Articolo metodologico

Misurazione della respirazione mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche umane e di topo mediante repirometria ad alta risoluzione

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DOI:

10.3791/66834

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4 ottobre 2024

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1John T. Milliken Department of Medicine, Division of Nutritional Sciences and Obesity Medicine, Washington University School of Medicine, 2Nutrition and Obesity Research Center, Cellular and Molecular Biology Core, Washington University School of Medicine, 3Nutrition and Obesity Research Center, Animal Model Research Core, Washington University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un metodo completo per misurare la fosforilazione ossidativa mitocondriale in fibre muscolari scheletriche fresche permeabilizzate da muscolo umano o di topo. Questo metodo consente la quantificazione in tempo reale della respirazione mitocondriale e la valutazione della preferenza per il carburante e della flessibilità metabolica, preservando le reti mitocondriali esistenti e l'integrità della membrana.

Abstract

La funzione mitocondriale, una pietra miliare della produzione di energia cellulare, è fondamentale per il mantenimento dell'omeostasi metabolica. La sua disfunzione nel muscolo scheletrico è legata a disturbi metabolici prevalenti (ad esempio, diabete e obesità), distrofie muscolari e sarcopenia. Sebbene esistano molte tecniche per valutare il contenuto e la morfologia mitocondriale, il metodo distintivo per valutare la funzione mitocondriale è la misurazione della fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) mediante respirometria. La quantificazione dell'OXPHOS mitocondriale fornisce informazioni sull'efficienza della produzione di energia ossidativa mitocondriale e della bioenergetica cellulare. Un respirometro ad alta risoluzione fornisce misurazioni altamente sensibili e robuste dell'OXPHOS mitocondriale nelle fibre muscolari permeabilizzate misurando le variazioni in tempo reale del tasso di consumo di ossigeno mitocondriale. L'uso di fibre muscolari permeabilizzate, al contrario dei mitocondri isolati, preserva le reti mitocondriali, mantiene l'integrità della membrana mitocondriale e, in ultima analisi, consente misurazioni più rilevanti dal punto di vista fisiologico. Questo sistema consente anche di misurare la preferenza per il carburante e la flessibilità metabolica, aspetti dinamici del metabolismo energetico muscolare. Qui, forniamo una guida completa per le misurazioni dell'OXPHOS mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche umane e di topo utilizzando un respirometro ad alta risoluzione. I gruppi muscolari scheletrici sono composti da diversi tipi di fibre che variano nella loro preferenza per il carburante mitocondriale e nella bioenergetica. Utilizzando un respirometro ad alta risoluzione, descriviamo i metodi per valutare sia i substrati glicolitici aerobici che quelli degli acidi grassi per valutare la preferenza per il carburante e la flessibilità metabolica in modo dipendente dal tipo di fibra. Il protocollo è versatile e applicabile sia alle fibre muscolari umane che a quelle dei roditori. L'obiettivo è migliorare la riproducibilità e l'accuratezza delle valutazioni della funzione mitocondriale, che miglioreranno la nostra comprensione di un organello importante per la salute muscolare.

Introduzione

I mitocondri sono la pietra angolare della produzione di energia cellulare, il che li rende indispensabili per mantenere un'omeostasi cellulare e dell'organismo ottimale. Questi organelli a doppia membrana sono i principali responsabili della fosforilazione ossidativa. Questo processo converte in modo efficiente i nutrienti, come gli zuccheri e gli acidi grassi, in adenosina trifosfato (ATP), la valuta cellulare per l'energia. Oltre al loro ruolo nel metabolismo energetico, i mitocondri sono anche regolatori chiave di vari processi cellulari, tra cui l'apoptosi, l'omeostasi del calcio e le specie reattive dell'ossigeno (ROS)1,2. A causa del loro ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi cellulare e dell'organismo, le interruzioni della funzione mitocondriale hanno spesso effetti dannosi sulla salute dei tessuti e dell'organismo. Nel muscolo scheletrico, la disfunzione mitocondriale è associata a numerosi stati patologici, tra cui disturbi metabolici (ad esempio, obesità, diabete e malattie cardiovascolari), sarcopenia e distrofia muscolare 3,4,5,6,7,8.

La disfunzione mitocondriale può manifestarsi principalmente con un'alterazione del contenuto, del numero e della morfologia mitocondriale, nonché con un metabolismo interrotto. Pertanto, il raggiungimento di una comprensione completa della disfunzione mitocondriale richiede un approccio integrativo e olistico. Gli studi iniziali di caratterizzazione prevedono l'esame dei livelli di espressione dei complessi proteici della catena respiratoria come lettura del contenuto mitocondriale, la quantificazione del DNA mitocondriale e dei marcatori di biogenesi come misura della biogenesi mitocondriale e sofisticate immagini al microscopio elettronico per valutare la morfologia mitocondriale 9,10. Ulteriori valutazioni della funzione mitocondriale includono la valutazione della produzione cellulare di ROS e ATP e del potenziale di membrana mitocondriale9.

Poiché i mitocondri sono essenziali per la produzione di energia cellulare e l'omeostasi, un segno distintivo per valutare la funzione mitocondriale è misurare la fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS). La respirometria ad alta risoluzione delle fibre muscolari permeabilizzate consente di misurare in tempo reale le variazioni del tasso di consumo di ossigeno mitocondriale come lettura delle variazioni dinamiche dell'attività della catena respiratoria mitocondriale OXPHOS 9,11,12. L'applicazione di modulatori e inibitori chimici selettivi consente di misurare l'attività di diversi complessi respiratori in modo diretto e sequenziale. Sebbene i mitocondri isolati possano essere utilizzati nella respirometria, l'uso di fibre muscolari fresche e permeabilizzate mantiene le reti mitocondriali endogene e l'integrità della membrana, consentendo così misurazioni più rilevanti dal punto di vista fisiologico. Inoltre, poiché diversi tipi di fibre muscolari hanno diverse preferenze di substrato e velocità di respirazione, questo sistema consente di misurare i cambiamenti nella preferenza del carburante e nella flessibilità metabolica in base al tipo di fibra13.

Qui, descriviamo un protocollo completo per le misurazioni dell'OXPHOS mitocondriale utilizzando fibre muscolari scheletriche umane o di topo in un sistema respirometrico ad alta risoluzione. Sono inclusi metodi per quantificare la respirazione di ossigeno mitocondriale in fibre ossidative o glicolitiche utilizzando piruvato o palmitoil-carnitina come substrato. Questo protocollo consente l'uso di altri substrati di combustibile per affrontare specifiche questioni metaboliche relative a difetti nell'utilizzo del substrato e nella preferenza del combustibile.

Protocollo

Tutte le procedure per i topi sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Washington University. Topi di qualsiasi sesso, età e peso possono essere utilizzati per questi esperimenti e dipenderanno dalla natura della domanda sperimentale che si cerca di affrontare. I topi utilizzati qui sono topi adulti (12-16 settimane), maschi di tipo selvatico C57BL/6. Tutte le procedure umane sono state approvate dall'Institutional Review Board della Washington University. I soggetti dello studio hanno acconsentito all'utilizzo dei dati e i dati rappresentativi dei soggetti umani inclusi in questo protocollo provengono da uno studio pubblicato14. I dati qui provengono da donne non diabetiche in post-menopausa (55-75 anni). I dettagli per la preparazione dei reagenti necessari per il test sono presentati nella Tabella 1. Le informazioni sui reagenti, gli strumenti e le macchine specifici utilizzati nel test sono elencate nella Tabella dei materiali. Una panoramica schematica del protocollo è presentata nella Figura 1.

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Figura 1: Schema per la respirometria ad alta risoluzione su campioni di muscolo scheletrico permeabilizzato. Il metodo descritto in questo manoscritto è diviso in 6 sezioni: 1) preparazione dei tamponi e dei reagenti per la respirazione, 2) preparazione dello strumento e del reagente il giorno del test, 3) preparazione e permeabilizzazione dei campioni muscolari, 4) preparazione del campione e dello strumento, 5) esecuzione del test di respirazione e 6) analisi dei dati. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione del saggio e taratura dello strumento

  1. Il giorno del test, rimuovere il numero necessario di aliquote di ciascun composto respiratorio (blebbistatina, palmitoil-carnitina, glutammato, malato, ADP, succinato, citocromo C, FCCP) e scongelare con ghiaccio. Scongelare le fiale di BIOPS e MiR05 con ghiaccio.
  2. Preparare le soluzioni di saponina e piruvato come indicato nella Tabella 1. Preparare una soluzione funzionante di MiR05 come nella Tabella 1. Preparare 5 mL di soluzione di lavoro di MiR05 per strumento (2 camere). Aumenta le prestazioni in base alle esigenze.
  3. Accendere il sistema di respirometria ad alta risoluzione e il sistema del vuoto. Rimuovere i tappi, rimuovere la soluzione di conservazione dell'etanolo al 70% con il vuoto e riempire la camera con H2O di grado molecolare ultrapuro. Rimuovere l'H2O con il vuoto e ricaricare. Ripetere per un totale di 3 lavaggi. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 2 ml di MiR05 (senza creatina o blebbistatina) in ciascuna camera.
  4. Aprire il software di respirometria. Dopo l'avvio del software, si aprirà una finestra pop-up per le impostazioni dello strumento. Impostare la velocità di agitazione della camera a 750 giri/min, la temperatura a 37 °C e l'intervallo di registrazione dei dati a 2 s. Impostare il guadagno su 1 e la tensione di polarizzazione su 800 mV per i sensori di ossigeno. Fare clic su Connetti a Oxygraph per stabilire la comunicazione con lo strumento.
  5. Dopo aver stabilito la comunicazione, si aprirà una finestra di dialogo per nominare e salvare il file sperimentale. Salvare il file con la data e la calibrazione correnti. Dopo aver salvato il file, verrà visualizzata una finestra di dialogo pop-up per i dettagli dell'esperimento. Non sono necessarie informazioni per la corsa alla calibrazione e la scatola può essere chiusa.
  6. Registrare la concentrazione di ossigeno per almeno 30 minuti per consentire il riscaldamento delle camere e per registrare i segnali per la calibrazione dell'aria. Questo può essere fatto durante la preparazione delle fibre muscolari, come descritto nel passaggio 2 di seguito.
  7. Al termine del periodo di taratura, contrassegnare una regione di taratura in tutta la regione in cui la concentrazione di ossigeno (linea blu) è stabile. Per fare ciò, tieni premuto il tasto Maiusc e il pulsante sinistro del mouse e trascina su una regione della timeline.
  8. Apri la finestra di calibrazione andando su Oxygraph > O2 Calibration. Per Calibrazione aria, selezionare il segno generato nel passaggio 1.8. Fare clic su Calibra e copia negli Appunti.
  9. Ripetere i passaggi 1.6-1.8 per la camera rimanente. Eseguire la calibrazione dell'aria ogni giorno. Interrompere la registrazione della calibrazione dell'aria e salvare il file scollegandolo dallo strumento. Dopo che i campioni sono pronti, procedere alla fase 3 per eseguire il saggio.

2. Raccolta e permeabilizzazione delle fibre muscolari scheletriche

  1. Isolamento del tessuto di topo
    1. Per ogni campione da analizzare, riempire un pozzetto di una piastra di coltura a 12 pozzetti con 1 mL di BIOPS. Mettere il piatto sul ghiaccio per raffreddare.
    2. Dopo aver soppresso il topo mediante inalazione di anidride carbonica seguita da lussazione cervicale, prelevare il muscolo scheletrico di interesse, assicurandosi di rimuovere tutto il tessuto connettivo e il grasso (Figura 2A). Posizionare il muscolo in uno dei pozzetti contenenti BIOPS. Mettere su ghiaccio fino alla preparazione delle fibre.
      NOTA: Qualsiasi muscolo scheletrico può essere esaminato utilizzando questo protocollo: il tipo di muscolo esaminato dipenderà dalla domanda sperimentale che si cerca di affrontare. Nel caso di muscoli scheletrici con tipi di fibre miste, come il gastrocnemio, è possibile separare il tessuto in sezioni bianche e rosse per misurare le fibre prevalentemente a contrazione rapida (sezioni bianche) e prevalentemente a contrazione lenta (sezioni rosse) (Figura 2B).
  2. Isolamento dei tessuti umani
    1. Raccogliere il tessuto seguendo il protocollo clinico14. Sciacquare rapidamente il fazzoletto con PBS freddo e sterile e metterlo in una provetta conica contenente 2 ml di soluzione BIOPS. Tenere il fazzoletto sul ghiaccio fino alla preparazione delle fibre.
  3. Preparazione delle fibre
    1. La permeabilizzazione avverrà in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti. Aggiungere 2 mL di soluzione BIOPS a una serie di pozzetti e 2 mL di MiR05 a un'altra serie di pozzetti. Sarà necessario un set di pozzetti per ogni campione analizzato.
    2. Prepara un vassoio con ghiaccio e posiziona una capsula di Petri di vetro capovolta sul ghiaccio. Assicurati di mantenere sempre il muscolo sul ghiaccio.
    3. Trasferire i campioni muscolari raccolti sulla piattaforma raffreddata della piastra di Petri utilizzando una pinza. Utilizzando due pinze a punta fine e un microscopio da dissezione con una fonte di luce, pulire delicatamente il tessuto rimuovendo eventuali tendini, fascia e tessuto adiposo attaccati al muscolo.
    4. Dopo che tutto il tessuto non muscolare estraneo è stato rimosso, separare delicatamente le fibre muscolari con la pinza a punta fine fino a quando non sono piccoli fasci di fibre traslucide di lunghezza compresa tra 0,75 e 1,0 mm (Figura 2C-D). Dopo aver separato le fibre, utilizzare la pinza per trasferire i fasci di fibre in un pozzetto sulla piastra a 6 pozzetti contenente la soluzione BIOPS su ghiaccio.
    5. Aggiungere 20 μL di soluzione di saponina da 5 mg/mL a ciascun pozzetto BIOPS e incubare la piastra su ghiaccio mentre la si dondola delicatamente in una stanza fredda per 20 minuti.
    6. Dopo il trattamento con saponine, trasferire le fibre muscolari nel pozzetto contenente MiR05 per risciacquare prima del test. Incubare con ghiaccio mentre si dondola delicatamente in una stanza fredda per 15 minuti.
    7. Al termine dell'incubazione delle fibre in MiR05, raccogliere le fibre con una pinza affilata e asciugare delicatamente le fibre muscolari su una salvietta da lavoro. Tarare una provetta da microcentrifuga in plastica da 1,5 ml con una bilancia fine e inserire 2-3 mg di fibre nella provetta. Registrare il peso finale della fibra sul lato di ciascun tubo. Metti il tubo sul ghiaccio. Ripetere con altri campioni. Procedere immediatamente al passaggio 3.

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Figura 2: Separazione delle fibre muscolari scheletriche del topo. (A) Morfologia macroscopica del gastrocnemio di topo dopo il raccolto. (B) Dissezione del gastrocnemio nei segmenti rosso (a sinistra) e bianco (a destra). (C) Fibre muscolari separate meccanicamente. (D) Un'immagine 10x di fibre muscolari separate con successo. La barra della scala è di 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Preparazione di campioni muscolari nel respirometro

  1. Aspirare il MiR05 utilizzato per la calibrazione dello strumento come descritto nel passaggio 1 sopra e aggiungere 2,1 ml di soluzione MiR05 funzionante a ciascuna camera.
  2. Avviare un nuovo file per l'esperimento utilizzando le stesse impostazioni dello strumento descritte nel passaggio 1.5. sopra. Imposta il nome del file e salva le impostazioni.
  3. Dopo aver impostato il nome del file, la finestra di dialogo della schermata successiva sarà per dettagli sperimentali specifici. Inserire le informazioni sul campione e il peso di ogni campione aggiunto a ciascuna camera. Chiudete la finestra di dialogo.
  4. Una volta nel nuovo file sperimentale, impostare la calibrazione aprendo la finestra Calibrazione O2. Fare clic su Copia da file e selezionare il file salvato dal passaggio 1.9. sopra. Fare clic sul pulsante Calibra e copia negli Appunti . Ripetere il processo per la camera rimanente.
  5. Utilizzando una pinza fine, trasferire con cura i fasci di fibre muscolari nella soluzione respiratoria per la camera appropriata. Ripetere per la camera rimanente.
  6. Posizionare i tappi sulla camera e semichiudere con cura la camera spingendo i tappi circa a metà verso il fondo. Una volta che gli o-ring sui tappi si innestano con la parete della camera e c'è resistenza, utilizzare un movimento rotatorio mentre si spinge verso il basso per chiudere. Quando la camera è chiusa a metà, si può osservare una piccola bolla d'aria nella parte superiore della camera.
    NOTA: Le fibre permeabilizzate sono soggette a limitazioni di diffusione dell'ossigeno in condizioni respiratorie regolari. Per aggirare questa limitazione, il test viene condotto a concentrazioni elevate di ossigeno11.
  7. Riempire una siringa di plastica da 10 ml con ossigeno puro da una bombola di ossigeno. Posizionare l'ago lungo e smussato fornito con lo strumento sulla siringa. Posizionare l'ago nella prima camera ed erogare lentamente circa 1 mL di ossigeno nella camera.
  8. Monitorare la concentrazione di ossigeno della camera nel software di respirometria. Quando la concentrazione di ossigeno della camera raggiunge i 350-400 nmol/mL, ruotare delicatamente il tappo mentre si spinge verso il basso per chiudere completamente la camera. Guardare all'interno della camera e assicurarsi che non rimangano bolle d'aria. Se è presente una bolla d'aria, riaprire con cautela e rapidamente la camera, aggiungere 100 μl di soluzione MiR05 di lavoro aggiuntiva e richiudere rapidamente la camera. Ripetere con le camere rimanenti.
  9. Le concentrazioni di ossigeno devono essere mantenute al di sopra di 250 nmol/mL durante il test. Aggiungere ulteriore ossigeno secondo necessità aprendo parzialmente la camera, aggiungendo altro ossigeno dalla siringa nella bolla d'aria e richiudendo con cura la camera.
  10. Normalizzare i dati del flusso di ossigeno in base alla massa di tessuto utilizzata per l'esperimento. Per regolare i grafici, modificare il layout in modo che rifletta il flusso di O2 (pmol O2 / (s x mg)). Dal menu di layout, selezionare il layout 06 - Flusso specifico per unità di esempio. I dati saranno ora presentati normalizzati alla quantità di tessuto in ciascuna camera.

4. Respirometria ad alta risoluzione

  1. Quando la concentrazione di ossigeno (linea blu) e il flusso di O2 (linea rossa) si sono stabilizzati dopo l'aggiunta di ossigeno, iniziare il protocollo di respirazione. L'ossigeno può essere considerato stabile quando la linea blu è piatta o diminuisce lentamente. Anche il flusso di O2 deve essere piatto ed entro 5 pmol O2 / s x mg.
  2. Aggiungere tutti i reagenti utilizzando siringhe di vetro. È importante non utilizzare la stessa siringa per substrati, inibitori e disaccoppiatori. Avere una siringa separata per ciascuno. Dopo aver aggiunto ciascun composto, registrare il flusso di ossigeno per 1-2 minuti dopo che la frequenza respiratoria si è stabilizzata prima di aggiungere il reagente successivo.
  3. Misurazione della respirazione
    1. Utilizzando una siringa di vetro da 10 μl, aggiungere 2,5 μl di malato 0,8 M in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la timeline ed etichettare il segno con M. Registrare un flusso O2 stabile per 1-2 minuti.
    2. Aggiungere reagenti specifici per i nutrienti come descritto di seguito.
      1. Glicolitico aerobico: utilizzando una siringa di vetro da 10 μl, aggiungere 10 μl di glutammato 2 M e 5 μl di piruvato 2 M in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la timeline ed etichettare il segno con G P. Registrare un flusso O2 stabile per 1-2 minuti.
      2. Acido grasso: utilizzando una siringa di vetro da 10 μL, aggiungere 10 μL di glutammato 2 M e 10 μL di palmitoyl-carnitina 10 mM in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la timeline ed etichettare il segno con G PC. Registrare un flusso di O2 stabile per 1-2 minuti.
    3. Utilizzando una siringa di vetro da 25 μl, aggiungere 20 μl di ADP 0,5 M (con MgCl2) in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la sequenza temporale ed etichettare il contrassegno con ADP. Registrare un flusso di O2 stabile per 1-2 minuti.
    4. Utilizzando una siringa di vetro da 25 μl, aggiungere 20 μl di succinato 1 M in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la timeline ed etichettare il segno con S. Registrare un flusso O2 stabile per 1-2 minuti.
    5. Utilizzando una siringa di vetro da 10 μl, aggiungere 5 μl di citocromo C da 4 mM in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la timeline ed etichettare il segno con Cyt C. Registrare un flusso O2 stabile per 1-2 minuti.
    6. Titolare in tre boli da 1 μL di FCCP da 1 mM utilizzando una siringa di vetro da 10 μL. C'è generalmente un effetto di miscelazione quando si aggiunge FCCP che si traduce in una breve diminuzione dei livelli di flusso di O2 . Attendere che il flusso di O2 aumenti e si stabilizzi prima di procedere al passaggio successivo. Premere F4 dopo ogni aggiunta per contrassegnare la sequenza temporale e contrassegnare l'etichetta con FCCP. Registrare un flusso stabile di O2 per 1 minuto dopo ogni aggiunta.
  4. Al termine del test respiratorio, rimuovere delicatamente i tappi ruotandoli e tirandoli verso l'alto. Sciacquare le camere 3 volte con H2O ultrapuro da un flacone a spruzzo, quindi 3 volte con etanolo al 70% da un flacone a spruzzo. Dopo l'ultimo risciacquo con etanolo, riempire le camere con etanolo al 70% per la conservazione.
  5. Posizionare i tappi nelle camere finché non si avverte resistenza. Non chiudere completamente i tappi. Posizionare i tappi sui tappi, salvare il file del test e scollegare lo strumento dal software di respirometria. Spegnere lo strumento.

5. Analisi dei dati

  1. Aprire il file di analisi nel software di respirometria. Estrarre i dati dalle regioni stabili del flusso di ossigeno ottenute dopo l'iniezione di composti per la respirazione.
  2. Per contrassegnare le regioni di interesse, tenere premuto il tasto Maiusc , fare clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinare la casella sulla regione della velocità di flusso O2 stabile per le fasi di analisi descritte di seguito.
  3. Fasi di analisi 14,15,16,17,18,19,20
    1. Segnare la sequenza temporale dopo l'aggiunta di malato/glutammato/piruvato (protocollo glicolitico aerobico) o malato/glutammato/palmitoil-carnitina (protocollo degli acidi grassi). Questo tasso rappresenta il tasso di respirazione del complesso I Stato 2 (LEAK(n)).
    2. Segna la sequenza temporale dopo l'aggiunta di ADP. Questo tasso rappresenta il tasso di respirazione del complesso I Stato 3 (CI OXPHOS).
    3. Segna la sequenza temporale dopo l'aggiunta di succinato. Questo tasso rappresenta il tasso di respirazione del complesso I+II Stato 3 (CI+II OXPHOS).
    4. Segna la sequenza temporale dopo aver aggiunto il citocromo C. Questo tasso rappresenta il tasso di respirazione del complesso I+II+Stato del citocromo 3 (CI+II+Cyt C OXPHOS).
    5. Segnare la tempistica per la titolazione FCCP con il tasso di flusso di O2 più alto. Questo tasso rappresenta la frequenza respiratoria massima (MAX ETS).
  4. Recupera i valori dei dati per le regioni contrassegnate sulla sequenza temporale selezionando Segna > statistiche. Copiare la velocità di flusso di O2 (pmol O2/(s x mg)) per la camera contrassegnata su un foglio di calcolo.
  5. Ripetere la marcatura e l'estrazione dei dati per le camere aggiuntive.
  6. Calcolare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) dividendo il complesso I+II stato 3 (dopo l'aggiunta di succinato) per il complesso I stato 2 (prima dell'aggiunta di ADP).

Risultati

La Figura 3 e la Figura 4 mostrano i grafici dell'ossigeno dei protocolli di respirometria aerobica glicolitica e degli acidi grassi, rispettivamente, per fibre muscolari rosse e bianche del gastrocnemio murino adeguatamente preparate. Vengono inoltre mostrati risultati quantificati rappresentativi come riferimento. La Figura 5 mostra un grafico dell'ossigeno della respirometria glicolitica aerobica in campioni di biopsia muscolare umana adeguatamente preparati. Vengono mostrati anche risultati quantificati rappresentativi. Si noti che per la Figura 3, la Figura 4 e la Figura 5, l'aggiunta di citocromo C dopo l'aggiunta di ADP non produce un impatto sul flusso di ossigeno, indicando che la membrana mitocondriale esterna del campione è intatta. La Figura 6 mostra un grafico dell'ossigeno della respirometria glicolitica aerobica in cui l'aggiunta di citocromo C dopo l'ADP provoca un picco (aumento del 40%) del flusso di ossigeno, indicando che la membrana mitocondriale esterna è stata danneggiata e quindi il campione non deve essere utilizzato per la respirometria - le potenziali ragioni di questo risultato possono essere una manipolazione inappropriata o il congelamento/scongelamento del tessuto, prolungare la permeabilizzazione del tessuto e non utilizzare tessuto appena isolato.

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Figura 3: Consumo di ossigeno nel topo. I risultati mostrano il consumo di ossigeno in (A) gastrocnemio rosso e (B) bianco utilizzando il protocollo del piruvato. Flusso di stato 2 a seguito dell'aggiunta di malato, glutammato e piruvato (tonalità blu, CI LEAK). Una stimolazione significativa del consumo di O2 si osserva dopo la somministrazione di ADP (tonalità verde, CI OXPHOS), con una maggiore stimolazione respiratoria dopo l'aggiunta di succinato (tonalità viola, CI+II OXPHOS). Il citocromo C non ha indotto un aumento significativo (<15%), indicando che la membrana mitocondriale esterna è intatta (tonalità arancione, CI+II+Cyt C OXPHOS). I mitocondri vengono disaccoppiati in seguito all'aggiunta di FCCP (tonalità gialla, MAX ETS). La linea blu rappresenta la concentrazione di ossigeno in una camera chiusa. La linea rossa rappresenta il tasso di consumo di ossigeno (flusso di O2 ). Composti aggiunti: Malato (m), Glutammato (g), Piruvato (p), Adenosina Difosfato (ADP), Citocromo C (cyt c), Cianuro di carbonile-p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP). (C) Il grafico a barre riflette risultati rappresentativi (n=8). I dati sono rappresentati come ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Consumo di ossigeno nel topo. I risultati mostrano il consumo di ossigeno in (A) gastrocnemio rosso e (B) bianco utilizzando il protocollo palmitoil-carnitina. Flusso di stato 2 a seguito dell'aggiunta di malato, glutammato e palmitoil carnitina (tonalità blu, CI LEAK). Una stimolazione significativa del consumo di O2 si osserva dopo la somministrazione di ADP (tonalità verde, CI OXPHOS), con una maggiore stimolazione respiratoria dopo l'aggiunta di succinato (tonalità viola, CI+II OXPHOS). Il citocromo C non ha indotto un aumento significativo (<15%), indicando che la membrana mitocondriale esterna è intatta (tonalità arancione, CI+II+Cyt C OXPHOS). I mitocondri vengono disaccoppiati in seguito all'aggiunta di FCCP (tonalità gialla, MAX ETS). La linea blu rappresenta la concentrazione di ossigeno in una camera chiusa. La linea rossa rappresenta il tasso di consumo di ossigeno (flusso di O2 ). Composti aggiunti: Malato (m), Glutammato (g), Palmitoil Carnitina (pc), Adenosina Difosfato (ADP), Citocromo C (cyt c), Cianuro di carbonile-p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP). (C) Il grafico a barre riflette risultati rappresentativi (n=7). I dati sono rappresentati come ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Risultati rappresentativi per il consumo di ossigeno nel vasto laterale umano utilizzando il protocollo del piruvato. (A) Flusso di stato 2 dopo l'aggiunta di malato, glutammato e piruvato (tonalità blu, CI LEAK). Una stimolazione significativa del consumo di O2 si osserva dopo la somministrazione di ADP (tonalità verde, CI OXPHOS), con una maggiore stimolazione respiratoria dopo l'aggiunta di succinato (tonalità viola, CI+II OXPHOS). Il citocromo C non ha indotto un aumento significativo (<15%), indicando che la membrana mitocondriale esterna è intatta (tonalità arancione, CI+II+Cyt C OXPHOS). I mitocondri vengono disaccoppiati in seguito all'aggiunta di FCCP (tonalità gialla, MAX ETS). La linea blu rappresenta la concentrazione di ossigeno in una camera chiusa. La linea rossa rappresenta il tasso di consumo di ossigeno (flusso di O2 ). Composti aggiunti: Malato (m), Glutammato (g), Piruvato (p), Adenosina Difosfato (ADP), Citocromo C (cyt c), Cianuro di carbonile-p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP). (B) Il grafico a barre riflette i risultati rappresentativi ottenuti dalle biopsie del vasto laterale (n = 24). I dati sono rappresentati come ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Risultato rappresentativo che dimostra la compromissione dell'integrità della membrana mitocondriale esterna nel gastrocnemio rosso di topo. Flusso di stato 2 a seguito dell'aggiunta di malato, glutammato e piruvato (tonalità blu, CI LEAK). Una stimolazione significativa del consumo di O2 si osserva dopo la somministrazione di ADP (tonalità verde, CI OXPHOS), con una maggiore stimolazione respiratoria dopo l'aggiunta di succinato (tonalità viola, CI+II OXPHOS). Il citocromo C ha indotto un aumento significativo del consumo di O2 (>15%), indicando un danno alla membrana mitocondriale esterna. La linea blu rappresenta la concentrazione di ossigeno in una camera chiusa. La linea rossa rappresenta il tasso di consumo di ossigeno (flusso di O2 ). Composti aggiunti: Malato (m), Glutammato (g), Piruvato (p), Adenosina Difosfato (ADP), Citocromo C (cyt c), Cianuro di carbonile-p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Preparazione dei reagenti dei composti per la respirazione e delle soluzioni per la respirazione. Vengono presentati i dettagli per la preparazione dei reagenti necessari per il saggio, comprese le concentrazioni finali delle scorte e le modalità di preparazione e conservazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Questo protocollo fornisce un protocollo modello completo e semplice per la valutazione della funzione mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche permeabilizzate sia per campioni umani che di topo. Ci sono diversi vantaggi nell'usare fibre permeabilizzate invece di mitocondri isolati. Un vantaggio chiave è che l'uso di fibre permeabilizzate richiede piccole quantità (2-5 mg) di tessuto, rendendo questo metodo adatto sia per i campioni di biopsia muscolare umana che per i muscoli del topo. Un altro vantaggio rispetto ai mitocondri isolati è che l'architettura cellulare rimane intatta, garantendo la conservazione delle interazioni strutturali e funzionali tra i mitocondri e i componenti cellulari 12,21,22,23.

L'uso di piruvato, malato e glutammato nel nostro protocollo glicolitico aerobico fornisce una valutazione completa e ad ampio spettro dell'apporto di NADH al complesso I 24,25,26,27,28. Mentre questo approccio globale fornisce una valutazione dell'attività del Complesso I in condizioni metaboliche olistiche e fisiologicamente rilevanti, l'uso di piruvato-malato o glutammato-malato può essere un approccio sperimentale più appropriato. Ad esempio, l'uso del glutammato-malato può evidenziare le differenze nella funzione mitocondriale correlate al catabolismo degli aminoacidi29. Incoraggiamo i ricercatori a considerare attentamente l'approccio appropriato da utilizzare per il loro specifico modello di ricerca.

Sebbene questo protocollo si concentri sull'uso di substrati per valutare l'attività mitocondriale, l'uso di inibitori specifici può essere necessario per raggiungere gli obiettivi sperimentali. Ad esempio, il rotenone può essere utilizzato per inibire il complesso I 12,21,30, l'oligomicina utilizzata per inibire il complesso V (ATP sintasi)12,21 e l'antimicina A per bloccare il complesso III 12,21 per la valutazione della respirazione non mitocondriale. Il protocollo sopra fornito può essere facilmente adattato per includere l'uso di inibitori specifici. Di notevole importanza, un avvertimento relativo all'uso degli inibitori è che questi composti sono appiccicosi e richiedono un'ampia pulizia per essere rimossi dalla camera dello strumento. Troviamo che l'utilizzo di una soluzione al 10% di BSA per 60 minuti è sufficiente per la rimozione degli inibitori residui.

La respirazione LEAK si riferisce al tasso di consumo di ossigeno che è indipendente dalla sintesi di ATP. Questa velocità rappresenta il flusso di protoni nella matrice mitocondriale attraverso la membrana mitocondriale interna. Esistono tre metodi accettati per valutare il consumo di ossigeno indipendente dalla sintesi di ATP (LEAK). Il primo, LEAK(n), misura il tasso di consumo di ossigeno in presenza di substrati ma senza l'aggiunta di adenilati (ADP o ATP)31,32,33. Questo stato LEAK rappresenta la permeabilità intrinseca della membrana mitocondriale. Il secondo metodo, LEAK(t), viene misurato in presenza di ATP34 e il terzo, LEAK(o), viene misurato in presenza dell'inibitore dell'ATP-sintasi oligomicina 35,36,37. Questo protocollo utilizza LEAK(n) per questa valutazione, ma a seconda degli obiettivi e dei modelli sperimentali, potrebbero essere appropriati altri metodi per misurare il flusso di ossigeno di LEAK.

Per questo test, MiR05 è integrato sia con creatina (3 mg/mL) che con blebbistatina (10 μM). Il trasporto mitocondriale dell'ADP è facilitato dalla creatinchinasi (CK) e la creatina viene aggiunta alla soluzione respiratoria per saturare l'attività di CK38,39. Le fibre muscolari possono contrarsi spontaneamente e sono anche sensibili alla contrazione indotta dall'ADP. Per valutare l'attività respiratoria mitocondriale senza l'influenza della contrazione, è stata aggiunta la blebbistatina per inibire l'attività contrattile delle fibre38. Inoltre, studi sul muscolo umano suggeriscono che la capacità respiratoria può essere influenzata dal metodo della biopsia (microbiopsia contro ago di Bergstrom) e che questa differenza può essere dovuta a differenze nella lunghezza delle fibre ottenute40,41. Le fibre più corte possono essere più suscettibili ai danni durante la preparazione e l'uso di blebbistatina aiuta a preservarne la funzione. Ci possono essere alcune condizioni in cui il rilassamento delle fibre non si adatta agli obiettivi della ricerca e, in tal caso, la blebbistatina può essere esclusa dalla soluzione MiR05.

La permeabilizzazione delle fibre muscolari scheletriche con la saponina genera pori nella membrana plasmatica consente ai substrati e agli inibitori di entrare liberamente nella cellula. La saponina ha un'elevata affinità per il colesterolo, che è ricco e abbondante nelle membrane plasmatiche cellulari, mentre le membrane mitocondriali sono povere di colesterolo42,43. Si prevede che il trattamento con saponine utilizzato per la preparazione delle fibre in questo protocollo preserverà l'integrità della membrana mitocondriale. I danni ai mitocondri possono verificarsi anche a causa delle forze di taglio che derivano dalla separazione meccanica del tessuto in fibre. Suggeriamo che la separazione del tessuto in fasci di fibre sia condotta rapidamente e con una manipolazione minima. Per valutare il potenziale danno mitocondriale, abbiamo incluso la titolazione del citocromo C nel protocollo respiratorio. Il citocromo C non può passare attraverso una membrana mitocondriale esterna intatta12, pertanto, qualsiasi aumento del flusso di O2 in seguito all'aggiunta del citocromo C indica che si è verificato un danno alla membrana mitocondriale esterna durante il processo di preparazione del campione. In uno dei nostri studi recenti, abbiamo scoperto che il flusso di O2 è aumentato dell'8%15 in seguito all'aggiunta di citocromo C, confermando che l'uso di saponina suggerito in questo protocollo non provoca danni mitocondriali. Suggeriamo che qualsiasi campione che dimostri un aumento superiore al 15% del flusso di O2 dopo l'aggiunta del citocromo C dovrebbe essere escluso dall'analisi44. Questa fase è inclusa strettamente come misura di controllo della qualità e non come valutazione dell'attività del Complesso IV.

Mentre la respirometria ad alta risoluzione eccelle nel fornire misurazioni altamente sensibili e affidabili del consumo di ossigeno, un notevole limite della strumentazione è che solo due campioni possono essere misurati contemporaneamente per strumento. Ciò richiede un'attenta considerazione quando si progettano studi che coinvolgono coorti con più campioni. Sebbene possa esserci la tentazione di condurre misurazioni su vari set di campioni durante il giorno, consigliamo vivamente agli investigatori di considerare l'influenza del ritmo circadiano sul metabolismo. La ricerca sul muscolo scheletrico umano e roditore ha rivelato un'influenza dell'orologio biologico sulla funzione mitocondriale45,46. Di conseguenza, si consiglia di effettuare misurazioni su più giorni alla stessa ora del giorno per tenere conto di queste fluttuazioni circadiane.

Infine, per garantire misurazioni della respirometria riproducibili e robuste, il respirometro deve essere sottoposto a pulizia, manutenzione e calibrazione regolari. La calibrazione dell'aria, come specificato nel protocollo, deve essere eseguita quotidianamente. Si consiglia agli utenti di eseguire anche una calibrazione mensile completa (sia aria che zero) dei sensori polarografici di ossigeno. Gli utenti devono fare riferimento alla documentazione e al sito Web del produttore per ulteriori informazioni su questo metodo di calibrazione e per istruzioni sulla manutenzione ordinaria dello strumento.

La respirometria ad alta risoluzione rimane il gold standard per misurare la respirazione mitocondriale. Il metodo descritto in questo protocollo facilita una solida valutazione della capacità mitocondriale sia nel muscolo scheletrico dei roditori che in quello umano. Questo protocollo è stato applicato a studi che valutano la funzione mitocondriale associata a modelli murini genetici15,16, nel contesto della malattia renale cronica19, dopo somministrazione di integratori alimentari14,20 ed esercizio fisico17,18.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal Nutrition Obesity Research Center, dalla sovvenzione NIH P30 DK056341 e dalla sovvenzione NIH K01 HL145326.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10 µ L Siringa Hamilton (siringa di vetro)ThermoFisher14-813-125Per la titolazione del saggio respiratorio
25 &; L Siringa Hamilton (siringa di vetro)ThermoFisher14-813-133Per la titolazione del saggio respiratorio
ADPMerck117105Saggio di respiromemetria
Piatto di dissezione in vetro nero ScinticaDD-90-S-BLKPer la preparazione del campione
BlebbistatinSigmaB0560Soluzione MiR05 di lavoro
BSA, senza acidi grassiSigmaA6003Soluzione MiR05
Carbonato di calcioSigmaC4830Soluzione BIOPS
CreatinaSigma27900Soluzione di lavoro MiR05
Citocromo CSigmaC7752Saggio di respirometria
DatLabOroboros InstrumentsN/ASoftware di respirometria
Ditiotreitolo (DTT) Soluzione SigmaD0632BIOPS
D-saccarosioSigma84097MiR05 Soluzione
EGTASigmaE4378BIOPS & Soluzione MiR05
FCCPSigmaC2920Saggio per spiriometria
GlutammatoSigmaG1626Saggio per spiriometria
HEPESSigmaH7523Soluzione MiR05
Imidazolo Soluzione BIOPS Sigma56750
KH2PO4 Soluzione SigmaP5379MiR05
Acido lattobionicoSigma153516Soluzione MiR05
MalatoSaggio di respirometriaSigmaM1000
MES idrato SigmaM8250BIOPS Soluzione
MgCl2 - 6 H2OSigmaM2670BIOPS & MiR05 Soluzione
Oroboros Oxygraph-2K (O2K) SystemOroboros Instruments10203-03Respirometro ad alta risoluzione
Palmitoil-CarnitinaSigmaP4509Saggio di respirometria
Idrossido di potassioSigmaP1767BIOPS Soluzione
Pinzette di precisioneFisher17-467-168Per la preparazione del campione
SaponinaSigmaS2149per la permeabilizzazione delle fibre
Sodio ATPSigmaA2383Soluzione BIOPS
Fosfocreatina di sodioSigmaP7936Soluzione BIOPS
Piruvato di sodioSigmaP2256Saggio di respirometria
SuccinatoSigmaS2378Saggio di spirometria
TaurinaSigmaT0625BIOPS & Soluzione MiR05

Riferimenti

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