Qui viene mostrata una procedura chirurgica minimamente invasiva, che prevede il posizionamento della sonda laser Doppler sul cranio sopra la regione distale dell'arteria cerebrale media (MCA), una posizione periorbitale adatta a ratti e topi, per valutare il flusso sanguigno durante l'occlusione transitoria MCA.
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Articolo metodologico
Posizionamento periorbitale di una sonda laser Doppler per il monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale prima dell'occlusione dell'arteria cerebrale media in modelli di roditori
In questo articolo
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Sommario
Abstract
L'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) è il metodo gold standard per la modellazione preclinica dell'ictus ischemico nei roditori. Tuttavia, il successo dell'occlusione non è garantito nemmeno dalle mani chirurgiche più esperte. Gli errori si verificano principalmente quando il filamento non è posizionato alla profondità corretta e includono casi di assenza di infarto o perforazione del vaso, che possono causare la morte. La flussimetria laser Doppler (LDF) è una tecnica affidabile che fornisce un feedback in tempo reale sul flusso sanguigno cerebrale regionale (CBF) durante la procedura MCAO. Qui dimostriamo una tecnica rapida per il posizionamento periorbitale di una sonda laser Doppler per la misurazione del CBF sia nei topi che nei ratti. La nostra logica era quella di semplificare l'implementazione di LDF, incoraggiando un uso diffuso per una migliore affidabilità chirurgica. La tecnica elimina la necessità di assottigliare il cranio e di attrezzature specializzate, con il posizionamento nella regione periorbitale piuttosto che nel posizionamento dorsale, promuovendo l'efficienza e la facilità di adozione. Il protocollo qui descritto comprende le preparazioni prechirurgiche, il posizionamento della sonda Doppler periorbitale e l'assistenza post-operatoria. I risultati rappresentativi includono rappresentazioni visive di elementi procedurali insieme a tracciati LDF rappresentativi che illustrano interventi chirurgici MCAO di successo, con casi di posizionamento non riuscito del filamento che hanno portato a complicanze. Il protocollo illustra l'LDF nel confermare il corretto posizionamento del filamento e offre una procedura semplificata rispetto ai metodi alternativi.
Introduzione
Il metodo dell'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) è stato ampiamente utilizzato nei roditori da quando è stato introdotto nella comunità scientifica per l'applicazione ai ratti nel 19861 con l'adattamento Longa descritto nel 19902 e gli adattamenti per i topi subito dopo3. Sebbene non descritto nella pubblicazione di Longa, l'uso del segnale di flussimetria laser Doppler (LDF) per confermare il posizionamento del filamento è stato presto descritto in letteratura4. L'impiego di LDF durante la procedura MCAO è presente in modo prominente in letteratura, ma è designato come passaggio opzionale nelle attuali procedure operative standard (SOP) delle reti di valutazione preclinica dell'ictus (SPAN)5.
L'uso di LDF conferma il corretto posizionamento del filamento durante la procedura MCAO e, quindi, contribuisce al rigore del disegno dello studio e ai risultati successivi, in particolare negli esperimenti progettati per esplorare l'efficacia dei farmaci. L'uso di LDF riduce gli errori chirurgici derivanti da un posizionamento errato del filamento, che si traduce nella situazione dicotomica di assenza di lesioni quando il filamento non è posizionato abbastanza lontano o di morte di animali a causa della perforazione del vaso che si verifica quando il filamento viene inserito troppo lontano. D'altra parte, l'uso di LDF non è associato alla variabilità delle dimensioni dell'infarto comunemente osservata dopo la procedura MCAO6. L'uso di LDF nella procedura MCAO può essere percepito come difficile e oneroso, in particolare nei ratti, perché il cranio è più spesso rispetto ai topi e può richiedere l'assottigliamento del cranio prima del posizionamento di LDF 7,8. Inoltre, il posizionamento della sonda dorsale è spesso descritto con alcuni protocolli che richiedono attrezzature o preparazione specializzate 7,8,9. Con una qualsiasi di queste barriere, l'implementazione dell'LDF per confermare il posizionamento del filamento potrebbe non aver luogo.
In questo protocollo, descriviamo il posizionamento della sonda laser Doppler sul cranio e sulla regione distale dell'arteria cerebrale media - un posizionamento periorbitale - per la valutazione del flusso sanguigno durante la procedura MCAO sia nei topi che nei ratti. Il nostro razionale è stato quello di sviluppare una procedura che presentasse molteplici vantaggi rispetto ad alcuni metodi riportati in letteratura 7,8,9,10 in quanto è minimamente invasiva, veloce e non richiede assottigliamento del cranio o apparecchiature specializzate oltre alla sonda laser Doppler.
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Protocollo
Per illustrare questo protocollo sono stati utilizzati topi e ratti adulti (25 g, C57BL/6J, Jackson Laboratories; 250 g, Sprague Dawley, Envigo). Le procedure di manipolazione e sperimentazione degli animali sono state eseguite con l'approvazione e in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università dell'Arizona, le leggi nazionali e secondo i principi della cura degli animali da laboratorio11. Ratti e topi sono stati alloggiati con un programma di 12 ore di luce/buio (7-19) con cibo e acqua disponibili ad libitum.
1. Preparazione prechirurgica
NOTA: Tipicamente, la chirurgia MCAO in un roditore viene eseguita come chirurgia di sopravvivenza, richiedendo l'uso di una tecnica chirurgica asettica o solo punte, come delineato in un protocollo IACUC specifico dell'istituto. In questo caso, il chirurgo utilizza una tecnica di sole punte con strumenti e forniture sterilizzati.
- Disinfettare la superficie di lavoro chirurgica con disinfettante commerciale e preparare confezioni chirurgiche sterili di strumenti, teli, garze, tamponi, suture e lame di bisturi mediante sterilizzazione in autoclave. Mantenere le condizioni sterili durante la chirurgia di sopravvivenza secondo le tecniche approvate dall'IACUC, come la copertura delle manopole del microscopio e il drappeggio con pellicola di plastica per alimenti.
- Utilizzare uno sterilizzatore a perline secche germinatore per risterilizzare gli strumenti chirurgici tra le procedure se vengono eseguiti più interventi chirurgici sui roditori durante una sessione.
- Posizionare il ratto o il topo in una camera di induzione e indurre l'anestesia con isoflurano al 3%-5% (1 L/min utilizzando una miscela combinata di 80% di aria e 20% di ossigeno).
- Spostare l'animale dalla camera al banco e all'ogiva per l'anestesia (topo: 0,5 L/min 80%/20% di miscela ossigeno/aria; ratto: 1,5 L/min 80%/20% di ossigeno/aria). Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi e radere accuratamente lo spazio tra l'orecchio e l'orbita oculare sul lato dell'intervento chirurgico MCAO (comunemente il destro), in modo da non tagliare la pelle usando il tagliacapelli. Nel ratto, una volta rasato, la fossetta dei baffi sarà visibile approssimativamente a metà strada tra l'orbita e l'orecchio. Continuare a radere le regioni secondo necessità per la procedura MCAO9 (non nell'ambito di questo documento).
- Riportare l'animale nella camera secondo necessità o spostarlo su un ogiva sul tavolo operatorio preparato riscaldato a 37 °C. Inserire un termometro rettale. L'animale deve essere tenuto a una temperatura di circa 36 °C ± 1 °C per tutta la durata della procedura e secondo il protocollo IACUC approvato.
- Applicare betadine su un batuffolo di cotone e disinfettare la pelle, a spirale verso l'esterno dal centro della regione chirurgica. Pulire con un tampone imbevuto di alcol. Ripetere entrambi i passaggi per un totale di tre cicli. Confermare la corretta anestesia e valutare ogni 15 minuti durante la procedura utilizzando il reflusso del pizzicamento delle dita.
2. Posizionamento della sonda Doppler periorbitale
- Con piccole forbici, praticare un taglio verticale (topo: ~0,5 cm; ratto: ~0,7 cm) tra l'angolo dell'occhio e la piega dell'orecchio, come mostrato nella Figura 2A (topo) e nella Figura 3A (ratto) per esporre la super faccia e il muscolo sottostante.
NOTA: Trattare il dolore prima dell'intervento secondo l'approvazione del protocollo IACUC. - Usando una pinza affilata e forbici ricurve, taglia con cura lo strato muscolare fino a raggiungere il cranio. Il cranio sarà piatto e difficile da toccare con la punta del forcipe. Questa è la finestra in cui si troverà la sonda laser Doppler, come visualizzato nella Figura 2B.
- Usa uno strumento di cauterizzazione a pinza per coagulare il sangue che fuoriesce, allargare la finestra e garantire il percorso verso il cranio.
- Una volta aperta la finestra, tamponare con tamponi di cotone per rimuovere il sangue in eccesso, se necessario.
Posiziona il topo o il ratto in posizione supina. - Usa una pinza per ritrarre la pelle o il tessuto e posiziona la sonda Doppler nella finestra periorbitale in modo che si appoggi al cranio perpendicolarmente senza pelle o muscoli presenti per ostacolare il segnale laser. Questa regione si trova sopra l'MCA distale, come illustrato nella Figura 1A, B. Fissare il posizionamento della sonda con del nastro da laboratorio. In questo protocollo viene descritto l'uso di una sonda diritta.
NOTA: Riconosciamo che i protocolli chirurgici variano da un laboratorio all'altro. In letteratura (quando riportato), alcuni macinano il cranio sottile e altri no9. Potrebbe essere perché il cranio è più sottile nella regione periorbitale, ma questa è solo una speculazione. Nella nostra esperienza, il posizionamento diretto senza macinazione può essere ottenuto nei topi e nei ratti ed è dimostrato in questo protocollo. - Monitorare le letture relative del flusso sanguigno sul monitor con un software appropriato (Figura 2D, Figura 3C,D). Le letture LDF possono variare. Tuttavia, l'intervallo ottimale per il rilevamento delle gocce di flusso sanguigno è di >200 unità di perfusione (PU).
- Procedere all'intervento chirurgico MCAO9 (non nell'ambito di questo documento). Durante l'intervento chirurgico MCAO, testare il posizionamento della sonda legando brevemente l'arteria carotide comune, che dovrebbe causare un improvviso calo del flusso sanguigno (~50%).
3. Rimozione della sonda Doppler e assistenza post-operatoria
- Al termine dell'MCAO o ogni volta che le letture del flusso sanguigno sono completate, rimuovere la sonda laser Doppler dalla finestra chirurgica. La sonda Doppler in genere rimane in posizione per tutta la durata dell'intervento chirurgico MCAO del topo perché i tempi di ischemia sono spesso inferiori a 90 minuti. D'altra parte, nella procedura MCAO di ratto, la sonda Doppler può essere rimossa dopo che il filamento è stato posizionato e durante l'ischemia (tipicamente > 90 minuti) e quindi posizionata nuovamente nella finestra periorbitale per confermare la riperfusione ripetendo i passaggi 2.6 e 2.7.
NOTA: Nella Figura 4A si può osservare un tipico tracciamento continuo LDF dal MCAO del topo. I tipici tracciati LDF da una procedura MCAO di ratto sono illustrati nella Figura 4B. - Iniettare l'anestetico locale approvato da IACUC per via sottocutanea lungo il sito di incisione prospettico.
- Chiudere la pelle con 1-2 punti di sutura utilizzando un nodo chirurgico standard con filo di sutura riassorbibile o colla chirurgica, secondo il protocollo IACUC approvato. Trattare il dolore post-chirurgico secondo l'approvazione del protocollo IACUC (ad es. bupivacaina HCL 0,5% e lidocaina 2%, una volta intra-incisione per topi e ratti). Gli animali non devono essere lasciati incustoditi fino a quando non sono in grado di mantenere la decubito sternale e nessun animale viene restituito alla compagnia di altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi.
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Risultati
Il posizionamento della sonda laser Doppler nella regione MCA è illustrato visivamente nella Figura 1, offrendo un pittogramma della vascolarizzazione e fungendo da guida visiva dalle prospettive sagittale e dorsale. La Figura 2 riassume i passaggi critici per il posizionamento della sonda laser Doppler e i risultati nel topo. La Figura 2A presenta l'immagine di un topo anestetizzato e preparato con una marcatura tratteggiata nel si...
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Discussione
La MCAO è la procedura gold standard per modellare l'occlusione e la riperfusione dell'arteria cerebrale nei roditori ed è stata la pietra angolare della ricerca preclinica sull'ictus, consentendo l'induzione dell'ischemia focale nei roditori per imitare la fisiopatologia dell'ictus umano. Si tratta di una procedura chirurgica impegnativa con una significativa variabilità inter- e anche intra-chirurgo. Sebbene non ci siano prove che l'applicazione di LDF riduca la variabilità, in alcuni ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata da NINDS 1R41NS124450. Biorender: KT26JWLYF6
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| forbici a molla curve | Castroviejo | 1501710 | |
| pinze #5 | Strumenti per le scienze fini | 11250-20 | |
| Pinze #5/45 | Strumenti per le scienze fini | 1151-35 | |
| Forcepts Strumento per cauterizzazione | Conmed | M18019-01 | |
| Nastro da laboratorio | Fisherbrand Nastro per etichettatura | 15-950 | |
| Monitor Doppler laser | Strumenti Moore | Software MOORVMS-LDF LDF | |
| Perisoft per Windows o moorSOFT | NA | ||
| Tosatrici | per mouse Philips Norelco | MG7910 | |
| Periflux System 4000, sonda 407 | Perimed | attrezzatura non più disponibile | |
| involucro di plastica | Glad | press n seal | |
| Tosatrici per topi | oster | A5 o simili | |
| Piccola anestesia per roditori | JD Medical | ordine | |
| piccole forbici | excelta | 362 Sissors o simile | |
| Sistema di monitoraggio della temperatura con sonda | Physitemp | TCAT-2AC Controller |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Periorbital Placement of a Laser Doppler Probe for Cerebral Blood Flow Monitoring Prior to Middle Cerebral Artery Occlusion in Rodent Models
Posted by JoVE Editors on 3/18/2025. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66839
