Questo articolo fornisce un protocollo e un video di accompagnamento per l'iniezione del seno retrobulbare fino a un volume totale di 150 μL per topi postnatali, giovani e adulti runted. Questa procedura è particolarmente adatta per l'iniezione di piccoli topi (15 g) quando l'iniezione della vena caudale non è fattibile.
Articolo metodologico
Trattamento sistemico per topi adulti postnatali, giovanili e runted mediante iniezione di seno retrobulbare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mentre le iniezioni della vena caudale sono spesso utilizzate come via di somministrazione sistemica nei topi adulti, le iniezioni retrobulbari sono un metodo alternativo per la somministrazione sistemica con meno limitazioni. In primo luogo, le iniezioni della vena caudale (TVI) sono limitate ai topi adulti in cui la dimensione della vena caudale è adatta per l'accesso. Essere limitati al trattamento di topi adulti può essere problematico quando si ha a che fare con modelli murini che non sopravvivono fino all'età adulta. In secondo luogo, le TVI non sono fattibili per i modelli murini con fenotipi di ritardo della crescita in cui i topi non raggiungono mai le dimensioni dei topi adulti wildtype. Pertanto, le iniezioni retrobulbari possono essere utilizzate con successo per trattare sia topi giovani che piccoli adulti. Infine, le iniezioni retrobulbari vengono eseguite in anestesia, che è meno stressante per i topi rispetto alle TVI che vengono comunemente eseguite senza anestesia. Questo articolo presenta un protocollo e istruzioni dettagliate per le iniezioni retrobulbari che possono essere utilizzate per la somministrazione sistemica a topi piccoli e giovani.
Introduzione
I modelli murini di malattie genetiche sono comunemente usati per dimostrare l'efficacia delle terapie a piccole molecole, genetiche e cellulari1. Nei topi, il metodo più utilizzato per replicare la somministrazione sistemica all'uomo è l'iniezione della vena caudale (TVI), che viene tipicamente eseguita nei topi adulti a circa 6-8 settimane di età per garantire che la vena sia abbastanza grande da poter accedere. La TVI è stata utilizzata con successo in numerosi studi preclinici di prova di principio di malattie genetiche, come l'emofilia, che hanno supportato gli studi clinici sull'uomo per la terapia genica2. Tuttavia, molti modelli murini di malattia genetica hanno fenotipi di crescita e/o letalità precoce, che impediscono loro di raggiungere l'età o le dimensioni di un topo adulto (Figura 1). Il trattamento di tali topi tramite TVI può essere estremamente difficile, se non impossibile, a seconda dell'età di letalità e/o delle dimensioni massime che gli animali possono raggiungere.
Al contrario, la somministrazione sistemica di un agente terapeutico mediante iniezione di seno retrobulbare (frequentemente e erroneamente indicata come retro-orbitale) può essere eseguita abbastanza facilmente nei topi, indipendentemente dall'età o dalla taglia3. Le iniezioni retrobulbari di virus adeno-associato (AAV) sono state utilizzate con successo in giovani modelli murini di malattia genetica ritardata della crescita, come l'acidemia metilmalonica (MMA) e la malattia di Niemann-Pick di tipo C 4,5,6,7,8. (Questa procedura può essere utilizzata anche per iniettare neonati 3,4,9,10; tuttavia, questa tecnica non è descritta in dettaglio in questo protocollo o nel video di accompagnamento.) Anche sostanze altamente tossiche come la doxorubicina possono essere somministrate in modo sicuro mediante iniezione retrobulbare11,12. A differenza della TVI, i topi vengono anestetizzati durante le iniezioni del seno retrobulbare, il che rende la procedura meno stressante per il topo e più facile per l'operatore che non deve trattenere fisicamente il topo13,14. Un'ulteriore preoccupazione è che la TVI utilizza spesso una lampada termica per dilatare la vena caudale, il che potrebbe potenzialmente causare disidratazione nei topi giovani e potrebbe essere problematico nei modelli murini di malattia genetica che sono più suscettibili allo stress correlato al calore. Un altro problema che può sorgere quando si utilizza la TVI è che la vena caudale può essere particolarmente difficile da visualizzare su topi altamente pigmentati. Tuttavia, come la TVI, le iniezioni di seno retrobulbare determinano un'ampia biodistribuzione sistemica15,16.
Protocollo
Questo protocollo e il video di accompagnamento sono per lo spazio di iniezione retrobulbare di topi adulti postnatali, giovani e runted mediante iniezione di seno retrobulbare; il protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (ACUC) dell'Istituto nazionale di ricerca sul genoma umano con il numero di protocollo G-03-4. Altre istituzioni potrebbero avere requisiti e restrizioni diversi e potrebbe essere necessario modificare questo protocollo per l'approvazione nel tuo istituto. Ottenere l'approvazione dall'ACUC del proprio istituto prima di eseguire questa o qualsiasi altra procedura sugli animali.
1. Preparazione pre-iniezione
- Diluire l'AAV al volume e alla concentrazione di iniezione desiderati con soluzione fisiologica tamponata con fosfato sterile (PBS) in una provetta da microcentrifuga sterile da 1,5 ml per ogni iniezione. Aggiungere un volume extra del 50% per ogni iniezione per consentire un riempimento accurato della siringa sterile monouso.
NOTA: Qui stiamo diluendo un reporter AAV8-CAG-eGFP per fornire una dose di 1 × 1013genomi virali per kg di massa corporea (vg/kg) in un volume di 50 μL. La quantità di AAV nei 50 μl da iniettare è calcolata utilizzando il peso dell'animale al momento dell'iniezione. In questo video, l'AAV viene iniettato per via retrobulbare per replicare la somministrazione sistemica negli esseri umani. Altri vettori di terapia genica (ad esempio, lentivirus, adenovirus), terapie a RNA e piccole molecole possono essere somministrati sistemicamente utilizzando questa procedura. - Assicurarsi che il sistema di anestesia per animali da laboratorio (LAAS) da tavolo sia configurato correttamente e funzioni correttamente in conformità con le istruzioni del produttore.
NOTA: Se viene utilizzato un metodo di anestesia alternativo, assicurarsi che l'anestesia sia preparata prima di iniziare le iniezioni. La procedura di iniezione retrobulbare dovrebbe essere compatibile con la maggior parte delle anestesie (ad esempio, un contentore chimico iniettabile come ketamina e xilazina). - Prima di riempire la siringa sterile monouso (in questo caso, una siringa da insulina, 31 G, lunghezza 8 mm, capacità 3/10 mL), muovere lo stantuffo su e giù più volte per assicurarsi che lo stantuffo possa essere premuto senza problemi. Quindi, riempire la siringa fino al volume desiderato, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria.
NOTA: È possibile iniettare volumi fino a 150 μl; Il nostro laboratorio inietta in genere un volume di 50 μL.
2. Sedazione del topo mediante somministrazione di gas isoflurano con un sistema di anestesia animale da laboratorio (LAAS)
- Assicurarsi che il gas fluisca solo verso la camera di induzione. Chiudere il rubinetto a due vie al circuito di non respirazione (NRB).
- Attivare la manopola verde del flusso di ossigeno sulla parte anteriore del flussometro in modo che vi sia una portata di 1 L/min.
- Ruotare l'isoflurano al ≤4% premendo la leva nella parte superiore del vaporizzatore e ruotando la manopola sulla concentrazione desiderata.
- Posizionare il mouse nella camera di induzione trasparente. Osserva attentamente il respiro e il movimento dell'animale. Una volta che l'animale è sdraiato, abbassa la manopola del vaporizzatore al 2-2,5% di isoflurano.
- Aprire il rubinetto a due vie del circuito NRB collegato alla maschera facciale e chiudere il flusso di gas alla scatola di induzione.
- Rimuovi l'animale e posizionalo nella maschera facciale del circuito NRB.
- Abbassare l'impostazione della concentrazione di isoflurano all'1,5%-1,75%, come determinato dalla reazione agli stimoli (ad esempio, pizzicare le dita dei piedi o stringere la zampa).
- Monitorare sempre continuamente la respirazione del topo e il colore delle mucose (se possibile). Se la respirazione dell'animale diventa affannosa o il colore della mucosa non è rosa, abbassare la concentrazione di anestetico.
- Mantieni l'animale al caldo durante l'intera procedura. Utilizzare uno scaldamani avvolto in un tovagliolo di carta posizionato sotto l'imbottitura inferiore e posizionato direttamente sotto il mouse.
- Spegnere l'ossigeno e il vaporizzatore dopo il completamento della procedura.
3. Iniezione dell'animale
- Se destrorso, iniettare l'occhio destro del mouse e posizionare il mouse sul lato sinistro con il muso rivolto verso la mano destra. Se mancino, iniettare l'occhio sinistro del mouse e posizionare il mouse sul lato destro con il muso rivolto verso la mano sinistra.
- Applicare una o due gocce di anestetico oftalmico sul bulbo oculare che deve essere iniettato. Quindi, rimuovere l'eventuale soluzione di anestetico oftalmico in eccesso utilizzando una garza assorbente sterile. Applicare una leggera pressione con la punta delle dita sulla pelle, dorsale e ventrale sull'occhio per sporgere parzialmente il bulbo oculare del topo dall'orbita (Figura 2A, B).
NOTA: Fare attenzione a non applicare una pressione eccessiva sui vasi cervicali circostanti quando si sporge l'occhio in quanto ciò impedirà il flusso sanguigno e l'iniezione. Inoltre, l'applicazione di pressione sulla trachea potrebbe impedire al topo di respirare. Assicurarsi che il mouse possa respirare durante la procedura. - Tenere l'ago in posizione smussata verso il basso con un angolo di circa 30° e posizionato nel canto mediale (Figura 2C).
NOTA: La profondità del posizionamento dell'ago per raggiungere il seno retrobulbare varierà in base alle dimensioni dell'animale. Tenere l'ago in posizione smussata verso il basso durante l'iniezione riduce il rischio di danni oculari. Fare attenzione a non posizionare l'ago troppo in profondità e a non perforare l'orbita. L'iniezione dovrebbe durare meno di un minuto. - Applicare lentamente e senza intoppi una pressione sullo stantuffo della siringa per erogare l'iniettato. Ciò ridurrà la possibilità di stravaso.
- Rimuovere l'ago lentamente e senza intoppi.
- Rimuovere la maschera facciale dal mouse per consentire il recupero dall'anestesia.
4. Post iniezione
- Spegnere l'ossigeno e il vaporizzatore dopo il completamento della procedura.
- Utilizzare una garza sterile per rimuovere il sangue se si verifica sanguinamento residuo.
- Assicurarsi che il mouse si trovi in un'area calda (circa 37 °C), ma non eccessivamente calda, per prevenire l'ipotermia durante il recupero dall'anestesia.
- Osservare il topo in isolamento fino a quando non si è completamente ripreso prima di rimetterlo nella gabbia e nel rack.
NOTA: L'isolamento del mouse durante il recupero impedisce ai compagni di gabbia di ferire il topo sedato durante il recupero.
Risultati
L'iniezione del seno retrobulbare è stata utilizzata con successo per fornire sistemicamente piccole molecole, anticorpi e virus adeno-associati (AAV)4,5,9,15,16. Nella Figura 3, il fegato di un topo trattato con PBS (veicolo) e di un fegato di topo trattato con AAV8 sono mostrati come esempio di iniezione ed espressione di AAV dopo un'iniezione retrobulbare. L'AAV8, come molti vettori AAV presenti in natura, è trofico epatico. Pertanto, è prevista una sostanziale trasduzione epatica in un topo che ha ricevuto una dose sistemica di 5 × 1012vg/kg17. L'elevato numero di epatociti che esprimono l'RNA della metilmalonil-CoA mutasi (MMUT) osservato nella Figura 3, che viene espresso dal transgene AAV, indica il successo dell'iniezione retroorbitale.
Figura 1: Un topo con ritardo di crescita con acidemia propionica. Questo è un esempio dell'estremo ritardo della crescita che può verificarsi nei modelli murini di malattia genetica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini e diagramma dell'iniezione del seno retrobulbare. (A) Immagine del posizionamento delle dita sul pelo fino a sporgere il bulbo oculare (indicato da una freccia bianca). (B) Immagine della sporgenza del bulbo oculare (indicata da una freccia bianca) dopo l'applicazione di una pressione verso il basso sul pelo prima del posizionamento dell'ago e dell'iniezione. (C) Diagramma dell'orientamento dello smusso dell'ago (smusso verso il basso rispetto al bulbo oculare), dell'angolo dell'ago (30°) e del posizionamento dell'ago del seno retrobulbare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ibridazione dell'RNA in situ dopo iniezione del seno retrobulbare con AAV8. Immagini di (A) 10 fegato trattato con veicolo, (B) 10 fegato trattato con AAV8, (C) 20 fegato trattato con veicolo e (D) 20 fegato trattato con AAV8 colorato per MMUT RNA. I topi con acidemia metilmalonica sono stati trattati con una dose di 5 × 10,12 vg/kg di AAV8-LPS-MMUT o con un veicolo di controllo (PBS) a 1 mese di età. Il tessuto epatico è stato raccolto 1 mese dopo il trattamento. MMUT RNA colorato di marrone (le frecce nere indicano le aree di colorazione positiva). Fegato controcolorato con ematossilina. Barre di scala = 100 μm 10x per le immagini, 50 μm per le immagini 20x (B). Abbreviazioni: AAV = virus adeno-associato; LPS = Promotore epatico-specifico; MMUT = metilmalonil-CoA mutasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussione
Sebbene l'iniezione retrobulbare sia un metodo affidabile per somministrare piccole molecole, proteine e terapie genomiche, la pratica della tecnica con un colorante è necessaria per garantire che si ottenga una somministrazione sistemica affidabile e replicabile. L'uso di un colorante è altamente raccomandato per praticare iniezioni retrobulbari nei topi prima di utilizzare questa via di somministrazione negli esperimenti. I coloranti possono essere controllati visivamente nei tessuti del topo per garantire una somministrazione sistemica costante.
Nella nostra dimostrazione della tecnica di iniezione retrobulbare, il gas isoflurano è stato utilizzato per anestetizzare i topi prima della procedura. Altre forme di anestesia possono essere utilizzate prima della procedura, ma è importante assicurarsi che il topo non si riprenda dalla sedazione prima che l'iniezione sia completata. Fortunatamente, l'iniezione vera e propria di solito richiede meno di un minuto e il tempo per il quale il topo deve essere completamente anestetizzato è breve. Il topo deve essere completamente sedato durante l'iniezione e l'anestesia deve essere somministrata nuovamente se il topo diventa cosciente prima dell'iniezione. Poiché ci sono rischi associati all'uso dell'anestesia, la durata del tempo in cui il topo viene sedato dovrebbe essere ridotta al minimo. Non abbiamo avuto problemi con l'isoflurano per sedare piccoli topi malati con acidemia metilmalonica e propionica. Tuttavia, alcuni modelli murini possono essere più sensibili alla sedazione e ad alcune anestesie. Questo potenziale problema dovrebbe essere considerato prima di tentare di utilizzare la sedazione in uno studio. Infine, l'uso della sedazione in combinazione con l'iniezione retrobulbare riduce notevolmente il disagio apparente che il topo mostra durante il processo di iniezione rispetto alla TVI in cui la sedazione non è comunemente usata.
Non abbiamo osservato alcun problema correlato all'iniezione post-iniezione, sebbene l'infezione sia un potenziale rischio con qualsiasi iniezione. Per ridurre la possibilità di infezione, vengono utilizzate una siringa monouso sterile e PBS sterile per diluire l'AAV purificato. Tutti i topi nella nostra struttura per animali vengono controllati quotidianamente per segni di potenziali problemi di salute e ricevono cure veterinarie per affrontare eventuali problemi di salute quando giustificato.
L'alternativa all'iniezione del seno retrobulbare e il metodo più utilizzato per la somministrazione sistemica a topi giovani e adulti è la TVI. L'IVI e l'iniezione del seno retrobulbare determinano una biodistribuzione simile nel caso di piccole molecole e anticorpi e, per estrapolazione, lo stesso ci si aspetterebbe per i vettori virali15,16. Tuttavia, in letteratura non è stato possibile trovare esempi che confrontino la somministrazione sistemica di vettori di terapia genica mediante TVI e iniezione di seno retrobulbare. A nostro avviso, le iniezioni del seno retrobulbare sono più facili da eseguire nei topi con un fenotipo di crescita ridotto e/o letalità precoce.
La TVI è spesso considerata più analoga alla somministrazione sistemica nell'uomo, nonostante gli esseri umani abbiano un seno retrobulbare ma non abbiano una coda. Da un certo punto di vista, l'iniezione del seno retrobulbare è simile alla somministrazione sistemica umana in quanto l'iniettore entra nel sistema venoso superiore come se un iniettore fosse somministrato a un essere umano da un catetere centrale inserito perifericamente (linea PICC) o da un catetere endovenoso posizionato nel braccio. Al contrario, l'iniettore entra nel sistema venoso inferiore di un topo dopo l'iniezione della vena caudale. Sfortunatamente, nessuno di questi metodi replica esattamente i metodi utilizzati per la somministrazione sistemica negli esseri umani, ma entrambi sono metodi efficaci di somministrazione sistemica nei topi.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla di rilevante per questa pubblicazione da rivelare.
Ringraziamenti
Apprezziamo l'assistenza del personale della struttura per topi NHGRI, del laboratorio di patologia molecolare dell'NCI e in particolare di Andrew Warner. R.J.C. è supportato dal Programma di Ricerca Intramurale del NHGRI attraverso 1ZIAHG200318-16 e questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). Figure 2C è stato creato con BioRender.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AAV8-CAG-eGFP | Univ. Penn. Vector Core | Ordine speciale | sono disponibili fonti alternative di reporter AAV e reporter AAV alternativi |
| Punte di barriera (filtro), 20 μ ThermoFisher | AM12645 | taglia L per diluire AAV per diluire il volume di iniezione e la concentrazione | |
| Barriera (filtro) Punte, 100 μ Taglia L (sterile) | ThermoFisher | AM12648 | per diluire AAV per differenziare il volume e la concentrazione dell'iniezione |
| Circuito a doppia produrazione | possibile utilizzare il metodo di anestesia alternativo | VetEquip | 921400 |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipetta | Gilson | F123600 | per diluire AAV per determinare il volume e la concentrazione dell'iniezione |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic Pipetta P100 | Gilson | F123615 | per diluire l'AAV per determinare il volume e la concentrazione dell'iniezione |
| Scaldamani (HOTHANDS) | ULINE | S-1497B | per mantenere il topo caldo durante l'anestetizzazione |
| Siringhe da insulina, lunghezza 31 G, 8 mm, capacità 3/10 mL | Becton Dickson | 328438 | utilizzato nel video; una siringa per iniezione |
| Isoflurano (Fluriso) | VETONE | 502017 | è possibile utilizzare l'anestesia alternativa |
| Medline Protection Plus Sottopolsini monouso | ThermoFisher | 23-666-062 | per posizionare il mouse durante l'iniezione |
| Contenitore per oggetti taglienti per flebotomia Oak Ridge con coperchio trasparente ThermoFisher | 22-730-434 | per lo smaltimento dell'ago | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato PBS, pH 7,4 | Gibco | 10010023 | Per diluire l'AAV alla concentrazione e al volume desiderati |
| Provette per microcentrifuga a bassa ritenzione con tappo a scatto (sterili) | ThermoFisher | 3451 | per diluire AAV per disire il volume di iniezione e la concentrazione |
| Spugna di garza sterile 4"x"4 | Covidien | 3033 | |
| Trecaina cloridrato Oftalmica (0,5%) | Ocenanside Pharmaceuticals | AK102D5DS | anestetico locale |
| Siringa per tubercolina con una siringa da 27,0 G (o inferiore) | Qualsiasi | N/A | alternativa alla siringa da insulina utilizzata nel video |
| VetEquip' s Guida per l'utente e manuale operativo per il sistema di anestesia per animali da tavolo e mobile da laboratorio. | VetEquip | chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf | link alla guida per l'utente e al manuale |
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Ristampe e permessi
