Questo studio presenta un modello ortotopico di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) basato sull'inoculazione intrapolmonare di sferoidi multicellulari di cellule fluorescenti A549-iRFP. Il modello ricapitola gli stadi clinici del NSCLC e risponde al cisplatino, secondo il monitoraggio dinamico in vivo della fluorescenza a lunghezza d'onda lunga.
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Articolo metodologico
Costruzione di un modello ortotopico di xenotrapianto di carcinoma polmonare non a piccole cellule che imita la progressione della malattia e predice le attività farmacologiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) è una malattia altamente letale con un microambiente tumorale complesso ed eterogeneo. Attualmente, i modelli animali comuni basati sull'inoculazione sottocutanea di sospensioni di cellule tumorali non ricapitolano il microambiente tumorale nel NSCLC. Qui descriviamo un modello murino ortotopico di xenotrapianto di carcinoma polmonare che impiega l'inoculazione intrapolmonare di sferoidi multicellulari tridimensionali (MCS). In particolare, le cellule NSCLC umane fluorescenti (A549-iRFP) sono state coltivate in micropiastre a 96 pozzetti a basso attaccamento con collagene per 3 settimane per formare MCS, che sono state poi inoculate intercostalmente nel polmone sinistro di topi nudi atimici per stabilire il modello di cancro del polmone ortotopico.
Rispetto alla linea cellulare A549 originale, la MCS della linea cellulare A549-iRFP ha risposto in modo simile ai farmaci antitumorali. Il segnale fluorescente a lunga lunghezza d'onda delle cellule A549-iRFP era fortemente correlato con i marcatori comuni della crescita delle cellule tumorali, tra cui il volume degli sferoidi, la vitalità cellulare e il livello di proteine cellulari, consentendo così il monitoraggio dinamico della crescita del cancro in vivo mediante imaging fluorescente. Dopo l'inoculazione nei topi, lo xenotrapianto A549-iRFP MCS è progredito in modo affidabile attraverso fasi molto simili agli stadi clinici del NSCLC, tra cui l'espansione del tumore primario, l'emergere di tumori secondari vicini e le metastasi delle cellule tumorali al polmone destro controlaterale e agli organi remoti. Inoltre, il modello ha risposto al farmaco di riferimento contro il cancro del polmone, il cisplatino, con la tossicità prevista e una progressione del cancro più lenta. Pertanto, questo modello murino ortotopico di xenotrapianto di NSCLC servirebbe come piattaforma per ricapitolare la progressione della malattia e facilitare lo sviluppo di potenziali farmaci antitumorali.
Introduzione
Tra tutti i disturbi oncologici, il cancro ai polmoni non solo infligge la più alta perdita di vita, ma reclama anche il secondo numero più alto di nuovi pazienti ogni annonegli Stati Uniti. Questa devastante malignità rappresenta un grave ostacolo nell'assistenza sanitaria moderna, che richiede una comprensione più profonda della sua intricata biologia e modalità terapeutiche più efficaci2. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) rappresenta l'85% del carcinoma polmonare e tende a svilupparsi in tumori solidi3. Una delle principali sfide nel cancro del polmone è il microambiente tumorale dinamico ed eterogeneo, che influenza profondamente la progressione del cancro e le risposte agli interventi terapeutici 4,5,6. Una comprensione più approfondita dell'interazione tra le cellule tumorali e il loro microambiente nelle diverse fasi del NSCLC richiede modelli patologici raffinati che ricapitolino le caratteristiche istologiche della progressione del NSCLC.
A questo proposito, i modelli animali ortotopici emergono come una strada promettente per la ricerca sul NSCLC. A differenza dei modelli di xenotrapianto sottocutaneo comunemente impiegati7, i modelli ortotopici presentano cellule tumorali che vengono inoculate direttamente nell'organo di origine. Per il cancro del polmone, ciò significa impiantare cellule tumorali direttamente nel tessuto polmonare 8,9. Di conseguenza, i modelli ortotopici di cancro del polmone imitano meglio il microambiente tumorale nativo, compresi i tessuti, i vasi e le componenti immunitarie vicine, migliorando così la loro rilevanza fisiologica e clinica.
Gli sferoidi multicellulari tridimensionali (MCS) rappresentano un altro approccio promettente per ricapitolare le caratteristiche dell'ambiente tumorale. La maggior parte dei tumori è caratterizzata dal complesso microambiente tumorale, comprese le varie interazioni cellula-cellula, la matrice extracellulare e i gradienti di ossigeno e sostanze nutritive 10,11. Le colture cellulari 2D tradizionali non hanno la complessità spaziale e strutturale per ricapitolare queste caratteristiche specifiche del tumore12. Al contrario, le MCS di dimensioni adeguate presentano una struttura eterogenea con un nucleo ipossico e necrotico, che ricapitola non solo il microambiente intratumorale ma anche la barriera fisiologica contro la penetrazione dei farmaci, che è uno dei principali meccanismi di resistenza ai farmaci nella terapia antitumorale 13,14,15.
Sfruttando sia i modelli animali ortotopici che le tecniche di coltura MCS, le MCS sono state inoculate a topi immunocompromessi per costruire con successo modelli ortotopici di cancro al seno e cancro alla prostata16,17. In questo articolo, riportiamo la metodologia dettagliata per costruire e caratterizzare un modello murino di xenotrapianto ortotopico di carcinoma polmonare. Questo metodo impiega l'inoculazione intrapolmonare di MCS 3D derivato da cellule di carcinoma polmonare umano fluorescente (A549-iRFP)18. Questo modello offre un'eccezionale opportunità per osservare la progressione in vivo del cancro del polmone attraverso stadi strettamente paralleli ai quattro stadi clinici del NSCLC. Inoltre, il cancro xenotrapianto di questo modello rispondeva al farmaco antitumorale del polmone clinicamente stabilito, il cisplatino.
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Protocollo
Lo studio sugli animali è stato condotto con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Pacifico (Protocolli animali 19R10 e 22R10). Per il presente studio sono stati utilizzati otto topi nudi amimici maschi di età compresa tra 5 e 6 settimane, del peso di 20-25 g, allevati con la dieta per roditori di riferimento e alloggiati in condizioni prive di agenti patogeni (SPF). Le gabbie, le lettiere e l'acqua potabile venivano sterilizzate in autoclave e cambiate regolarmente. Uno schema dell'inoculazione del tumore nei topi è mostrato nella Figura 1. Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.
1. Costituzione di MCS tridimensionali di celle A549-iRFP
- Incubare le cellule A549-iRFP (adenocarcinoma polmonare umano) in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 a 37 °C e farle crescere in un terreno di crescita completo DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina-streptomicina e 1 μg/mL di puromicina.
- Seminare le cellule A549-iRFP in una micropiastra sferoidale a fondo tondo a 96 pozzetti a bassissimo attacco con una densità di semina di 4.000 cellule/pozzetto, utilizzando 100 μL di terreno di crescita completo integrato con lo 0,3% di collagene.
- Centrifugare le micropiastre a 300 × g per 7 minuti a 4 °C per facilitare la formazione di MCS. Esaminare la morfologia MCS al microscopio per garantire l'aggregazione cellulare dopo la centrifugazione.
- Dopo 48 ore, aggiungere 100 μl di terreno di coltura completo a ciascun pozzetto per ottenere un volume totale di 200 μl di terreno di crescita per pozzetto.
- Sostituire 100 μL di terreno di coltura in ciascun pozzetto con un terreno di coltura completo fresco a giorni alterni.
2. Caratterizzazione di A549-iRFP MCS
- Osservare e visualizzare la morfologia di MCS utilizzando un microscopio e stimare il volume di MCS mediante simulazione con il software di riferimento di MATLAB basato sulle immagini del microscopio a contrasto di fase.
- Aprire un'immagine MCS nel software ImageJ.
- Utilizza le selezioni a mano libera per selezionare il bordo dell'MCS e aggiungerlo a ROI Manager.
- Fai clic su Modifica | Selezione | Crea maschera.
- Fai clic su Modifica | Inverti.
- Fare clic su File | Salva con nome | Tiff.
- Aprire il software ReViSP.
- Aprire l'immagine TIFF salvata facendo clic su Sfoglia.
- Fare clic su Avvia per completare la simulazione MCS.
- Misurare il segnale fluorescente iRFP utilizzando il sistema di imaging a infrarossi sul canale a 700 nm e quantificare il segnale fluorescente utilizzando il software (ad esempio, Image Studio).
- Aprire il software Image Studio.
- Nella scheda Canali , selezionare 700 e Intensità = 5.
- Nella scheda Controlli di scansione , selezionare 84 μm, Medio, 0,0 mm e Capovolgi immagine. Mantieni tutto il resto come predefinito.
- Fare clic su Avvia per avviare la scansione.
- Valutare e quantificare la vitalità cellulare utilizzando il saggio di vitalità cellulare 3D secondo il protocollo del fornitore.
- Valutare e quantificare le proteine cellulari utilizzando il saggio BCA secondo il protocollo del fornitore.
3. Selezione MCS per l'inoculazione del tumore
NOTA: Dopo che gli MCS sono stati seminati in micropiastre sferoidi e cresciuti per 2-3 settimane con un regolare scambio del terreno di crescita, selezionare MCS con le seguenti caratteristiche appropriate per l'inoculazione del tumore.
- Osservare la morfologia della MCS al microscopio e scegliere la MCS con una forma rotonda con bordi complessivamente lisci ma con 5-10 gemme ruvide (frecce nella Figura 2F) e un diametro compreso tra 700 e 800 μm.
- Misurare la fluorescenza iRFP (fare riferimento al passaggio 2.2) e selezionare l'MCS i cui segnali fluorescenti si trovano entro una deviazione standard della media.
4. Inoculazione intrapolmonare di MCS
NOTA: Utilizzare uno spray con alcol isopropilico al 70% per pulire la stazione chirurgica e gli strumenti prima di maneggiare gli animali.
- Anestetizzare ogni topo con un'iniezione IP di 80 mg/kg di ketamina e 12 mg/kg di xilazina; Pizzicare i piedini del mouse con una pinza per garantire un'anestesia completa.
- Iniettare 10 μL di buprenorfina cloridrato (0,3 mg/mL) per via sottocutanea per ridurre il dolore.
- Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza.
- Posiziona il mouse in una posizione dorsale e fissa gli arti in una posizione di allungamento con dei nastri.
- Sterilizzare la pelle della schiena con bastoncini di iodio e tampone imbevuto di alcol.
- Praticare un'incisione di 0,5-1 cm utilizzando le forbici chirurgiche sul lato posteriore sinistro (Figura 1B). Usa con attenzione una pinza per separare i tessuti muscolari e adiposi fino a quando la parete toracica e il movimento polmonare sono visibili.
- Trasferire un MCS selezionato da una micropiastra in una capsula di Petri di vetro contenente PBS ghiacciato, utilizzando una pipetta.
- Collegare un ago da 20 G a una siringa di vetro da 100 μL, preraffreddarla con ghiaccio e aspirare 20 μL di una miscela preraffreddata di PBS e Matrigel (1:1 v/v).
- Utilizzare la siringa per aspirare rapidamente un MCS dalla capsula di Petri in un volume minimo di miscela PBS-Matrigel, mantenendo l'MCS nella parte metallica dell'ago.
NOTA: Mantenere una presa salda sulla siringa e sullo stantuffo per evitare che l'MCS scivoli fuori dall'ago. - Inserire delicatamente l'ago verticalmente tra due costole a una profondità di ~3 mm e iniettare lentamente tutta la miscela da 20 μl di PBS e Matrigel che contiene l'MCS.
NOTA: Evitare una forza eccessiva durante l'inserimento per evitare danni al polmone, al sistema vascolare o al cuore. - Rimuovere con cautela l'ago e applicare un triplo unguento antibiotico sulla ferita.
- Sigillare l'incisione con clip chirurgiche, che devono essere rimosse dopo 2 settimane.
NOTA: Non suturare l'incisione perché le linee di sutura potrebbero interferire con l'imaging a fluorescenza. I topi nudi sono in grado di guarire naturalmente dopo l'intervento chirurgico. - Posiziona l'animale su un termoforo a infrarossi e coprilo con salviette da laboratorio per mantenere la temperatura corporea. Monitora l'animale per almeno 30-60 minuti fino a quando non si sveglia e si muove correttamente.
- Iniettare 10 μL di buprenorfina cloridrato (0,3 mg/mL) per via sottocutanea 3 volte al giorno per le prime 48 ore per ridurre il dolore.
5. Monitoraggio post-chirurgico
- Misurare il peso corporeo ogni 3-4 giorni.
- Misurare il segnale fluorescente iRFP dallo xenotrapianto tumorale ogni 3-4 giorni su un sistema di imaging di piccoli animali a canale 700 nm in quattro posture: sinistra, destra, dorsale e ventrale, mentre i topi sono tenuti in anestesia mediante inalazione di isoflurano (portata: 1,5-2 L/min di ossigeno contenente isoflurano all'1,5%) per 2-3 minuti.
- Quantificare l'intensità fluorescente netta del cancro xenotrapianto in vivo utilizzando un software (ad esempio, Image Studio).
- Utilizzare un rettangolo fisso (A1, 200 x 125 pixel) come finestra di campionamento per l'area del torace dei topi.
- Utilizzare la funzione a mano libera per tracciare la forma dei mouse all'interno del rettangolo (A1) e misurare l'intensità della fluorescenza (F1) nell'area A1.
- Usa un altro rettangolo più piccolo (A2, 25 x 40 pixel) per misurare la fluorescenza di fondo (F2) dei topi nella zona della coscia.
- Utilizzare l'equazione (1) per calcolare l'intensità fluorescente netta del cancro xenotrapianto in ciascun topo:
(1)
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Risultati
Caratterizzazione di A549-iRFP MCS
Gli MCS A549-iRFP sono stati coltivati con successo in micropiastre sferoidi con l'assistenza del collagene e della centrifugazione. Quando la MCS ha raggiunto un diametro di circa 500 μm dopo 1 settimana, sia la MCS A549 che la MCS A549-iRFP sono state esposte a una varietà di farmaci e formulazioni antitumorali per 3 giorni e poi mantenute in terreno di crescita libero da farmaci per altri 4 giorni. L'MCS A549-iRFP ha mostrato un modello di risposta che rispecchia ...
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Discussione
La costruzione di A549-iRFP MCS è una procedura di laboratorio semplice e altamente riproducibile e può essere tradotta in formazione di MCS per più linee cellulari. La MCS generata con l'aiuto della centrifugazione e del collagene mostra una struttura più integra e solida-simile a quella del tumore entro 3-4 giorni. Questo metodo garantisce la formazione di robusti sferoidi che mantengono la loro struttura integrale per periodi prolungati, in genere 2-3 settimane o anche più a lungo fino a quando iniziano a emergere pic...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni SAAG e SEED dell'Università del Pacifico. Ringraziamo il Dr. William Chan per aver concesso l'accesso al sistema Odyssey Infrared Imaging 205 e il Dr. John Livesey per aver concesso l'accesso al lettore di piastre SpectraMax iD3. Ringraziamo la Dott.ssa Melanie Felmlee per la consulenza tecnica sui protocolli per gli animali.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 100 µ L Siringa in vetro | Hamilton | Part/REF #80601 | |
| Ago da 20 g | Thermo Fisher Scientific Inc. | 826D | |
| Corning | 15-100-173 | ||
| A549-iRFP | Imanis Scienze della vita | CL082-STAN | |
| AIN-93M Dieta per roditori maturi | Diete di ricerca, Inc. | ||
| Topo nudo atimico | Charles River Laboratories, Inc. | Codice ceppo: 490; omozigote | |
| BCA | Pierce | 23227 | |
| Buprenorfina cloridrato | Patterson Numero | NDC veterinario: 42023-179-05 | |
| CellTiter-Glo Saggio di vitalità cellulare 3D | Promega | G9683 | |
| Collagene | Gibco | A1064401 | |
| DMEM | Corning | MT10013CV | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Cytiva HyClone | SH3039603 | |
| ImageJ | Strumento open source (https://imagej.net/ij/) | N/A | |
| Image Studio | LI-COR | versione 5.2 | |
| Isoflurano | Patterson Veterinario | NDC Numero: 17033-0091-25 | |
| Ketamina | Patterson Veterinario | NDC Numero: 50989-0161-06 | |
| Microscopio | Keyence | : BZ-X710 | |
| Matrigel | Corning | CB-40234 | |
| Odyssey Infrared Imaging 205 System | LI-COR | Numero di modello: 9140 | |
| PBS | Corning | MT21040CV | |
| Pearl Trilogy sistema di imaging per piccoli animali | LI-COR | Numero di modello: 9430 | |
| Penicillina-Streptomicina | Corning | MT30002CI | |
| Puromicina | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| software ReViSP di MATLAB | Strumento open source su Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/) | N/A | |
| Clip chirurgiche - Sistema AutoClip | Strumenti per la scienza fine | 12020-00 | |
| Xylazine | Patterson Veterinary | NDC Numero: 61133-6017-01 |
Riferimenti
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