Questo protocollo descrive il metodo per ridurre l'assunzione alimentare di acido folico o colina nei topi femmina prima della gravidanza con l'obiettivo di studiare l'impatto della dieta materna sui risultati di salute della prole.
Articolo metodologico
Modifica dei livelli di acido folico o colina nella dieta materna per studiare l'impatto delle carenze sugli esiti di salute della prole
In questo articolo
Sommario
Abstract
La nutrizione materna durante la gravidanza e l'allattamento svolge un ruolo importante nel neurosviluppo della prole. Il metabolismo a un carbonio (1C), che si concentra sull'acido folico e sulla colina, così come su altre vitamine del gruppo B, svolge un ruolo chiave durante la chiusura del tubo neurale del feto in via di sviluppo. Tuttavia, l'impatto di queste carenze nutrizionali materne durante la gravidanza sugli esiti di salute della prole dopo la nascita rimane relativamente indefinito. Inoltre, le carenze alimentari materne di acido folico o colina possono influire su altri risultati di salute nella prole, rendendolo un modello prezioso. Questo protocollo ha lo scopo di delineare la procedura per indurre un deficit nel metabolismo dell'1C nei topi femmina attraverso modifiche della dieta. Le femmine vengono messe a dieta allo svezzamento, fino a 2 mesi di età, per 4-6 settimane prima dell'accoppiamento e rimangono a dieta durante la gravidanza e l'allattamento. La prole di queste femmine può essere valutata per gli esiti di salute. Le femmine possono essere utilizzate più volte per generare prole e i tessuti delle femmine possono essere raccolti per misurare le misurazioni dei metaboliti 1C. Questo protocollo fornisce una panoramica su come indurre carenze alimentari materne di acido folico o colina per studiare i risultati di salute della prole.
Introduzione
La nutrizione materna durante la gravidanza e l'allattamento svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo della prole. Il metabolismo a un carbonio (1C) è una rete metabolica chiave che integra i segnali nutrizionali con la biosintesi, l'omeostasi redox e l'epigenetica. L'acido folico e la colina sono componenti centrali dell'1C che svolgono un ruolo importante nella chiusura del tubo neurale. È ampiamente raccomandato per le donne integrare con acido folico e colina durante l'età fertile1. Mentre il ruolo critico dell'acido folico nello sviluppo fetale è chiaramente stabilito, i meccanismi sottostanti coinvolti rimangono poco chiari. Si raccomanda alle donne in età fertile di assumere acido folico prima di rimanere incinte poiché la chiusura del tubo neurale avviene entro il primo trimestre2. Le madri in gravidanza che sono carenti di acido folico o di altri componenti di 1C, come la colina, hanno una maggiore incidenza di partorire con difetti del tubo neurale a causa dell'elevata richiesta di sintesi nucleotidica e di altri processi richiesti dal primo periodo gestazionale3.
L'impatto a lungo termine delle diete materne carenti nell'assunzione di metabolismo di 1C sugli esiti di salute della prole è scarsamente compreso. La ricerca dei nostri laboratori, così come di altri, ha dimostrato che le diete materne carenti di acido folico o colina hanno effettivamente un impatto sugli esiti di salute della prole dopo l'ictus ischemico utilizzando modelli preclinici 4,5,6. L'impatto della dieta materna è stato dimostrato anche in studi clinici in cui sono stati descritti volumi cerebrali più piccoli e livelli di metilazione alterati7. La teoria delle origini dello sviluppo della salute e della malattia (DOHaD) suggerisce che le malattie croniche prospettiche sono programmate in utero 8,9 e la dieta materna svolge un ruolo importante.
Questo protocollo è progettato per delineare il metodo per modificare il consumo alimentare di 1C nei topi femmina prima della gravidanza, con lo scopo di esaminare gli effetti della nutrizione materna sugli esiti di salute della prole.
Protocollo
Questo protocollo è stato approvato e tutti i soggetti animali sono stati utilizzati in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Midwestern University (Protocollo 2983). In questo studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J, di 2 mesi di età (peso corporeo, ~20 g). In generale, possono essere utilizzati topi femmine in età riproduttiva10. Per evitare gli effetti della cucciolata, è necessario utilizzare più femmine per ogni dieta11. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Preparazione sperimentale
- Procurati una dieta carente di acido folico o colina dai produttori commerciali di alimenti per roditori. Fare riferimento alla Tabella 1 per l'elenco dettagliato dei micro e macronutrienti, inclusa l'esatta quantità di acido folico o colina necessaria nelle diete carenti.
NOTA: È necessario ordinare anche una dieta di controllo corrispondente; i dettagli sono elencati nella Tabella 1. Queste diete erano basate su AIN93G e contenevano i nutrienti raccomandati per i roditori10. - In collaborazione con il produttore, determinare la colorazione delle diete, in quanto ciò può aiutare con la distribuzione di diete corrette durante gli studi sperimentali. Questo studio ha utilizzato il verde per le diete carenti di acido folico, il giallo per la colina e il bianco per la dieta di controllo. Sono tutti facilmente distinguibili.
NOTA: Non ci sono restrizioni sul consumo di acqua. L'acqua non contiene acido folico, colina o altri metaboliti 1C.
2. Indurre una carenza alimentare di acido folico o colina
- Prima di mettere a dieta le femmine, pesare tutti gli animali. Questo sarà indicato come peso di base.
- A seconda della configurazione della gabbia da laboratorio (ventilata o non ventilata, vedere la tabella dei materiali), sostituire o rabboccare i pellet dietetici speciali per ciascuna gabbia alcune volte alla settimana. Non riempire eccessivamente i cagnolini per cibo in gabbia con diete speciali, poiché ciò potrebbe portare al deterioramento dei pellet una volta che interagiscono con la saliva degli animali e al deterioramento nel tempo.
NOTA: Assicurarsi che le scorte dietetiche siano conservate secondo le linee guida del produttore e utilizzate prima della data di scadenza. - Mantieni i topi femmina a dieta per 4-6 settimane prima dell'accoppiamento.
- Introduci i topi maschi nelle gabbie femminili per l'accoppiamento. Assicurati che i maschi vengano introdotti nelle gabbie femminili dopo che le femmine hanno seguito diete speciali per un minimo di 4-6 settimane. Introdurre un maschio in una gabbia femminile per uno o più giorni.
NOTA: Nel presente studio, i maschi sono stati tenuti con le femmine per l'intera durata dell'esperimento (~ 4 mesi) per aumentare il numero di cuccioli prodotti poiché l'accoppiamento nei topi può avvenire dopo la nascita12. Le femmine dopo i 6 mesi di età non sono state utilizzate per nessuno studio. - Controlla quotidianamente le femmine di topo per verificare la presenza di un tappo copulatorio, che indica che si è verificata la riproduzione.
- Raccogli le misurazioni del peso dei topi femmina ogni settimana per monitorare la loro salute e lo stato di gravidanza.
NOTA: È sicuro per le femmine essere mantenute a dieta per la gravidanza (~21 giorni) e l'allattamento (~21 giorni). - Quando la prole viene svezzata dalla madre (~21 giorni dopo la nascita), sottoporla a una dieta carente di acido folico e colina, nonché a una dieta di controllo. Per i dettagli, vedere la sezione risultati.
NOTA: Quando si studia l'impatto della dieta materna sui risultati di salute della prole, si raccomanda che la prole venga sottoposta a una dieta di controllo dopo essere stata svezzata. La dieta di controllo deve contenere quantità adeguate di vitamine e sostanze nutritive per la sopravvivenza. - Al termine dello studio (determinazione dei pesi settimanali per monitorare la salute generale delle femmine mantenute con diete carenti di acido folico o colina), sopprimere le madri utilizzando un sovradosaggio di CO2 (dosaggio, spostamento di volume del 10%-30% al minuto, seguendo protocolli istituzionalmente approvati) e raccogliere i tessuti (fase 3) per confermare le carenze alimentari.
3. Raccolta di tessuti per la misurazione dell'1C e dei relativi metaboliti
NOTA: Quando si sopprimono gli animali, è importante assicurarsi che gli animali non rispondano a un pizzicamento delle dita. Una volta che gli animali non rispondono, può iniziare la dissezione dei tessuti. Il tessuto che verrà sezionato deve essere determinato in anticipo13,14 e i materiali devono essere preparati. Questi materiali includono tubi per la conservazione, strumenti di dissezione appropriati e ghiaccio secco o azoto liquido.
- Raccogliere sangue e tessuti epatici seguendo i protocolli precedentemente pubblicati15,16.
- Raccogliere ~500-1000 μL di sangue utilizzando una puntura cardiaca seguendo i passaggi seguenti. Per i dettagli, fare riferimento a Parasuraman et al.17:
- Fai un taglio a forma di V attraverso la pelle e la parete addominale. Sposta gli organi addominali da parte e inserisci un ago attraverso il diaframma e nel cuore per raccogliere il campione di sangue.
- Inserire i campioni di sangue in provette rivestite di EDTA. La provetta può essere lasciata a temperatura ambiente fino a quando tutti i campioni non sono stati raccolti.
- Centrifugare i campioni di sangue in una centrifuga a 1000-2000 x g per 7 minuti a 4 °C per isolare il plasma sanguigno. Raccogliere il plasma in una provetta per microfuge da 1,5 mL e conservarlo a -80 °C fino all'analisi.
- Per rimuovere il fegato, aprire l'addome e sezionare l'intero fegato seguendo il protocollo15 precedentemente pubblicato.
- Dopo aver rimosso il fegato dalla cavità del corpo, tagliare il tessuto in pezzi più piccoli con una piccola forbice e congelarli a scatto usando ghiaccio secco o azoto liquido.
NOTA: I pezzi di tessuto congelati possono essere inseriti in una provetta per microcentrifuga criogenica da 1,5 ml e mantenuti a -80 °C fino all'analisi.
- Dopo aver rimosso il fegato dalla cavità del corpo, tagliare il tessuto in pezzi più piccoli con una piccola forbice e congelarli a scatto usando ghiaccio secco o azoto liquido.
- Raccogliere ~500-1000 μL di sangue utilizzando una puntura cardiaca seguendo i passaggi seguenti. Per i dettagli, fare riferimento a Parasuraman et al.17:
Risultati
L'obiettivo di questo studio è stato quello di indagare l'impatto delle carenze alimentari materne sull'acido folico o sulla colina sugli esiti di salute della prole. I pesi settimanali sono stati determinati per monitorare la salute generale delle femmine mantenute con diete carenti di acido folico o colina. Nel nostro lavoro precedente, non sono stati osservati cambiamenti nel peso corporeo tra i gruppi dietetici materni4. La Figura 1 mostra il peso basale e settimanale per le femmine mantenute con diete carenti di controllo, colina o acido folico durante le quattro settimane precedenti l'accoppiamento (F (1,144, 4,577) = 11,96, p = 0,196). Un'osservazione generale è che il numero di prole che segue queste diete speciali è ridotto nel numero di prole rispetto al cibo standard per topi. Questo non è stato determinato come statisticamente significativo.
Quando le femmine di topo vengono alimentate con diete carenti di 1C, acido folico o colina, ci sono cambiamenti nei metaboliti all'interno dei tessuti corporei che elaborano l'1C. Le misurazioni dell'1C e dei metaboliti correlati possono essere effettuate utilizzando una varietà di tecniche. Nel presente studio è stata utilizzata la cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC), come precedentemente descritto12. Vengono presentate sia le misurazioni epatiche (Tabella 2) che plasmatiche (Tabella 3) di 1C per l'omocisteina totale, la S-adenosilmetionina (SAM), la S-adenosilomocisteina (SAH), la metionina, la cistationina, la betaina e la colina. Esistono diversi modi per misurare questi metaboliti; LC-MS è solo un modo.
I dati presentati nella Tabella 2 e nella Tabella 3 mostrano alcune variazioni minori nei livelli di metaboliti. Le misurazioni attuali sono state prese quando le femmine si accoppiavano a dieta per 6 mesi. Potrebbe essere meglio misurare i metaboliti dopo 4 settimane o dopo uno o due cicli di gravidanze. I dati provenienti dal fegato e dal plasma sono stati analizzati utilizzando ANOVA unidirezionali e software statistici e grafici. Qualsiasi effetto significativo della dieta ANOVA con i confronti a coppie di Tukey, così come i confronti a coppie tra la dieta di controllo e le diete carenti di acido folico o colina.
Figura 1: Peso corporeo di topi femmina mantenuto con diete sufficienti e carenti con un solo carbonio. Il peso corporeo delle femmine di topo prima di iniziare diete appositamente formulate (basale) e poi il peso settimanale per 4 settimane con diete di controllo (CD), nonché diete carenti di acido folico (FADD) e colina (ChDD). I dati sono presentati come media + errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Metabolismo a un carbonio e ruoli biologici correlati (metilazione e sintesi nucleotidica). Gli enzimi sono indicati in cerchi neri. Abbreviazioni: BHMT, betaina omocisteina metiltransferasi; CHDH, colina deidrogenasi; COMT, catecol-O-metiltransferasi; DHFR, diidrofolato reduttasi; dTMP, deossitimidina monofosfato; dTTP, deossitimidina trifosfato; dUMP, deossiuridina monofosfato; dUTP, deossiuridina trifosfato; FR, recettore dei folati; MTHFR, metilenetetraidrofolato reduttasi; MTR, metionina sintasi; MTRR, metionina sintasi reduttasi; RFC, vettore ridotto di folati; SAM, S-adenosilmetionina; SAH S-adenosilomocisteina; e TS, timidilato sintasi. Questa figura è stata modificata da Jadavjiet al.18. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Elenco dei contenuti di micro e macronutrienti nelle diete carenti di controllo del metabolismo a un carbonio, acido folico. La dieta carente di acido folico contiene 0,3 mg/kg di acido folico. La dieta carente di colina contiene 300 mg/kg di colina bitrate. I valori sono elencati nella tabella con evidenziazioni rosse all'interno delle parentesi. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Concentrazioni materne di metaboliti a un carbonio nel tessuto epatico isolato. Questi dati sono adattati da Hurley et al.4. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Concentrazioni materne di un metabolita di carbonio nel plasma isolato. Questi dati sono adattati da Hurley et al.4. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Discussione
Durante l'implementazione di questo protocollo nei laboratori di ricerca, ci sono diverse note importanti che i ricercatori devono considerare prima di iniziare gli esperimenti. In primo luogo, nella produzione di diete, è necessario disporre di un tempo sufficiente per produrre la dieta prima dell'inizio dello studio sperimentale. I tempi di consegna possono variare da azienda ad azienda e anche la spedizione della dieta deve essere presa in considerazione. I topi femmina che sono in età riproduttiva (~2-2,5 mesi di età) possono essere sottoposti a dieta 4-6 settimane prima dell'accoppiamento 4,6,14. Studi precedenti hanno utilizzato solo topi C57Bl/6J 4,5,6,18, ma altri gruppi hanno utilizzato topi BALB/c in studi simili 19,20,21.
La dieta prodotta utilizzata in questo studio contiene l'1% di succinilsulfatiazolo per aiutare a ridurre la sintesi di folati da parte della flora intestinale; Questo è un altro motivo per cui è necessario utilizzare una dieta di controllo, in quanto contiene gli stessi antibiotici presenti nelle diete carenti. Una volta che la dieta è stata prodotta e spedita, la sua conservazione è fondamentale. È importante seguire le istruzioni del produttore in modo che la dieta possa durare per tutta la durata dello studio sperimentale. È importante notare che il cibo per topi standard è formulato con livelli elevati di acido folico e colina per supportare la gravidanza e la salute generale delle colonie di topi. Pertanto, è necessario utilizzare l'uso di una dieta di controllo negli studi volti principalmente a esplorare gli effetti della carenza di acido folico e/o colina. Per tali studi sperimentali, si raccomanda di ottenere diete di controllo dai produttori con la quantità minima raccomandata di acido folico (2,0 mg/kg) o di colina bitrate (1150 mg/kg)10 (Tabella 1).
Inoltre, non è stato ancora provato a combinare la carenza di acido folico e colina nelle femmine. Sia l'acido folico che la colina sono importanti donatori di metile e c'è una forte richiesta durante la gravidanza per lo sviluppo della prole. Lavori precedenti hanno dimostrato che il metabolismo dei folati e della colina è strettamente legato alla normale funzione cerebrale 16,17. Questo è stato dimostrato anche da altri in altri tessuti18,19. Non è noto se una dieta carente di acido folico e colina possa produrre una prole vitale.
Quando si considera il disegno sperimentale, è importante notare che è stato riportato che le carenze alimentari di 1C nei maschi hanno un impatto negativo sugli esiti di salute della prole11. Questo è un punto importante da considerare quando si mettono i maschi in gabbie con femmine alimentate con una dieta carente di acido folico o colina. A questo punto, l'impatto della carenza alimentare a breve termine nei maschi rimane sconosciuto.
Il successo dell'allevamento dei topi può introdurre sfide nel progresso sperimentale. Si consiglia di consultare il personale addetto alla cura degli animali presso l'istituto o la letteratura, compresi i fornitori che allevano con successo topi. Pesare le femmine su base settimanale ha aiutato a monitorare la progressione della gravidanza.
L'impatto a lungo termine delle carenze materne di 1C durante la gravidanza sugli esiti di salute della prole richiede ulteriori indagini 4,14. Questo protocollo ha descritto come indurre carenze alimentari materne di acido folico o colina in un modello murino, nonché come confermarle. Per determinare altri potenziali marcatori di carenze alimentari nell'acido folico o nella colina, assicurarsi di consultare la Figura 2 18. Questo modello sperimentale facilita lo studio delle carenze alimentari materne di acido folico o colina durante la gravidanza e l'allattamento sui risultati a lungo termine della salute della prole.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da 1,5 mL | Eppendorf | ||
| C57BL/6 Topi femmina | Charles River | 27 | I topi possono essere allevati anche in casa. |
| Dieta carente di colina | Envigo | TD.06119 | |
| Dieta di controllo | Envigo | TD.190790 | |
| Provette | |||
| Dieta carente di acido folico | Envigo | TD.01546 | |
| Prisma | https://www.graphpad.com/features | ||
| Alloggiamento per roditori Prodotti da | laboratorio, LLC | Uno CageRack ventilati & Gabbie | |
| Cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) | sciex, Framingham, MA | 5500 QTrap | |
| Cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC) | Shimadzu, Columbia, MD, USA | Nexera |
Riferimenti
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