Method Article

Nuovo protocollo di quantificazione per la progressione della calcificazione cardiovascolare utilizzando immagini longitudinali MicroPET/MicroCT

DOI:

10.3791/66805

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November 15th, 2024

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1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 4Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 5Department of Orthopaedic Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 6Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 7Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo nuovo protocollo comporta la quantificazione della progressione della calcificazione cardiovascolare da immagini seriali di tomografia a emissione di micro positroni (PET)/micro tomografia computerizzata (TC) in piccoli animali da ricerca.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La micro tomografia a emissione di positroni (PET) e la micro tomografia computerizzata (TC) sono strumenti di ricerca potenti e ideali per seguire la progressione della calcificazione cardiovascolare. Grazie alla loro natura non invasiva, i piccoli animali da ricerca possono essere ripresi in più punti temporali. La sfida risiede nella quantificazione accurata della calcificazione cardiovascolare. Qui, forniamo un protocollo, utilizzando le immagini delle fasi successive della malattia come modello, per quantificare con precisione la progressione della calcificazione cardiovascolare negli studi longitudinali. Il protocollo prevede 1) l'allineamento dell'area del torace in più immagini dello stesso animale durante uno studio longitudinale come primo passo, 2) la definizione di una regione di interesse (ROI) situata all'interno del cuore e dell'aorta nel sito di depositi di calcio più grandi che diventano evidenti nelle immagini successive e 3) la segmentazione e la quantificazione simultanea dei depositi di calcio in tutte le immagini acquisite durante lo studio longitudinale. Questo metodo semplificato migliora l'accuratezza dell'analisi delle immagini nel seguire la progressione della calcificazione cardiovascolare, migliorando la precisione della definizione del ROI e riducendo la variabilità associata alle tecniche precedenti che analizzano le singole scansioni in modo indipendente.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie cardiovascolari sono una delle principali cause globali di morbilità e mortalità, che richiede un'indagine rigorosa per scoprirne i meccanismi e ideare strategie preventive e terapeutiche efficaci. La calcificazione dell'arteria coronarica (CAC) è ampiamente riconosciuta dagli esperti del settore come fattore predittivo delle malattie cardiovascolari, aumentando significativamente il rischio di mortalità cardiovascolare 1,2,3,4,5. Le calcificazioni microscopiche sono considerate i primi stadi dell'aterosclerosi calcifica e il termine "microcalcificazioni" è stato usato per riferirsi a depositi di calcio compresi tra 0,5 e 50 μm 6,7,8,9 di diametro. Si ritiene che queste piccole calcificazioni si uniscano per formare depositi di calcio più grandi, alimentando la progressione della placca calcifica 6,7.

La tomografia a emissione di positroni (PET) e la tomografia computerizzata (CT) sono strumenti di ricerca preziosi, frequentemente impiegati per la valutazione non invasiva della calcificazione cardiovascolare in vivo 5,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Queste modalità di imaging si sono dimostrate particolarmente vantaggiose per il monitoraggio della progressione della calcificazione vascolare in studi longitudinali che coinvolgono piccoli animali da ricerca 11,12,13,19. L'imaging MicroCT ha dimostrato efficacia nel fornire immagini anatomiche di depositi di calcio relativamente grandi 11,12,13,19,20.Tuttavia, la sua utilità per l'imaging di piccoli depositi di calcio negli animali viventi è limitata dalla sua risoluzione spaziale di ~100 μm 8,14, rendendo difficile lo studio della calcificazione durante le sue fasi iniziali.

Un notevole progresso è l'adozione dell'imaging combinato microPET/microCT con il tracciante PET, fluoruro di sodio marcato con fluoruro 18 (18F-NaF), come metodo standard per il rilevamento della calcificazione in base al suo legame con la superficie del minerale. Questo approccio utilizza 18F-NaF radiomarcato, che ha dimostrato di identificare la superficie del minerale di calcio10,13 quando gli ioni fluoruro si legano covalentemente all'idrossiapatite di calcio, sostituendo i gruppi ossidrilici per formare fluoroapatite21. Coerentemente con il tasso di cambio più lento rispetto al decadimento radioattivo del 18F (emivita ~ 110 min) e alla clearance del tracciante attraverso i reni22, Irkle e colleghi13 hanno scoperto che il legame del 18F-NaF ai campioni carotidi calcificati era limitato alla superficie al momento del rilevamento. Pertanto, l'assorbimento del tracciante dovrebbe essere direttamente correlato con la superficie del minerale, che è maggiore quando una data quantità di minerale si trova in più piccoli focolai o in forma porosa rispetto a quando è presente in pochi, grandi depositi solidi. Accentuando le prime fasi della mineralizzazione con un'elevata sensibilità, l'imaging PET 18F-NaF può fornire preziose informazioni sulle prime fasi della malattia, rendendolo particolarmente utile nello studio di strategie preventive e terapeutiche 13,14,15.

Anche con i recenti progressi nell'imaging combinato microPET/microCT della calcificazione vascolare, ci sono opportunità per migliorare l'accuratezza dell'analisi delle immagini negli studi di calcificazione longitudinale e cardiovascolare. Gli approcci convenzionali utilizzano la delineazione manuale e laboriosa delle regioni di interesse (ROI) attorno a ciascuna regione calcificata visibile in ogni topo in ogni singolo punto temporale durante lo studio longitudinale. Questo metodo riduce la precisione, in particolare nelle prime fasi della malattia, quando le dimensioni dei depositi di calcio si avvicinano ai limiti di rilevamento degli scanner, rendendo potenzialmente invisibili alcune aree con minuscoli depositi disposti a bassa densità.

Nell'ambito dell'imaging, l'allineamento si riferisce generalmente all'allineamento spaziale di una serie di immagini. Introducendo l'allineamento come nuova soluzione alle sfide esistenti, il nostro metodo proposto consente ai ricercatori di utilizzare una posizione coerente per seguire la progressione della calcificazione nelle immagini seriali di singoli soggetti durante uno studio longitudinale. Dato che è noto che la calcificazione dei tessuti deriva da vescicole di matrice di dimensioni nanometriche (50-150 nm), che si fondono per formare un minerale di idrossiapatite23 microscopico, quindi macroscopico, si può identificare retrospettivamente dove sarebbero state localizzate le microcalcificazioni nelle prime immagini prima che fossero distinguibili.

Seguire quella stessa posizione nel tempo, reso possibile dall'allineamento dell'immagine, è la base di questo metodo. Ovvia alla necessità di identificare direttamente le prime fasi di calcificazione, poiché il ROI viene assegnato in base alle ultime fasi in cui la mineralizzazione è prontamente identificata. In questo protocollo, presentiamo un metodo di analisi dei dati migliorato e semplificato che incorpora l'allineamento di una serie temporale di immagini come passaggio vitale, migliorando la quantificazione accurata della deposizione di calcio in studi di imaging longitudinali, combinati, microPET/microCT (Figura 1). Sebbene utilizziamo l'analisi dei dati PET/CT come esempio, questo metodo può essere applicato all'analisi di altri dati di imaging longitudinale, tra cui la tomografia computerizzata a emissione di fotoni singoli (SPECT), la risonanza magnetica (MRI) e l'imaging ottico24.

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Figura 1: Diagramma di flusso della panoramica del protocollo. Diagramma di flusso che riassume il nuovo protocollo per quantificare la calcificazione cardiovascolare. Le fasi generali includono l'imaging longitudinale, l'allineamento delle immagini acquisite in diversi punti temporali e la segmentazione e la quantificazione della regione calcificata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le immagini rappresentative presentano una femmina di topo con deficit di apolipoproteina E (Apoe-/-). I protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università della California, Los Angeles.

1. Scansione degli animali

  1. Tra le due acquisizioni di immagini, nutrire il topo con una dieta standard senza alcun intervento. Tuttavia, prima della prima immagine a 15 mesi di età, passare a una dieta occidentale (21% di grassi, 0,2% di colesterolo) dai 12 ai 14 mesi di età per indurre la calcificazione aortica al basale.
  2. Assicurarsi che lo scanner microPET/CT sia calibrato regolarmente per un'acquisizione ottimale dei dati PET e la co-registrazione CT. Eseguire le calibrazioni secondo le istruzioni del produttore.
  3. Anestetizzare il topo utilizzando gas isoflurano al 2% in una camera per 10 minuti prima dell'imaging. Confermare l'anestesia pizzicando il dito del piede dell'animale senza risposta.
  4. Acquisizione di immagini microPET (350-650 keV, tempo di scansione 10 min) e microCT da 100 μm (80 kVp, 150 μA, proiezione 720, tempo di scansione 1 min) in uno scanner combinato microPET/CT 60 minuti dopo l'iniezione endovenosa di 3,7 MBq di 18F-NaF. Acquisisci le scansioni microCT immediatamente dopo le scansioni microPET.
    NOTA: Il piano dello scanner ha spostato l'animale dalla modalità PET a quella CT mentre l'animale è rimasto sotto anestesia e nella stessa posizione.
  5. Ricostruisci le immagini microPET utilizzando un algoritmo di massimizzazione delle aspettative di sottoinsiemi ordinati in 3D (24 sottoinsiemi e 3 iterazioni), con correzione casuale, attenuazione e decadimento. Ricostruire le immagini CT utilizzando un algoritmo di Feldkamp modificato.
    NOTA: Dopo l'imaging, il topo è stato monitorato fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Alla fine dello studio longitudinale, tutti i topi sono stati soppressi.

2. Importa i file DICOM nel software di visualizzazione DICOM

NOTA: Sebbene questo protocollo rappresentativo utilizzi il software ORS Dragonfly con una licenza non commerciale, la sua flessibilità si estende ad altre opzioni software di visualizzazione DICOM.

  1. Avviare il software del visualizzatore DICOM facendo doppio clic sull'applicazione.
  2. Passa a File nell'angolo in alto a sinistra. Nel menu a discesa, selezionare Importa immagini DICOM... per visualizzare la finestra Gestisci immagini DICOM (File supplementare 1- Figura supplementare S1A).
  3. Nella finestra Gestisci immagini DICOM , fare clic sulla scheda Contenuto cartella . Sul lato destro, selezionare Apri cartella... per scegliere le cartelle contenenti i file DICOM di interesse in uno studio longitudinale (File supplementare 1- Figura supplementare S1B).
  4. Identificare le cartelle contenenti i file DICOM. Fare clic su Seleziona cartella per importare la prima cartella nella finestra Gestisci immagini DICOM (File supplementare 1- Figura supplementare S1C).
  5. Selezionare entrambi i file DICOM PET ("PT") e CT ("CT") nella finestra Gestisci immagini DICOM . Successivamente, fare clic su Visualizza studio sul lato destro per aprire tutte le immagini DICOM importate (File supplementare 1- Figura supplementare S1D).
  6. Ripetere i passaggi 2.4 e 2.5 per ogni cartella contenente immagini DICOM relative allo stesso singolo soggetto nello studio longitudinale.

3. Regolare le impostazioni del visualizzatore DICOM per ottimizzare la visualizzazione delle immagini

  1. Modificare il layout per visualizzare quattro viste (3D, trasversale, coronale, sagittale), come illustrato nel file supplementare 1 - Figura supplementare S2. All'interno del menu a discesa Layout sul lato sinistro, trova Viste (nella scena selezionata) e seleziona un layout che mostri quattro viste.
  2. Rinomina le immagini per indicare i punti temporali e se si tratta di immagini PET o TC. Seleziona il nome dell'immagine e fai doppio clic per rinominare ogni immagine.
  3. Attiva un'immagine accedendo al menu a discesa Proprietà e impostazioni dei dati sul lato destro. Fare clic sull'icona a forma di occhio a sinistra del nome di ogni immagine per attivare o disattivare la visibilità (File supplementare 1 - Figura supplementare S2)
  4. Regola la luminosità e il contrasto su ciascuna immagine CT, individualmente.
    NOTA: La luminosità e l'intervallo di contrasto ottimali della TC possono variare a seconda del soggetto, del protocollo di imaging, dello scanner e dei parametri di ricostruzione25,26; Tuttavia, tutti gli aggiustamenti dovrebbero essere coerenti per un singolo soggetto in uno studio longitudinale.
    1. Selezionare e attivare un'immagine CT facendo clic sul nome dell'immagine in Proprietà e impostazioni dei dati (File supplementare 1- Figura supplementare S2).
    2. Trova l'istogramma all'interno del menu a discesa Livellamento finestra situato nella scheda Principale sul lato sinistro dello schermo del display. Attiva LogY sopra l'istogramma; quindi, procedere a fare clic e far scorrere gli indicatori di intervallo gialli per comprendere completamente il secondo picco nell'istogramma (File supplementare 1- Figura supplementare S3A). Effettuare lievi regolazioni fino a raggiungere la luminosità/contrasto ottimali; fare riferimento alla Figura 2B per un esempio di immagine TC regolata in luminosità/contrasto.
    3. Individuare la casella Intervallo selezionato sotto l'istogramma di livellamento della finestra (File supplementare 1- Figura supplementare S3B). Prendere nota dei valori dell'intervallo selezionato da utilizzare nei passaggi successivi.
    4. Selezionare e attivare una seconda immagine TC (File supplementare 1- Figura supplementare S3C). Inserire i valori dell'intervallo selezionato dalla prima immagine CT nella casella Intervallo selezionato per la seconda immagine CT (File supplementare 1- Figura supplementare S3B-S3D). Ripetere l'operazione per tutte le immagini consecutive.
  5. Perfeziona ogni immagine PET regolando il filtro Tabella di ricerca, individualmente.
    NOTA: L'intervallo ottimale della scala cromatica PET può variare a seconda del soggetto, del protocollo di imaging, dello scanner e dei parametri di ricostruzione27; Tuttavia, tutti gli aggiustamenti dovrebbero essere coerenti per un singolo soggetto in uno studio longitudinale.
    1. Selezionare e attivare un'immagine PET facendo clic sul nome dell'immagine in Proprietà e impostazioni dei dati (File supplementare 1- Figura supplementare S2).
    2. Nel menu a discesa Livellamento finestra nella scheda Principale , individua Tabella di ricerca (LUT) e scorri fino a trovare PET nel menu a discesa LUT e seleziona il filtro PET (File supplementare 1- Figura supplementare S4A).
    3. Ottimizza l'intervallo selezionato utilizzando l'istogramma nel menu a discesa Livellamento finestra per ottenere una visualizzazione ottimale. Attiva LogY sopra l'istogramma; quindi, procedere con il clic e far scorrere gli indicatori di intervallo gialli verso la posizione mostrata nella Figura supplementare S4B (File supplementare 1). Effettuare lievi regolazioni fino a raggiungere l'intervallo selezionato ottimale per la visualizzazione dell'immagine PET; fare riferimento alla Figura 2D per un esempio di immagine PET/CT regolata per l'intervallo selezionato ottimale.
    4. Trova il menu a discesa Intervallo selezionato sotto l'istogramma di livellamento della finestra (File supplementare 1- Figura supplementare S4B). Prendere nota dei valori dell'intervallo selezionati da utilizzare nei passaggi successivi.
    5. Selezionare e attivare una seconda immagine PET (File supplementare 1- Figura S4C). Ripetere il passaggio 3.5.2 per la seconda immagine.
    6. Inserire i valori dell'intervallo selezionato dalla prima immagine PET nella casella Intervallo selezionato per la seconda immagine PET (File supplementare 1- Figura S4B-S4D). Ripetere l'operazione per tutte le immagini consecutive.

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Figura 2: Regolazione delle impostazioni del visualizzatore DICOM per ottimizzare la visualizzazione delle immagini. (A,B) Vista coronale delle immagini TC (A) prima e (B) dopo la regolazione del contrasto/luminosità. (C, D) Vista coronale delle immagini PET/TC (C) prima e (D) dopo la regolazione della tabella di ricerca. Abbreviazioni: TC = tomografia computerizzata; PET = tomografia a emissione di positroni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Allineare l'area del torace nelle immagini TC

NOTA: Per semplicità, un'immagine CT fungerà da immagine "base" e non verrà traslata o ruotata. La seconda immagine TC (ed eventualmente le successive immagini seriali) saranno tradotte e/o ruotate per allinearsi con l'immagine base; Questa sarà chiamata immagine "sovrapposta" ai fini della dimostrazione. Durante l'allineamento, è importante distinguere tra l'immagine di base e tutte le altre immagini sovrapposte.

  1. Disattiva tutte le immagini PET e attiva l'immagine CT di base facendo clic sull'icona a forma di occhio a sinistra di ciascun nome di immagine nel menu a discesa Proprietà e impostazioni dati .
  2. Cambia l'opacità dell'immagine CT a ~50%. Fare clic su una delle viste 2D. Sotto la casella Livellamento finestra , trova il menu a discesa Mappatura opacità e fai scorrere la scala di opacità al centro (File supplementare 1- Figura S5).
  3. Attiva l'immagine CT sovrapposta e ripeti il passaggio 4.2.
  4. Modificare il filtro dell'immagine CT sovrapposta per distinguere tra l'immagine TC di base e l'immagine CT sovrapposta. Nell'elenco a discesa Livellamento finestra nella scheda Principale , trova Tabella di ricerca (LUT). Nel menu a discesa LUT, scorri e fai clic sul filtro rosso .
    NOTA: A questo punto dovrebbero essere presenti due immagini CT in ciascuna vista, come illustrato nella Figura S5 (File Supplementare 1).
  5. Utilizzare gli strumenti Trasla/Ruota nelle viste 2D per allineare l'area del torace nell'immagine di sovrapposizione il più vicino possibile a quella dell'immagine di base. Fare riferimento alla gabbia toracica, alla colonna vertebrale superiore e allo sterno come indicatori di allineamento del torace nell'immagine TC.
    NOTA: Le seguenti azioni possono essere eseguite solo nelle viste 2D (Trasversale, Coronale o Sagittale) (File supplementare 1- Figura supplementare S1). Per ottenere il miglior risultato, passa da una vista 2D all'altra e usa gli strumenti di traslazione/rotazione per allineare l'area del torace in ciascuna vista.
    1. Seleziona l'immagine di sovrapposizione nel menu a discesa Proprietà e impostazioni dati e fai clic una volta per selezionare una delle viste 2D.
    2. Trova il menu a discesa Trasla/Ruota nella scheda Principale e fai clic sull'icona Sposta (File supplementare 1- Figura S6A).
    3. Fare clic e trascinare sulla casella di traslazione nell'angolo in basso a sinistra e ruotare il punto di rotazione al centro della vista 2D selezionata per spostare l'immagine di sovrapposizione in modo che si allinei approssimativamente con l'immagine di base (File supplementare 1 - Figura supplementare S6B). Fare riferimento alle strutture ossee per il riferimento dell'allineamento.
    4. Trova lo strumento Traccia nel menu a discesa Manipola e sposta l'asse nell'area del torace facendo clic e trascinando il centro dell'asse. Ingrandisci l'area del torace facendo clic sul pulsante di scorrimento centrale del mouse del computer e trascinando il mouse lontano dallo schermo (File supplementare 1 - Figura supplementare S6C).
  6. Ottimizza l'allineamento per un posizionamento preciso con strutture toraciche come la gabbia toracica, la parte superiore della colonna vertebrale e lo sterno attraverso ulteriori regolazioni di traslazione e rotazione. Passa da una vista 2D all'altra e ripeti i passaggi 4.5.3-4.5.4 fino a quando le due immagini non sono allineate in modo da assomigliare alla Figura 3.
  7. Dopo che le immagini CT di base e la prima sovrapposizione sono state allineate, modificare il filtro dell'immagine CT di sovrapposizione in scala di grigi nel menu a discesa LUT. Ripetere la sezione 4 per tutte le immagini TC sovrapposte dello stesso animale, utilizzando un'immagine di base costante.

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Figura 3: Allineamento di tutte le immagini TC. (A,B) Vista coronale delle immagini TC di base (grigio) e sovrapposte (rosso) (A) prima e (B) dopo l'allineamento. (C, D) Vista sagittale delle immagini TC (C) prima e (D) dopo l'allineamento. Le frecce blu indicano la (1) gabbia toracica, (2) la colonna vertebrale e (3) lo sterno. Abbreviazione: CT = tomografia computerizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Co-registrare le immagini PET con le immagini CT corrispondenti

NOTA: L'allineamento dell'immagine TC sovrapposta e dell'immagine TC di base comporterà inizialmente un disallineamento dell'immagine TC sovrapposta con la rispettiva immagine PET vista nella Figura 4. L'immagine PET deve essere nuovamente co-registrata con l'immagine CT corrispondente.

  1. Attiva l'immagine CT sovrapposta e la rispettiva immagine PET facendo clic sull'icona a forma di occhio a sinistra del nome di ciascuna immagine.
  2. Modificare l'opacità delle immagini PET e CT a ~50%. Nell'elenco a discesa Livellamento finestra , individuare l'elenco a discesa Mappatura opacità e far scorrere la scala di opacità verso il centro (File supplementare 1 - Figura supplementare S5).
  3. Utilizzare gli strumenti Trasla/Ruota nelle viste 2D per allineare l'immagine PET con l'immagine CT corrispondente, in base alla struttura ossea nell'immagine CT e alla superficie ossea 18F-NaF nell'immagine PET.
    1. Selezionare l'immagine PET corrispondente all'immagine CT sovrapposta nel menu a discesa Proprietà e impostazioni dati e fare clic una volta per selezionare una delle viste 2D.
    2. Trova il menu a discesa Trasla/Ruota nella scheda Principale e fai clic sull'icona Sposta (File supplementare 1 - Figura supplementare S6A).
    3. Fare clic e trascinare sulla casella di traslazione nell'angolo in basso a sinistra e ruotare il punto di rotazione al centro della vista 2D selezionata (File supplementare 1 - Figura supplementare S6B) per spostare l'immagine PET in modo che si registri insieme all'immagine CT.
  4. Ripetere la sezione 5 per tutte le immagini PET e CT sovrapposte che non sono co-registrate con le relative immagini CT.
    NOTA: Se la co-registrazione è completa, le immagini PET/CT corrispondenti devono essere allineate lungo l'intera lunghezza del corpo, come mostrato nella Figura 4.

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Figura 4: Allineamento delle immagini PET con l'immagine TC corrispondente. Un'immagine PET rappresentativa e la corrispondente immagine TC (A, C) prima e (B, D) dopo la coregistrazione. Dopo il completamento della co-registrazione, le immagini PET e TC devono essere allineate come dimostrato nel pannello B. Abbreviazioni: TC = tomografia computerizzata; PET = tomografia a emissione di positroni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Identificare la calcificazione cardiovascolare

  1. Identificare il punto temporale con le più grandi regioni calcificate previste nello studio longitudinale (ad esempio, punto temporale di calcificazione tardiva o soggetti pretrattati). Selezionare l'immagine corrispondente a questo punto temporale da utilizzare come immagine di "riferimento", enfatizzando la calcificazione più distintamente visibile. L'immagine scelta fungerà quindi da modello per il confronto con tutte le altre immagini contenenti aree di calcificazione più piccole in diversi punti temporali.
  2. Attiva l'immagine CT di riferimento facendo clic sull'icona a forma di occhio a sinistra dell'immagine. Selezionare lo strumento Traccia nell'elenco a discesa Manipola e spostare il centro dell'asse attorno alla regione cardiaca.
  3. Ingrandisci per trovare le regioni calcificate (piccoli siti luminosi e densi) sovrapposte alla silhouette cardiaca tra la gabbia toracica, lo sterno e la colonna vertebrale (Figura 5). Se le regioni calcificate non sono immediatamente visibili, scorrere i livelli di ciascuna immagine selezionando una vista 2D e scorrendo con il mouse.
  4. Sposta l'asse Traccia per passare il mouse sopra la regione calcificata, garantendone la visibilità in tutte le viste 2D. Per un riferimento visivo delle regioni di calcificazione in un'immagine TC di topo, consultare la Figura 5.
  5. Attiva l'immagine PET corrispondente per convalidare la presenza di calcificazione.
    NOTA: Se le impostazioni dell'immagine PET e la co-registrazione sono state regolate in modo appropriato, l'immagine PET dovrebbe mostrare l'attività intorno alla regione calcificata, come esemplificato nella Figura 5D.

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Figura 5: Identificazione delle regioni calcificate nel cuore. Regioni di calcificazione raffigurate in immagini rappresentative (A) sagittale, (B) trasversale e (C) TC coronale, nonché (D) un'immagine PET/TC coronale. Le frecce gialle indicano depositi di calcio. Le frecce blu identificano le strutture di riferimento utilizzate per determinare la posizione della calcificazione. Abbreviazioni: TC = tomografia computerizzata; PET = tomografia a emissione di positroni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Disegna il ROI intorno alle regioni calcificate

  1. Disattivare l'immagine di riferimento PET. Attivare solo l'immagine di riferimento CT facendo clic sull'icona a forma di occhio a sinistra dell'immagine.
  2. Trova il menu a discesa Forme e scegli la forma Sfera (File supplementare 1 - Figura supplementare S7). Regola le dimensioni della sfera facendo clic e trascinando i suoi bordi per modificare le dimensioni. Riposiziona la sfera facendo clic e trascinando il quadrato centrale.
    1. Naviga tra le viste 2D per posizionare con attenzione la sfera. La sfera dovrebbe incapsulare l'intera regione di calcificazione identificata e alcune aree circostanti, ma evitare le ossa circostanti. Per una guida visiva sul disegno ottimale della sfera, fare riferimento alla Figura Supplementare S7 (File Supplementare 1) per il corretto posizionamento della sfera.
  3. Nel menu a discesa Proprietà e impostazioni dei dati , fai clic con il pulsante destro del mouse sul nome della sfera e scegli Aggiungi al ROI... (File supplementare 1 - Figura supplementare S8A), seguito dalla selezione Nuovo ROI (File supplementare 1 - Figura supplementare S8B).
    1. Assegna un nome appropriato al ROI appena creato. In Geometria, selezionare l'immagine CT per la quale deve essere generata una ROI (File supplementare 1 - Figura supplementare S8C).
    2. Attivare la ROI facendo clic sull'icona a forma di occhio a sinistra del nome della ROI e osservare una ROI colorata corrispondente alle dimensioni della sfera disegnata in precedenza, come illustrato nella Figura Supplementare S8D (File Supplementare 1).
  4. Individuare la scheda Segmento a sinistra dello schermo di visualizzazione, accanto alla scheda principale (Figura 6A). La scheda Segmento consente la creazione e la modifica di ROI.
    NOTA: I tre passaggi successivi sono orientati alla creazione di un ROI con una precisione che evidenzia esclusivamente le aree calcificate all'interno della sfera designata.
    1. Seleziona il ROI di riferimento in Proprietà e impostazioni dati e individua il menu a discesa Intervallo nella scheda Segmento . Fare clic per selezionare Definisci intervallo (Figura 6A).
    2. Modificare l'intervallo definito utilizzando la casella Intervallo selezionato (Figura 6A). Assicurarsi che l'intervallo definito incapsula tutti i pixel non calcificati con valori di unità di Hounsfield (HU) inferiori alla soglia di calcio. Questa dimostrazione utilizza una soglia di 300 HU per il calcio e il pixel con densità più bassa in questa immagine è -2.626; pertanto, l'intervallo selezionato è -2.626-300 HU.
    3. Una volta configurato l'intervallo selezionato, fare clic su Rimuovi (Figura 6A) per eliminare tutti i pixel al di sotto della soglia specificata dal ROI della sfera.
      NOTA: Questa azione si traduce in un nuovo ROI che evidenzia esclusivamente le regioni calcificate all'interno della sfera, semplificando l'attenzione per ulteriori analisi. Le ROI completate dovrebbero assomigliare alla ROI illustrata nella Figura 6B.
  5. Ripetere i passaggi 7.3-7.4 per tutte le immagini CT consecutive per creare nuove ROI uniche utilizzando una sfera di riferimento comune. Assegna un nome a ciascun ROI in modo che corrisponda all'identificazione della sua specifica immagine TC, garantendo un'analisi concisa e organizzata.
    NOTA: NON dovrebbe essere necessario creare una nuova sfera per l'analisi del ROI di ogni immagine perché la sfera di riferimento dovrebbe incapsulare la regione calcificata più grande di tutte le immagini, supponendo che l'allineamento sia accurato.

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Figura 6: Utilizzo della segmentazione per limitare il ROI alle regioni calcificate. (A) Le frecce guidano attraverso i passaggi necessari per eliminare i dati di densità indesiderati dal ROI. La freccia blu punta alla scheda Segmento ; la freccia gialla evidenzia la funzione Definisci intervallo ; le frecce verdi indicano gli ingressi di gamma selezionati; e la freccia rossa punta al pulsante Rimuovi . (B) Dopo il completamento delle fasi del protocollo 7.4-7.4.3, il ROI dovrebbe delineare in modo specifico le regioni calcificate, come illustrato in questo pannello. Abbreviazione: ROI = regione di interesse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

8. Quantifica il ROI per ogni immagine

  1. Seleziona il ROI da quantificare nel menu a discesa Proprietà e impostazioni dei dati .
  2. Trova il menu a discesa Proprietà statistiche sul lato destro sotto il menu a discesa Proprietà di base (Figura 7).
  3. Individuare la tabella Set di dati in Proprietà statistiche. Utilizzando il menu a discesa a destra, scegliere il set di dati di imaging appropriato che si correla al ROI da quantificare (Figura 7).
    1. Quando si quantificano i dati CT all'interno della ROI, scegliere il nome dell'immagine CT correlato alla ROI.
    2. Quando quantifichi i dati PET all'interno del ROI, scegli il nome dell'immagine PET che corrisponde al ROI.
  4. Fare clic su Aggiorna per acquisire i valori quantificati della regione calcificata selezionata. Prendere nota dei valori Min, Max e Mean in base alla tabella del set di dati. Utilizzare i valori medi per la quantificazione (Figura 7).
  5. Individuare il calcolo del volume nella parte superiore della casella Proprietà statistiche . Utilizzare questo volume per la quantificazione (Figura 7).
  6. Per i set di dati CT, i valori sono riportati in HU. Calcolare il contenuto volumetrico di calcio (vHU) utilizzando il prodotto del valore medio di ROI (HU) e del volume di ROI (mm3)12.
  7. Per i set di dati PET, i valori sono riportati in Becquerels (Bq), che corrispondono a decadimenti/secondo. Convertire in Bq/mm3 dividendo il valore medio del ROI (Bq) per il volume del ROI (mm3), per la concentrazione di assorbimento del tracciante.

figure-protocol-6
Figura 7: Quantificazione del ROI. La scheda Proprietà statistiche per un ROI selezionato. Le frecce rosse illustrano i passaggi necessari per ottenere informazioni statistiche per un set di dati basato sul ROI. Le caselle rosse identificano il volume e il valore medio dell'unità Hounsfield, essenziali per ulteriori calcoli di analisi. Abbreviazione: ROI = regione di interesse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Results

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Metodi di analisi
Questa sezione illustra l'utilizzo corretto attraverso risultati rappresentativi. Qui, mostriamo l'immagine combinata microPET/microCT di un singolo topo scansionato a 15 e 18 mesi di età, dopo essere stato sottoposto a una dieta occidentale (21% di grassi, 0,2% di colesterolo) dai 12 ai 14 mesi di età. Seguendo le sezioni 2-8 del protocollo per la quantificazione della calcificazione, quattro ricercatori indipendenti hanno misurato separatamente il contenuto volumetrico di calcio e l'attività PET di 18F-NaF utilizzando le stesse immagini microPET/microCT rappresentative ottenute nei punti temporali di 15 e 18 mesi. Sono state calcolate analisi statistiche, tra cui la media, la deviazione standard, il coefficiente di correlazione intraclasse (ICC)28,29, per determinare l'affidabilità e la riproducibilità del protocollo tra i valutatori. Le stime ICC e i loro intervalli di confidenza al 95% sono stati calcolati utilizzando il pacchetto statistico IBM SPSS basato su un modello di effetti casuali a 2 vie (ICC(C,1)) (Supplemental File 1-Supplemental Table S1).

Risultati
Il contenuto volumetrico di calcio, che deriva dal volume e dalla densità della regione calcificata, è aumentato in un topo tra i punti temporali dell'immagine a 15 mesi (media = 876,08 vHU, deviazione standard = 27,18 vHU) e a 18 mesi (media = 1253,13 vHU, deviazione standard = 7,61 vHU) (Figura 8). Al contrario, l'attività PET di 18F-NaF, che misura l'area superficiale della regione calcificata, è diminuita nello stesso topo tra i punti temporali dell'immagine di 15 mesi (media = 24173,90 Bq/mm3, deviazione standard = 1426,60 Bq/mm3) e 18 mesi (media = 13849,94 Bq/mm3, deviazione standard = 1524,67 Bq/mm3) (Figura 8).

Questi risultati sono coerenti con i risultati precedenti secondo cui l'imaging PET e TC 18F-NaF fornisce quelle che sembrano essere informazioni divergenti sulle placche aterosclerotiche 12,13,14. Uno studio longitudinale sulla calcificazione ha mostrato una tendenza simile, suggerendo che la riduzione del segnale 18F-NaF può essere dovuta alla coalescenza di piccoli depositi di calcio, che in ultima analisi diminuiscono l'area superficiale nonostante un aumento del contenuto12.

figure-results-1
Figura 8: Immagini microPET/CT rappresentative. Le viste trasversali (a sinistra), coronali (al centro) e sagittali (a destra) illustrano l'assorbimento del fluoruro-18 (F-18) in immagini microPET rappresentative a 15 mesi rispetto a 18 mesi. Le punte di freccia bianche indicano le regioni di calcificazione. Abbreviazioni: TC = tomografia computerizzata; PET = tomografia a emissione di positroni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le piccole deviazioni standard osservate nei nostri risultati suggeriscono un alto grado di accordo e coerenza tra le misurazioni ottenute da diversi ricercatori. Inoltre, il valore ICC(C,1) di 0,997 con intervallo di confidenza del 95% = 0,983-1,000 ottenuto nel nostro studio (Supplemental File 1-Supplemental Table S1) indica un eccellente accordo tra le misurazioni effettuate da diversi ricercatori. Questo livello di accordo suggerisce che le misurazioni sono affidabili e coerenti tra i ricercatori, indicando l'elevata riproducibilità di questo nuovo protocollo di quantificazione.

Discussion

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Questo nuovo protocollo è un approccio migliorato alla quantificazione della calcificazione cardiovascolare. A causa della natura non invasiva dell'imaging, possono essere acquisite immagini microCT longitudinali per seguire la progressione della calcificazione cardiovascolare nei piccoli animali. Sebbene le immagini microCT da sole possano mostrare la progressione del contenuto di calcio, le immagini microPET, quando disponibili, possono fornire ulteriori livelli di informazioni, in particolare il rilevamento potenziato di piccoli depositi di calcio dovuti al legame del tracciante con la superficie. Per migliorare ulteriormente l'accuratezza e la riproducibilità di questo metodo, si raccomanda l'incorporazione dell'imaging TC cardiaco con mezzo di contrasto. L'imaging TC con mezzo di contrasto semplifica l'applicazione di questo protocollo in studi clinici e su animali più ampi, dove la TC con mezzo di contrasto a bassa risoluzione con imaging PET 18F-NaF è lo standard per la quantificazione della calcificazione cardiovascolare30,31. Inoltre, la PET cardio-dipendente e la TC cardio-dipendente riducono gli artefatti da movimento utilizzando i dati dell'elettrocardiogramma (ECG), ottenendo immagini più chiare e di qualità superiore del cuore32,33. Il nostro metodo di analisi delle immagini può essere applicato ai dati di PET e TC cardio-dipendenti in studi longitudinali.

I visualizzatori DICOM offrono universalmente le funzioni essenziali di questo protocollo. Le funzioni di base, tra cui la visualizzazione di immagini 2D e 3D, gli istogrammi, i controlli di finestra, le tabelle di ricerca, la traslocazione, la rotazione, la sovrapposizione e gli strumenti di navigazione, sono standard nella maggior parte dei software di visualizzazione DICOM34,35 e consentono l'allineamento preciso delle immagini e l'individuazione delle calcificazioni. Funzioni più avanzate come la segmentazione sono comuni anche alla maggior parte dei software di visualizzazione DICOM 34,35,36 , consentendo una precisa delineazione del ROI e una quantificazione accurata dei ROI selezionati. Nel complesso, questo protocollo adattabile garantisce la compatibilità tra le piattaforme di visualizzazione DICOM, consentendo ai ricercatori di utilizzare il software preferito senza compromettere la metodologia.

Sebbene questo protocollo sia generalmente semplice, l'utilizzo corretto e i risultati affidabili dipendono da diverse considerazioni critiche. Prima della ricostruzione e dell'analisi dell'immagine, è imperativo includere la dose iniettata corretta per il decadimento e la sua unità di tracciante PET 18F-NaF nel file DICOM per garantire l'accuratezza della quantificazione. Inoltre, il mantenimento di un posizionamento coerente e stabile dei mouse all'interno del foro dello scanner facilita notevolmente l'allineamento digitale delle immagini, un processo fondamentale per mantenere la coerenza analitica tra le immagini seriali in uno studio longitudinale.

Altri passaggi critici sono incorporati nel protocollo. Il ROI deve essere selezionato con attenzione per escludere l'osso scheletrico e altre strutture calcificate nella parte superiore del torace (come la cartilagine tiroidea). Prima di iniziare il disegno di una ROI, un passaggio fondamentale è un'attenta selezione del punto temporale con la calcificazione visibile più grande come immagine di "riferimento" (fare riferimento al passaggio 6.1 del protocollo). Per aumentare ulteriormente l'accuratezza della ROI, è meglio estendere la dimensione della sfera oltre i limiti di calcificazione visibili escludendo qualsiasi osso adiacente, come esemplificato nella Figura S7 supplementare (File supplementare 1). Queste scelte strategiche assicurano che i confini del ROI comprendano in modo completo le regioni di calcificazione in tutte le scansioni successive. Un passaggio altrettanto cruciale è quello di selezionare un valore soglia di densità voxel che identifichi il minerale di calcio (fare riferimento al passaggio 7.4 del protocollo); questo può variare a causa delle specifiche di un particolare studio, come le apparecchiature di imaging e il software di visualizzazione DICOM utilizzato. Nell'esempio illustrativo, la soglia minima di densità microCT per il ROI è stata definita come 300 HU sulla base della nostra esperienza con microPET/microCT.

La risoluzione dei problemi per questo protocollo comporta principalmente la verifica che le immagini, gli oggetti e le ROI corretti siano selezionati o attivati/disattivati in modo appropriato in ogni passaggio. Gli errori comuni nella quantificazione del ROI coinvolgono gli utenti che selezionano erroneamente un'immagine invece di un ROI o scelgono un set di dati nel menu a discesa delle proprietà statistiche che non si allinea con il ROI scelto. La visualizzazione delle immagini può rappresentare un'altra sfida. Ad esempio, senza l'utilizzo di una scala di colori adeguata, le immagini possono essere eccessivamente scure o luminose, oscurando i depositi di calcio. La messa a punto delle impostazioni di visualizzazione è fondamentale, poiché la configurazione ottimale può variare da quella impiegata in questo protocollo. Un'ulteriore modifica del protocollo che può rivelarsi utile prevede l'esplorazione di varie forme durante la fase di disegno del ROI per circondare al meglio la regione calcificata. A seconda dei requisiti dello studio, forme alternative, come il cilindro o la capsula, possono rivelarsi più efficaci della sfera standard utilizzata nel protocollo di esempio. Per un'assistenza più dettagliata nella risoluzione degli errori specifici del software di visualizzazione DICOM, si consiglia di consultare il supporto tecnico del software.

Sebbene questo protocollo semplifichi l'analisi della calcificazione cardiovascolare nei roditori, ci sono alcune limitazioni. Nonostante sia un metodo eccellente per rilevare le calcificazioni cardiovascolari, l'imaging PET 18F-NaF può incontrare difficoltà nel catturare i depositi di calcio più piccoli a causa delle limitazioni di risoluzione e dell'effetto volume parziale, portando potenzialmente a una sottostima del segnale PET 8,27. Nelle immagini TC, la presenza di rumore può influire sul rilevamento37. Sebbene il rumore possa essere mitigato impostando una soglia HU più elevata, il compromesso è l'esclusione dei depositi più piccoli a bassa densità. Quando i depositi di minerali di calcio della densità abituale sono più piccoli delle dimensioni dei voxel, l'effetto volume parziale fa sì che sembrino di densità inferiore e di dimensioni maggiori rispetto al38,39 effettivo. Di conseguenza, esiste un delicato equilibrio nella definizione della soglia minima di densità per uno studio, con un compromesso tra la potenziale sovrastima dovuta al rumore e la potenziale sottostima dovuta all'esclusione di piccoli depositi.

Molti metodi consolidati hanno quantificato la calcificazione attraverso l'imaging TC 11,12,20,40,41,42. Ciò include in genere l'identificazione del punteggio CAC nei soggetti della ricerca e nei pazienti, seguendo il protocollo del punteggio Agatston43. Tuttavia, gravi limitazioni del punteggio di Agatston lo rendono altamente inaffidabile, a causa del troncamento post-acquisizione, della riassegnazione e della soglia dei dati39. Inoltre, il protocollo di punteggio Agatston è in grado di identificare solo le regioni al di sopra del limite di rilevamento dello scanner di 100-200 μm8. Riconoscendo la crescente importanza della calcificazione come fattore di rischio per le malattie cardiovascolari, è imperativo sviluppare metodi che quantifichino accuratamente la calcificazione. I progressi nell'imaging 18F-NaF PET/CT hanno migliorato la visualizzazione della calcificazione cardiovascolare; Tuttavia, persistono sfide nello sviluppo di metodi accurati di analisi dei dati per gli studi longitudinali. Gli attuali metodi per la quantificazione della calcificazione prevedono il disegno manuale delle ROI attorno a ciascuna area calcificata visibile in ogni soggetto in ogni singolo punto temporale dello studio longitudinale 11,12,15. Questi metodi attuali possono ostacolare la precisione, in particolare quando i depositi sono vicini al limite di rilevamento dello scanner. Senza l'allineamento al punto temporale che mostra la calcificazione maggiore, la definizione del ROI nelle immagini con calcificazioni più piccole diventa difficile. Nel nostro nuovo protocollo, presentiamo un approccio di analisi dei dati raffinato che integra l'allineamento delle immagini e la coerenza del ROI per aumentare la coerenza dell'analisi dei dati nelle immagini sequenziali, migliorando così la validità della valutazione della calcificazione negli studi longitudinali PET/CT. Questo metodo non solo affronta le sfide nell'analisi dei dati, ma può anche fornire informazioni sul processo di progressione della calcificazione cardiovascolare.

Disclosures

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

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Ringraziamo tutti i membri dell'UCLA Crump Preclinical Imaging Technology Center per il loro aiuto nell'acquisizione e nella trasmissione dei dati, nonché nella manutenzione delle apparecchiature e delle infrastrutture. Ringraziamo Jeffrey Collins per il suo aiuto nel funzionamento del ciclotrone e nella sintesi di 18F-NaF. Ringraziamo l'UCLA Statistical Consulting Group per il loro aiuto con l'analisi statistica. Questo lavoro è supportato dal NIH Cancer Center Support Grant (2 P30 CA016042-44 a MT) e dal National Institutes of Health, Heart, Lung, and Blood Institute (HL137647 e HL151391 a YT e LLD). Lo scanner GNEXT PET/CT è stato finanziato dal NIH S10 Shared Instrumentation for Animal Research Grant (1S10OD026917-01A1 a Arion Chatziioannou).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Siringhe da insulina sterili da 0,5 ccExel International#26028Utilizzato per l'iniezione endovenosa di 18F-NaF PET Tracer
18F-NaF PET TracerCNSI Cyclotron
BiorenderBiorenderUtilizzato per figura 1
Femmina Apoe-/- mouseJackson Laboratories#002052B6.129P2-Apoe tm1Unc/J
GNEXT PET/CTSofie Biosciences, Dulles, Virginia
IsofluranoPiramal Critical CareUtilizzato come anestesia per l'imaging del topo
ORS DragonflyComet Technologies Canada Inc.
DietaIBM
Envigo#TD8813921% di grassi, 0,2% di colesterolo
occidentale

References

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