Questo protocollo descrive il metodo per ridurre l'assunzione alimentare di acido folico o colina nei topi femmina prima della gravidanza con l'obiettivo di studiare l'impatto della dieta materna sui risultati di salute della prole.
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Articolo metodologico
Modifica dei livelli di acido folico o colina nella dieta materna per studiare l'impatto delle carenze sugli esiti di salute della prole
In questo articolo
Sommario
Abstract
La nutrizione materna durante la gravidanza e l'allattamento svolge un ruolo importante nel neurosviluppo della prole. Il metabolismo a un carbonio (1C), che si concentra sull'acido folico e sulla colina, così come su altre vitamine del gruppo B, svolge un ruolo chiave durante la chiusura del tubo neurale del feto in via di sviluppo. Tuttavia, l'impatto di queste carenze nutrizionali materne durante la gravidanza sugli esiti di salute della prole dopo la nascita rimane relativamente indefinito. Inoltre, le carenze alimentari materne di acido folico o colina possono influire su altri risultati di salute nella prole, rendendolo un modello prezioso. Questo protocollo ha lo scopo di delineare la procedura per indurre un deficit nel metabolismo dell'1C nei topi femmina attraverso modifiche della dieta. Le femmine vengono messe a dieta allo svezzamento, fino a 2 mesi di età, per 4-6 settimane prima dell'accoppiamento e rimangono a dieta durante la gravidanza e l'allattamento. La prole di queste femmine può essere valutata per gli esiti di salute. Le femmine possono essere utilizzate più volte per generare prole e i tessuti delle femmine possono essere raccolti per misurare le misurazioni dei metaboliti 1C. Questo protocollo fornisce una panoramica su come indurre carenze alimentari materne di acido folico o colina per studiare i risultati di salute della prole.
Introduzione
La nutrizione materna durante la gravidanza e l'allattamento svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo della prole. Il metabolismo a un carbonio (1C) è una rete metabolica chiave che integra i segnali nutrizionali con la biosintesi, l'omeostasi redox e l'epigenetica. L'acido folico e la colina sono componenti centrali dell'1C che svolgono un ruolo importante nella chiusura del tubo neurale. È ampiamente raccomandato per le donne integrare con acido folico e colina durante l'età fertile1. Mentre il ruolo critico dell'acido folico nello sviluppo fetale è chiaramente stabilito, i meccanismi sottostanti coinvolti rimangono poco chiari. Si raccomanda alle donne in età fertile di assumere acido folico prima di rimanere incinte poiché la chiusura del tubo neurale avviene entro il primo trimestre2. Le madri in gravidanza che sono carenti di acido folico o di altri componenti di 1C, come la colina, hanno una maggiore incidenza di partorire con difetti del tubo neurale a causa dell'elevata richiesta di sintesi nucleotidica e di altri processi richiesti dal primo periodo gestazionale3.
L'impatto a lungo termine delle diete materne carenti nell'assunzione di metabolismo di 1C sugli esiti di salute della prole è scarsamente compreso. La ricerca dei nostri laboratori, così come di altri, ha dimostrato che le diete materne carenti di acido folico o colina hanno effettivamente un impatto sugli esiti di salute della prole dopo l'ictus ischemico utilizzando modelli preclinici 4,5,6. L'impatto della dieta materna è stato dimostrato anche in studi clinici in cui sono stati descritti volumi cerebrali più piccoli e livelli di metilazione alterati7. La teoria delle origini dello sviluppo della salute e della malattia (DOHaD) suggerisce che le malattie croniche prospettiche sono programmate in utero 8,9 e la dieta materna svolge un ruolo importante.
Questo protocollo è progettato per delineare il metodo per modificare il consumo alimentare di 1C nei topi femmina prima della gravidanza, con lo scopo di esaminare gli effetti della nutrizione materna sugli esiti di salute della prole.
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Protocollo
Questo protocollo è stato approvato e tutti i soggetti animali sono stati utilizzati in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Midwestern University (Protocollo 2983). In questo studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J, di 2 mesi di età (peso corporeo, ~20 g). In generale, possono essere utilizzati topi femmine in età riproduttiva10. Per evitare gli effetti della cucciolata, è necessario utilizzare più femmine per ogni dieta11. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Preparazione sperimentale
- Procurati una dieta carente di acido folico o colina dai produttori commerciali di alimenti per roditori. Fare riferimento alla Tabella 1 per l'elenco dettagliato dei micro e macronutrienti, inclusa l'esatta quantità di acido folico o colina necessaria nelle diete carenti.
NOTA: È necessario ordinare anche una dieta di controllo corrispondente; i dettagli sono elencati nella Tabella 1. Queste diete erano basate su AIN93G e contenevano i nutrienti raccomandati per i roditori10. - In collaborazione con il produttore, determinare la colorazione delle diete, in quanto ciò può aiutare con la distribuzione di diete corrette durante gli studi sperimentali. Questo studio ha utilizzato il verde per le diete carenti di acido folico, il giallo per la colina e il bianco per la dieta di controllo. Sono tutti facilmente distinguibili.
NOTA: Non ci sono restrizioni sul consumo di acqua. L'acqua non contiene acido folico, colina o altri metaboliti 1C.
2. Indurre una carenza alimentare di acido folico o colina
- Prima di mettere a dieta le femmine, pesare tutti gli animali. Questo sarà indicato come peso di base.
- A seconda della configurazione della gabbia da laboratorio (ventilata o non ventilata, vedere la tabella dei materiali), sostituire o rabboccare i pellet dietetici speciali per ciascuna gabbia alcune volte alla settimana. Non riempire eccessivamente i cagnolini per cibo in gabbia con diete speciali, poiché ciò potrebbe portare al deterioramento dei pellet una volta che interagiscono con la saliva degli animali e al deterioramento nel tempo.
NOTA: Assicurarsi che le scorte dietetiche siano conservate secondo le linee guida del produttore e utilizzate prima della data di scadenza. - Mantieni i topi femmina a dieta per 4-6 settimane prima dell'accoppiamento.
- Introduci i topi maschi nelle gabbie femminili per l'accoppiamento. Assicurati che i maschi vengano introdotti nelle gabbie femminili dopo che le femmine hanno seguito diete speciali per un minimo di 4-6 settimane. Introdurre un maschio in una gabbia femminile per uno o più giorni.
NOTA: Nel presente studio, i maschi sono stati tenuti con le femmine per l'intera durata dell'esperimento (~ 4 mesi) per aumentare il numero di cuccioli prodotti poiché l'accoppiamento nei topi può avvenire dopo la nascita12. Le femmine dopo i 6 mesi di età non sono state utilizzate per nessuno studio. - Controlla quotidianamente le femmine di topo per verificare la presenza di un tappo copulatorio, che indica che si è verificata la riproduzione.
- Raccogli le misurazioni del peso dei topi femmina ogni settimana per monitorare la loro salute e lo stato di gravidanza.
NOTA: È sicuro per le femmine essere mantenute a dieta per la gravidanza (~21 giorni) e l'allattamento (~21 giorni). - Quando la prole viene svezzata dalla madre (~21 giorni dopo la nascita), sottoporla a una dieta carente di acido folico e colina, nonché a una dieta di controllo. Per i dettagli, vedere la sezione risultati.
NOTA: Quando si studia l'impatto della dieta materna sui risultati di salute della prole, si raccomanda che la prole venga sottoposta a una dieta di controllo dopo essere stata svezzata. La dieta di controllo deve contenere quantità adeguate di vitamine e sostanze nutritive per la sopravvivenza. - Al termine dello studio (determinazione dei pesi settimanali per monitorare la salute generale delle femmine mantenute con diete carenti di acido folico o colina), sopprimere le madri utilizzando un sovradosaggio di CO2 (dosaggio, spostamento di volume del 10%-30% al minuto, seguendo protocolli istituzionalmente approvati) e raccogliere i tessuti (fase 3) per confermare le carenze alimentari.
3. Raccolta di tessuti per la misurazione dell'1C e dei relativi metaboliti
NOTA: Quando si sopprimono gli animali, è importante assicurarsi che gli animali non rispondano a un pizzicamento delle dita. Una volta che gli animali non rispondono, può iniziare la dissezione dei tessuti. Il tessuto che verrà sezionato deve essere determinato in anticipo13,14 e i materiali devono essere preparati. Questi materiali includono tubi per la conservazione, strumenti di dissezione appropriati e ghiaccio secco o azoto liquido.
- Raccogliere sangue e tessuti epatici seguendo i protocolli precedentemente pubblicati15,16.
- Raccogliere ~500-1000 μL di sangue utilizzando una puntura cardiaca seguendo i passaggi seguenti. Per i dettagli, fare riferimento a Parasuraman et al.17:
- Fai un taglio a forma di V attraverso la pelle e la parete addominale. Sposta gli organi addominali da parte e inserisci un ago attraverso il diaframma e nel cuore per raccogliere il campione di sangue.
- Inserire i campioni di sangue in provette rivestite di EDTA. La provetta può essere lasciata a temperatura ambiente fino a quando tutti i campioni non sono stati raccolti.
- Centrifugare i campioni di sangue in una centrifuga a 1000-2000 x g per 7 minuti a 4 °C per isolare il plasma sanguigno. Raccogliere il plasma in una provetta per microfuge da 1,5 mL e conservarlo a -80 °C fino all'analisi.
- Per rimuovere il fegato, aprire l'addome e sezionare l'intero fegato seguendo il protocollo15 precedentemente pubblicato.
- Dopo aver rimosso il fegato dalla cavità del corpo, tagliare il tessuto in pezzi più piccoli con una piccola forbice e congelarli a scatto usando ghiaccio secco o azoto liquido.
NOTA: I pezzi di tessuto congelati possono essere inseriti in una provetta per microcentrifuga criogenica da 1,5 ml e mantenuti a -80 °C fino all'analisi.
- Dopo aver rimosso il fegato dalla cavità del corpo, tagliare il tessuto in pezzi più piccoli con una piccola forbice e congelarli a scatto usando ghiaccio secco o azoto liquido.
- Raccogliere ~500-1000 μL di sangue utilizzando una puntura cardiaca seguendo i passaggi seguenti. Per i dettagli, fare riferimento a Parasuraman et al.17:
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Risultati
L'obiettivo di questo studio è stato quello di indagare l'impatto delle carenze alimentari materne sull'acido folico o sulla colina sugli esiti di salute della prole. I pesi settimanali sono stati determinati per monitorare la salute generale delle femmine mantenute con diete carenti di acido folico o colina. Nel nostro lavoro precedente, non sono stati osservati cambiamenti nel peso corporeo tra i gruppi dietetici materni4. La Figura 1 mostra il peso basale e settima...
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Discussione
Durante l'implementazione di questo protocollo nei laboratori di ricerca, ci sono diverse note importanti che i ricercatori devono considerare prima di iniziare gli esperimenti. In primo luogo, nella produzione di diete, è necessario disporre di un tempo sufficiente per produrre la dieta prima dell'inizio dello studio sperimentale. I tempi di consegna possono variare da azienda ad azienda e anche la spedizione della dieta deve essere presa in considerazione. I topi femmina che sono in età riproduttiva (~2-2,5 mesi di età...
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da 1,5 mL | Eppendorf | ||
| C57BL/6 Topi femmina | Charles River | 27 | I topi possono essere allevati anche in casa. |
| Dieta carente di colina | Envigo | TD.06119 | |
| Dieta di controllo | Envigo | TD.190790 | |
| Provette | |||
| Dieta carente di acido folico | Envigo | TD.01546 | |
| Prisma | https://www.graphpad.com/features | ||
| Alloggiamento per roditori Prodotti da | laboratorio, LLC | Uno CageRack ventilati & Gabbie | |
| Cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) | sciex, Framingham, MA | 5500 QTrap | |
| Cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC) | Shimadzu, Columbia, MD, USA | Nexera |
Riferimenti
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