Articolo metodologico

Studio degli effetti degli inquinanti ambientali inalati sulla funzione olfattiva nei topi

DOI:

10.3791/66818

⸱

13 settembre 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, Qingdao University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata del test del cibo sepolto e dell'esperimento di discriminazione degli odori sociali per valutare gli effetti dell'esposizione agli inquinanti ambientali inalati sulla funzione olfattiva nei topi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La compromissione olfattiva è un problema significativo per la salute pubblica e predice in modo indipendente il rischio di malattie neurodegenerative. L'esposizione agli inquinanti ambientali inalati può compromettere l'olfatto; In tal modo, c'è un urgente bisogno di metodi per valutare gli effetti dell'esposizione agli inquinanti ambientali inalati sull'olfatto. I topi sono modelli ideali per esperimenti olfattivi grazie al loro sistema olfattivo altamente sviluppato e alle caratteristiche comportamentali. Per valutare gli effetti dell'esposizione agli inquinanti ambientali inalati sulla funzione olfattiva nei topi, viene fornito un test dettagliato del cibo sepolto e un esperimento di discriminazione degli odori sociali, compresa la preparazione dell'esperimento, la selezione e la costruzione di strutture sperimentali, il processo di test e gli indici di tempo. Nel frattempo, vengono discusse le apparecchiature di cronometraggio, i dettagli operativi e l'ambiente sperimentale per garantire il successo del test. Il solfato di zinco viene utilizzato come trattamento per dimostrare la fattibilità dell'approccio sperimentale. Il protocollo fornisce un processo operativo semplice e chiaro per valutare gli effetti degli inquinanti ambientali inalati sulla funzione olfattiva nei topi.

Introduzione

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La compromissione olfattiva è emersa come un problema di salute pubblica degno di nota ed è associata in modo indipendente a un aumento del rischio di malattie neurodegenerative. Questa condizione può influire negativamente sul benessere generale, contribuire allo sviluppo di sintomi depressivi e comportare una diminuzione della qualità della vita. Il suo impatto è evidente nell'alterata percezione del cibo, nell'ostacolo nella comunicazione sociale e nell'aumento dei sentimenti negativi1. Vari fattori, tra cui la malattia sinonasale, l'infezione del tratto respiratorio superiore e le lesioni cerebrali traumatiche, sono stati considerati fattori che contribuiscono alla compromissione olfattiva nell'uomo2. In particolare, gli inquinanti ambientali inalabili come il PM2,5, che si stima vadano dal 2% al 16%, entrano nel corpo attraverso l'aria inspirata, attraversano la cavità nasale e raggiungono specifiche regioni dedicate all'olfatto dove si depositano 3,4,5,6,7. Recenti scoperte indicano che gli inquinanti ambientali inalabili, tra cui PM2.5 e ammoniaca, possono effettivamente danneggiare i neuroni sensoriali olfattivi 8,9,10. Tuttavia, è necessaria un'ulteriore convalida per accertare se tale danno porta direttamente a disfunzioni olfattive. Pertanto, una valutazione meticolosa degli effetti degli inquinanti ambientali inalabili sulla funzione olfattiva è di particolare importanza.

Attualmente, numerosi laboratori di ricerca impiegano i topi come modello alternativo di vertebrati per esperimenti comportamentali volti a comprendere i cambiamenti nella funzione olfattiva 11,12,13,14. I topi sono stati scelti come sistema modello preferito per lo studio della comunicazione chimica dei vertebrati, e mostra una notevole sensibilità olfattiva cruciale per il foraggiamento e la comunicazione sociale15. Inoltre, la gamma in continua evoluzione di strumenti per osservare e influenzare il comportamento dei topi ha reso questa specie eccezionalmente attraente per la ricerca sulla funzione olfattiva16.

In questo studio, abbiamo impiegato il test del cibo sepolto e l'esperimento di discriminazione degli odori sociali per valutare la compromissione olfattiva in un modello murino esposto a inquinanti ambientali inalabili. Per migliorare la precisione della valutazione, abbiamo optato per il metodo più rappresentativo per la valutazione della funzione olfattiva. Abbiamo sistematicamente perfezionato questo metodo per garantire semplicità e chiarezza, permettendoci di valutare efficacemente l'entità della disfunzione olfattiva indotta da inquinanti ambientali inalabili.

Protocollo

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Abbiamo utilizzato topi maschi C57BL/6J (età: 6-8 settimane; peso: 20-22 g) per tutti i test comportamentali. I topi sono stati sottoposti a condizioni stabili (ad esempio, temperatura, 23 ± 1 °C; umidità, 55% ± 5% e ciclo luce-buio di 12/12 ore con luci accese alle 7:00). Tutti i test comportamentali sono stati eseguiti tra le 10:00 e le 17:00. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico del Comitato Professionale per gli Esperimenti sugli Animali dell'Università di Qingdao. Dopo un periodo di acclimatazione di 1 settimana, tutti i topi sono stati esposti a inquinanti ambientali inalabili.

1. Esposizione agli agenti inquinanti

  1. Somministrazione intranasale per instillazione
    1. Sciogliere gli inquinanti ambientali inalabili in una soluzione salina allo 0,9%. Utilizzare una volta una soluzione di solfato di zinco al 5%, che ha dimostrato di causare disfunzioni olfattive17. Per i topi di controllo, somministrare una soluzione salina normale allo 0,9%.
    2. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital 18 di sodioall'1% e valutare la profondità dell'anestesia utilizzando il riflesso del pizzicamento delle dita. Applicare un unguento veterinario sugli occhi del topo per prevenire la secchezza. Posizionare il mouse sul dorso su una superficie inclinata, con la testa rivolta verso il basso.
    3. Utilizzando una pistola pipettatrice, somministrare 10 μl di soluzione in una narice del topo, consentendo di inalare naturalmente la soluzione nella cavità nasale.
    4. Per garantire il benessere del topo e prevenire qualsiasi potenziale disagio, ripetere l'inalazione per l'altra narice dopo un intervallo di 10 minuti.
    5. A 3 giorni dalla somministrazione intranasale mediante instillazione nei topi, eseguire il test del cibo sepolto.

2. Test del cibo sepolto

  1. Effettuare la privazione del cibo a 18-24 ore prima del test rimuovendo tutti i pellet di cibo dalla tramoggia del cibo della gabbia domestica. Cambia i materiali della lettiera per i topi. Non rimuovere la bottiglia d'acqua.
  2. Disporre il tavolo operatorio come descritto di seguito.
    1. A 1 ora prima dell'inizio del test, portare la gabbia contenente i topi in sala operatoria per riposare.
    2. Organizzare la sala operatoria durante questo periodo. Usa e contrassegna le gabbie per mouse standard in PVC trasparente come A poiché creano un ambiente familiare. Utilizzare e contrassegnare la gabbia di prova come B, che è una gabbia di scoiattolo standard in PVC trasparente. Contrassegna la gabbia comune utilizzata per posizionare i topi dopo l'esperimento come gabbia C.
    3. Copri le gabbie A e B con 3 cm di materiale da lettiera e misurale con un righello. Disporre le gabbie una accanto all'altra, con una distanza di 0,5 m tra ciascuna gabbia (Figura 1).
    4. Definire l'area sperimentale come un'area con un raggio di 2 m, con il centro che è il centro delle gabbie. Definisce l'area al di fuori dell'intervallo di 2 m come area di osservazione.
    5. Tenere la gabbia C e le gabbie contenenti topi non testati il più lontano possibile dall'area sperimentale.
  3. Registrare il tempo necessario per trovare il cibo come descritto di seguito.
    1. Selezionare una posizione a caso nella gabbia B, seppellire il cibo 1 cm sotto la superficie della lettiera e lisciare la superficie della lettiera.
    2. Metti il mouse nella gabbia A per 4 minuti. Trasferisci i mouse nella gabbia B al termine del cronometraggio, accendi il dispositivo video e torna nell'area di osservazione.
    3. Quando il topo raccoglie il blocco di cibo con la zampa anteriore, interrompi la registrazione video. In alcuni casi, i topi possono essere visti mangiare con la testa china sul cibo. Questo comportamento indica anche il successo della prova, anche se il topo non tiene il cibo con la zampa anteriore.
    4. Registra i dati. Registrare il tempo trascorso dal contatto con il tappetino sul fondo della gabbia B fino a quando non è stato trovato il cibo per ogni topo. Se i topi non trovano cibo dopo 4 minuti, registrare il tempo di ricerca come tempo di ritardo di 240 s.
    5. Metti il mouse nella gabbia C dopo il test.
    6. Togliete il mangime dalla gabbia B e mettetelo in un sacchetto sigillato. Sostituisci il cibo nella gabbia B e prova il topo successivo dopo aver cambiato il materiale della lettiera, come descritto di seguito.
      1. Per i topi alloggiati nella stessa gabbia, eseguire il test con lo stesso set di materiali da lettiera nella gabbia B. Per i topi in gabbie diverse, pulire la gabbia con alcol e sostituire i materiali della lettiera.
    7. Aggiungi mangime e acqua ai topi dopo l'esperimento. Esegui l'esperimento di discriminazione sociale degli odori 1 giorno dopo.
      NOTA: Le maschere devono essere indossate durante tutto il processo e i guanti trasparenti devono essere cambiati dopo che ogni topo ha terminato l'esperimento per evitare il più possibile la croce degli odori. Mantieni l'ampiezza dei movimenti il più piccola possibile per evitare lo stress del mouse.

3. Esperimento sociale di discriminazione degli odori

  1. Raccolta delle urine
    1. Raccogliere separatamente l'urina dei topi maschi sessualmente maturi e dei topi femmina e aliquotare in provette in volumi uguali19. Confezionare in provette da microcentrifuga da 2 ml con 300 μl di urina in ciascuna provetta.
    2. Conservare i campioni a -80°C fino al momento dell'uso. Agitare le provette per distribuire uniformemente il campione dopo lo scongelamento. Non scongelare e congelare ripetutamente il campione.
  2. Disporre il tavolo operatorio come descritto di seguito.
    1. A 1 ora prima dell'inizio del test, portare la gabbia contenente i topi in sala operatoria per riposare.
    2. Organizzare la sala operatoria durante questo periodo come descritto nei passaggi 2.2.2-2.2.5.
  3. Registrare il tempo di ricerca dell'urina come descritto di seguito.
    1. Praticare una scanalatura con del nastro adesivo attorno a ciascuno dei due lati larghi della gabbia B abbastanza grande da contenere la provetta da microcentrifuga contenente 300 μl di urina maschile e femminile. Posizionare i tubi e tenere chiusi i due coperchi dei tubi per ora.
    2. Metti il mouse nella gabbia A e imposta un conto alla rovescia per 4 minuti. Aprire i due tubi della gabbia B al termine della cronometraggio.
    3. Trasferire il mouse nella posizione centrale della gabbia B, alla stessa distanza dai due tubi, quindi accendere l'apparecchiatura di registrazione video e ritirarsi delicatamente e lentamente nell'area di osservazione.
    4. Quando il topo annusa la parete/bocca del tubo o anche all'interno del tubo, il tubo viene annusato con successo. A questo punto, premere il cronometro e registrare il tempo come il tempo di annusare il tubo (MS), quindi continuare a registrare il tempo di permanenza (X s) fino a quando il mouse non si allontana dal tubo.
    5. Continuate a cronometrare l'ora annusando l'altro tubo. Quando il topo annusa la parete/bocca del tubo o anche all'interno del tubo, il tubo viene annusato con successo. Premere il cronometro e registrare il tempo impiegato per annusare l'altro tubo (NS), quindi continuare a registrare il tempo di permanenza (Y s) fino a quando il mouse non si allontana dal tubo.
    6. Trasferisci il topo nella gabbia C alla fine dell'esperimento.
    7. Cambiare le provette delle urine e il materiale della lettiera della gabbia B dopo ogni test sui topi. Metti l'urina di ratto usata in un sacchetto pulito in base al sesso.
    8. Cambia i guanti e prova il mouse successivo come descritto sopra.
  4. Esegui l'esperimento in un laboratorio senza odore evidente. Evita i prodotti personali che emettono odori forti. Indossare guanti e maschere durante la procedura per evitare il più possibile l'attraversamento degli odori. Mantieni l'ampiezza dei movimenti il più piccola possibile per evitare lo stress del mouse.

Risultati

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Gli inquinanti ambientali inalabili compromettono la funzione olfattiva nei topi. È stato dimostrato che lo zinco atmosferico emesso dagli inceneritori e dai veicoli a motore è un inquinante inalato che può provocare infiammazione polmonare allergica20. Il solfato di zinco è considerato uno dei composti tipici che causano disfunzioni olfattive21. Pertanto, utilizziamo il solfato di zinco come trattamento per esporre i topi mediante instillazione intranasale e test utilizzando il test del cibo sepolto e l'esperimento di discriminazione degli odori sociali. Nel test di sepoltura del cibo, i topi esposti al solfato di zinco hanno impiegato più di 240 secondi per trovare il cibo rispetto al gruppo di controllo (Figura 2). I topi privi di cibo con un olfatto normale in genere trovano il cibo sepolto entro 1 minuto. Quando i topi hanno sviluppato una disfunzione olfattiva, ci è voluto più tempo per trovare cibo o addirittura non riuscivano a trovarlo. Rispetto al gruppo di controllo, i topi del gruppo esposto hanno impiegato più tempo per trovare cibo, con alcuni casi in cui non sono riusciti a trovare cibo entro 240 secondi, indicando un danno alla funzione olfattiva.

Risultati simili sono stati osservati nell'esperimento di discriminazione sociale degli odori. Nei topi esposti al solfato di zinco, né l'urina maschile né quella femminile potevano essere sniffate durante il tempo di osservazione stabilito (Figura 3A). Oltre il tempo stabilito, i topi esposti al solfato di zinco hanno sniffato brevemente l'urina di femmine e maschi, ma il tempo di sniffare era significativamente inferiore a quello dei topi di controllo (Figura 3B). Quando vengono presentati contemporaneamente volumi uguali di urina femminile e maschile, i topi maschi di solito preferiscono l'urina femminile22. I topi del gruppo esposto avevano bisogno di un tempo più lungo per distinguere tra l'urina femminile e quella maschile o non riuscivano nemmeno a distinguerli. In particolare, rispetto al gruppo di controllo, i topi del gruppo esposto hanno trascorso più tempo ad annusare l'urina e hanno trascorso un tempo più breve in prossimità dell'urina.

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Figura 1: Layout della tabella operativa. Le gabbie A e B sono state mantenute a una distanza di 0,5 m. L'apparecchiatura di registrazione video è stata controllata sopra la gabbia B dal supporto del telefono cellulare e il campo video è stato regolato per registrare l'ambiente interno della gabbia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Risultati dei test sugli alimenti sepolti. Analisi statistica dei topi di controllo e dei topi esposti al solfato di zinco in cerca di cibo. I topi del gruppo di controllo hanno trovato cibo entro 30 secondi e i topi esposti al solfato di zinco hanno trovato cibo per più di 240 secondi, che sono stati calcolati come 240 secondi. È stato utilizzato un t-test campione indipendente per confrontare le differenze tra i due gruppi. I dati sono presentati come media ± SD (n = 3 topi per gruppo); ** p < 0,01. Se un animale non trovava il cibo dopo 240 s, il tempo per trovare il cibo veniva registrato in 240 s, come nel caso di tutti gli animali trattati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Esperimento di discriminazione sociale degli odori. (A) Analisi statistica dei topi di controllo e dei topi esposti al solfato di zinco alla ricerca di urina. I topi del gruppo di controllo hanno trovato l'urina entro 30 secondi e i topi esposti al solfato di zinco hanno trascorso più di 240 secondi alla ricerca di urina femminile o maschile, che è stata contata come 240 secondi. Se un animale non trovava la fiala di urina dopo 240 s, il tempo per trovare la fiala veniva registrato come 240 s, come nel caso di tutti gli animali trattati. (B) Il tempo di permanenza a contatto con l'urina è stato analizzato statisticamente per i topi di controllo e i topi esposti al solfato di zinco. È stato utilizzato un t-test campione indipendente per confrontare le differenze tra i due gruppi. I dati sono presentati in media ± SD (n = 3 topi per gruppo); ** p < 0,01, * p < 0,5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Questo articolo introduce due protocolli fondamentali progettati per la valutazione rapida della compromissione olfattiva nei topi. Vari inquinanti ambientali inalabili provocano livelli distinti di disfunzione olfattiva nei topi. Il test del cibo sepolto viene impiegato per valutare la capacità di rilevare gli odori volatili, mentre l'esperimento di discriminazione degli odori sociali valuta la capacità dell'animale di discernere e differenziare i vari odori sociali. Il protocollo serve a valutare gli effetti tossici degli inquinanti ambientali sulla funzione olfattiva.

Gli inquinanti ambientali inalati, tra cui ozono, ammoniaca e gas di scarico diesel, possiedono odori che possono influenzare la percezione olfattiva dei topi durante l'analisi del campione23,24. È fondamentale notare che condurre esperimenti comportamentali sui topi subito dopo la conclusione dell'esposizione potrebbe potenzialmente produrre risultati falsi negativi22. Per affrontare questa preoccupazione, abbiamo implementato misure per migliorare l'affidabilità sperimentale. In particolare, le gabbie sono state pulite a fondo e i materiali delle lettiere sono stati sostituiti dopo il periodo di esposizione. Successivamente, sono stati condotti esperimenti comportamentali con un intervallo di 24 ore dopo l'esposizione22. Questo adeguamento procedurale mira a garantire risultati accurati e significativi.

Nell'esperimento di sepoltura del cibo, un parametro chiave era il tempo impiegato dai topi per localizzare il cibo nascosto. Vale la pena notare che i topi stressati tendono a mostrare un'attività maggiore e una concentrazione ridotta durante i test, il che può potenzialmente portare a risultati falsi positivi 25,26,27,28. Pertanto, è imperativo assicurarsi che i topi rimangano calmi e non siano sottoposti a stress eccessivo durante la fase di test. Per evitare qualsiasi potenziale interferenza, i topi sono stati trasferiti dal loro alloggiamento all'area di test 1 ora prima dell'esperimento. Questo passo è stato fatto per consentire ai topi di acclimatarsi e ridurre lo stress. Per facilitare la registrazione accurata dell'ora, il videoregistratore è stato attivato quando i topi sono stati introdotti nella gabbia sperimentale B, quindi gli osservatori si sono immediatamente ritirati nell'area di osservazione. Gli osservatori sono stati posizionati a una distanza ottimale di 2 m dalla gabbia, garantendo un'osservazione chiara senza causare disturbi. I criteri per identificare la scoperta di cibo di successo includevano casi in cui i topi usavano le zampe anteriori o chinavano la testa sul cibo. Entrambi i comportamenti sono stati considerati indicativi della ricerca di cibo, in linea con gli standard ampiamente accettati19. Nei casi in cui più topi all'interno dello stesso gruppo di dosaggio necessitassero di test, è stato garantito che non venissero riportati nella loro gabbia di allevamento originale, ma temporaneamente collocati in una normale gabbia C. Solo dopo aver testato tutti i topi nella stessa gabbia, sono stati collettivamente riportati al loro alloggio originale. Dato il potenziale odore degli alimenti testati, sono state prese precauzioni per conservarli in sacchetti ermetici in anticipo e richiuderli o richiuderli o metterli in contenitori ermetici dopo l'uso. Queste misure sono state implementate per mantenere l'integrità delle condizioni sperimentali e garantire risultati affidabili.

Negli esperimenti di discriminazione sociale degli odori, è essenziale utilizzare campioni di urina derivati da topi sessualmente maturi19. La determinazione della maturità sessuale si basa sull'età dei topi, un parametro che varia tra i diversi ceppi di topi. Dopo la raccolta, si raccomanda di conservare separatamente l'urina maschile e femminile in frigorifero a -80 °C. Studi precedenti utilizzavano cronometri per scopi di cronometraggio. Tuttavia, questo metodo presentava dei limiti, come il fatto che gli osservatori si trovavano a una distanza considerevole dalla gabbia sperimentale, portando a potenziali problemi come osservazioni poco chiare e tempi imprecisi 19,22,29. Per affrontare queste sfide, abbiamo migliorato le procedure di cronometraggio incorporando apparecchiature video al posto dei cronometri. Questa modifica non solo facilita l'acquisizione di dati più precisi, ma consente anche la raccolta di dati da più gruppi sperimentali.

In questi esperimenti, il dispositivo video è stato utilizzato per registrare il comportamento dei topi, il che ha il vantaggio di ridurre la frequenza dei fotogrammi del video e consentire agli osservatori di registrare il tempo delle varie attività comportamentali dei topi in modo più accurato, compensando la carenza che gli osservatori non potevano osservare il comportamento dei topi nell'area di osservazione. Tuttavia, lo svantaggio dell'utilizzo di apparecchiature di registrazione video è che il tempo di analisi aumenterà. Alla fine dell'esperimento, abbiamo dovuto guardare di nuovo il video per registrare il tempo delle varie attività comportamentali di ciascun topo. Quando il numero di topi è elevato, è necessario analizzare il video di ciascun topo, il che aumenterà il carico di lavoro del laboratorio.

I risultati della ricerca indicano che vari inquinanti ambientali inalabili possono avere un impatto negativo sulla funzione olfattiva. Questo articolo introduce un approccio rapido, semplice e ragionevolmente preciso alla valutazione della tossicità olfattiva associata agli inquinanti ambientali inalabili. Questo metodo è fondamentale per condurre valutazioni del rischio di disfunzione olfattiva attribuita agli inquinanti ambientali nei soggetti umani.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (82204088, 82273669) e dalla Natural Science Foundation of Shandong Province, China (ZR2021QH209).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5-10 μ L  micropipetta regolabileEppendorf, Germania3123000225Instillazione intranasale
Soluzione salina allo 0,9%Solarbio7647-14-5Dissolvere gli inquinanti
Solfato di zinco anidroMacklin7733-02-0Esporre i topi
Provetta da centrifuga (2 mL)Biosharp IncorporatedBS-20-MPosizionare l'urina
Bilancia elettronicaChangzhou Ohaus Co. EX125DZHPeso anestetici e inquinanti
GraphPad Prism GraphPadSoftware8.0.1analisi statistica
Rilevatore di polvere portatileTSI  IncorporatoDuatTrak figure-materials-18532Topi esposti all'inalazione
Apparecchiature di registrazione videoApple Inc.iPhone 6s PlusIl tempo di attività dei topi è stato registrato
Vortex mixerHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.Vortice-5 Soluzione di miscelazione

Riferimenti

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