Imaging e quantificazione della vascolarizzazione epatica dei topi mediante ecografia Doppler ultraveloce

Sommario

L'ecografia Doppler ultraveloce (UFUS) con elevata risoluzione spaziale (100 μm) e sensibilità rappresenta una modalità di imaging non invasiva adatta per ottenere una panoramica qualitativa completa della vascolarizzazione epatica. L'UFUS facilita anche le misurazioni quantitative della microvascolarizzazione, con l'obiettivo di migliorare la nostra comprensione dei meccanismi delle malattie vascolari.

Abstract

L'imaging non invasivo in vivo del sistema vascolare è un potente strumento per studiare i meccanismi della malattia nei roditori. Per ottenere un imaging ad alta sensibilità della microvascolarizzazione utilizzando metodi ecografici Doppler, sono preferite le modalità di imaging che utilizzano il concetto di imaging ultraveloce. Aumentando la frequenza dei fotogrammi dell'ecografo a migliaia di fotogrammi al secondo, è possibile migliorare la sensibilità del flusso sanguigno fino a 2 mm/s e ottenere informazioni funzionali sulla microcircolazione rispetto a una sensibilità di circa 1 cm/s nelle modalità Doppler convenzionali. Sebbene l'ecografia Doppler ultraveloce (UFUS) sia stata adottata nelle neuroscienze, dove può catturare l'attività cerebrale attraverso l'accoppiamento neurovascolare, presenta sfide maggiori quando si esegue l'imaging della vascolarizzazione degli organi addominali a causa di movimenti più ampi legati alla respirazione. Il fegato, posizionato anatomicamente sotto il diaframma, è particolarmente suscettibile al movimento fuori piano e al movimento respiratorio oscillatorio. Questi artefatti non solo influenzano negativamente l'imaging Doppler, ma complicano anche l'analisi anatomica delle strutture vascolari e il calcolo dei parametri vascolari. Qui, presentiamo un'analisi di imaging qualitativa e quantitativa della vascolarizzazione epatica nei topi mediante UFUS. Identifichiamo le principali strutture vascolari anatomiche e forniamo illustrazioni grafiche dell'anatomia macroscopica epatica, confrontandola con una valutazione anatomica approfondita della vascolarizzazione epatica basata su letture Doppler. Inoltre, abbiamo sviluppato un protocollo di quantificazione per misurazioni robuste del volume ematico epatico della microvascolarizzazione nel tempo. Per contemplare ulteriori ricerche, l'analisi vascolare qualitativa fornisce una panoramica completa e suggerisce una terminologia standardizzata per i ricercatori che lavorano con modelli murini di malattia epatica. Inoltre, offre l'opportunità di applicare gli ultrasuoni come metodo complementare non invasivo per ispezionare i difetti vascolari epatici in vivo e misurare le alterazioni microvascolari funzionali in profondità all'interno dell'organo prima di svelare le anomalie dei vasi sanguigni a livello di scala micron utilizzando la colorazione ex vivo su sezioni di tessuto.

Introduzione

I modelli murini preclinici sono ampiamente utilizzati per studiare l'insorgenza e la progressione della malattia microvascolare epatica ^1,2. Il follow-up longitudinale è vantaggioso, poiché le alterazioni dei capillari sanguigni si verificano in una fase precoce della malattia prima che compaiano l'infiammazione e la fibrosi, che possono portare alla cirrosi nel tempo¹. Per studiare la progressione della malattia, potenti strumenti di imaging sono essenziali per visualizzare e misurare la funzione dei vasi sanguigni in vivo. L'ecografia Doppler ultraveloce (UFUS) rappresenta una modalità adatta per il suo basso costo, portabilità, semplicità e capacità in tempo reale, ma anche perché è una procedura non invasiva e che fa risparmiare tempo³. Rispetto all'ecografia Doppler convenzionale, che può raggiungere una risoluzione spaziale simile ma è limitata a un flusso sanguigno di grandi dimensioni, l'UFUS consente di rilevare un flusso sanguigno lento fino a 2 mm/s da 1 cm/s, consentendo di sondare il contributo di vasi molto più piccoli⁴. L'UFUS migliora la sensibilità, che si ottiene attraverso trasmissioni a onda piana con un ampio campo visivo in una singola sonificazione per aumentare il frame rate e quindi il numero di immagini ecografiche disponibili⁵. L'elevato numero di campioni temporali migliora la cancellazione del segnale proveniente dal tessuto e migliora la rivelazione degli echi riflessi dai diffusori di sangue, aumentando la sensibilità senza richiedere agenti di contrasto⁶. Stimando l'energia degli echi del diffusore di sangue attraverso la stima del power Doppler, si ottiene una quantità che è proporzionale al volume di sangue in ogni pixel anche se i vasi sanguigni sono troppo piccoli per essere risolti nell'immagine⁷.

L'UFUS offre una combinazione favorevole di risoluzione spaziale e temporale, rendendolo uno strumento adatto per la valutazione qualitativa dell'architettura vascolare epatica. Sebbene l'utilizzo di uno scanner a ultrasuoni sia relativamente semplice, è necessaria una comprensione completa dell'anatomia del fegato per navigare attraverso la vascolarizzazione epatica dei diversi lobi epatici nei topi. Studi recenti si sono concentrati sulla descrizione dell'anatomia del fegato murino e dell'albero vascolare epatico utilizzando la tomografia micro-computerizzata 3D (μ-CT)^8,9. Anche se alcune delle differenze morfologiche tra il fegato umano e quello di topo sono ben documentate¹⁰, la ricerca condotta sui roditori spesso adotta terminologie anatomiche rilevanti per l'uomo, portando a una certa confusione nel contesto degli animali quadrupedi. Anche la nomenclatura standardizzata riconosciuta, come i Nomina Anatomica Veterinaria (NVA), manca di informazioni sufficienti su terminologie coerenti per le strutture vascolari epatiche dei roditori¹¹. Oltre alla sfida delle strutture anatomiche scarsamente documentate nei roditori, sorgono difficoltà ancora maggiori nell'interpretazione delle letture ecografiche, in particolare quando si prevede un approccio riproducibile.

Ottenere informazioni funzionali non invasive sugli organi viventi su varie scale spaziali pone sfide per l'imaging in vivo ³. Le modalità di imaging epatico di fascia alta come la TC, la risonanza magnetica e l'angiografia (MRI/MRA) o l'imaging Doppler convenzionale che utilizza onde focalizzate sono essenziali per valutare la progressione della malattia, ma non riescono a catturare la maggior parte delle dinamiche del flusso sanguigno ad eccezione dell'imaging fotoacustico 12,13,14. UFUS ha un'elevata sensibilità e può rilevare un flusso sanguigno lento in piccoli vasi, che non si limitano a flussi più grandi di un centimetro al secondo ^4,15. Recentemente, abbiamo sviluppato un metodo di imaging personalizzato basato su considerazioni anatomiche utilizzando UFUS, consentendo una misurazione affidabile del volume del sangue epatico in un modello murino con espansione vascolare¹⁶.

In questo protocollo, delineiamo la procedura per l'imaging UFUS non invasivo del fegato utilizzando una piattaforma ecografica disponibile in commercio originariamente sviluppata per l'imaging cerebrale funzionale. Per semplificare il processo e migliorare il recupero delle informazioni, offriamo un'illustrazione completa del fegato di topo con nomenclatura anatomica e un metodo di analisi completo. Inoltre, forniamo una rappresentazione dettagliata delle letture di imaging acquisite come riferimento, indicando strutture anatomiche e punti di riferimento comuni per facilitare la selezione del piano dipendente dall'operatore. Inoltre, includiamo un'illustrazione pertinente delle analisi qualitative e quantitative della vascolarizzazione epatica.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo la legislazione europea (Direttiva 2010/63/UE) e le linee guida del governo olandese e approvati dal Comitato Etico Animale del Leiden University Medical Center.

1. Preparazione del mouse per l'imaging UFUS (tempo ~ 10 min)

1. Preparazione del setup di imaging
   1. Centrifugare il gel per la trasmissione degli ultrasuoni in provette da 50 mL a 100 x g per 3-5 minuti per prevenire la formazione di bolle d'aria.
   2. Accendere il termoforo e riscaldare fino a 35 °C. Riempi il serbatoio dell'acqua stampato in 3D con acqua deionizzata.
      NOTA: Bolle d'acqua o piccole particelle presenti nell'acqua possono disturbare la misurazione Doppler.
2. Anestetizzazione dell'animale
   1. Pesare l'animale. Sono stati utilizzati cucciolate maschi e femmine di 8-16 settimane con un peso corporeo di 19-32 g. Preparare una miscela anestesiologica di ketamina con una dose di somministrazione di 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg in NaCl allo 0,9%. Preparare la miscela sterile e fresca ogni giorno perché la miscela non è stabile e potrebbe perdere potenza.
      NOTA: Il peso corporeo preferito dell'animale è compreso tra 23 e 30 g.
   2. Disinfettare il sito di iniezione, cioè il quadrante inferiore destro o sinistro dell'addome, utilizzando una garza ed etanolo al 70%. Iniettare 10 μL/g di peso corporeo intraperitoneale (ip) con un ago da 27 G e una siringa monouso da 1 ml o una siringa da insulina da 30 G.
   3. Rimetti l'animale in una gabbia su un termoforo senza chiudere il coperchio della gabbia. Avvia timer.
      NOTA: L'anestesia profonda dovrebbe durare circa 40 minuti. Se si desidera una sessione di imaging più lunga, prendere in considerazione l'utilizzo di un'anestesia reversibile, come miscele di ketamina 60 mg/kg e medetomidina 0,4 mg/kg in NaCl allo 0,9% seguite da inversione con iniezione sottocutanea di atipamezolo 1 mg/kg. L'anestesia per iniezione è preferita all'anestesia per inalazione a causa della configurazione di imaging.
   4. Verificare l'efficacia dell'anestesia. Confermare se l'anestesia funziona pizzicando delicatamente le zampe posteriori dopo circa 5 minuti. Se l'animale continua a reagire, attendere altri 2-3 minuti per ottenere l'anestesia completa.
   5. Applicare un unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione corneale e i traumi oculari quando l'animale dorme profondamente. Controlla nuovamente i riflessi e inizia la procedura solo quando l'animale non mostra alcuna reazione al pizzicamento.
3. Preparazione dell'area di imaging (Figura 1)
   1. Taglia delicatamente la pancia dell'animale con un rifinitore veterinario mentre è posizionato su un termoforo. Eseguire il taglio molto delicatamente senza applicare compressione sul torace o sull'addome.
   2. Applicare la crema depilatoria per non più di 2 minuti.
      ATTENZIONE: Non prolungare il tempo di incubazione della crema depilatoria, poiché potrebbe causare infiammazioni cutanee. Ciò non solo influisce sulla qualità dell'imaging, ma può anche causare disagio all'animale.
   3. Rimuovere la crema depilatoria con dei fazzoletti di carta e pulire delicatamente con acqua tiepida.
4. Posizionare l'animale e la configurazione di imaging per le misurazioni Doppler (Figura 2A).
   1. Posiziona l'animale dorsalmente su un termoforo e fissa delicatamente le zampe con del nastro adesivo. Idratare la pelle con una piccola quantità di acqua tiepida.
   2. Applicare il gel centrifugato per la trasmissione degli ultrasuoni direttamente sulla pelle rasata utilizzando una siringa da 20 mL.
      NOTA: Le bolle d'aria possono influenzare l'imaging Doppler e causare artefatti.
   3. Posiziona il serbatoio dell'acqua stampato in 3D pieno d'acqua sopra l'animale. Assicurarsi che l'altezza del serbatoio dell'acqua sia adatta all'animale, a circa 1 mm sopra di esso, e non schiacci l'animale.
   4. Verificare la presenza di aria tra il gel di trasmissione degli ultrasuoni e il polimetilpentene termoplastico (PMP) del serbatoio dell'acqua.

2. Funzionamento della sonda e selezione del piano (temporizzazione ~ 10 min)

1. Avvia il software e crea una sessione sperimentale sul sistema. Avviare il software di scansione.
   NOTA: Il software di scansione è integrato nel sistema.
2. Centrare i motori facendo clic su Sì nella finestra pop-up. Un sistema motorizzato viene utilizzato per controllare a distanza la sonda tramite software di scansione. Centrando i motori, la sonda si muoverà automaticamente in tre direzioni, cioè verticalmente, lateralmente e ruotata. Assicurarsi che nessun oggetto ostacoli la traiettoria della sonda per evitare di danneggiare l'apparecchiatura.
   NOTA: È fondamentale centrare i motori; In caso contrario, il software non funziona correttamente.
3. Creare una nuova sessione sperimentale selezionando Sessione dal menu. Inserisci le informazioni richieste nel pannello della sessione, tra cui Progetto, Oggetto, Sessione, Nome utente, Commento e Tag. Fare clic su Convalida.
   NOTA: La sessione deve essere creata prima di acquisire o salvare i dati di imaging. Le informazioni sulla sessione possono essere modificate durante l'esperimento, ma tieni presente che modificheranno anche la destinazione per il salvataggio dei dati.
4. Posizionare la sonda. La sonda ultrasonica lineare da 15 MHz a 128 elementi è collegata al sistema attraverso un sistema motorizzato composto da un modulo motore a quattro assi, ovvero tre sensi di movimento traslazionali e uno rotatorio.
   1. Vai al menu Sposta sonda e utilizza il sistema di posizionamento controllato da computer per spostare la sonda nell'acqua nel serbatoio dell'acqua stampato in 3D. Utilizzare i pulsanti di controllo indicati nella posizione della sonda per muovere i motori, definendo i passi in mm per il movimento di traslazione (X, Y e Z) o in ° per il movimento rotatorio (R). Per evitare incidenti in direzione Z, definire il limite Z in Sicurezza.
      NOTA: È fondamentale che gli elementi della sonda siano a contatto con l'acqua. Tuttavia, evitare di spostare la sonda completamente in acqua, poiché ciò potrebbe danneggiare l'apparecchiatura. Se i motori non riescono a raggiungere la posizione, viene visualizzato l'avviso Fuori area di lavoro.
   2. Salva le coordinate come posizione di riferimento cliccando su Imposta Home. Non modificare le traslazioni e le rotazioni contemporaneamente perché R è relativo a X, Y e Z. Fare sempre clic su Imposta inizio prima di modificare R.
   3. Definisci i parametri di imaging e visualizzazione. Vai al menu Live view e fai clic su Riproduci per selezionare il piano di interesse.
      ATTENZIONE: Avviare solo una visualizzazione dal vivo o un'acquisizione quando gli elementi della sonda a ultrasuoni sono circondati da un mezzo corrispondente all'impedenza acustica per garantire la durata dell'apparecchiatura e prevenire il surriscaldamento.
5. Scegli i parametri di imaging in Preset.
   1. Caricare una sequenza di ultrasuoni ultrasensibili Doppler da 10 ms con il pulsante Carica sequenza , ad esempio, 11 onde piane composte (angoli da -10° a 10°) con una tensione di imaging di 25 V e un framerate Doppler di 10 ms.
      NOTA: Non è necessario utilizzare una sequenza Doppler veloce (ad es. 10 ms) per visualizzare e filtrare i movimenti respiratori dell'organo durante l'analisi.
   2. Definisci una profondità di imaging compresa tra 1 mm e 50 mm, con una profondità massima di 50 mm. L'impostazione predefinita è una profondità di 9 mm da 1 mm a 10 mm, con la profondità consigliata tra 2 mm e 12 mm.
      NOTA: A seconda delle dimensioni dell'animale e del serbatoio dell'acqua, la profondità di imaging può essere adattata a esigenze specifiche.
6. Selezionare i parametri di visualizzazione.
   1. Scegli Doppler per visualizzare la vascolarizzazione.
      NOTA: L'intensità dei pixel nell'U.A. rappresenta il volume del sangue e deve essere confrontata solo quando si utilizza la stessa sonda e sequenza.
   2. Scegli Media per applicare la media temporale per ottimizzare il rapporto segnale/rumore.
      NOTA: La media temporale delle immagini aumenta la qualità dell'immagine ma riduce la frequenza dei fotogrammi. A seconda dell'obiettivo, è necessario fare un compromesso adeguato.
   3. Scegli Compressione immagine: Logaritmica (alta), Radice quadrata (intermedia) o Lineare (bassa). In alternativa, è possibile adattare l'intervallo di contrasto automaticamente o manualmente utilizzando i cursori per le opzioni di contrasto alto e basso.
      NOTA: I dati non sono influenzati dalla scelta della compressione dell'immagine; Influisce solo sulla visualizzazione dell'imaging in tempo reale.
   4. Seleziona la scala della Mappa dei colori dal nero al bianco selezionando l'opzione Grigio o dal nero-rossastro al giallo selezionando Caldo.
7. Selezione del piano (Figura 2B)
   1. Selezionare il piano di imaging sui punti di riferimento anatomici. Passa dalla visualizzazione del Doppler alla modalità B per familiarizzare con l'anatomia dei lobi epatici e della vascolarizzazione.
   2. Interrompere la visualizzazione Live facendo clic sull'icona Stop .
   3. Vai al menu Sposta sonda per navigare la sonda e seleziona un piano facendo clic su Imposta Home per salvare le coordinate come posizione di riferimento. Assicurarsi che l'albero vascolare sia ben definito e visibile con il minor segnale possibile fuori dal piano.
   4. Torna al menu Live view e fai clic sull'icona Stop .

3. Acquisizione scansione Doppler (Timing ~ 20 min)

1. Avvia un'acquisizione Doppler con un framerate di 10 ms.
   1. Vai al menu fUS 2D per visualizzare le variazioni emodinamiche nel tempo in una posizione specifica (Figura 3). Per aumentare il contrasto, somministrare un bolo di 50 μL per via endovenosa (iv) di microbolle iniettate con una concentrazione di 2 x 10⁸ microbolle per mL alla vena caudale.
   2. Nel tocco Preset, definire la durata totale della registrazione in secondi (30 s). Scegliere una modalità continua senza pause tra le immagini impostando Tempo tra le immagini su 0 s.
   3. Premere il pulsante Registra per avviare l'acquisizione 2D. La registrazione può essere annullata premendo il pulsante Stop . I dati possono andare persi quando l'acquisizione viene interrotta prima del completamento.
2. Visualizza e adatta la registrazione acquisita.
   1. Se lo si desidera, modificare il contrasto e la mappa dei colori toccando Visualizzazione. Se necessario, riproduci la registrazione scorrendo i fotogrammi con il cursore, incluso nella funzione Tempo.
3. Salvare i dati.
   1. Specificare un nome per la registrazione acquisita per salvare il file in formato .scan nella cartella della sessione. Alla fine di ogni registrazione viene proposta automaticamente una finestra pop-up per salvare i dati. I dati vengono salvati automaticamente.
4. Avvia un'altra acquisizione facendo clic sulla scheda Preset e ripeti dal passaggio 3.1.1 in poi.
5. Rimuovi la configurazione di imaging e prenditi cura dell'animale.
   1. Vai al menu Sposta sonda per spostare verticalmente la sonda verso l'alto all'esterno del serbatoio dell'acqua stampato in 3D. Rimuovi il setup e il gel ad ultrasuoni e sblocca l'animale.
   2. Eutanasia dell'animale quando il disegno sperimentale raggiunge il punto finale; In caso contrario, continuare con i passaggi seguenti.
   3. Applicare una crema idratante sulla zona della pelle rasata dell'animale se si intendono misurazioni longitudinali.
   4. Rimetti l'animale nella gabbia e lascialo svegliare dall'anestesia sotto una lampada termica per prevenire l'ipotermia. Monitorare l'animale durante il recupero.
   5. Rimetti l'animale nella gabbia ventilata individualmente quando torna a camminare normalmente. Termina gli esperimenti sugli animali da laboratorio prima di analizzare il set di dati.

4. Analisi quantitativa (Timing ~ 1 h)

1. Aprire lo script di analisi gui_analysis.m disponibile nel file supplementare 1.
2. Seleziona la scansione e imposta i parametri quantitativi nelle impostazioni: 10 regioni di interesse (ROI) con una dimensione del voxel di 2 x 2. Scegliere 40 ms per ogni fotogramma per eseguire l'integrazione Doppler.
3. Disegnare la periferia vascolare dell'organo; i 10 ROI sono preposizionati automaticamente tra le arterie chiaramente visibili e possono essere regolati manualmente se necessario (Figura 4A). Chiudete la finestra di dialogo mobile quando siete soddisfatti del posizionamento. Garantire un'acquisizione stabile (Figura 4B) per un calcolo affidabile del volume sanguigno, evitando acquisizioni influenzate da forti artefatti da movimento (Figura 4C).
4. Quantificare il volume medio di sangue epatico in U.A. dei 10 ROI totali stimando automaticamente la media e la deviazione standard dei valori del frame di quiete entro la registrazione di 30 s (Figura 4D).
   NOTA: La tabella dei dati delle intensità dei ROI può essere copiata/incollata direttamente in un file di foglio di calcolo.
5. Ripetere l'analisi per almeno due piani aggiuntivi, -0,3 mm e -0,6 mm, in direzione caudale. Quantificare tutti i dati di acquisizione prima di eseguire l'analisi statistica.
6. Controllare la deviazione standard delle intensità sull'intera immagine e determinare un cutoff come media complessiva (μ) con 2 deviazioni standard (2σ) per escludere oggettivamente le misurazioni suscettibili di artefatti da movimento (Figura 4E).
   NOTA: La media e la deviazione standard dei valori del fotogramma silenzioso stimati sull'intera immagine sono fornite nella prima riga della tabella dati.
   ATTENZIONE: Gli artefatti di movimento impediscono una quantificazione robusta e devono essere identificati oggettivamente in base all'analisi dell'intera immagine temporale.
7. Prendiamo la media di tutto il volume medio del sangue epatico quantificato su 3 piani diversi in 30 ROI per animale nella fase 4.3 (Figura 4F). Applica il test ROUT 1% in un software di analisi statistica per identificare i ROI anomali prima di calcolare una media di 30 ROI per animale. Per migliorare la stima del volume del sangue, registrare piani aggiuntivi per animale.
8. Per somministrare il trattamento del veicolo, disinfettare il sito di iniezione, cioè il quadrante inferiore destro o sinistro dell'addome, utilizzando una garza ed etanolo al 70%. Iniettare 20 μL di soluzione fisiologica o DMSO ip con un ago da 27G e una siringa monouso da 1 mL o una siringa da insulina da 30G o somministrare 100 μL di (idrossipropil) metilcellulosa mediante sonda gastrica utilizzando un ago da alimentazione riutilizzabile da 30G con punta rotonda. Tracciare i dati di 3 coorti che ricevono soluzione salina o DMSO tramite ip o somministrazione orale (po) di cellulosa (Figura 4G). Eseguire l'analisi in modo cieco senza rivelare la condizione e/o il trattamento ricevuto.
   NOTA: La somministrazione del veicolo non ha alcun impatto sulle misurazioni del volume del sangue.

Risultati

Seguendo il protocollo, l'imaging della vascolarizzazione epatica è facilitato sulla base della standardizzazione delle strutture anatomiche e della terminologia corrispondente (Figura 1). Per proporre una nomenclatura standardizzata per i ricercatori che utilizzano modelli epatici preclinici, abbiamo mostrato schematicamente il posizionamento comune del fegato nella cavità addominale dei topi (Figura 1A), fornito la disposizione strutturale dei diversi lobi epatici (Figura 1B) e specificato la rete vascolare arteriosa (Figura 1C). Dotato di competenze anatomiche, l'imaging UFUS in vivo è stato eseguito utilizzando un serbatoio d'acqua stampato in 3D per ridurre gli artefatti di movimento (Figura 2A). L'impedenza acustica è stata corretta introducendo la sonda nell'acqua e applicando il gel di trasmissione degli ultrasuoni direttamente sulla pelle rasata dell'animale. Adottando questa configurazione, la respirazione e altri artefatti di movimento sono ridotti poiché la sonda non è a diretto contatto con il torace e l'addome in movimento dell'animale. In questo modo, abbiamo visualizzato la struttura vascolare dei lobi destro e sinistro, che sono facilmente accessibili dagli UFUS a causa della loro posizione superficiale (Figura 2B). Altri lobi epatici, come il caudato e il lobo quadrato, sono situati più in profondità nel corpo, rendendo più difficile identificare anatomicamente il sistema vascolare epatico correttamente da parte dell'UFUS.

Avendo dimostrato l'importanza di indicazioni e interpretazioni anatomiche standardizzate e comunemente accettate delle strutture vascolari, abbiamo eseguito più scansioni Doppler su vari piani per fornire una panoramica completa della vascolarizzazione epatica visualizzata da UFUS con mezzo di contrasto nei topi (Figura 3). Abbiamo delineato la rete arteriosa epatica dei singoli lobi epatici, cioè i lobi laterale sinistro (LL), mediale sinistro (LM), laterale destro (RL) e mediale destro (RM). Inoltre, le arterie principali sono etichettate, come l'aorta addominale (AA), l'arteria epatica (HA), l'arteria epatica laterale sinistra (LLHA) e l'arteria epatica mediale destra (RMHA). È importante notare che i lobi del fegato possono essere posizionati in modo leggermente diverso a seconda della posizione e del movimento peristaltico dell'intestino tenue (SM), nonché dello stato di riempimento dello stomaco (S). Questa panoramica con mezzo di contrasto dell'intera vascolarizzazione del fegato di topo fornisce un atlante vascolare completo per l'imaging epatico in vivo mediante UFUS.

Un'accurata selezione dei piani anatomici è fondamentale per ottenere una lettura quantitativa derivata da un lobo epatico. È possibile ottenere misurazioni affidabili del volume sanguigno selezionando manualmente 10 regioni di interesse (ROI) per piano (Figura 4A). Per una quantificazione affidabile del volume sanguigno del microcircolo, è necessaria un'acquisizione stabile con una bassa variazione dell'intensità media dell'immagine. Questo è determinato in base al valore medio dell'immagine (MIV) dell'intera immagine nel tempo (Figura 4B), a differenza di una registrazione suscettibile di artefatti di movimento significativi (Figura 4C). Per gestire gli artefatti da movimento, è stata utilizzata la selezione automatica di un basso MIV per una quantificazione affidabile delle misurazioni del volume ematico epatico (Figura 4D) tracciando la deviazione standard di tutti i bassi MIV temporali di un'intera immagine (Figura 4E). Le scansioni Doppler di più piani per animale mostrano un'accettabile intra e intervariabilità all'interno e tra i topi di 3 diverse coorti dopo il trattamento anomalo su 30 ROI per animale con test ROUT 1% (Figura 4F). Per migliorare la stima del volume sanguigno per animale, si consiglia di registrare piani aggiuntivi o di aumentare il numero di ROI selezionati per aereo. Inoltre, le letture del volume ematico possono essere utilizzate per monitorare il trattamento farmacologico, mirando in particolare alla microvascolarizzazione. Somministrando il veicolo attraverso due vie di somministrazione, abbiamo dimostrato che non vi è alcun effetto sulle misurazioni del volume ematico epatico (Figura 4G). Questi risultati indicano che la delezione genica o la somministrazione del trattamento non sono influenzate dalla somministrazione del veicolo, garantendo un solido disegno sperimentale. Nel complesso, viene fornito un protocollo quantitativo oggettivo e riproducibile per la ricerca futura per esplorare i difetti vascolari epatici in vari modelli murini.

Figura 1: Anatomia del fegato murino. (A) Panoramica schematica del posizionamento del fegato nella cavità addominale sotto il diaframma del topo. (B) Descrizione schematica del fegato murino con quattro lobi epatici, cioè lobo sinistro, quadrato, caudato e destro, e la triade porta costituita dalla vena porta, dall'arteria epatica e dal dotto biliare. (C) Illustrazione schematica della rete arteriosa del sistema vascolare tattile. Identificazione delle arterie epatiche (HA) e dei rami (ramo) con nomenclatura latina fornita. Abbreviazione: HA = Arteria epatica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Ecografia Doppler ultraveloce (UFUS) della vascolarizzazione epatica nei topi. (A) Panoramica schematica del setup sperimentale per l'imaging non invasivo in vivo . (B) Illustrazioni schematiche della direzione dell'imaging e dei rappresentanti associati del lobo mediale destro e sinistro, nonché del lobo laterale sinistro, ripresi da UFUS. Abbreviazione: AA = Addominali dell'aorta, LLL = Lobo laterale sinistro, LML = Lobo mediale sinistro, RML = Lobo mediale destro. Barra della scala = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Ecografia Doppler ultraveloce (UFUS) rappresentativa con mezzo di contrasto della vascolarizzazione epatica murina. Una panoramica dell'intera vascolarizzazione epatica di un topo adulto ripreso in 3 posizioni, cioè laterale destra, mediale e laterale sinistra, in 4 piani dal cranio verso la caudale. Il riferimento è situato direttamente sotto il diaframma ripreso in mediale e 1 cm lateralmente a destra e a sinistra, con gli stessi piani in direzione caudale. Abbreviazione: AA = Aorta addominali, HA = Arteria epatica, LLL = Lobo laterale sinistro, LLHA = Arteria epatica laterale sinistra, LML = Lobo mediale sinistro, RLL = Lobo laterale destro, RMHA = Arteria epatica mediale destra, RML = Lobo mediale destro, SI = Intestino tenue, S = Stomaco. Barra graduata 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Ecografia Doppler ultraveloce (UFUS) misurazione quantitativa del volume del sangue epatico. (A) Rappresentanti del lobo mediale (ML) di topi adulti di controllo C57BL/6 wildtype nel piano 1 selezionato sotto il diaframma, corrispondente a 0 mm, piano 2 a -0,3 mm e piano 3 a -0,6 mm con una selezione di 10 regioni di interesse (ROI). Barra scala 1 mm. Illustrazione del Power Doppler di 30 secondi con (B) acquisizione stabile (grigio) e (C) movimento del tessuto (rosso) basato su valori medi dell'immagine in unità arbitrarie (A.U.) dell'intera immagine per la valutazione quantitativa. (D) Riconoscimento automatico di basse intensità (A.U.) per la misurazione quantitativa del volume ematico nel tempo. (E) Deviazione standard (St. Deviation) di basse intensità tracciate per identificare acquisizioni instabili (rosso) causate da artefatti di movimento indicati da un taglio della media complessiva (μ) dal numero (N) di animali da 3 coorti con 2 SD (2σ) valutazione della deviazione standard (SD) di basse intensità (A.U.) in condizioni fisiologiche (grigio) in topi adulti di controllo C57BL/6 wildtype. (F) La quantificazione delle variazioni del volume del sangue misurate in vivo nel tempo in media su 3 piani, ovvero 30 ROI in totale per animale, è rappresentata come intensità di pixel (A.U.). Rilevamento dei valori anomali mediante test ROUT 1%. (G) Non vi è alcuna differenza tra il tipo di veicolo di consegna e il percorso di somministrazione. La coorte 1 (n=6) ha ricevuto un'iniezione intraperitoneale (ip) di soluzione fisiologica, la coorte 2 (n=3) iniezione ip di DMSO e la coorte 3 (n=6) somministrazione orale (po) di cellulosa. ANOVA unidirezionale con test di confronto multiplo di Dunnett, ns P > 0,05. Abbreviazione: A.U. = Unità arbitrarie, DMSO = Dimetilsolfossido, ip = Intraperitoneale, po = Somministrazione orale, ROI = Regione di interesse, St. Deviazione = Deviazione standard, UFUS = Ecografia Doppler ultraveloce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Ecografia Doppler ultraveloce (UFUS) script quantitativo delle misurazioni del volume del sangue epatico. Script gui_analysis.m fornisce un'interfaccia grafica per il posizionamento automatico della regione di interesse (ROI) per le misurazioni del volume del sangue. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

In questo protocollo, dimostriamo come eseguire l'imaging UFUS non invasivo del sistema vascolare epatico del topo. Presentiamo una descrizione dettagliata della procedura di imaging, che comprende la manipolazione degli animali, il funzionamento dello scanner a ultrasuoni e l'analisi dei dati per il calcolo delle variazioni del volume del sangue in vivo. Per facilitare l'interpretazione dei dati ecografici, forniamo una panoramica completa delle strutture anatomiche che possono essere chiaramente visualizzate da UFUS. Inoltre, descriviamo una procedura di quantificazione standardizzata per misurazioni robuste di parametri vascolari. Il raggiungimento di una risoluzione adeguata è possibile senza l'uso di un mezzo di contrasto, consentendo una valutazione quantitativa sicura e semplice del volume ematico epatico del microcircolo. Sottolineiamo l'uso di una nomenclatura anatomica standardizzata per evitare confusione e interpretazioni errate, in particolare quando si valutano le misurazioni quantitative della microvascolarizzazione.

L'imaging UFUS della vascolarizzazione murina è stato precedentemente riportato, principalmente nel campo delle neuroscienze⁷. L'imaging cerebrale non è influenzato negativamente dagli artefatti del movimento a differenza del fegato, che è altamente suscettibile al movimento respiratorio. A causa della sua posizione anatomica sotto il diaframma, la depilazione nella regione addominale deve essere eseguita molto delicatamente per evitare di introdurre una respirazione irregolare riducendo al minimo le forze fisiche sulla regione del torace e dell'addome. Inoltre, il raggiungimento di un adeguato grado di anestesia è essenziale per garantire una respirazione oscillante regolare, un fattore che può essere relativamente facilmente corretto nelle fasi di post-elaborazione. La sensibilità degli UFU è stata migliorata applicando un filtro SVD (Singular Value Decomposition) per rimuovere gli artefatti di movimento⁶ e censurando ulteriormente i fotogrammi ad alto movimento. I filmati Power Doppler ad alta frequenza di fotogrammi vengono acquisiti qui a 10 ms per consentirci ulteriormente di visualizzare e misurare l'effetto del movimento respiratorio sui fotogrammi che hanno generato picchi di alto valore a causa di artefatti di movimento. La frequenza respiratoria può quindi essere identificata dal picco nella trasformata di Fourier veloce del segnale medio dell'immagine e i corrispondenti fotogrammi di picco corrispondenti all'alto movimento dell'organo possono essere scartati.

L'imaging ecodoppler riproducibile all'interno di un singolo animale nel tempo, così come tra animali di peso corporeo diverso, può ancora incontrare diverse limitazioni. In primo luogo, il posizionamento del fegato può essere influenzato da fattori come uno stomaco molto pieno e il movimento peristaltico dell'intestino. Questa influenza è particolarmente pronunciata quando si seleziona il lobo epatico laterale sinistro come riferimento. Pertanto, si consiglia di scegliere il lobo laterale sinistro solo negli animali più grandi e di preferire il lobo mediale destro o sinistro negli animali più piccoli. In secondo luogo, negli animali in difficoltà possono verificarsi forti movimenti respiratori non oscillanti, con conseguenti artefatti di movimento difficili da correggere e, di conseguenza, non possono essere utilizzati per il calcolo del volume sanguigno. Pertanto, una scelta appropriata dell'anestesia, insieme a un dosaggio su misura per il peso corporeo, è fondamentale. Infine, il limite di risoluzione limita la visualizzazione della microvascolarizzazione epatica, ovvero i vasi sanguigni possono essere visualizzati con diametri che vanno fino a 100 mm³.

L'uso di agenti di contrasto è stato recentemente proposto per acquisire un'immagine dettagliata del sistema vascolare del topo tracciando le microbolle. Tale approccio può raggiungere un'elevata risoluzione spaziale e fornire misurazioni quantitative della velocità del sangue¹⁷. Tuttavia, il tracciamento delle microbolle rimane molto impegnativo per il movimento degli organi interni, soprattutto se acquisite in 2D.

Qui, abbiamo dimostrato che le misurazioni stabili del volume ematico epatico ottenute con Doppler ultraveloce potrebbero essere acquisite in topi di controllo da tre coorti che ricevono diversi veicoli somministrati tramite iniezioni ip o sonda orale. Recentemente, tali misurazioni del volume sanguigno sono state utilizzate con successo in un modello murino di malattia epatica¹⁶. Per elaborare, l'espansione vascolare è stata rilevata a livello di microscopia elettronica e confermata da misurazioni quantitative utilizzando UFUS. Questo studio ha sottolineato la sensibilità della valutazione in vivo per indagare i difetti vascolari a livello funzionale e quantitativo, anche con un'angioarchitettura epatica conservata, che è promettente per la diagnosi clinica e il monitoraggio.

In sintesi, questo protocollo funge da guida per studi qualitativi e quantitativi non invasivi della vascolarizzazione epatica nei topi. Può essere impiegato anche per il follow-up longitudinale grazie alla sua procedura semplice e non invasiva. Inoltre, ha il potenziale per fornire valutazioni funzionali dei vasi sanguigni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
(Idrossipropil)metilcellulosa HPMC	Sigma-Aldrich	H7509	0,5% Centrifuga HPMC
ZentriMix 380 R	Hettich	3200
Provette da centrifuga 50 mL coniche Sterili in polipropilene	Provette CELLSTAR	227 261
Punte in cotone	Meditip Clean	G80215
Acqua deionizzata	in casa
Crema depilatoria	nelle vicinanze farmacia
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma	D2650-5X5ML	sterile
Etanolo assoluto	FRESENIUS KABI	010-0622-1
Ago di alimentazione, riutilizzabile	FST Fine Science Tools	18064-20
Pinze con punta fine Dumont #5 pinze	FST Fine Science Tools	11252-00
Garze 5 x 5 cm	Klinipress	175 004
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	Versione 9
Script di analisi GUI	Inserm	gui_analysis.m	necessita di una scansione Doppler da 10 ms
Termoforo 17 x 17 cm, 6 W	ThermoLux	Acculux 461265
Siringa da insulina 30G 0,30 x 8 mm, 0,3 mL e 0,5 mL	BD Microfine + Demi	25636
Ketamina Anesketina	Dechra	REG NL 111764	100 mg/mL
Kimwipes Tergicristallo a basso contenuto di lanugine	KIMTECH ULINE	S-8115
Nastro da laboratorio 19 mm x 50 m x 0,125 mm	Software Stokvis	M451
MATLAB	MathWorks	Versione R2022b
Crema idratante	nelle vicinanze farmacia
Ago giallo 30G 0,3 x 13 mm	BD Microlance	304000
Unguento oftalmico Oculentum Simplex	Aggiunto Pharma	220201
Fazzoletti di carta	in casa
Pennarello da laboratorio permanente	VWR	52877-310
Soluzione salina fisiologica (NaCl 0,9%)	FRESENIUS KABI	B102986
sterile Contenitore monouso per oggetti taglienti Medical Dispo 2,5 L	APmedical	UN3291
Provette sterili da 1,5 mL	Eppendorf	0030 120.086
Siringa 1 mL	BD Plastipak	303172
Siringa 20 mL Luer-Lok	BD Plastipak	300629
Timer	West Bend	40053
Trimmer	Exacta Aesculap	GT416
Ultrafast piattaforma ecografica	Iconeus &   INSERM 'Biomedical Ultrasound' ART	Iconeus Un prototipo	con una sequenza di 10ms
Gel di trasmissione degli ultrasuoni Aquasonic 100	Parker Laboratories INC.	BT-025-0037N Serbatoio
dell'acqua stampato in 3D 10 x 10 x 1,5 cm polimetilpentene (PMP) 0,125 mm	GoodFellow Cambridge limited	ME311100/2	file CAD su richiesta
Xilazina Sedamun	Dechra	REG NL 10084	20 mg/mL