Un flusso di lavoro basato sul web per la selezione di potenziatori specifici per geni e tessuti

Sommario

Presentiamo un flusso di lavoro senza codifica per i biologi per identificare i potenziatori genici tessuto-specifici utilizzando solo strumenti basati su browser. Il nostro protocollo sfrutta i marcatori istonici pubblici H3K4me1/H3K27ac e i dati Hi-C, consentendo ai ricercatori senza competenze di programmazione di accedere, analizzare e identificare potenziali elementi regolatori associati ai loro geni di interesse.

Abstract

Gli enhancer sono regioni del DNA che regolano l'espressione genica. Le mutazioni all'interno degli enhancer possono provocare una regolazione genica anomala che porta alla malattia. Pertanto, l'identificazione di potenziatori che regolano l'attività genica in tessuti specifici è fondamentale per comprendere le basi genetiche della malattia. Tuttavia, gli enhancer sono difficili da identificare in quanto non codificano le proteine. Sebbene siano disponibili numerosi repository di potenziatori e strumenti di identificazione, la complessità di questi strumenti può rappresentare una sfida per i biologi. Per facilitare i biologi nell'utilizzo di queste risorse, presentiamo un protocollo (https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow) di facile utilizzo per i biologi che sfrutta i dati genomici esistenti basati sul web come i marcatori istonici H3K4me1 e H3K27ac e i dati dell'analisi della conformazione della cromatina (Hi-C) per scoprire potenziatori associati a un gene di interesse (GoI) in un tessuto bersaglio in cui l'enhancer è attivo. Questo protocollo è interamente basato sul web e non richiede competenze di programmazione da parte degli utenti finali. Abbiamo dimostrato l'utilità di questo approccio caratterizzando i candidati enhancer che regolano TBX5, un gene fondamentale per lo sviluppo del cuore. Questo protocollo facilita l'identificazione degli enhancer associati a questo gene nel ventricolo sinistro.

Introduzione

Gli enhancer sono regioni del DNA non codificanti che regolano la trascrizione, lo sviluppo e la differenziazione genica ^1,2. La mutazione degli enhancer può portare a varie malattie, tra cui disturbi dello sviluppo, tumori e altre condizioni genetiche 3,4,5,6. Pertanto, la comprensione degli enhancer è fondamentale per comprendere l'espressione genica, la mutazione e le malattie.

Per capire come gli enhancer interagiscono con i loro geni bersaglio, è importante identificare le loro posizioni all'interno del genoma. Tuttavia, identificare le posizioni degli enhancer non è sempre semplice in quanto gli enhancer possono essere localizzati sia vicino al sito di inizio trascrizionale (TSS) che molto più lontano, estendendosi da decine a centinaia di kilobasi 2,7,8,9.

Nonostante la loro posizione genomica imprevedibile, gli enhancer mostrano firme biochimiche e strutturali distinte, che ne consentono il tracciamento sistemico. Generalmente, gli enhancer tendono ad essere arricchiti nelle regioni intergeniche e introniche, con un piccolo numero che si trova all'interno degli esoni ^2,8. Sono spesso caratterizzati da specifiche modificazioni istoniche e dal legame con i fattori di trascrizione, che definiscono i loro ruoli regolatori e determinano la loro attività spazio-temporale in diversi stadi di sviluppo e tessuti^10,11.

ChIP-seq viene utilizzato per identificare i siti di legame del fattore di trascrizione (TFBS) e i segni di modifica degli istoni, come il segno distintivo degli enhancer, H3K4me1, i segni di enhancer attivi, i marchi H3K27ac e H3K4me3, che sono arricchiti nelle regioni del promotore 1,12,13,14,15. Le tecniche di cattura della conformazione della cromatina (3C) e i loro derivati, come 4C, 5C, Hi-C e ChIA-PET, vengono utilizzati per mappare le interazioni fisiche tra regioni genomiche distanti. Mentre il 3C si rivolge a interazioni specifiche in tessuti specifici, Hi-C offre un'architettura dell'intero genoma attraverso i tipi di cellule^16,17.

Oltre ai metodi attuali, sono stati sviluppati approcci specializzati per caratterizzare gli enhancer, tra cui database aggregati di enhancer, come EnhancerAtlas o EnhancerFinder^18,19. Tuttavia, questi strumenti spesso richiedono ai ricercatori di integrare più set di dati per studiare più potenziatori in molti tessuti, il che può essere travolgente per i biologi senza esperienza in bioinformatica e data mining.

Qui, descriviamo un protocollo user-friendly per selezionare gli enhancer, interamente basato su strumenti web esistenti. Ciò consente ai ricercatori di interrogare un gene di interesse (GoI) e recuperare gli enhancer corrispondenti. Il protocollo qui seleziona gli enhancer in base a una serie specifica di criteri: modificazioni istoniche, interazioni cromatiniche e specificità tissutale 1,12,13,14,15,16,17,20,21. Gli enhancer trovati all'interno degli introni hanno maggiori probabilità di mostrare un'attività tessuto-specifica rispetto agli enhancer intergenici, che sono posizionati nelle regioni genomiche tra i geni²². Per garantire una copertura completa di potenziali potenziatori attivi, abbiamo definito l'intervallo di ricerca tra due GoI vicini per aumentare la probabilità di catturare elementi regolatori situati al di fuori dei corpi genici. Abbiamo utilizzato un segno distintivo epigenetico specifico dell'enhancer, H3K4me1, e un marcatore dell'enhancer attivo, H3K27ac, per elencare i candidati enhancer. Questi candidati sono stati poi raffinati sulla base dei dati Hi-C, mantenendo gli enhancer con interazioni fisiche con il promotore corrispondente. Questo protocollo è progettato per guidare i biologi attraverso il processo di identificazione dei potenziatori utilizzando solo strumenti basati sul web disponibili pubblicamente. Integrando i dati di interazione epigenetica e cromatinica, l'approccio qui descritto offre un quadro pratico per generare ipotesi su potenziali potenziatori per un'ulteriore validazione sperimentale.

Protocollo

NOTA: una guida dettagliata è disponibile all'indirizzo https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow. I dati utilizzati nel protocollo sono riassunti nella Tabella 1 e nella Tabella 2. La risoluzione dei problemi è disponibile nel file supplementare 1.

1. Localizzazione del GoI (Figura 1)

1. Aprire il browser del genoma EnsEMBL (https://www.EnsEMBL.org).
2. Scegli l'assemblaggio del genoma appropriato che corrisponde alla specie e alla versione.
3. Inserisci GoI nel campo di ricerca e fai clic su Vai.
4. Seleziona il collegamento all'ID del gene EnsEMBL appropriato.
5. Fai clic sul link al visualizzatore della scheda Regione nei dettagli , situato sotto la sezione di riepilogo, per navigare nella regione che circonda il governo dell'India.

2. Definizione della regione di rilevamento dell'enhancer (Figura 2)

1. Identificare i due geni vicini del GoI per definire la regione di rilevamento. Usa la traccia Leggenda Genetica per cercare questi geni, che sono annotati come elementi visivi relativi all'unione di EnsEMBL/Havana nella traccia Annotazioni Genetiche di Base da GENCODE . Determinare la direzionalità del GoI in base ai segni < e > sul nome del gene appropriato nella traccia GENCODE.
2. Fare clic e trascinare per selezionare la regione intergenica tra questi geni, quindi fare clic su Salta alla regione nella finestra pop-up per visualizzare l'area selezionata. Ridefinire la regione di interesse in qualsiasi momento ripetendo questo passaggio.
3. (FACOLTATIVO) Per personalizzare la visualizzazione , selezionare Aggiungi/rimuovi tracce nella parte superiore del visualizzatore tracce. Modula il livello di zoom utilizzando i controlli di zoom/navigazione sopra il visualizzatore tracce.

3. Analisi dei segni istonici (Figura 3)

1. Nella barra laterale del visualizzatore della scheda Regione nei dettagli , seleziona Configura questa pagina.
2. Nella barra laterale della scheda Configura immagine regione , nell'elenco a discesa Regolazione , selezionare Attività per cellula/tessuto.
3. Utilizza la barra di ricerca Cellule/Tessuti per cercare e selezionare i tessuti di interesse. In alternativa, utilizza la barra di navigazione alfabetica sotto la barra di ricerca per trovare i tessuti di interesse.
4. Seleziona la scheda Esperimenti , accanto a Cellula/Tessuto.
5. Selezionare H3K4me1 e H3K27ac come marcatore di potenziatori e H3K4me3 come marcatore di promotori.
6. Selezionare Configura visualizzazione traccia.
7. Selezionare Visualizza tracce per visualizzare le regioni contrassegnate con H3K4me1 nella regione di rilevamento dell'enhancer e le regioni contrassegnate con H3K4me3 a monte del GoI.
8. Per i candidati potenziatori, recuperare le coordinate delle regioni genomiche contrassegnate da H3K4me1 all'interno delle regioni di rilevamento definite facendo clic sugli elementi visivi/box colorati nelle tracce H3K4me1 appena aggiunte. Questo rivela il pop-up "Hists & Pols", che contiene informazioni sulla posizione genomica dell'elemento nella coppia di basi (bp).
   1. Recupera i candidati potenziatori attivi scegliendo le regioni H3K4me1 in cui gli elementi visivi/box colorati di H3K4me1 e H3K27ac si sovrappongono. La granularità del livello di zoom può influire sul numero di candidati enhancer mostrati in questa traccia.
   2. In alternativa, è possibile definire manualmente le regioni di interesse per ciascuna caratteristica genomica facendo clic e trascinando sulla traccia per incapsulare i picchi del grafico sotto la traccia H3K4me1/H3K27ac. Copia le coordinate della posizione genomica in un file di testo e salvale in formato .bed .
9. Allo stesso modo, per le regioni promotrici, replicare il passaggio 3.8 utilizzando la traccia H3K4me3, concentrandosi sulla regione a monte del GoI.

4. Analisi della cattura della conformazione della cromatina (Hi-C) (Figura 4)

1. Accedi al portale dati 4DN (https://data.4dnucleome.org/). Nel grafico a barre in pila principale della home page di 4DN (Figura 5), assicurarsi che Set di esperimenti sia selezionato come asse Y, che Tipo di esperimento sia selezionato come asse X e che il grafico sia raggruppato per Organismo.
2. Lungo l'asse X del grafico a barre principale, individuare la barra Hi-C in situ. Fare clic sulla parte della barra raggruppata per i set di esperimenti umani, quindi fare clic sul pulsante Sfoglia nel pop-up. Filtra i set di dati pertinenti utilizzando il pannello laterale sinistro.
3. Fare clic sul collegamento nella colonna Titolo del campione biologico pertinente per il tessuto di interesse.
4. Fare clic su Esplora dati nella scheda File elaborati per esplorare il set di dati Hi-C in modo più dettagliato.
5. Inserire le coordinate del promotore identificato nel tessuto di interesse (dal passaggio 3.9) e contrassegnare la regione orizzontalmente facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla mappa di calore (Figura 4). Le linee aggiunte assicurano che la regione del promotore venga tracciata visivamente nella mappa di calore. Per rimuovere le linee accidentali, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla linea e selezionare la regola orizzontale/verticale e Chiudi serie.
6. Inserire le coordinate di tutti gli enhancer di controllo convalidati sperimentalmente²³ per calcolare la soglia di interazione in base al loro minimo. È stato precedentemente confermato che questi potenziatori di controllo interagiscono con la regione del promotore, fungendo da parametri di riferimento per definire l'interazione minima significativa.
7. Definire la soglia promotore-potenziatore, utilizzando gli enhancer di controllo, in base al punteggio di interazione più basso diverso da zero secondo la chiave di colore sul lato destro della matrice.
8. Inserire le coordinate genomiche di tutte le regioni associate a H3K4me1 (dal passaggio 3.8) e contrassegnare verticalmente sulla mappa di calore Hi-C. Ciò consente un modello di controllo incrociato, in cui l'intersezione tra gli enhancer marcati con H3K4me1 (verticale) e la regione del promotore (orizzontale) può essere esaminata per interazioni significative.
   1. Quindi, filtrare le regioni debolmente interagenti confrontando i punteggi di interazione delle regioni marcate con H3K4me3 con la soglia di interazione (passaggio 4.6).
   2. Selezionare le coordinate genomiche che mostrano frequenze di interazione superiori alla soglia definita nella mappa di calore del portale 4DN. Queste regioni appaiono come segnali più concentrati (più scuri) nella mappa di calore, tranne che in formato BED.

Risultati

Per illustrare l'uso del protocollo presentato, abbiamo studiato il gene TBX5 nel cuore umano, esplorando gli enhancer associati a TBX5 utilizzando il flusso di lavoro completo che coinvolge i dati H3K4me1, H3K27ac e Hi-C. TBX5 è un gene che contribuisce allo sviluppo degli arti e del cuore, compresa la formazione delle quattro camere e la separazione del setto²⁴. La mutazione in questo gene è una delle principali cause della sindrome di Holt-Oram (HOS), che causa anomalie degli arti e cardiopatie congenite (CHD), inclusi difetti del setto²⁴. La mutazione degli enhancer cardiaci associati a TBX5 può influenzare in modo critico la CHD²⁴. Uno studio precedente ha scoperto tre noti enhancer TBX5 nel tessuto cardiaco umano specifico, vale a dire "Enhancer 2", "Enhancer 9" e "Enhancer 16" (Supplementary File 2), che hanno dimostrato di avere fenotipi comparativi nei topi transgenici²³.

Abbiamo studiato le regioni arricchite con H3K4me1 e H3K27ac tra RBM19 e TBX3, che sono due geni fiancheggianti a valle e a monte di TBX5 nell'uomo, per recuperare potenziatori putativi nel locus TBX5 (Figura 1 e Figura 2). Per identificare i potenziatori specifici del cuore, sono state scelte le cellule del muscolo cardiaco. Le regioni putative dell'enhancer cardiaco TBX5 sono state recuperate come coordinate (chr12: inizio-fine) e sono state identificate 22 regioni associate a H3K4me1 e H3K27ac (Figura 3 e File supplementare 3). I potenziatori cardiaci putativi di TBX5 sono stati recuperati dal database genomico EnsEMBL per incrociare i dati Hi-C contenuti nel database 4DNucleome (Figura 4). Questo è stato fatto per valutare le possibili interazioni tra potenziali potenziatori e il promotore cardiaco TBX5 . Seguendo il protocollo qui descritto, è stato confermato che 21 delle 22 regioni genomiche interagiscono con il promotore TBX5 (chr12: 114400143-114410103) nelle cellule muscolari cardiache (File supplementare 4). C'era una regione che non aveva alcuna interazione fisica con il promotore (Figura 4, passaggio 4.8). Infine, abbiamo confrontato questo protocollo con questi enhancer biologicamente convalidati e l'attuale database gold standard di enhancer cardiaci, VISTA Cardiac Enhancers Browser, e abbiamo rivelato ulteriori enhancer non attualmente catturati dal database²⁵.

Abbiamo eseguito un confronto incrociato dei 21 enhancer TBX5 recuperati dal protocollo qui presentato con i database esistenti. Abbiamo recuperato 4 enhancer TBX5 da VISTA Cardiac Enhancer Browser (File supplementare 5)²⁵. Dei 4 potenziatori cardiaci identificati da VISTA, 3 potenziatori, hs2329, mm1282 e m370 si sovrapponevano alle regioni identificate da questo protocollo di rilevamento degli enhancer basato sul web (Figura 5). Ciascuno degli enhancer previsti condivideva anche le regioni genomiche con gli enhancer precedentemente validati sperimentalmente da Smemo et ^al.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) e Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38), mentre non mostravano sovrapposizioni con l'Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38). Uno degli enhancer identificati da VISTA, hs498 non si sovrapponeva ad alcun enhancer previsto da questo protocollo o dagli enhancer²³ convalidati sperimentalmente da Smemo et al. (Figura 5), anche se la regione mostrava una parziale sovrapposizione con i marcatori H34Kme1 (Figura 5). Allo stesso modo, l'enhancer 9 non si sovrapponeva agli enhancer previsti da questa pipeline, ma era associato ai marcatori H3K4me1 (Figura 5).

Figura 1: Guida passo passo per individuare il GoI nel browser del genoma EnsEMBL. L'utente apre prima la homepage di EnsEMBL (1.1), seleziona la specie (Umano) e inserisce il gene nella barra di ricerca (1.2-1.3). Dall'elenco dei risultati, viene selezionato l'ID del gene appropriato (1.4), che apre la pagina di riepilogo del gene. L'utente fa quindi clic sul collegamento ipertestuale Region in Detail (1.5) per visualizzare la regione genomica che circonda il GoI, inclusi gli elementi adiacenti e le caratteristiche regolatorie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Definizione della regione di rilevamento dell'enhancer intorno al GoI utilizzando il browser genomico EnsEMBL. Per definire la regione di rilevamento dell'enhancer, identificare i due geni vicini che fiancheggiano il GoI utilizzando le annotazioni geniche di base del percorso GENCODE , in cui i geni sono mostrati come blocchi giallo scuro etichettati con annotazioni EnsEMBL/Havana unite. La direzione trascrizionale di ciascun gene è indicata da punte di freccia (< o >) accanto al nome del gene (2.1). Per selezionare la regione intergenica tra i geni vicini, fare clic e trascinare sulla regione di interesse, quindi scegliere Salta alla regione nella finestra pop-up per ingrandire (2.2). Per aggiungere annotazioni relative alle normative o ai potenziatori, fare clic su Aggiungi/rimuovi tracce (2.3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Configurazione delle tracce di modifica degli istoni nella regione di rilevamento dell'enhancer utilizzando il browser genomico EnsEMBL. Nella barra degli strumenti a sinistra, fare clic su Configura questa pagina (3.1) per accedere al pannello di configurazione della traccia e passare a "Attività per cellula/tessuto" nella sezione Regolazione (3.2). Nella scheda che si apre, seleziona la sezione "Esperimenti" (3.3) e utilizza la barra di ricerca Cellula/Tessuto per individuare e selezionare il tessuto di interesse (cellula del muscolo cardiaco) (3.4). Nel pannello dei segni istonici (3.5), abilitare H3K4me1 e H3K27ac come segni di potenziamento attivi e H3K4me3 come segno promotore, quindi fare clic su "Configura visualizzazione traccia" (3.6). Dopo aver confermato le selezioni delle tracce, fare clic su "Visualizza tracce" (3.7) per tornare al visualizzatore del genoma. I picchi degli istoni sono ora mostrati nella regione di rilevamento (3.8) come blocchi colorati sotto l'etichetta del tessuto corrispondente (giallo: H3K4me1, blu: H3K27ac e arancione: H3K4me3). Pop-up "Hists & Pols" contenente le coordinate genomiche della regione in coppie di basi (chr:start-end), che possono essere copiate e salvate per l'analisi a valle. Un pop-up "Hists & Pols" appare dopo aver cliccato sugli elementi colorati nel brano. Il pop-up contiene le coordinate genomiche della regione in coppie di basi (ad esempio, chr12:11443450-114451611 per la regione del promotore), che possono essere copiate e salvate per l'analisi a valle (3.8). Allo stesso modo, per estrarre i potenziatori candidati, dare priorità alle regioni in cui i picchi di H3K4me1 e H3K27ac si sovrappongono, come mostrato dall'allineamento verticale dei picchi e delle caselle tra le tracce (3.9). Le regioni sovrapposte possono essere selezionate direttamente facendo clic sulle relative caselle o facendo clic e trascinando manualmente sui picchi allineati per definire una regione (ad esempio, chr12:114400143-114410103 per una regione candidata attiva). Le coordinate mostrate nel pop-up devono essere salvate in formato BED per la convalida o la visualizzazione a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Visualizzazione delle interazioni tra promotore e potenziatore della cromatina utilizzando le mappe di calore Hi-C dal 4D Nucleome Data Portal. La homepage del 4D Nucleome Data Portal mostra un grafico a barre impilate che riassume i tipi di esperimenti disponibili per organismo. Il set di dati "Hi-C in situ " per campioni umani viene selezionato facendo clic sulla sezione corrispondente della barra (4.1). Viene visualizzato un elenco filtrato di set di dati pertinenti; è stato selezionato un dataset Hi-C derivato da cellule H9 differenziate in mioblasti cardiaci (4.2). Il set di dati selezionato (4.3) viene aperto nel browser HiGlass tramite il pulsante Esplora dati (4.4). La regione genomica di interesse viene inserita nella casella delle coordinate (4.5) e la matrice di contatto viene visualizzata come una mappa di calore in scala di colori. I colori più scuri (dal rosso intenso al nero) indicano una frequenza di contatto della cromatina più forte, mentre i colori più chiari (dal bianco all'arancione) rappresentano interazioni più deboli. Una regola orizzontale è posta alla coordinata del promotore e le regole verticali sono disegnate nelle posizioni di tre enhancer di controllo validati sperimentalmente (4.6). Queste intersezioni sono utilizzate per definire una soglia di interazione rigorosa, impostata dal segnale visibile più forte (colore più scuro) tra i contatti promotore-potenziatore (4.7). Ulteriori regole verticali sono disegnate nelle posizioni dei candidati enhancer marcati H3K27ac e H3K4me1 (dal passaggio 3.8). I candidati le cui intersezioni promotore-potenziatore sono uguali o più scure della soglia vengono mantenuti, mentre quelli con segnali più deboli (quadrati di colore più chiaro) sono esclusi (4.8). Le coordinate conservate vengono estratte manualmente e salvate in formato BED per le analisi a valle. (a. Enhancer 2, b. Enhancer 9 e c. Enhancer 16) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Vista del browser genomico degli enhancer TBX5 previsti rispetto agli enhancer cardiaci e agli enhancer di controllo convalidati da VISTA. Le istantanee del browser del genoma mostrano l'intervallo di ricerca dell'enhancer (STEP 2) confrontando gli enhancer previsti recuperati dal protocollo basato sul web (in basso) con gli enhancer convalidati da VISTA (in alto) e gli enhancer di controllo convalidati sperimentalmente (al centro). Il pannello principale mostra il locus genomico completo con elementi regolatori annotati, inclusi i picchi H3K4me1 specifici per le cellule muscolari cardiache (giallo), H3K27ac (blu) e H3K4me3 (arancione). Tre figure ingrandite catturano l'allineamento tra il recuperato dal protocollo, VISTA e i potenziatori di controllo. La sovrapposizione con i potenziatori di controllo è delineata da riquadri rossi. Le coordinate per ogni sottoregione vengono visualizzate nei pannelli inferiori del browser. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Dati utilizzati nello studio. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Strumenti basati sul Web utilizzati nello studio. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: Istruzioni per la risoluzione dei problemi per EnsEMBL Genome Browser. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Un file BED in formato GRCh38, i potenziatori del controllo cardiaco TBX5 convalidati sperimentalmente ²³. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Un file BED in formato GRCh38, potenziatori cardiaci TBX5 recuperato da STEP3 da EnsEMBL. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: Un file BED in formato GRCh38, potenziatori cardiaci TBX5 recuperato da STEP4 da EnsEMBL. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 5: Un file BED in formato GRCh38, potenziatori cardiaci TBX5 recuperati dal browser VISTA 25. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Il protocollo basato sul Web qui descritto funziona come un flusso di lavoro per il recupero dell'enhancer, piuttosto che come previsione dell'enhancer. Sfruttando i set di dati tessuto-specifici disponibili pubblicamente, le modifiche istoniche (H3K4me1 e H3K27ac) e i dati di interazione Hi-C, si restringe il campo dei potenziali potenziatori associati al GoI. A differenza degli strumenti di previsione computazionale che dipendono dall'apprendimento automatico o da modelli basati su sequenze, il nostro approccio si concentra sul recupero di potenziatori solo sulla base di dati sperimentali. Le istruzioni per la risoluzione dei problemi per il browser del genoma EnsEMBL sono fornite nel file supplementare 1.

Questo flusso di lavoro integra elementi chiave come i marcatori istonici e i dati di interazione con la cromatina, in modo simile a metodi avanzati come ChIA-PET e PLAC-seq, che mappano le interazioni enhancer-promoter con maggiore precisione^10,11. Tuttavia, questo metodo è vantaggioso quando le tecniche sperimentali ad alta risoluzione non sono fattibili, poiché il protocollo richiede meno risorse e consente di risparmiare molto tempo.

Il limite principale dell'approccio sopra presentato è la sua dipendenza dalla disponibilità e dalla qualità dei set di dati esistenti, che può influenzare la precisione delle interazioni recuperate. Lo studio dell'attività dell'enhancer durante lo sviluppo cardiaco nel contesto delle mutazioni genetiche associate a TBX5 richiede una risoluzione tessuto-specifica. Per tale analisi, il tessuto cardiaco embrionale sarebbe il più appropriato data la sua rilevanza per la regolazione dello sviluppo. Tuttavia, nessun set di dati embrionali che includeva i dati sulle modificazioni istoniche erano disponibili al pubblico al momento dell'analisi. Per tenere conto di ciò, l'integrazione di risorse alternative come ENCODE, Enhancer Atlas 2.0 o EnhancerFinder può espandere l'utilità della pipeline fornendo set di dati aggiuntivi per l'identificazione e la convalida dei potenziatori^18,19.

Nel TBX5 REPFIX, l'analisi basata su H3K4me1 ha rivelato 22 potenziatori putativi come punto di partenza per ulteriori indagini. La successiva analisi Hi-C ha mostrato che 21 dei 22 candidati enhancer basati su precedenti segni di modifica degli istoni hanno interagito con il promotore TBX5 nelle cellule muscolari cardiache (Figura 5). Ciò supporta l'affidabilità dell'approccio basato sui segni di modifica degli istoni nella previsione delle regioni di interesse.

Abbiamo scelto di non dare priorità alla conservazione delle sequenze tra le specie in questo protocollo, sebbene sia un criterio comune per identificare gli enhancer. Poiché in precedenza si è dimostrato meno efficace per i potenziatori tissutali o specie-specifici, molti dei quali non sono fortemente conservati durante l'evoluzione²⁶. Detto questo, abbiamo scelto di concentrarci su marcatori basati sulla cromatina che sono più direttamente indicativi dell'attività del potenziatore funzionale. Tuttavia, la conservazione della sequenza può ancora avere valore in contesti specifici, come lo studio di potenziatori con significato evolutivo. In questo caso, potrebbe essere aggiunto come passaggio facoltativo per gli utenti interessati agli elementi normativi conservati.

Il protocollo si è dimostrato efficace nel recupero di 21 enhancer specifici per il gene TBX5 dal sito web EnsEMBL, che in precedenza aveva eluso l'identificazione da parte di una piattaforma esistente, VISTA Cardiac Enhancers Browser. Sebbene il protocollo qui descritto non sia stato in grado di recuperare uno degli enhancer, hs498, suggerendo la possibilità di una limitazione nel rilevamento, l'approccio ha scoperto alcuni enhancer non rilevati dal VISTA Cardiac Enhancers Browser. Tuttavia, è necessaria un'ulteriore convalida degli enhancer recuperati, poiché il protocollo produce un numero maggiore di regioni putative rispetto ai database VISTA curati. Questo conteggio più elevato aumenta il rischio di falsi positivi e un numero maggiore di enhancer previsti non indica necessariamente un miglioramento della specificità o della rilevanza funzionale. L'incorporazione di ulteriori set di dati sperimentali o saggi funzionali come l'analisi dell'espressione genica, la perturbazione CRISPR o i saggi reporter sarà fondamentale per confermare la validità biologica di questi candidati, come eseguito in Smemoet al.' Studio²³.

Il confronto incrociato con tre enhancer convalidati sperimentalmente ha mostrato una parziale sovrapposizione con le regioni previste (Figura 5). L'enhancer previsto "e1" era posizionato in modo più ampio rispetto all'enhancer 2 convalidato, mentre "e18" ha mostrato una parziale sovrapposizione con l'enhancer 16 (Figura 5). Questi risultati suggeriscono che questo approccio identifica con successo le regioni con attività regolatoria nota, sebbene l'intervallo più ampio degli enhancer previsti possa riflettere la flessibilità nei confini degli enhancer. Gli enhancer spesso funzionano come elementi modulari e la loro attività può dipendere dal contesto della cromatina, dal tipo di cellula e dai tempi di sviluppo ^2,27. Pertanto, le regioni previste possono includere i siti attivi principali con sequenze adiacenti che contribuiscono alla funzione regolatoria, nonostante la necessità di una convalida sperimentale per determinare quali porzioni di queste previsioni più ampie sono funzionalmente attive in un contesto tessuto-specifico o di sviluppo. Mentre VISTA Cardiac Enhancer Browser ha identificato quattro regioni all'interno dell'intervallo definito, solo un enhancer, mm370, si sovrapponeva parzialmente a un enhancer convalidato sperimentalmente, Enhancer 16, in particolare nella regione contrassegnata da H3K4me1 (Figura 5)²³. La porzione rimanente di mm370, che non si sovrappone all'enhancer 16, può indicare una sottoregione non funzionale o inattiva dell'enhancer^28,29.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Postazione di lavoro del computer	N/A	N/A	Computer compatibile con browser Web, sistema operativo Windows/Mac/Linux
Portale dati 4DN	Portale dati 4DN	https://data.4dnucleome.org/
Galassia	Galassia	https://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445
Github	Github	https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow
VISTA	VISTA Cardiac Enhancer Browser	https://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/