di Lievito di Lievito sintetico dropout senza Triptofano; 3,032 g di NaCl; 20,92 g di MOPS; 1,116 g di KCl e 0,124 g di NH4Cl.
    3. Aggiungere 9,30 ml di un brodo di acido L-lattico da 1 M; 2,70 mL di una scorta di glucosio da 1,1 M; 1,75 mL di un ceppo di CaCl2,2H 2O da 1 M; 1,20 mL di una riserva di N-acetilglucosamina da 0,25 M e 1,00 mL di una riserva di FeSO 4,7H 2O da 3,6 mM.
    4. Aggiungere 660 μl di un stock di triptofano 0,1 M; 606 μL di un stock di 1 M MgCl 2.6H 2O; 0,60 g di acido desossiribonucleico da spermatozoi di aringhe; 400 μL di una 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) da 250 mg/mL.
    5. Una volta aggiunti tutti i componenti, regolare il pH a 6,80 con un stock di NaOH 5 M. Completare a 500 mL con diH2O. Sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C.
  2. Per preparare una scorta di mucina da 10 mg/mL (2x), utilizzare un flacone di vetro pulito contenente 250 mL di diH2O e mescolando:
    1. Aggiungere 5,0 g di mucina dallo stomaco suino - Tipo II. Mescolare la sospensione per 10 min. Completare a 500 mL con diH2O.
    2. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 min. Conservare a 4 °C fino al momento dell'utilizzo.
  3. Ricostituire l'ASM.
    NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito il giorno dell'esperimento.
    1. Miscelare un rapporto in volume 1:1 tra il brodo 2x ASMb e il brodo di mucina 10 mg/mL.
    2. Agitare accuratamente prima dell'uso.

2. Preparazione di terreni selettivi per comunità polimicrobiche

NOTA: Di seguito sono riportate le quantità necessarie per preparare un volume di 1 L di supporto.

  1. Per preparare il Mannitol Salt Agar (MSA) e lo Pseudomonas Isolation Agar (PIA), seguire le istruzioni del produttore.
  2. Per preparare l'agar selettivo Prevotella (PSA), in una bottiglia di vetro pulita, aggiungere quanto segue:
    1. 30,0 g di brodo di soia triptico (TSB). 15,0 g di agar. 5,00 g di estratto di lievito. 0,50 g di L-cisteina cloridrato.
    2. 10,0 mL di una stock di emina da 0,5 mg/mL. 100 μL di una stock di menadione da 10 mg/mL.
    3. Aggiungere 940 mL di diH2O e mescolare. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 min.
    4. Una volta raffreddato (cioè la bottiglia può essere tenuta a mani nude), aggiungere mescolando: 50,0 ml di sangue di pecora defribrinato. 2,00 mL di una riserva di kanamicina da 50 mg/mL. 150 μL di una riserva di vancomicina da 50 mg/mL. 500 μL di polimixina B da 10 mg/mL.
  3. Per preparare lo Streptococcus Selective Agar (SSA), in una bottiglia di vetro pulita, aggiungere quanto segue:
    1. 30,0 g di cucchiaino. 15,0 g di agar.
    2. Aggiungere 950 mL di diH2O e mescolare. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 min.
    3. Una volta raffreddato (cioè la bottiglia può essere tenuta a mani nude), aggiungere mescolando: 50,0 ml di sangue di pecora defribrinato. 1,00 mL di una polimixina B da 10 mg/mL. 1,00 mL di una scorta di acido ossolinico da 10 mg/mL.
      NOTA: Versare nei piatti e conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese. Prima dell'uso, lasciare asciugare le piastre a temperatura ambiente fino a 24 ore prima di essere inoculate. Il PSA è stato convalidato con P. melaninogenica e Prevotella intermedia. La SSA è stata convalidata con S. sanguinis e con il gruppo Streptococcus milleri (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius e Streptococcus anginosus, indicato come SMG). Si raccomanda vivamente di convalidare de novo questi terreni selettivi se si vogliono testare nuovi ceppi.

3. Preparazione dei terreni liquidi batterici e condizioni di crescita

  1. Per coltivare abitualmente P. aeruginosa e S. aureus, utilizzare un terreno sterile ricco (ad esempio, brodo di lisogenia (LB) o TSB).
    1. Iniziare la notte raccogliendo una singola colonia precedentemente coltivata su una piastra di agar LB/TSB per 20-24 ore a 37 °C.
    2. Far crescere i fermenti in brodo a 37 °C durante la notte con agitazione a 250 giri/min per 16-18 ore.
  2. Per coltivare lo Streptococcus spp., utilizzare il brodo sterile Todd Hewitt integrato con estratto di lievito allo 0,5% (THB-YE).
    1. Iniziare la coltura liquida durante la notte da una singola colonia precedentemente coltivata su una piastra di agar TSB integrata con sangue di pecora defibrinato al 5% (piastra di agar sanguigno) per 24 ore a 37 °C + 5% di CO2.
    2. Coltivare le colture THB-YE in modo anaerobico o a 37 °C + 5% CO2 durante la notte senza agitare per 18-22 ore.
  3. Per coltivare Prevotella spp., preparare 1 litro di terreno di coltura Prevotella (PGM) aggiungendo quanto segue a una bottiglia pulita:
    1. 30,0 g di cucchiaino. 5,00 g di estratto di lievito. 0,50 g di L-cisteina cloridrato. 10,0 mL di una scorta di emina da 0,5 mg/mL e 100 μL di una scorta di menadione da 10 mg/mL.
    2. Aggiungere 990 mL di diH2O. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 min. Avvolgere la bottiglia in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce.
    3. Coltivare le colonie di Prevotella spp. su una piastra di agar sanguigno incubata anaerobicamente a 37 °C per 48 ore.
    4. Inoculare una singola colonia in PGM e crescere durante la notte senza agitare a 37 °C in modo anaerobico per 24 ore.
      NOTA: Il PGM può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di due settimane. Si consiglia vivamente di eseguire test di sterilità su ciascun terreno di coltura prima dell'uso. Se non si utilizza una camera anaerobica, potrebbe essere necessario iniziare durante la notte il liquido di Prevotella spp. da un appezzamento di colonie.

4. Preparazione dell'esperimento di co-coltura

NOTA: la Figura 1 illustra un flusso di lavoro sperimentale riassunto. L'impostazione dell'esperimento può essere eseguita in condizioni ossiche se il tempo di preparazione richiede meno di 1 ora. Se si prevede che durerà più tempo, si consiglia vivamente di eseguire l'esperimento utilizzando una camera anaerobica (con il 10% di CO2, il 10% di H2 e l'80% di N2 di gas miscelato). I barattoli anaerobici possono essere utilizzati anche per incubare i campioni sperimentali.

  1. Preparazione delle monocolture e co-colture
    NOTA: Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 10.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente. Per le co-colture, mescolare i campioni batterici appena prima di inoculare le piastre da 96 pozzetti. Tipicamente, un volume di 1 mL per i ceppi di P. aeruginosa e S. aureus viene raccolto dalle colture notturne. Per Streptococcus spp. e Prevotella spp., i volumi overnight possono variare tra 2-4 mL. Questi volumi possono essere regolati in base al numero di condizioni da testare.
    1. Utilizzando il liquido batterico delle colture notturne, eseguire i seguenti passaggi:
      1. Per i ceppi di P. aeruginosa e S. aureus , lavare due volte utilizzando soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS).
      2. Per Streptococcus spp. e Prevotella spp., lavare una volta con PBS sterile.
        NOTA: Utilizzare una pipetta per scartare con cura i surnatanti, poiché i pellet possono andare facilmente persi.
      3. Dopo i lavaggi, risospendere ogni pellet in 1 mL di 1x ASMb diluito in acqua.
      4. Effettuare una diluizione 1:10 di ciascun campione in PBS sterile e misurare l'OD600.
      5. Regolare tutte le impostazioni cultura su un OD600 di 0,2 in ASM.
      6. Utilizzando le sospensioni OD600 = 0,2, diluire in ASM i campioni batterici fino a un ODfinale di 0,01 (per ogni microbo) per le monocolture e le co-colture.
      7. Agitare accuratamente per 5 s.
        NOTA: Ad esempio, per preparare un totale di 1 mL di sospensione ASM in monocoltura di P. aeruginosa a OD600 = 0,01, aggiungere 50 μL di P. aeruginosa a OD600 = 0,2 a un volume di 950 μL di ASM. Per la co-coltura, prelevare 50 μL di sospensioni di P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. e Prevotella spp. con OD600 = 0,2 e aggiungere 800 μL di ASM.
      8. Utilizzando una pipetta, aggiungere 100 μl di sospensioni di monocoltura e co-coltura in tre pozzetti separati di una piastra sterile di plastica a fondo piatto da 96 pozzetti.
      9. Incubare la piastra (senza agitare) per 24 ore a 37 °C in condizioni anossiche.
        NOTA: Qui possono essere utilizzate anche altre tensioni di ossigeno (ad es. microxia, normossia). Tuttavia, il modello è stato sviluppato e convalidato con condizioni anossiche. Confermare l'inoculo iniziale diluendo in serie le sospensioni batteriche mono e co-colture e si consiglia vivamente di placcare su PIA, MSA, SSA e PSA. La concentrazione iniziale target per ciascuna specie batterica è di 1 × 107 UFC/mL (P. aeruginosa), 3,5 × 106 UFC/mL (S. aureus), 1,2 × 106 UFC/mL (Streptococcus spp.) e 4,6 × 106 UFC/mL (Prevotella spp.). Anche gli inoculi batterici possono essere modificati, come descritto da Jean-Pierre e colleghi10.
  2. Sostituire il terreno dopo la formazione del biofilm.
    1. Dopo 24 ore di incubazione, rimuovere le cellule non attaccate (planctoniche) mediante aspirazione utilizzando una pipetta multicanale.
    2. Reintegrare i biofilm preformati con 100 μL di ASM fresco o del trattamento desiderato (ad es. antibiotici, metaboliti, ecc.).
    3. Incubare la piastra per altre 24 ore a 37 °C in condizioni anossiche.
      NOTA: Questi passaggi possono essere eseguiti in modo aerobico se eseguiti rapidamente (cioè meno di 1 minuto). In caso contrario, utilizzare una camera anaerobica.

5. Raccolta e impiattamento dei campioni

  1. Dopo le ulteriori 24 ore di incubazione, aspirare le cellule non attaccate (planctoniche) con una pipetta multicanale.
    NOTA: La frazione planctonica può essere conservata, diluita in serie e placcata su terreni selettivi o scartata.
  2. Lavare delicatamente i biofilm due volte utilizzando 125 μL di PBS sterile ed eliminare i volumi.
  3. Aggiungere 50 μl di PBS sterile e staccare i biofilm raschiando delicatamente le cellule dalla piastra utilizzando un replicatore a 96 pin.
  4. Trasferire le cellule del biofilm risospese nella fila A di una nuova piastra sterile a 96 pozzetti.
    NOTA: La piastra a 96 pozzetti conterrà PBS sterile nelle file da B a H.
  5. Eseguire una diluizione seriale 10x delle frazioni planctonica (se necessario) e del biofilm.
  6. Piastra 3-5 μl di ciascun campione di diluizione su PIA, MSA, SSA e PSA.
  7. Lasciare asciugare i punti di inoculazione.

6. Incubazione delle piastre selettive e conteggio delle unità formanti colonie (CFU)

  1. Per P. aeruginosa e S. aureus, incubare a 37 °C per 18-20 h.
  2. Per Streptococcus spp, incubare a 37 °C in condizioni anossiche per 24 ore.
  3. Per Prevotella spp, incubare a 37 °C in condizioni anossiche per 48 ore.
  4. Dopo l'incubazione, contare le colonie (~10-35 per spot) e calcolare le CFU per mL.
  5. Tracciare i dati utilizzando uno strumento di visualizzazione.

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Risultati

Come rappresentato nella Figura 2, sono stati riportati diversi fenotipi, tra cui (1) una riduzione del numero di cellule vitali di P. aeruginosa e S. aureus quando cresciute in comunità planctoniche miste rispetto alla monocoltura, (2) un aumento della crescita polimicrobica delle cellule di S. sanguinis e, (3) una crescita di comunità miste di P. melaninogenica come precedentemente riportato da Jean-Pierre e colleghi10.

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Discussione

L'utilità di questo sistema di co-coltura in vitro clinicamente informato risiede nella sua capacità di rilevare funzioni batteriche specifiche del polimicrobico. Cioè, attraverso l'utilizzo di questo modello abbiamo riportato fenotipi microbici che vanno dalla crescita specifica della comunità di Prevotella spp. (Figura 2) ai cambiamenti nella suscettibilità alla FC Abx di prima linea di P. aeruginosa, S. aureus e S. ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non divulgare.

Ringraziamenti

Desideriamo ringraziare il Dr. George A. O'Toole e il Dr. Thomas H. Hampton per il loro ruolo significativo nella progettazione e nello sviluppo del modello di comunità polimicrobica in vitro . Ringraziamo la dottoressa Sophie Robitaille per i suoi utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Cystic Fibrosis Foundation JEAN21F0 a F.J-P. La Figura 1 del manoscritto è stata creata utilizzando BioRender.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)Fisher ScientificNC0387928Preparare un brodo da 250 mg/mL in cloroformio direttamente nel flacone. Mantenere a -20°C. Concentrazione finale 200 μ g/mL in 2 basi ASM.
Acido 3-morfolinopropano-1-solfonico (MOPS)SigmaM1254Concentrazione finale 200 mM in base 2X ASM.
Replicatore a 96 pinFisher Scientific05-450-9Possono essere utilizzati anche replicatori monouso. Gatto #NC1567338.
Piastra standard sterile a 96 pozzetti con coperchioFisher Scientific62406-081
AgarFisher ScientificDF0145-17-0
AnaeroPack Barattolo rettangolare da 2,5 LFisher Scientific23-246-385
CaCl2*2H2O Fisher ScientificC79-500Preparare un brodo da 1 M in acqua e filtrare sterilizzare con un 0,22 μ m filtro. Concentrazione finale 3,5 mM in 2x base ASM.
di pecora defribrinatoPer preparare le placche di accrescimento per Streptococcus e Prevotella.
Acido desossiribonucleico da spermatozoo di aringaSigmaD7290Concentrazione finale 1,2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O Fisher Scientific AA1449830Preparare un brodo da 1 mg/mL (3,6 mM) in acqua e filtrare sterilizzare con un valore di 0,22 μ m filtro. Conservare avvolto in un foglio di alluminio. Concentrazione finale 0,0072 mM in 2x base ASM.
GasPaksFisher ScientificB260678
GlucosioFisher ScientificD16-3Preparare in acqua con una quantità di brodo al 20% (1,1 M) e sterilizzare in autoclave. Concentrazione finale 6 mM in 2x ASM base.
HeminSigma51280Sciogliere 100 mg di emina in 2 mL di 1 M NaOH e poi aumentare il volume a 200 mL con acqua. Conservare in una bottiglia ambrata o in una bottiglia normale avvolta con un foglio di alluminio a 4 °C.
K2SO4Fisher ScientificP304-500Preparare un impasto da 0,25 M in acqua e sterilizzare con un filtro da 0,22 μ m filtro. Concentrazione finale 0,54 mM in 2x base ASM.
KanamicinaPreparare una soluzione madre da 50 mg/mL in acqua. Filtro sterilizzare con un 0,22 μ m filtrare e conservare a 4 °C.
KClFisher ScientificP217-500Concentrazione finale 30,0 mM in base 2x ASM.
KNO3Fisher ScientificP263-500Preparare un ceppo da 1 M in acqua e sterilizzare con un filtro 0,22 μ m filtro. Concentrazione finale 0,70 mM in base 2x ASM.
L-cisteina cloridratoFisher ScientificAAA1038922
Acido L-lattico SigmaL1750Preparare un ceppo da 1 M in acqua e filtrare sterilizzare con un 0,22 μ m filtro. Regolare il pH a 7,0. Concentrazione finale 18,6 mM in 2x basi ASM.
L-TriptofanoSigmaT0254Preparare un stock 0,1 M in 0,2 M NaOH e filtrare sterilizzare con un 0,22 μ m filtro. Conservare in frigorifero a 4 gradi C avvolto in un foglio di alluminio. Concentrazione finale 0,132 mM in base 2x ASM.
Mannitolo Sale AgarFisher ScientificB11407Preparare seguendo le raccomandazioni del produttore.
MenadioneSigmaM5625Preparare una soluzione madre da 10 mg/mL disciolta in etanolo al 96-100%. Conservare a 4 gradi C avvolto in un foglio di alluminio. Vortice prima dell'uso.
MgCl2*6H2O Fisher ScientificAA12288A9Preparare un brodo da 1 M in acqua e filtrare sterilizzare con un 0,22 μ m filtro. Concentrazione finale 1,21 mM in 2x basi ASM.
Mucina da stomaco suino - Tipo IISigmaM2378Preparare un brodo da 10 mg/mL (2x) in acqua; mescolare accuratamente prima della sterilizzazione in autoclave. Mantenere a 4 °C.
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500Preparare un stock da 0,2 M in acqua e sterilizzare con un filtro da 0,22 μ m filtro. Concentrazione finale 2,5 mM in 2x base ASM.
N-acetilglucosamina SigmaA8625Preparare un stock da 0,25 M in acqua e sterilizzare con un filtro da 0,22 μ m filtro. Conservare il brodo in frigorifero a 4 °C. Concentrazione finale 0,6 mM in 2x ASM base.
NaClFisher ScientificS271-500Concentrazione finale 103,7 mM in base 2x ASM.
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500Preparare un stock da 0,2 M in acqua e sterilizzare con un filtro da 0,22 μ m filtro. Concentrazione finale 2,6 mM in 2x base ASM.
NaOHFisher ScientificS318-500Preparare una soluzione madre da 5 M. Utilizzare per regolare il pH di 2x ASM base.
NH4ClFisher ScientificA661-500Concentrazione finale 4,6 mM in base 2x ASM.
ossolinicoPreparare una soluzione madre da 10 mg/mL 0,5 M NaOH. Filtro sterilizzare con un 0,22 μ m filtrare e conservare a 4 °C.
Polimixina BPreparare una soluzione madre da 10 mg/mL in acqua. Filtro sterilizzare con un 0,22 μ m filtrare e conservare a 4 °C.
Pseudomonas Isolation AgarFisher ScientificDF0927-17-1Preparare utilizzando le raccomandazioni del produttore.
Todd Hewitt BrodoFisher ScientificDF0492-17-6Preparare utilizzando le raccomandazioni del produttore.
Brodo di soia tripticoFisher ScientificDF0370-17-3Preparare utilizzando le raccomandazioni del produttore.
VancomicinaPreparare una soluzione madre da 50 mg/mL in acqua. Filtro sterilizzare con un 0,22 μ m filtrare e conservare a 4 °C.
Estratto di lievitoFisher ScientificB11929
Forcellino sintetico di lievito senza triptofanoSigmaY1876Concentrazione finale 8,0 mg/mL in 2x ASM base.
Sangue Acido

Riferimenti

  1. Cogen, J. D., Nichols, D. P., Goss, C. H., Somayaji, R. Drugs, drugs, drugs: Current treatment paradigms in cystic fibrosis airway infections. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S32-S39 (2022).
  2. O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373 (9678), 1891-1904 (2009).
  3. Jean-Pierre, F., Vyas, A., Hampton, T. H., Henson, M. A., O'Toole, G. A. One versus many: Polymicrobial communities and the cystic fibrosis airway. mBio. 12 (2), e00006-e00021 (2021).
  4. Martin, C., et al. Longitudinal microbial and molecular dynamics in the cystic fibrosis lung after elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy. Respir Res. 24 (1), 317(2023).
  5. Sosinski, L. M., et al. A restructuring of microbiome niche space is associated with elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy in the cystic fibrosis lung. J Cystic Fibros. 21 (6), 996(2022).
  6. Orazi, G., O'Toole, G. A. 34;It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  7. Nichols, D. P., et al. Clinical effectiveness of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor in people with cystic fibrosis: A clinical trial. Am J Respir Crit Care Med. 205 (5), 529-539 (2022).
  8. Filkins, L. M., O'Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: Polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS Pathog. 11 (12), e1005258(2015).
  9. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 35 (6), 947-953 (2016).
  10. Jean-Pierre, F., et al. Community composition shapes microbial-specific phenotypes in a cystic fibrosis polymicrobial model system. Elife. 12 (12), e81604(2023).
  11. Toole Orazi, G., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa alters Staphylococcus aureus sensitivity to vancomycin in a biofilm model of cystic fibrosis infection. mBio. 8 (4), e00873-e00917 (2017).
  12. Lipuma, J. J. The sense and nonsense of antimicrobial susceptibility testing in cystic fibrosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S46-S52 (2022).
  13. Coenye, T. Biofilm antimicrobial susceptibility testing: Where are we and where could we be going. Clin Microbiol Rev. 36 (4), e0002423(2023).
  14. Waters, V. J., et al. Reconciling antimicrobial susceptibility testing and clinical response in antimicrobial treatment of chronic cystic fibrosis lung infections. Clin Infect Dis. 69 (10), 1812-1816 (2019).
  15. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031(2020).
  16. Varga, J. J., et al. Antibiotics drive expansion of rare pathogens in a chronic infection microbiome model. mSphere. 7 (5), e0031822(2022).
  17. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  18. Clay, M. E., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutant fitness in microoxia is supported by an anr-regulated oxygen-binding hemerythrin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3167-3173 (2020).
  19. Hoffman, L. R., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutants are associated with cystic fibrosis lung disease progression. J Cyst Fibros. 8 (1), 66-70 (2009).
  20. Heirali, A., et al. Sputum microbiota in adults with CF associates with response to inhaled tobramycin. Thorax. 75 (12), 1058-1064 (2020).
  21. Nelson, M. T., et al. Maintenance tobramycin primarily affects untargeted bacteria in the cf sputum microbiome. Thorax. 75 (9), 780-790 (2020).
  22. Kesthely, C. A., Rogers, R. R., El Hafi, B., Jean-Pierre, F., O'Toole, G. A. Transcriptional profiling and genetic analysis of a cystic fibrosis airway-relevant model shows asymmetric responses to growth in a polymicrobial community. Microbiol Spectr. 11 (5), e0220123(2023).
  23. Jean-Pierre, F., Henson, M. A., O'Toole, G. A. Metabolic modeling to interrogate microbial disease: A tale for experimentalists. Front Mol Biosci. 8, 634479(2021).
  24. Hendricks, M. R., et al. Respiratory syncytial virus infection enhances Pseudomonas aeruginosa biofilm growth through dysregulation of nutritional immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1642-1647 (2016).
  25. Hogan, D. A., Vik, A., Kolter, R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 54 (5), 1212-1223 (2004).
  26. Wu, Y., et al. Co-assembling living material as an in vitro lung epithelial infection model. Matter. 7 (1), 216-236 (2024).

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