Articolo metodologico

Perfusione di Langendorff modificata per tempi di perfusione prolungati di innesti cardiaci di roditori

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DOI:

10.3791/66815

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14 giugno 2024

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1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Harvard Medical School and Massachusetts General Hospital, 2Shriners Children's Boston, 3Division of Cardiac Surgery, Corrigan Minehan Heart Center, Massachusetts General Hospital

In questo articolo

Sommario

Questo articolo dimostra la fattibilità di ottenere tempi di perfusione più lunghi (4 ore) di innesti cardiaci murini senza perdita di funzione impiegando pressioni di perfusione inferiori (30-35 mmHg) rispetto a quelle fisiologiche (60-80 mmHg) durante Langendorff.

Abstract

Nonostante gli importanti progressi nella diagnosi e nel trattamento delle malattie cardiovascolari (CVD), il campo ha urgente bisogno di aumentare la ricerca e il progresso scientifico. Di conseguenza, l'innovazione, il miglioramento e/o il riutilizzo del set di strumenti di ricerca disponibili possono fornire banchi di prova migliori per l'avanzamento della ricerca. La perfusione di Langendorff è una tecnica di ricerca estremamente preziosa per il campo della ricerca sulle CVD che può essere modificata per soddisfare un'ampia gamma di esigenze sperimentali. Questa personalizzazione può essere ottenuta personalizzando un gran numero di parametri di perfusione, tra cui la pressione di perfusione, il flusso, la perfusione, la temperatura, ecc. Questo protocollo dimostra la versatilità della perfusione di Langendorff e la fattibilità di ottenere tempi di perfusione più lunghi (4 ore) senza perdita di funzione dell'innesto utilizzando pressioni di perfusione più basse (30-35 mmHg). Ottenere tempi di perfusione prolungati senza danni all'innesto e/o perdita di funzione causati dalla tecnica stessa ha il potenziale per eliminare gli elementi confondenti dai risultati sperimentali. In effetti, in circostanze scientifiche in cui tempi di perfusione più lunghi sono rilevanti per le esigenze sperimentali (ad esempio, trattamenti farmacologici, analisi della risposta immunologica, editing genetico, conservazione del trapianto, ecc.), pressioni di perfusione più basse possono essere la chiave per il successo scientifico.

Introduzione

Il campo della ricerca cardiovascolare ha visto importanti progressi nella diagnosi e nel trattamento delle malattie cardiovascolari (CVD). Tuttavia, nonostante la generale diminuzione dell'incidenza e dei tassi di mortalità, le CVD rimangono la principale causa di morte a livello globale 1,2. Questo dato allarmante evidenzia la necessità di aumentare la ricerca e il progresso scientifico, che dipende senza dubbio dall'accuratezza e dalla prevedibilità degli strumenti di ricerca disponibili. Di conseguenza, c'è un costante bisogno di innovazione, miglioramento e/o riutilizzo del set di strumenti di ricerca. Ad esempio, la perfusione cardiaca retrograda o di Langendorff, una tecnica disponibile sul campo da oltre un secolo, può essere facilmente modificata per coprire una gamma più ampia di esigenze scientifiche e ottenere una gamma più ampia di applicazioni.

L'isolamento dell'innesto cardiaco dal resto dell'organismo durante la perfusione di Langendorff fornisce un importante grado di controllo su un'ampia gamma di parametri sperimentali, tra cui temperatura, soluzione circolante, pressioni di perfusione coronarica, ecc.3,4,5,6,7. La manipolazione di questi parametri facilita la simulazione di un gran numero di scenari cardiaci che possono essere sfruttati per ulteriori progressi scientifici 5,8,9,10. Tra questi parametri, la pressione di perfusione è probabilmente l'impostazione sperimentale più trascurata11.

Durante Langendorff, le pressioni di perfusione mostrano una correlazione diretta con la frequenza cardiaca, le pressioni sistoliche/diastoliche di picco e il consumo di ossigeno11. Questa correlazione fornisce un controllo diretto e preciso sulla quantità di lavoro prodotto dagli innesti cardiaci, che può essere regolata per soddisfare le esigenze sperimentali individuali. Nonostante questa preziosa capacità di controllo, il campo ha storicamente gravitato verso l'uso di pressioni di perfusione più elevate (60-80 mmHg), sottoponendo tutti gli innesti cardiaci a un'elevata richiesta di lavoro indipendentemente dalle esigenze sperimentali 8,12,13,14,15. Le conseguenze di questa domanda di lavoro inutilmente elevata derivano dal principio generale secondo cui il superlavoro tende a portare a un fallimento prematuro. Ciò sembra essere particolarmente vero per gli innesti cardiaci perfusi tramite Langendorff, poiché la natura non fisiologica di questo metodo e la mancanza di supporto al recupero presente in vivo sembrano esacerbare il fallimento dell'innesto. Questa perdita prematura della funzione del trapianto limita significativamente la perfusione e i tempi sperimentali. In effetti, in circostanze in cui tempi di perfusione più lunghi sono più rilevanti per le esigenze sperimentali (ad esempio, trattamenti farmacologici, analisi della risposta immunologica, editing genetico, conservazione del trapianto, ecc.), è possibile permettersi un lavoro cardiaco inferiore in cambio di una maggiore durata del trapianto.

Questo protocollo dimostra la fattibilità dell'utilizzo di pressioni di perfusione più basse (30-35 mmHg) durante Langendorff, nonché l'effetto significativo che queste rappresentano per la funzione dell'innesto cardiaco nel tempo rispetto a pressioni di perfusione più elevate (60-80 mmHg). Inoltre, i risultati di questo manoscritto evidenziano l'importanza di dare priorità alla personalizzazione dell'ampia gamma di parametri di perfusione per soddisfare meglio le esigenze sperimentali.

Protocollo

Questo studio è stato condotto seguendo l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Massachusetts General Hospital.

1. Progettazione del sistema

  1. Assemblare il sistema con i tre componenti a doppia guaina, tra cui una trappola per bolle, un serbatoio, un ossigenatore, una pompa peristaltica e un circolatore d'acqua.
  2. Fissare tutti i componenti rivestiti a un clamp supporto. Collegare i componenti in sequenza con il tubo in silicone in due diverse sequenze (Figura 1A).
    1. Sequenza 1 - Andamento del flusso dell'acqua attraverso la camicia (linee continue nella Figura 1A):
      1. Collegare il deflusso del circolatore d'acqua all'ingresso inferiore della camicia del separatore di bolle utilizzando un tubo da 36 G. Ciò garantirà che il perfusato venga mantenuto alla giusta temperatura (37 °C) prima di raggiungere il cuore, poiché l'acqua perderà calore mentre viaggia attraverso gli altri componenti del sistema.
      2. Collegare l'ingresso superiore della camicia della trappola a bolle d'aria all'ingresso inferiore della camicia del serbatoio utilizzando un tubo della stessa dimensione.
      3. Successivamente, collegare l'ingresso superiore della camicia del serbatoio all'ingresso inferiore della camicia dell'ossigenatore.
      4. Infine, collegare l'ingresso superiore dell'ossigenatore all'afflusso del circolatore d'acqua.
    2. Sequenza 2 - Andamento del flusso del perfusato attraverso il sistema (linee tratteggiate in Figura 1A)
      1. Collegare i connettori luer su entrambi i lati del tubo da 16 G. Fissare la prima estremità alla base del serbatoio e farla passare attraverso la testa della pompa peristaltica. Collegare l'altra estremità a uno degli ingressi della bobina in silicone all'interno dell'ossigenatore.
      2. Collegare un secondo pezzo di tubo da 16 G, dotato di connettori luer lock su entrambe le estremità, al secondo ingresso della bobina in silicone dell'ossigenatore all'ingresso della trappola per bolle con la sporgenza lunga.
      3. Collegare un pezzo più corto di tubo da 16 G, dotato di connettori luer, all'uscita inutilizzata della trappola per bolle a una valvola luer lock a tre vie.
      4. Sul lato opposto della valvola a tre vie, collegare un pezzo di tubo da 16 G con una seconda valvola luer all'altra estremità. Questa seconda valvola si trova immediatamente sopra il serbatoio. Collegare il lato opposto della valvola a un altro tubo da 16 G, seguito dal sensore di pressione.
      5. Collegare un tubo di diametro inferiore ( ̃3,7 mm) alla porta verticale della valvola a tre vie con un connettore alla cannula (14 G angiocath). Il perfusato scorre dal serbatoio all'ossigenatore attraverso la trappola a bolle prima di ricircolare nel serbatoio attraverso la connessione della cannula aortica.

2. Preparazione del perfusato

  1. Preparare il perfusato di base, il tampone Krebs-Henseleit allo 0,96%, il destrano 9,915 mM, il bicarbonato di sodio 25 mM, l'albumina sierica bovina 1,054 mM, lo streptococco all'1%, l'insulina allo 0,13%, l'idrocortisone allo 0,02%, l'eparina allo 0,5% e il cloruro di calcio a 2,75 mM e portare a volume con acqua distillata.

3. Configurazione del sistema di perfusione

  1. Collegare due siringhe da 10 ml alle porte di sfiato superiore e laterale della trappola a bolle.
  2. Aggiungere la base perfusato (75 mL) al serbatoio. Accendere la pompa peristaltica e impostare il circolatore d'acqua a 37 °C.
  3. Collegare una linea di ossigeno (95% O2 e 5% CO2) al terzo ingresso dell'ossigenatore e ossigenare il perfusato a un pO2 minimo di 400 mmHg.
  4. Fissare una porta di iniezione alla porta verticale della valvola a tre vie immediatamente dopo la trappola per bolle. Collegare un ago per infusione alato con una siringa da 1 ml alla porta di iniezione (utilizzata per il campionamento). Picchiettare delicatamente la porta di iniezione o aspirare il perfusato con la siringa da 1 ml per eliminare eventuali bolle introdotte nel circuito.
  5. Una volta che il perfusato di base ha raggiunto la temperatura e il livello di ossigeno, eseguire una lettura iniziale dei parametri biochimici per garantire la corretta concentrazione di ioni (Tabella 1) e la corretta ossigenazione.
    NOTA: I livelli di ioni e pH devono essere letti dopo che la soluzione è stata portata a temperatura (37 °C) ed è stata ossigenata con l'apposita miscela di gas (95% O2, 5% CO2).
  6. Azzerare il sensore di pressione sbloccando il tubo collegato e lasciare che il perfusato fluisca attraverso il sensore aperto e la cannula per equilibrarsi. Una volta bilanciato, premere il pulsante zero nella scatola del sensore e riagganciare il tubo. Registrare le pressioni basali prima del collegamento del cuore al sistema per flussi compresi tra 1 mL/min e 15 mL/min.
  7. Perfusione a bassa pressione
    1. Flebo di adenosina: Preparare una scorta iniziale di 20 mM di adenosina nel perfuso di base. Sciogliere l'adenosina mettendo il tubo in un bagno di acqua tiepida e mescolando per inversione.
    2. Diluire ulteriormente l'adenosina madre fino a una concertazione di 0,06 mg/mL in perfusato base e aggiungerla a una siringa da 50 mL.
    3. Collegare un ago per infusione alato alla siringa da 50 ml e collegarlo alla porta di iniezione nella valvola a tre vie. Fissare la siringa a una pompa a siringa e impostarla a una velocità di infusione di 166,6 μl/min.
      NOTA: Le bolle vengono rilasciate dalla porta di infusione toccando o sfiorando leggermente la porta.
  8. Perfusione ad alta pressione:
    1. Isolamento dei globuli rossi concentrati (pRBC):
      1. Raccogliere 10-12 ml di sangue intero di ratto tramite puntura cardiaca di un ratto donatore.
      2. Centrifugare il sangue a 2000 x g per 10 min.
      3. Rimuovere lo strato di plasma e buffy coat tramite pipettaggio.
      4. Risospendere i pRBC in perfusato senza cloruro di calcio in un rapporto 1:1 (ad esempio, 5 mL di pRBC: 5 mL di perfusato) mediante miscelazione per inversione.
      5. Ripetere i passaggi 3.8.1.2-3.8.1.4 due volte per un totale di 3 lavaggi.
      6. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in perfusato in rapporto 1:1 e aggiungere la miscela al sistema di perfusione, già contenente i 75 mL di perfusato base.
    2. Lasciare che le cellule si distribuiscano uniformemente attraverso il sistema e misurare l'ematocrito del perfusato utilizzando una macchina ematologica. L'ematocrito varia dal 5% al 7%.

4. Preparazione per l'approvvigionamento di innesti cardiaci

  1. Adescare completamente il sistema di perfusione prima dell'inizio dell'approvvigionamento per ridurre al minimo il tempo di ischemia fredda.
  2. Preparare gli strumenti chirurgici. Gli strumenti chirurgici includono tamponi blu, nastro chirurgico, suture di seta 5-0, tamponi di cotone, siringhe saline (50 mL e 10 mL), forbici operatorie, pinze, micro forbici, micro pinze, morsetto di Halstead, 30 U di eparina, tubo da 16 G per il lavaggio del portale, tubo da 14 G per la canulazione del cuore, Angiocath da 16 G, Angiocath da 14 G modificato con bracciale, sensore di pressione, secchiello per il ghiaccio con ghiaccio, piastra Petri da 47 mm, garza.
  3. Creare una cannula modificata inserendo un sottile anello di tubo (diametro interno [ID] 0,167 mm, diametro esterno [OD] 2,42 mm) sulla cannula da 14 G, creando un effetto cuffia.
    1. Rimuovi l'ago della cannula e aggiungi una goccia di super colla sotto l'anello. Far scorrere con cautela l'anello a 1/4 di pollice sopra la base della cannula. Lasciare asciugare la colla prima dell'uso.
    2. Tagliare la cannula il più vicino possibile al bracciale ad angolo e rimuovere gli spigoli vivi.
  4. Riempire una siringa da 60 mL con soluzione fisiologica eparinizzata (0,03 U/mL) per il lavaggio della vena porta. Collegare la siringa al sensore di pressione, quindi al tubo di lavaggio da 16 G.
  5. Collegare una siringa da 10 ml di soluzione fisiologica eparinizzata (0,03 U/mL) alla provetta da 14 G. Collegare l'altra estremità del tubo alla cannula aortica e sciacquare per rimuovere eventuali bolle d'aria.
  6. Posizionare la cannula aortica in una piastra di Petri da 47 mm con una garza e riempirla con soluzione fisiologica. Lasciare la capsula di Petri sul ghiaccio fino a quando il cuore non è collegato al sistema di perfusione.

5. Approvvigionamento di innesti cardiaci

  1. Anestetizzare i ratti in una camera anestetica con isoflurano al 3%.
  2. Una volta che i riflessi non vengono notati, rimuovere il ratto dalla camera, posizionarlo nello spazio chirurgico e somministrare isoflurano continuo (3%) tramite maschera facciale.
  3. Dopo il test di pizzicamento delle dita, eparinizzare l'animale attraverso la vena del pene con 30 U di eparina.
  4. Radere il ratto su tutto l'addome e la parte superiore del torace. Rimuovere i trucioli di pelo dal campo chirurgico. Fissare ogni arto con nastro adesivo per garantire l'assenza di movimenti durante l'intervento chirurgico.
  5. Praticare un'incisione orizzontale sulla linea mediana nella pelle del basso addome, esponendo i muscoli addominali.
  6. Praticare una seconda incisione orizzontale sulla linea mediana nei muscoli addominali esponendo gli organi interni.
  7. Rivela lo sterno, fissalo con un emostatico e ritrailo cranialmente per esporre il fegato e la vena porta. Incannulare la vena porta utilizzando un Angiocath calibro 16.
  8. Collegare la siringa da 60 ml di soluzione salina eparinizzata all'angiocath e creare un'incisione nella vena cava inferiore e nell'aorta addominale per lo sfiato. Lavare l'intera quantità di soluzione fisiologica attraverso la vena porta.
    NOTA: La pressione di lavaggio deve rimanere intorno ai 10 mmHg.
  9. Fai un taglio orizzontale nel diaframma, seguito da un taglio prossimale attraverso le costole su entrambi i lati dello sterno per rivelare la cavità toracica.
  10. Togliete il cuore dalla cavità e posizionatelo immediatamente sulla piastra di Petri con soluzione salina con ghiaccio.
  11. Identificare l'arco aortico, bloccare con emostatici ed esporre l'aorta discendente pulendo il tessuto connettivo rimanente.
  12. Praticare un taglio orizzontale a metà dell'aorta discendente e incannulare con l'angiocath da 14 G.
    NOTA: Non violare la valvola aortica con la cannula.
  13. Fissare la cannula con una sutura sopra la cuffia e rilasciare l'emostato.
  14. Lascia che il cuore rimanga sul ghiaccio fino a quando non viene inserito nel sistema di perfusione.

6. Inizio della perfusione

  1. Impostare il flusso della pompa peristaltica su 1,0 ml/min.
    NOTA: La cannula aortica viene sempre maneggiata con un angolo di 90° rispetto al cuore per evitare l'introduzione di bolle nelle coronarie (Figura 1B).
  2. Pesare il cuore con la cannula prima di collegare il cuore al sistema.
    NOTA: La cannula aortica deve essere completamente priva di bolle d'aria.
  3. Collegare la cannula al connettore del sistema e avviare un timer.
  4. Una volta che il cuore ha una contrazione completa, aumentare il flusso di 0,2 ml/min con incrementi osservando attentamente le pressioni.
  5. Arrestare gli aumenti di flusso al raggiungimento delle pressioni desiderate o fino al raggiungimento di un minimo di 3,5 mL/min.
    1. Perfusione a bassa pressione
      1. Per pressioni comprese tra 30 e 35 mmHg, utilizzare un flusso di 4,5 mL/min.
      2. Avviare la pompa a siringa per adenosina.
    2. Perfusione ad alta pressione
      1. Per pressioni comprese tra 70 e 80 mmHg, utilizzare un flusso minimo di 5,0 mL/min.
      2. Avviare la pompa a siringa per adenosina.

7. Palloncino intraventricolare:

  1. Collegare un palloncino in lattice piccolo (50 μl) a un catetere a palloncino (2 mm di diametro, 15 cm di lunghezza) con una punta affusolata (1,4 mm di diametro).
  2. Collegare il catetere a un sensore di pressione tramite un connettore luer lock e fissare l'intera configurazione a un supporto a morsetto.
  3. Riempire il palloncino/catetere/sensore di pressione con circa 200 μl di soluzione fisiologica tramite una siringa collegata all'estremità superiore del sensore di pressione e rimuovere le bolle dall'interno del sensore, del catetere e del palloncino.
  4. Calibrare il sensore di pressione utilizzando uno sfigmometro.
  5. Fai una piccola incisione orizzontale sopra l'atrio sinistro. Sgonfiare il palloncino aspirando la siringa nella parte superiore del sensore di pressione e inserendola nel ventricolo sinistro.
  6. Avviare l'acquisizione dei dati e gonfiare il palloncino fino a quando le pressioni diastoliche non leggono 0 mmHg.

8. Campionamento

  1. Raccogliere la frequenza cardiaca, il flusso aortico e la pressione coronarica dopo i primi 20 minuti di perfusione e ogni ora successiva.

9. Fine/pulizia

  1. Al termine della perfusione, rimuovere il cuore dal sistema e pesarlo per la stima dell'edema.
  2. Tagliare l'apice del cuore tramite un taglio circonferenziale e congelare rapidamente in azoto liquido per le analisi post-perfusione.
  3. Tagliare un pezzo circonferenziale del cuore per l'imaging istologico e la colorazione. Smaltisci il resto del cuore e la canula.
  4. Sciacquare tutti i componenti del sistema aggiungendo abbondanti quantità di acqua deionizzata (DI) nel serbatoio e azionando la pompa peristaltica. Raccogli l'acqua in un secchio esterno.
  5. Ripetere il passaggio 9.4 due o tre volte.
  6. Sciacquare accuratamente tutte le porte del campione e il tubo del sensore di pressione.
  7. Riempire il serbatoio con 600 ml di acqua deionizzata e 3 ml di pompa detergente da laboratorio in tutto il sistema.
  8. Spegnere lo scaldabagno, il serbatoio dell'ossigeno e la pompa peristaltica.

Risultati

I cuori di ratti Lewis maschi adulti (250-300 g di peso corporeo) sono stati raccolti e perfusi a pressioni di perfusione alte (70-80 mmHg) o basse (30-35 mmHg) (n = 3 per gruppo). Gli effetti della pressione di perfusione sulla funzione cardiaca generale e sulla salute sono stati determinati raccogliendo la frequenza cardiaca, l'edema e la funzione ventricolare sinistra.

È stata determinata una chiara correlazione tra frequenza cardiaca e pressioni di perfusione (Figura 2). La frequenza cardiaca era statisticamente più alta nei cuori ad alta pressione rispetto ai cuori a bassa pressione per tutti i punti temporali, tranne il primo (60 minuti, Figura 2A, B). È interessante notare che i cuori a bassa pressione sembrano subire un periodo di aggiustamento all'inizio della perfusione, in cui ci sono voluti circa 30 minuti perché la frequenza cardiaca si stabilizzasse e raggiungesse i livelli che sono stati mantenuti durante il resto della perfusione (Figura 2A). È stata osservata anche una grande differenza nella pressione del polso ventricolare sinistro (LVPP) tra i gruppi, con la LVPP dei cuori ad alta pressione statisticamente più alta di quella dei cuori a bassa pressione in ogni punto temporale (Figura 3B). Questa elevata domanda di lavoro ha portato a una progressiva perdita di funzione nei cuori ad alta pressione con una diminuzione statistica di LVPP osservata dopo 2 ore di perfusione (Figura 3A, B). In alternativa, non era presente alcuna perdita di funzione nei cuori perfusi con basse pressioni, con LVPP che rimaneva invariato per tutto il tempo di perfusione (Figura 3A, B). Analogamente al LVPP, i cuori ad alta pressione hanno mostrato una maggiore contrazione del muscolo cardiaco (dP/dtmax) e rilassamento (dP/dtmin) durante il tempo di perfusione rispetto ai cuori a bassa pressione (Figura 3C, D). Di conseguenza, i cuori ad alta pressione hanno subito una progressiva perdita di contrattilità e capacità di rilassamento, con entrambi i parametri statisticamente più alti a 1 ora nel tempo di perfusione rispetto all'ultima ora di perfusione. Diversamente, la contrattilità del muscolo cardiaco e le capacità di rilassamento erano comparabilmente basse nel gruppo a bassa pressione e sono rimaste invariate per 4 ore di tempo di perfusione (Figura 3C, D). Oltre agli effetti funzionali, elevate pressioni di perfusione per lunghi periodi di tempo esacerbano anche la ritenzione di liquido interstiziale all'interno degli innesti cardiaci, portando all'edema. Questo edema è stato semi-quantificato in percentuale di variazione di peso e ha portato i cuori ad alta pressione ad avere un aumento di peso statisticamente più elevato rispetto ai cuori perfusi a basse pressioni (Figura 2C).

figure-results-1
Figura 1: Configurazione del sistema di perfusione. (A) Configurazione generale della perfusione. Le linee tratteggiate rappresentano l'ordine in cui i componenti del sistema sono stati collegati per ottimizzare la circolazione del perfusato. Le linee continue e colorate rappresentano l'ordine in cui i componenti sono stati collegati per ottimizzare la temperatura del perfusista. (B) Il modo corretto di maneggiare il cuore dopo l'incannulamento per evitare lo svuotamento del catetere e l'introduzione di aria nelle coronarie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Effetti della pressione sulla frequenza cardiaca e sull'edema. (A) Frequenza cardiaca ottenuta dalle misurazioni del palloncino intraventricolare. La linea continua è la mediana dei gruppi sperimentali. L'area ombreggiata è l'intervallo interquartile. (B) Area sotto la curva (AUC) dei dati sulla frequenza cardiaca per ogni ora di perfusione. (C) Percentuale di peso guadagnato dopo 4 ore di perfusione a basse e alte pressioni. Tutti i dati sono espressi come mediana ±intervallo interquartile (IQR). *p < 0,01, **p < 0,05, ***p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Effetti della pressione sulla funzione ventricolare sinistra. (A) Pressione sistolica massima tracciata nel tempo, indicata come pressione del polso ventricolare sinistro (LVPP). La linea continua è la mediana dei gruppi sperimentali. L'area ombreggiata è l'intervallo interquartile. (B) L'area sotto la curva LVPP (AUC) per ogni ora di perfusione. (C) Contrattilità del muscolo cardiaco quantificata dalla derivata massima dell'impulso pressorio. (D) Rilassamento del muscolo cardiaco quantificato dalla derivata minima dell'impulso pressorio. Tutti i dati sono espressi come mediana ± intervallo interquartile. *p < 0,01, **p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

IoneConcentrazione (mmol/L)
Na+ 135–145
K + <6.00
ca +2 1.0–1.3
Cl - 96–106

Tabella 1: Intervallo accettabile di concentrazione di ioni nel perfusato.

Discussione

La perfusione di Langendorff è una tecnica estremamente flessibile che consente una personalizzazione e una regolazione impressionanti per soddisfare un'ampia gamma di esigenze sperimentali. Questa personalizzazione è consentita dalla significativa regolabilità della maggior parte dei parametri di perfusione, comprese le pressioni di perfusione. A causa della natura retrograda di Langendorff, le pressioni di perfusione sono equivalenti alle pressioni di perfusione coronarica, che svolgono un ruolo essenziale nella funzione cardiaca. È noto che le pressioni di perfusione coronarica (CPP) controllano direttamente il lavoro cardiaco, poiché un'ampia gamma di indici cardiaci (ad esempio, pressione ventricolare sinistra, contrattilità (dP/dtmax), tensione della parete, rigidità ventricolare) sono direttamente proporzionali a CPP 16,17,18. Storicamente, il campo ha utilizzato pressioni di perfusione, e in effetti CPP, comprese tra 60 mmHg e 80 mmHg nel tentativo di imitare le condizioni fisiologiche 5,8,15,19,20,21. Tuttavia, la natura non fisiologica della perfusione retrograda ex vivo delle macchine, in combinazione con l'elevata richiesta di lavoro, porta a una perdita della funzione cardiaca nel tempo (Figura 3). In alternativa, pressioni di perfusione più basse (30-35 mmHg), nonostante non replichino accuratamente le condizioni fisiologiche dei cuori di ratto in vivo, riducono intrinsecamente la richiesta di lavoro cardiaco e raggiungono tempi di perfusione prolungati (4 ore) senza la perdita di funzione nel tempo (Figura 3) e una diminuzione dell'edema del trapianto (Figura 2C). L'uso di pressioni di perfusione più basse, sebbene significhi una deviazione dalla CPP fisiologica, sembra fornire importanti vantaggi rispetto all'uso di pressioni di perfusione fisiologiche, poiché l'eliminazione della perdita di funzione dipendente dalla tecnica durante la perfusione di Langendorff migliora la tecnica in un sistema modello più accurato e prevedibile con un potenziale significativo per far progredire la ricerca cardiovascolare. In particolare, le aree di ricerca che beneficiano e/o richiedono tempi di perfusione prolungati per raggiungere la rilevanza scientifica (ad esempio, trattamenti farmacologici, analisi della risposta immunologica, editing genetico, conservazione del trapianto normotermico, ecc.) stanno diventando sempre più importanti nella battaglia contro le CVD.

La perfusione di Langendorff è indiscutibilmente uno strumento essenziale per il campo della ricerca cardiovascolare. Pertanto, insieme ai notevoli vantaggi che questa tecnica scientifica pone alla comunità di ricerca, si presenta con un importante livello di complessità scientifica. In effetti, ci sono diversi passaggi critici all'interno di questo protocollo che richiedono un'attenta standardizzazione, principalmente per evitare danni al trapianto cardiaco prima, durante e immediatamente dopo l'inizio della perfusione. La prima possibilità di danno da innesto è poco appariscente durante il lavaggio della vena porta. Questo lavaggio con soluzione salina eparinizzata mira a rimuovere quanto più sangue intero possibile dall'innesto cardiaco con un duplice scopo. In primo luogo, serve come via di eutanasia attraverso il dissanguamento. In secondo luogo, riduce al minimo le possibilità di coagulazione all'interno del trapianto cardiaco durante il recupero, l'incannulamento e il trasporto, poiché è noto che il sangue intero di ratto ha tempi di vestizione estremamente brevi22,23. Tuttavia, dopo centinaia di perfusioni cardiache riuscite, è diventato evidente che la pressione applicata all'organismo del ratto durante il lavaggio è di estrema importanza, con la pressione di lavaggio ideale di circa 10 mmHg. Pressioni di lavaggio più elevate della vena porta sembrano provocare danni al sistema vascolare dell'innesto cardiaco, con conseguente aumento della resistenza vascolare (figure-discussion-1). Una maggiore resistenza vascolare in effetti fa sì che le pressioni di perfusione target vengano raggiunte a velocità di flusso inferiori. Questo squilibrio tra pressione e flusso coronarico viene veicolato nella pressione del polso ventricolare sinistro (LVPP) prodotta, con conseguente variabilità significativa.

Il prossimo caso di possibile danno cardiaco all'innesto si verifica durante il collegamento dell'innesto al sistema tramite l'introduzione di bolle d'aria nelle coronarie. Le bolle d'aria possono essere facilmente introdotte maneggiando in modo errato il cuore cannulato (Figura 1B) o rimuovendo in modo improprio le bolle dal sistema di perfusione a monte della trappola per bolle24. A causa della natura retrograda di questa configurazione, qualsiasi introduzione di aria provocherà embolia cardiaca gassosa, con conseguenti insulti ischemici, fibrillazione e, molto comunemente, morte del trapianto. Infine, l'ultimo passaggio critico per garantire il successo del protocollo si verifica durante l'inizio della perfusione. A differenza della grande maggioranza dei manoscritti che riportano l'utilizzo di Langendorff come tecnica, l'inizio della perfusione in questo protocollo viene eseguito a flussi relativamente bassi (1 mL/min) con aumenti incrementali (+0,2 mL/min), che garantiscono un controllo completo sulle pressioni di perfusione 5,8,15,19,20,21 . Questo aumento incrementale del flusso, e quindi della pressione, è fondamentale in quanto bruschi cambiamenti di pressione aumentano irreversibilmente la resistenza vascolare e alterano il delicato equilibrio flusso/pressione.

L'elevata resistenza vascolare nelle perfusioni di Langendorff a pressione controllata è molto consequenziale, poiché le pressioni di perfusione target vengono raggiunte a flussi inferiori e gli innesti risultano sottoperfusi. La grande dipendenza da questo perfetto equilibrio tra flusso e pressione è probabilmente la più grande limitazione di questo protocollo, poiché qualsiasi danno precedente al trapianto, intenzionale (ad esempio, conservazione prolungata del freddo, insulto di ischemia calda, infarto del miocardio, ecc.) o non intenzionale, porta a un aumento della resistenza vascolare. In effetti, questo protocollo è particolarmente utile per la ricerca in cui l'esperimento inizia dopo l'inizio della perfusione (ad esempio, trattamenti farmacologici, analisi della risposta immunologica, editing genetico, conservazione del trapianto normotermico, ecc.) ma non prima. Questa limitazione è un perfetto esempio di un Langendorff che non si adatta a tutti gli scopi e si dovrebbe prestare particolare attenzione ad adattare i parametri di perfusione per soddisfare meglio le esigenze sperimentali.

Dichiarazioni

SNT ha domande di brevetto rilevanti per questo studio e fa parte del comitato consultivo scientifico di Sylvatica Biotech Inc., una società focalizzata sullo sviluppo di tecnologie per la conservazione degli organi. Tutti gli interessi in competizione sono gestiti dall'MGH e da Partners HealthCare in conformità con le loro politiche in materia di conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da generosi finanziamenti a S.N.T. da parte del National Institutes of Health degli Stati Uniti (K99/R00 HL1431149; R01HL157803) e American Heart Association (18CDA34110049). Riconosciamo inoltre con gratitudine il finanziamento del National Institute of Health (R01DK134590; R24OD034189), National Science Foundation (EEC 1941543), Harvard Medical School Eleanor and Miles Shore Fellowship, Polsky Family Foundation, il Claflin Distinguished Scholar Award per conto del MGH Executive Committee on Research e Shriners Children's Boston (Grant #BOS-85115).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5-0 SutureFine Scientific Tools18020-50
14 G AngiocathBecton Dickinson381867
16 G AngiocathBecton Dickinson381957
24 mm Adattatori per camera cardiacaRadnoti140132
Catetere a palloncinoRadnoti170423
BD  Siringhe sterili con punta a slittamento - 10 mLFisher Scientific14-823-16E
BD  Siringhe sterili con punta a slittamento - 1 mLFisher Scientific14-823-434
BD  Siringhe sterili con punta scorrevole - 50 mLFisher Scientific14-820-11
Albumina sierica bovinaSigmaA7906
Camera di conformità Bubble Trap Radnoti130149
Cloruro di calcioSigmaC7902
Supporto per morsettoUnited ScienticRTCLMP1
destranoSigma31389
Cavo di prolunga DIN8IworxSKU  C-DIN-EXT
Falcon High Clarity 50 mL provette conicheFisher Scientific14-432-22
GSC Go Science Crazy  Supporto per anello di supporto in ghisaFisher ScientificS13748
Heart  CameraRadnoti140160
Bagno circolatore d'acqua riscaldataCole ParmerN/A Eparina
sodica IniezioneMedplusG-0409-2720-0409-2721
IdrocortisoneSolu-CortefMGH Farmacia
InsulinaHumulin RMGH Farmacia
Sensore di pressione sanguigna riempito di liquido invasivoIworxSKU  BP-10x
Iworx Sistema di acquisizione datiIworxIX-RA-834
Krebs-Henseleit BufferSigmaK3753
Palloncino di pressione ventricolare sinistroRadnoti170404
Masterflex L/S Easy-Load II Testa della pompa per tubi di precisione, alloggiamento in PPS, rotore SSVWRMFLX77200-60
Masterflex L/S Standard Sistemi di pompe digitaliVWRMFLX07551-30
Camera di ossigenazione a membranaRadnoti130144
Penicillina-StreptomicinaThermoFisher Scientific15140122
Tubi in polietileneFisher Scientific14-170-12H
Tubo per pompa di precisione-16VWRMFLX96410-16
Bicarobonato di sodioSigma5761
Pompa a siringa standard PHD ULTRA CPHarvard Aparatus88-3015
Tygon Tubo di trasferimentoVWRMFLX95702-03

Riferimenti

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