Articolo metodologico

LPS e morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA e sua validazione

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DOI:

10.3791/66831

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3 maggio 2024

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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo si basa sulla LPS e sulla morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. Utilizziamo la citometria a flusso per analizzare l'annessina V e la doppia colorazione 7-AAD per rilevare la morte cellulare, utilizzando l'intera cellula e impiegando la microscopia elettronica a scansione per osservare la morfologia della membrana cellulare.

Abstract

La morte cellulare è un processo fondamentale in tutti gli organismi viventi. Il protocollo stabilisce una deposizione lipidica differenziata da lipopolisaccaride (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) indotta da forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) in un modello di macrofagi monociti umani (THP-1) per osservare la morte cellulare. L'LPS combinato con l'ATP è un classico metodo di induzione infiammatoria, spesso utilizzato per studiare la piroptosi, ma anche l'apoptosi e la necroptosi rispondono alla stimolazione da parte di LPS/ATP. In circostanze normali, la fosfatidilserina è localizzata solo nel lembo interno della membrana plasmatica. Tuttavia, nelle prime fasi della piroptosi, dell'apoptosi e della necroptosi, la membrana cellulare rimane intatta ed esposta alla fosfatidilserina e, nelle fasi successive, la membrana cellulare perde la sua integrità. Qui, la citometria a flusso è stata utilizzata per analizzare la doppia colorazione dell'annessina V e della 7-amminoattinomicina D (AAD) per rilevare la morte cellulare da intere cellule. I risultati mostrano che le cellule sostanziali sono morte dopo la stimolazione con LPS/ATP. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, osserviamo le possibili forme di morte cellulare nelle singole cellule. I risultati indicano che le cellule possono andare incontro a piroptosi, apoptosi o necroptosi dopo la stimolazione con LPS/ATP. Questo protocollo si concentra sull'osservazione della morte dei macrofagi dopo la stimolazione con LPS/ATP. I risultati hanno mostrato che la morte cellulare dopo la stimolazione di LPS e ATP non si limita alla piroptosi e che possono verificarsi anche apoptosi e apoptosi necrotica, aiutando i ricercatori a comprendere meglio la morte cellulare dopo la stimolazione di LPS e ATP e a scegliere un metodo sperimentale migliore.

Introduzione

La morte cellulare è un processo fisiologico fondamentale in tutti gli organismi viventi. Negli ultimi anni, studi sostanziali hanno dimostrato che la morte cellulare è coinvolta nell'immunità e nell'equilibrio all'interno dell'organismo. Studiare la morte cellulare ci aiuta a comprendere meglio l'insorgenza e lo sviluppo delle malattie. Sono state descritte diverse forme di morte cellulare programmata e sono stati identificati alcuni bersagli chiave in questi processi. La piroptosi, l'apoptosi e la necroptosi sono le tre vie di morte cellulare programmata geneticamente definite coinvolte nell'equilibrio interno e nella malattia1.

La piroptosi è caratterizzata dalla formazione di pori di membrana e dal rilascio di contenuto cellulare. Le caspasi attivate o granzimi scindono le gasdermine per separare i loro domini N-terminali, che poi oligomerizzano, si legano alla membrana e formano pori 2,3,4. Il poro di gasdermin fornisce un canale di secrezione atipico attraverso le membrane cellulari, con conseguente risposta cellulare a valle, tra cui il rilascio di contenuto e l'afflusso di ioni 2,3,4. Alla fine, le cellule alla fine subiscono la rottura della membrana plasmatica e la lisi piptotica facilitata dalla ninferina-15. Nell'apoptosi, Bax e Bak attivati formano oligomeri sulla membrana esterna mitocondriale e rilasciano citocromo C, che è regolato da un equilibrio tra proteine proapoptotiche e antiapoptotiche della famiglia BCL-2, caspasi iniziatrici (caspasi-8, -9 e -10) e caspasi effettrici (caspasi-3, -6 e -7)1,6,7. I cambiamenti morfologici dell'apoptosi includono il blebbing della membrana, il restringimento cellulare, la frammentazione nucleare, la condensazione della cromatina e la formazione di corpi apoptotici 6,8. La serina/treonina-proteina chinasi 1 (RIPK3) che interagisce con il recettore e il dominio chinasi a linea mista (MLKL) sono due componenti fondamentali a valle del meccanismo necroptotico1. RIPK3 recluta e fosforila MLKL, p-MLKL oligomerizza, si associa con la membrana cellulare, avvia perforazioni di membrana, provoca afflusso di ioni, aumenta l'osmolarità intracellulare e infine la rottura cellulare 6,9. Gasdermins e MLKL si legano alla membrana plasmatica e mediano rispettivamente la piroptosi e la necroptosi, mentre BAX/BAK media l'apoptosi legandosi alla membrana esterna dei mitocondri6.

Sebbene ogni percorso abbia meccanismi ed esiti specifici, portano a cambiamenti simili sulla membrana cellulare. In circostanze normali, la fosfatidilserina (PS) è localizzata solo nel lembo interno della membrana plasmatica. Tuttavia, nelle prime fasi della piroptosi, dell'apoptosi e della necroptosi, il PS sarà esposto, al di fuori della membrana plasmatica. La caspasi-3/caspasi-7 attiva le famiglie TMEM16 e XKR, che porta a una membrana cellulare asimmetrica ed esternalizza il PS durante l'apoptosi10. L'afflusso di Ca2+ mediato da Gasdermin D e MLKL porta alla perdita della simmetria del doppio strato fosfolipidico sulla membrana cellulare e all'esposizione di PS. L'esposizione avviene prima della perdita dell'integrità della membrana cellulare11,12. Sulla base dei cambiamenti simili nella membrana di questi tre tipi di morte cellulare programmata, utilizziamo la citometria a flusso per analizzare la doppia colorazione dell'annessina V/7-amminoactinomicina D (7-AAD) per rilevare la morte cellulare. L'annessina V, una proteina legante i fosfolipidi calcio-dipendente, ha un'elevata affinità per la PS, che può fungere da sonda sensibile per rilevare la PS esposta sulla superficie della membrana plasmatica13. Il 7-AAD è una colorazione di acido nucleico che non può passare attraverso l'intera membrana cellulare. È simile allo ioduro di propidio (PI), un colorante di acidi nucleici comunemente usato. Hanno caratteristiche di fluorescenza simili, ma 7-AAD ha uno spettro di emissione più ristretto e meno interferenze con altri canali di rivelazione. A causa di queste somiglianze, non è sufficiente distinguere tra piroptosi, apoptosi e necroptosi. Abbiamo usato la citometria a flusso per rilevare la morte cellulare da cellule intere. Un secondo metodo viene utilizzato per catturare la membrana cellulare utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) per osservare le possibili forme di morte cellulare nelle singole cellule.

Abbiamo stabilito un modello di deposizione lipidica differenziata da lipopolisaccaride (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) indotta da forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) in un modello di macrofagi monociti umani (THP-1) per osservare la morte cellulare. Questo protocollo si concentra sull'osservazione della morte cellulare piuttosto che sullo studio dei meccanismi.

Protocollo

1. Linea cellulare e coltura cellulare

  1. Coltivare la linea cellulare monocitica umana THP-1 in un terreno di coltura completo RPMI-1640 con il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina-streptomicina e 0,05 mM di β-mercaptoetanolo. Coltivare le cellule a 37 °C in aria umidificata al 5% di CO2 . Sottocoltura delle cellule ogni 2-3 giorni.
    NOTA: THP-1 è una cella di sospensione, selezionare per cambiare metà del mezzo per la sub-coltura. Quando si osservano molti frammenti cellulari al microscopio ottico, centrifugare a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule nel terreno di coltura cellulare completo fresco preriscaldato.
  2. Utilizzare le cellule (nei passaggi 4-10) nella fase di crescita logaritmica per tutti gli esperimenti. Quando le cellule sono in buone condizioni e in fase di crescita logaritmica, sono rotonde, luminose, dense e senza grumi e frammenti cellulari al microscopio ottico a 100 x.

2. Differenziamento delle cellule THP-1

  1. Preparare una soluzione madre di PMA con una concentrazione di 1 mM (sciogliere 1 mg di PMA in 1,62 mL di dimetilsolfossido). Diluire la soluzione madre di PMA con un terreno di coltura cellulare completo fino a una concentrazione finale di 100 nM.
  2. Raccogliere le cellule nella piastra di coltura in una provetta da centrifuga sterile da 10 mL. Centrifugare a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente, risospendere le cellule con 3 mL di terreno di coltura completo contenente PMA.
  3. Aprire il contatore di celle e il software di conteggio. Pipettare 20 μL di sospensione cellulare nella scheda contacellule e inserirla nella scheda contacellule. Fare clic su Anteprima B1, ruotare la manopola in basso a destra dello strumento e regolare la distanza focale per rendere le celle con un centro luminoso con contorni chiari sul software. Fare clic su Conteggio per avviare il conteggio.
  4. Sulla base dei risultati del conteggio, utilizzare un terreno di coltura completo contenente PMA per regolare la densità cellulare a 1 x 106 cellule/mL. Seminare le cellule in una piastra a 6 pozzetti, incubare la piastra per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2 prima di iniziare un ulteriore trattamento.

3. Trattamento delle cellule THP-1

  1. Preparare una soluzione madre di LPS con una concentrazione di 1 mg/mL (sciogliere 1 mg di LPS in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)). Diluire la soluzione madre di LPS con terreno privo di siero fino a una concentrazione di lavoro finale di 1 μg/mL. Preparare una soluzione madre di Na2ATP con una concentrazione di 500 mM (sciogliere 0,3026 g di ATP in 1 mL di PBS).
  2. Aspirare il terreno contenente PMA dai pozzetti e lavare con PBS 1x. Aggiungere il terreno senza siero al gruppo di controllo e il terreno senza siero contenente LPS al gruppo di modelli. Incubare la piastra per 6 ore a 37 °C + 5% CO2 prima di procedere con ulteriori trattamenti.
  3. Dopo 6 ore, aggiungere la soluzione madre di ATP al gruppo modello fino a una concentrazione di lavoro finale di 500 nM. Incubare la piastra per 45 minuti a 37 °C + 5% CO2 prima di procedere.

4. Analisi di citometria a flusso (Metodo 1)

  1. Preparazione di campioni sperimentali
    1. Seminare e incubare le cellule in piastre a 6 pozzetti secondo la fase 2. Stabilire quattro gruppi di controllo senza trattamento: un controllo senza macchie, due controlli a colorazione singola (uno per ogni colorazione) e un controllo a doppia colorazione. Stabilire un gruppo di trattamento e trattare secondo il passaggio 3.
    2. Dopo il trattamento, aspirare tutto il surnatante dai pozzetti e lavare con PBS 2x. Aggiungere 500 μl di tripsina allo 0,05% (non EDTA) a ciascun pozzetto e incubare nell'incubatore per 30 s.
    3. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura completo RPMI-1640 a ciascun pozzetto per evitare il distacco delle cellule e raccogliere le cellule nella provetta da 5 mL. Centrifugare a 300 x g per 3 min a temperatura ambiente.
    4. Aggiungere 1 mL di PBS per risospendere le cellule. Mettere le provette con le cellule a bagnomaria a 37 °C per 3 minuti. Centrifugare tutti i campioni a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
    5. Diluire 200 μl di tampone legante 5x con 800 μl di acqua distillata in 1x tampone legante. Aggiungere 100 μl di tampone legante 1x per risospendere le cellule e trasferire le cellule nella provetta da 5 mL.
    6. Aggiungere 5 μL di soluzione di Annessina V-PE a una provetta di cellule del gruppo di controllo per 10 minuti e 5 μL di soluzione 7-AAD a un'altra provetta di cellule del gruppo di controllo per 5 minuti (come controlli a colorazione singola separatamente). Agitare delicatamente ogni provetta per mescolare, colorare e incubare i campioni a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Aggiungere 400 μl di PBS a ciascuna provetta e agitare delicatamente per terminare l'incubazione.
    7. Aggiungere 5 μL di soluzione di Annessina V-PE alle provette rimanenti e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Agitare delicatamente ogni provetta per mescolare, colorare e incubare i campioni a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Dopo 5 minuti, aggiungere 5 μL di soluzione di 7-AAD per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 400 μl di PBS a ciascuna provetta e agitare delicatamente per terminare l'incubazione.
    8. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando una rete di nylon da 35 μm che fa parte dei tubi a fondo tondo in polistirene da 5 mL. Posizionare il tubo sul ghiaccio e attendere il test. Mescolare delicatamente prima di eseguire il test e quindi inserirlo nello strumento.
  2. Citometria a flusso
    1. Utilizzare un citometro a flusso di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza per il test. Aprire il software di analisi dei dati del citometro a flusso e confermare le prestazioni del rivelatore e del laser. Fare clic sul citometro e scegliere Avvio fluidics, attendere che il sistema sia pronto. Escludere le bolle della camera di flusso facendo clic su Citometro > Modalità di pulizia > Cella di flusso Degassosa.
    2. Fare clic su Esperimento, selezionare in sequenza Nuova cartella, Esperimento, Campione, Tubo e Modifica nome. Una freccia di forma pentagonale davanti al tubo, diventa verde quando si accende.
    3. Fare clic sull'icona del citometro FACSCelesta (un'icona con un tasto di scelta rapida), selezionare Parametro, quindi selezionare FSC, SSC e segnale PE . Fare clic sull'icona del foglio di lavoro globale (un'icona del tasto di scelta rapida) per stabilire l'istogramma PE. Per il citometro a flusso utilizzato in questo studio, utilizzare PE per l'annessina V a 586 nm e tracciare sull'asse X; PerCP-Cy5.5 per 7-AAD a 700 nm e grafico sull'asse Y.
    4. Inserire prima il campione di controllo non colorato nello strumento. Fare clic sull'icona di Acquisition Dashboard (un'icona di scelta rapida), acquisire un minimo di 10.000 eventi dalla popolazione desiderata. Escludere i detriti utilizzando un punto di iniezione (P1) su un diagramma a punti FSC-A e SSC-A. Regola la portata alla velocità media e registra i dati. Regolare la tensione per posizionare la popolazione cellulare sulla diagonale dell'istogramma FSC/SSC e fare clic su Riavvia. Regola la portata alla velocità media e registra i dati.
    5. Fare clic su Tubo successivo, eseguire i controlli di colorazione singola dell'annessina V e del 7-AAD per regolare la compensazione. Esegui le provette rimanenti e raccogli i dati.

5. Imaging SEM (Metodo 2)

  1. Preparazione di campioni sperimentali
    1. Seminare e incubare le cellule in piastre a 6 pozzetti secondo la fase 2 e trattare secondo la fase 3.
    2. Dopo il trattamento, aspirare tutto il surnatante dai pozzetti e lavare 2 volte con PBS. Aggiungere 500 μl di tripsina allo 0,05% (non EDTA) a ciascun pozzetto e incubare nell'incubatore per 30 s.
    3. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura completo RPMI-1640 a ciascun pozzetto per evitare il distacco delle cellule e raccogliere le cellule nella provetta da 5 mL. Centrifugare a 300 x g per 3 min a temperatura ambiente.
    4. Fissare le cellule con 500 μL di fissativo per microscopio elettronico (dialdeide glutarica al 2,5%, sali di fosforo 100 mM) per 2 ore a temperatura ambiente, seguite da una notte a 4 °C.
    5. Preparare la soluzione di allume di cromo: aggiungere 1,0 g di gelatina a 100 ml di acqua ultrapura, riscaldamento a bagnomaria a 70 °C e mescolare uniformemente. Aggiungere 0,05 g di allume di cromo, mescolare uniformemente e filtrare con carta da filtro. Immergere il vetro di copertura pulito in una soluzione di allume di cromo per 2 ore a 37 °C e asciugarlo in forno a 37 °C per un uso successivo.
      NOTA: Lo scopo è quello di prevenire il distacco delle cellule durante l'esperimento.
    6. Raccogliere le cellule dalla soluzione fissa. Centrifugare a 300 x g per 3 min a temperatura ambiente. Aggiungere 100 μl di PBS e soffiare via delicatamente le cellule. Lasciare cadere la sospensione della cella sul vetro di copertura, lasciare riposare per 5 minuti. Aspirare tutto il surnatante e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta.
      NOTA: L'operazione deve essere eseguita delicatamente per evitare il distacco delle celle. Non agitare energicamente, muoverti lentamente e aggiungere lentamente il liquido lungo il muro.
    7. Aggiungere 500 μl di fissazione dell'acido osmico all'1% per 1 ora. Aspirare tutto il surnatante e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta.
    8. Disidratare i campioni in successione in una serie di concentrazioni di etanolo (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) per 15 minuti per soluzione di EtOH.
      NOTA: I bicchieri copri possono essere conservati in 100% EtOH per diversi giorni a 4 °C ma devono asciugarsi il prima possibile per evitare un'eccessiva disidratazione.
    9. Accendere l'essiccatore a punto critico, aprire il serbatoio di CO2 e raffreddare la camera a 10 °C. Avvolgere rapidamente il campione con carta da filtro quando la pressione della camera è 0 psi e inserirlo nella camera.
    10. Aprire la valvola di ingresso, osservare attraverso la finestra di osservazione CO2 , aumentare il livello di CO2 del liquido tra le due linee rosse (non superare il limite superiore), chiudere la valvola di ingresso. Immergere il campione per 10 minuti. Aprire contemporaneamente le valvole di aspirazione e di scarico per equalizzare la CO2 per 1 min (la CO2 liquida sostituisce l'EtOH). Chiudere la valvola di scarico per aumentare il livello di CO2 del liquido nella posizione specificata, chiudere la valvola di aspirazione.
    11. Impostare la temperatura a 35 °C e la pressione a 1250 psi. Una volta che la temperatura e la pressione si sono stabilizzate, depressurizzare a 100 psi/min. Estrarre il campione quando la pressione della camera è zero e spegnere lo strumento.
    12. Montare i campioni su portacampioni in alluminio SEM utilizzando nastro conduttivo. Utilizzare un rivestimento sputter per coprire i campioni con uno strato (2-5 nm) di oro.
  2. Imaging
    1. Utilizzare il SEM ad emissione di campo freddo ad alta risoluzione per l'imaging. Impostare la tensione di accelerazione del SEM a 3 kV. Impostare la distanza di lavoro su 10 mm. Impostare l'ingrandimento su 1.000x per osservare il panorama. Impostare l'ingrandimento su 5.000x e 20.000x per individuare la membrana plasmatica e visualizzare il campione.
      NOTA: Il processo di visualizzazione dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA tramite SEM è simile ad altri tipi di cellule e tessuti e dipende dagli strumenti utilizzati. La referenza14 fornisce un protocollo SEM dettagliato con video di accompagnamento.

Risultati

I campioni di cellule sono stati trattati come descritto nel protocollo ed è stato effettuato il rilevamento con citometria a flusso. Le cellule normali non possono essere colorate con l'annessina V e il 7-AAD (annessina V-/7-AAD-). Nelle prime fasi della piroptosi, dell'apoptosi e della necroptosi, il PS era esposto e legato all'annessina V, ma la membrana cellulare era ancora intatta ed escludeva il 7-AAD dallo spazio extracellulare (annessina V+/7-AAD-). Nelle fasi successive, la membrana cellulare perde la sua integrità, le cellule vengono colorate contemporaneamente con Annessina V e 7-AAD, mostrando risultati doppi positivi (Annessina V+/7-AAD+). Le cellule necrotiche sono state colorate solo con 7-AAD (annessina V-/7-AAD+). La Figura 1 mostra che dopo la stimolazione con LPS/ATP, le cellule nella regione Q2 sono aumentate in modo significativo, indicando la morte cellulare.

Utilizziamo il SEM per catturare la superficie della membrana plasmatica, osservando direttamente le caratteristiche della membrana da una singola cellula. La Figura 2A mostra le cellule di controllo, la Figura 2B-D mostra le cellule dopo la stimolazione di LPS/ATP. Abbiamo osservato cellule con caratteristiche di piroptosi, tra cui blebbing e rottura della membrana (Figura 2B), cellule con caratteristiche apoptotiche, tra cui blebbing della membrana e restringimento cellulare (Figura 2C) e cellule con caratteristiche di necroptosi, tra cui rigonfiamento cellulare e rottura della membrana (Figura 2D).

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Figura 1: Rilevamento della doppia colorazione dell'annessina V/7-AAD mediante citometria a flusso. (A) Colorazione Annestina V negativa e 7-AAD negativa (Q4), Annessina V positiva e 7-AAD negativa doppia colorazione (Q3), Colorazione Annessina V positiva e 7-AAD positiva (Q2) e Colorazione Annessina V negativa e 7-AAD positiva (Q1). (B) Dati quantitativi per (A). I dati sono presentati come media ± SD (n=3), test t non appaiato, **p < 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Immagini al microscopio elettronico a scansione di macrofagi THP-1 differenziati con PMA. (A) Gruppo di controllo, ingrandimento 5.000x/20.000x. (B, C, D) Il gruppo LPS/ATP mostra blebbing della membrana, rottura della membrana (↑), rigonfiamento cellulare (↑) e restringimento cellulare (↑) con ingrandimento di 5.000x/20.000x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

In questo manoscritto, sono stati utilizzati due metodi per rilevare LPS e la morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. È stata utilizzata la doppia colorazione con annessina V/7-AAD e i risultati sono stati analizzati mediante citometria a flusso dalla colorazione complessiva. Come per altre analisi citofluorimetriche, un gruppo di cellule non colorate e due gruppi di cellule colorate singolarmente sono stati impostati per escludere risultati falsi positivi e falsi negativi. I risultati mostrano che dopo la stimolazione di LPS/ATP, diverse cellule hanno perso l'integrità della membrana, indicando che potrebbe essersi verificata la morte cellulare. Questo metodo di rilevamento ci permette di valutare la morte cellulare da cellule intere. Vale la pena notare che la doppia colorazione con annessina V/7-AAD non è sufficiente per distinguere tra piroptosi, apoptosi e necroptosi. Nelle prime fasi di queste tre forme, la PS sarà esposta al di fuori della membrana plasmatica e la colorazione con annessina V è positiva. L'integrità della membrana viene persa durante la fase avanzata di queste tre forme e i risultati della colorazione mostrano una colorazione a doppia positività. Pertanto, abbiamo utilizzato il SEM per osservare ulteriormente le possibili forme di morte cellulare che potrebbero verificarsi.

Nell'apoptosi, si verifica la formazione di pori BAX/BAK sulla membrana esterna mitocondriale, il successivo restringimento cellulare e il blebbing della membrana cellulare. La necroptosi impiega MLKL per aprire i pori nella membrana cellulare, mentre il segnale della piroptosi attiva la gasdermin per formare pori nella membrana cellulare. Vale la pena notare che sia la piroptosi che la necroptosi sono accompagnate dalla rottura della membrana cellulare nella fase finale. Tuttavia, i pori della gasedermina sono molto più grandi dei pori MLKL, quindi i pori della gasdermina non hanno selettività ionica. Le cellule necroptotiche mostrano un significativo rigonfiamento della morfologia15. Alla fine terminano con la rottura della membrana. Indipendentemente dalla via di segnalazione a monte dell'attivazione della permeabilità della membrana cellulare, i cambiamenti nella membrana cellulare accompagnano queste tre forme di morte cellulare. Abbiamo usato il SEM per osservare ulteriormente la membrana cellulare, che fornisce un modo intuitivo per esaminare la morte cellulare. Abbiamo osservato le caratteristiche della piroptosi, tra cui il blebbing della membrana e la membrana di rottura, e la necroptosi, tra cui il rigonfiamento cellulare e la membrana di rottura, coerenti con le caratteristiche studiate da precedenti ricercatori15. Abbiamo osservato il blebbing della membrana e il restringimento cellulare, coerenti con le caratteristiche dell'apoptosi studiate da precedenti ricercatori16.

In studi precedenti, la combinazione di LPS e ATP è stata spesso utilizzata per indurre la piroptosi. È interessante notare che abbiamo osservato caratteristiche di apoptosi e necroptosi. Sebbene tutte e tre le forme possano verificarsi nella morte cellulare indotta da LPS/ATP, studi precedenti hanno dimostrato che la piroptosi rimane la modalità di morte dominante. L'LPS è uno dei pattern molecolari associati ai patogeni più caratterizzati. L'ATP rilasciato dalle cellule morenti, ha un'alta concentrazione all'interno della cellula. L'ATP extracellulare è uno dei pattern molecolari associati al pericolo17. LPS/ATP è un classico metodo di stimolazione in due fasi per indurre la piroptosi. La ricerca ha dimostrato che l'aggiunta di ATP alle cellule stimolate da LPS può attivare rapidamente la caspasi-118, mentre il silenziamento del gene della caspasi-1 può invertire significativamente la morte cellulare indotta da LPS/ATP19. In studi precedenti, abbiamo anche trovato l'attivazione indotta da LPS/ATP di proteine bersaglio apoptotiche e necroptotiche20,21. Sebbene LPS/ATP sia un classico induttore della piroptosi, può anche indurre apoptosi e necroptosi.

In effetti, queste tre forme spesso non esistono in modo indipendente e la diafonia tra gli stadi del segnale. Ad esempio, le proteine gasdermin prendono di mira i mitocondri per promuovere il rilascio di citocromo c e migliorare la via apoptotica mitocondriale22. L'attivazione della caspasi-3 può scindere la gasdermina E e quindi innescare la piroptosi23. Uno studio suggerisce che la segnalazione MLKL/PIPK3 è coinvolta nell'attivazione degli inflammasomi NLRP324. Questo complesso cross-talk ha portato al concetto di PANoptosi, definita come una via infiammatoria programmata di morte cellulare regolata dal complesso PANoptosoma con caratteristiche chiave di piroptosi, apoptosi e/o necroptosi che non possono essere spiegate da nessuna di queste vie di morte cellulare programmata da sola25. Quando è stato proposto il concetto di PANoptosi, gli scienziati hanno descritto il verificarsi della morte cellulare programmata in modo più completo, questo evidenzia anche la complessità della morte cellulare programmata. Nel frattempo, questo indica anche i limiti di questo metodo di ricerca. Sebbene la piroptosi sia considerata dominante nella morte cellulare indotta da LPS/ATP, non è possibile determinare la proporzione di queste forme di morte o se esistano tutte, anche coinvolgendo altre forme di morte programmata. Questa può essere un'area da indagare in futuro.

Questo protocollo si basa sulla LPS e sulla morte indotta da ATP dei macrofagi. Abbiamo descritto un metodo di test dall'insieme all'individuo, che è applicabile anche ad altri modelli e cellule. I risultati indicano che le cellule potrebbero aver subito piroptosi, apoptosi o necroptosi, che non si limita alla piroptosi, aiutando i ricercatori a comprendere meglio la morte cellulare dopo la stimolazione di LPS e ATP e a scegliere un metodo sperimentale migliore. In studi precedenti, l'annessina V/7-AAD o l'annessina V/PI a doppia colorazione erano comunemente usate per indicare l'insorgenza dell'apoptosi26,27, alcuni ricercatori l'hanno utilizzata anche per studiare l'apoptosi28. In effetti, non possiamo distinguere tra i tre tipi di morte cellulare attraverso queste doppie colorazioni. Questo protocollo ricorda ai ricercatori, in particolare ai principianti, che la doppia colorazione con annessina V/7-AAD o annessina V/PI non può valutare il tipo di morte cellulare. Può solo mostrare il danno cellulare e la morte nel suo insieme o indicare che la cellula potrebbe aver subito una qualche forma di morte. In ricerche più mirate, è necessario introdurre un gruppo di controllo che inibisce altre morti per dimostrare che la morte programmata in modo definitivo è a portata di mano. Allo stesso modo, ulteriori ricerche meccanicistiche indagheranno sugli obiettivi critici di diverse morti programmate.

Inoltre, durante la preparazione dell'esperimento, abbiamo scoperto che attualmente esistono molte procedure sperimentali dettagliate per il SEM di cellule aderenti, con poca descrizione delle cellule sospese. Qui forniamo una descrizione più dettagliata del metodo di preparazione del campione per le cellule sospese. Il passaggio 5.5 è un passaggio necessario per facilitare l'immobilizzazione delle cellule sospese sui vetrini delle cellule. Le operazioni successive devono essere eseguite delicatamente per evitare il distacco delle cellule. Oltre alla soluzione di allume di cromo, anche la poli-L-lisina può immobilizzare le cellule.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Esprimiamo il nostro grande apprezzamento a Jiayi Sun e Lu Yang dell'Istituto Innovativo di Medicina Cinese e Farmacia, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu, per l'assistenza con la citometria a flusso, Cuiping Chen del Laboratorio chiave statale delle risorse di medicina cinese sudoccidentale, per l'aiuto con la microscopia elettronica a scansione. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [82104491], dalla Natural Science Foundation of Sichuan [2023NSFSC0674] e dalla Post-doctoral Science Foundation of China [2021M693789].

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di enzima pancreatico allo 0,25% (escluso EDTA)BOSTER Biological Technology co.ltdPYG0068
provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mLCORNING352235
provetta da centrifuga da 5 mLLabgic Technology Co., Ltd.BS-50-M
Piastra a 6 pozzetti Sorfa Life Science Research Co., Ltd220100
Kit di analisi dell'apoptosi dell'annessina V-PE/7-AADAbsin (Shanghai) Tecnologia biologica co.ltdabs50007Annexin V-PE, 7-AAD, 5× Tampone legante, apoptosi Soluzione di controllo positivo
per celcoltura CO2 incubatoreEsco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.N / A
piatto per colture cellulari, 100 mmSorfa Life Science Research Co., Ltd230301
Cellometro K2 Contatore cellulare fluorescenteNexcelom Bioscience LLCCellometro K2
Cellometro SD100 Camere di conteggioNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
CentrifugaHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., LtdL530
allume di cromo Guangdong Wengjiang Reagente chimico Co., Ltd.
occhiali da vista, 9 mmLabgic Technology Co., Ltd.BS-09-RC
essiccatore a punto criticoQuorum TechnologiesK850
dimetilsolfossido BOSTERBiological Technology co.ltdPYG0040
microscopio elettronico fissativoServicebio Technology co.ltd G11022,5% dialdeide glutarica, 100 mM sali di fosforo bilancia
elettronicaSHIMADZUATX124
etanolo assolutoChengdu Kelong Chemical Co., Ltdcitometro a flusso 2021033102
Becton, Dickinson and CompanyFACSCanto figure-materials-1
analisi per citometria a flussoBecton,Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM Software
gelatinaGuangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA00256 
Microscopio elettronico a scansione ad emissione di campo freddo ad alta risoluzioneTITACHIRegulus 8100
linea cellulare monocitica umana THP-1Procell Life Science& Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.CL0233
microscopio invertito Leica Microsystems Co., LtdDMi1
IR Vortex MixerVELP Scientifica SrlZX4
lipopolisaccaride Pechino Solarbio Scienza & Tecnologia Co., Ltd.L8880LPS è derivato da Escherichia coli 055:B5
Na2ATPPechino Solarbio Science & Tecnologia Co., Ltd.A8270
forbolo-12-miristato-13-acetato Pechino Solarbio Scienza & Tecnologia Co., Ltd.P6741
soluzione salina tamponata con fosfatoServicebio Technology co.ltd G4202
PipettaEppendorf AGN/A Puntali
pipette, 10 μ LServicebio Technology co., ltd T-10PL
, 1 mLServicebio Technology co.ltd T-1250L
, 200 & LServicebio Technology co., ltd T-200L
RPMI-1640 terreno di coltura completoProcell Life Science& Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.CM0233RPMI-1640 + 10% FBS + 0,05mM β-mercaptoetanolo + 1% P/S
RPMI-1640 terreni di coltura Shanghai  BasalMedia  Fornitore verificato - Technologies Co., LTD.
fluido guainaBECKMAN COULTER8546733
sputter coaterCressington Scientific Instruments Ltd108
bagnomaria termostaticoGUOHUA Electric Appliance CO., Ltd HH-1
PA04354software di per Puntali per pipette Puntali per pipette K211104

Riferimenti

  1. Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
  2. Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
  3. Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803(2023).
  4. Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
  5. Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
  6. Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378(2022).
  7. Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
  8. Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772(2020).
  9. Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
  10. Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
  11. Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
  12. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
  13. Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
  14. JoVE, JoVE. Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2024).
  15. Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
  16. Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
  17. Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
  18. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  19. Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48(2018).
  20. Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830(2022).
  21. Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233(2018).
  22. Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689(2019).
  23. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  24. Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515(2015).
  25. Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  27. Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
  28. Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244(2023).

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