Articolo metodologico

Valutazione dei tratti strutturali in Triticum aestivum e Zea mays per la differenziazione fotosintetica C3 e C4 utilizzando sezioni a mano libera e semisottili

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DOI:

10.3791/66843

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12 luglio 2024

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1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

In questo articolo

Sommario

La valutazione delle differenze anatomiche tra le sezioni trasversali delle foglie C3 e C4 aiuta a comprendere l'efficienza della fotosintesi. Questo articolo descrive la preparazione e l'esame delle sezioni trasversali delle foglie a mano libera e semisottili, insieme alle avvertenze nella preparazione per le specie di colture Triticum aestivum e Zea mays.

Abstract

La maggiore efficienza della fotosintesi del C4 , rispetto al meccanismo del C3 , deriva dalla sua capacità di concentrare il CO2 nelle cellule della guaina del fascio. L'efficacia della fotosintesi del C4 e l'efficienza intrinseca nell'uso dell'acqua sono direttamente collegate alla quota di cellule fogliari del mesofillo e del fascio, alle dimensioni e alla densità delle guaine dei fasci e alle dimensioni, alla densità e allo spessore della parete cellulare delle cellule della guaina del fascio. L'analisi microscopica rapida di questi caratteri può essere eseguita su sezioni a mano libera e semi-sottili utilizzando la microscopia ottica convenzionale, fornendo preziose informazioni sull'efficienza fotosintetica nelle colture C4 mediante l'identificazione e l'esame di specifici tipi di cellule. Inoltre, vengono mostrati gli errori nella preparazione di sezioni a mano libera e semisottili che influiscono sulle misurazioni anatomiche e sulle diagnosi del tipo di cellula, nonché come evitare questi errori. Questo approccio microscopico offre un mezzo efficiente per raccogliere informazioni sull'acclimatazione fotosintetica alle variazioni ambientali e aiuta nella rapida selezione delle colture per i climi futuri.

Introduzione

La fotosintesi è un processo fondamentale in cui l'energia luminosa viene convertita in energia chimica, fungendo da pietra angolare delle reti trofiche terrestri. La maggior parte delle piante segue la via della fotosintesi C3, in cui il prodotto fotosintetico primario è il composto a tre atomi di carbonio glicerato 3-fosfato. La fotosintesi del C3 si è evoluta oltre 2 miliardi di anni fa nell'atmosfera ricca di CO2 e povera di O21. L'enzima fotosintetico chiave ribulosio 1,5 bisfosfato carbossilasi/ossigenasi (Rubisco), che si è evoluto in queste condizioni, non è ottimale per le attuali condizioni di basso CO2 e alto O2 in quanto reagisce in modo competitivo con O2, avviando la fotorespirazione2. La fotorespirazione è un percorso dispendioso che consuma energia invece di produrla e rilasciare CO2 come sottoprodotto. Di conseguenza, è fondamentale mantenere un'elevata concentrazione di CO2 intorno a Rubisco nei cloroplasti per prevenire l'ossigenazione 3,4. A causa dell'incapacità delle piante di C3 di concentrare la CO2, si verifica un significativo abbassamento di CO2 dall'aria ambiente ai cloroplasti, frenando la fotosintesi e influenzando la crescita delle piante e la produzione di biomassa 2,5,6.

Nelle piante C3, la fotosintesi è limitata dall'ingresso di CO2 attraverso gli stomi, dalla sua diffusione attraverso il mesofillo e dall'attività biochimica degli enzimi fotosintetici. L'ingresso di CO2 è inizialmente limitato dalla conduttanza stomatica, che è controllata dalle condizioni ambientali come la temperatura e l'umidità dell'aria. Quindi la CO2 si diffonde attraverso la fase gassosa e liquida interna della foglia a Rubisco7. Nelle piante C3, tutte le fasi della fotosintesi si verificano nei cloroplasti delle cellule mesofille e le piante devono mantenere un afflusso costante di CO2 dall'atmosfera ai cloroplasti. La dipendenza della disponibilità di CO2 nei cloroplasti dall'apertura stomatica, dall'architettura del mesofillo e dalle caratteristiche delle singole cellule e dei cloroplasti lascia le piante suscettibili ai vincoli ambientali che alla fine influenzano la fotosintesi, come la bassa disponibilità di acqua e le alte temperature 7,8,9,10, evidenziando in particolare la loro vulnerabilità alle condizioni di cambiamento climatico11.

Date le sfide poste dalle inefficienze della via del C3, nonché le limitazioni nel mantenere livelli ottimali di CO2 e la suscettibilità ai fattori ambientali, in alcune piante si è evoluta un'altra via, la via della fotosintesi del C4. Tipicamente, le piante C4 hanno due percorsi biochimici spazialmente separati; la fissazione iniziale della CO2 avviene nelle cellule del mesofillo da parte della fosfoenolpiruvato carbossilasi, che ha una maggiore affinità per la CO2 rispetto al Rubisco e manca anche di attività di ossigenazione. Il prodotto C4 formato viene ulteriormente trasportato alle cellule della guaina del fascio, dove viene decarbossilato, e la CO2 viene nuovamente rilasciata e fissata da Rubisco (fotosintesi C3)12,13,14. La maggiore affinità della PEP carbossilasi con la CO2 e le spesse pareti cellulari delle cellule della guaina del fascio consentono la concentrazione di CO2 nelle cellule della guaina del fascio e, quindi, le piante di C4 riducono al minimo la fotorespirazione segregando spazialmente la fissazione della CO2 e il ciclo di Calvin. L'adozione del percorso C4 mette in evidenza la risposta adattativa della natura ai vincoli ambientali, offrendo approfondimenti sulle potenziali strategie per migliorare la produttività e la resilienza delle colture in condizioni climatiche mutevoli15.

L'anatomia specializzata della struttura fogliare nelle piante C4 è caratterizzata da vene circondate da cellule della guaina del fascio vascolare allargate contenenti cloroplasti e con una disposizione radiale delle cellule del mesofillo in un anello esterno che si modella attorno alle cellule della guaina del fascio. Le cellule del mesofillo si trovano in prossimità delle cellule della guaina del fascio, il che consente un trasporto rapido e continuo dei metaboliti tra i due tipi di cellule. La disposizione di questa cellula è tipica delle piante C4 ed è indicata come anatomia di Kranz16. Nelle specie C3, la specializzazione e la disposizione delle cellule mesofille possono variare, ma le cellule della guaina del fascio sono nettamente più piccole e hanno pochi cloroplasti o nessun cloroplasto. L'anatomia specifica di Kranz consente di concentrare la CO2 nei cloroplasti in cellule della guaina del fascio dove si trova l'enzima C 3-carbossilante Rubisco, ostacolando efficacemente la fotorespirazione 4,17,18. Nonostante la sua disposizione apparentemente complessa, questi cambiamenti si sono verificati indipendentemente più volte nell'evoluzione delle angiosperme, indicando che si tratta di un percorso evolutivo relativamente fattibile 19,20,21, e vari taxa hanno dimostrato di essere in uno stadio intermedio tra il metabolismo del carbonio C3 e C 4, indicato come C3-C 4 o C2, avere capacità di concentrazione e riassimilazione di CO2 22,23,24,25.

Molte piante di C4 sono colture con un'elevata importanza economica e l'ingegneria genetica delle colture C3, come il riso, per migliorare la loro resilienza climatica e garantire la resa è stato un argomento di interesse negli ultimi decenni26,27. Tuttavia, gli sforzi ingegneristici richiedono una comprensione dettagliata dell'anatomia specializzata del C4 e di come controlla la fotosintesi 2,28.

Stabilire l'anatomia del C4 Kranz è un prerequisito per raggiungere l'ambizioso obiettivo di ingegnerizzare la fotosintesi del C4 nelle colture C3 25. Tuttavia, l'attuale comprensione della regolazione dell'anatomia di Kranz e dei metodi per lo screening rapido dei suoi tratti anatomici chiave è limitata, rendendo difficile l'identificazione delle specie ibride. Studi precedenti hanno dimostrato che i tratti chiave che regolano l'efficienza fotosintetica nelle piante C3 e C4 includono la distanza interveinale, il diametro del complesso della guaina del fascio e la dimensione delle celle della guaina del fascio14,29. Questi caratteri possono essere facilmente sottoposti a screening utilizzando sezioni a mano libera e analizzati quantitativamente utilizzando sezioni semisottili. Qui, descriviamo il metodo di valutazione dei tratti che consentono la diagnostica della differenziazione anatomica C3 e C4 attraverso la microscopia incrociata e ottica a mano libera, vale a dire l'area della guaina del fascio, la distanza interveinale e la frequenza delle vene.

Protocollo

1. Condizioni di crescita delle piante

  1. Selezionare il frumento (Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, "Fredis") e il mais (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") come piante rappresentative rispettivamente di C3 e C4 . Coltiva entrambe le specie vegetali in una camera di crescita a temperatura controllata dai semi.
  2. Mantenere l'umidità relativa al 55% con la temperatura dell'aria a 25 °C/18 °C (giorno/notte) con un periodo di luce di 12 ore. Mantenere la densità del flusso di fotoni fotosintetici (Q) sulla superficie della pianta a 1200 μmol/m2/s per rappresentare le loro condizioni di crescita naturali. Coltiva tutte le piante a una concentrazione ambiente di CO2 di 400 μmol/mol.
  3. Innaffia le piante ogni 2giorni con acqua distillata e concima con la soluzione di Hoagland 10 giorni dopo l'emergenza della piantina. Coltiva le piante alle condizioni date per 60 giorni e usa foglie completamente espanse per analisi microscopiche.

2. Preparazione e visione delle sezioni a mano libera

  1. Seleziona 3 foglie mature non senescenti da ogni pianta e tienile in acqua distillata. Utilizzando una nuova lama di rasoio su un lato, eseguire un taglio livellante per formare un angolo retto con la superficie della foglia per garantire che le sezioni siano sezioni trasversali rese perpendicolari alla superficie della foglia.
  2. Posizionare il campione di foglia su una lastra di vetro su un pezzo di cera dentale per stabilizzare il campione ed evitare che scivoli. Tagliare muovendo la lama verso il basso sul campione fogliare per tagliare in modo netto le cellule. Conservare le sezioni trasversali in acqua distillata.
  3. Montare i campioni su un vetrino posizionandoli su una goccia d'acqua e coprendoli con un vetrino coprioggetti per la visualizzazione e l'imaging microscopici. Evitare di intrappolare bolle d'aria.
  4. Visualizzate il vetrino con un microscopio ottico composto con ingrandimento 10x e 20x. Salva le immagini come da guida del software, insieme alla relativa scala.

3. Preparazione di sezioni semisottili

  1. Tagliare sezioni di circa 3 mm x 5 mm dalle aree intercostali lungo la nervatura centrale dalle foglie di Z. mays e T. aestivum su una lastra di vetro come al punto 2.2. Assicurarsi che la lunghezza della sezione tagliata scorra lungo la venatura della foglia.
  2. Mettere il materiale vegetale in una siringa con 1 mL di tampone di fissazione (aldeide glutarica al 4% in tampone fosfato 0,1 M, pH = 6,9, Tabella 1).
  3. Tenere la siringa in verticale, rimuovere l'aria e, tenendo un dito sulla punta, pompare la siringa per creare il vuoto. Ripetere l'operazione fino a quando i campioni si trovano sul fondo della siringa, indicando che l'infiltrazione è riuscita.
  4. Trasferire il contenuto della siringa in un flaconcino di vetro etichettato e conservare a 4 °C per 48 ore prima del passaggio successivo (Tabella 2).
  5. Per ogni flaconcino, rimuovere delicatamente il fissativo con una pipetta e aggiungere il tampone fosfato fino a coprire il campione. Lasciare agire per 30 min. Ripeti questo passaggio 3 volte.
  6. Rimuovere il tampone fosfato con una pipetta e aggiungere il tetrossido di osmio (ATTENZIONE) fino a coprire il campione. I campioni e altra materia organica diventeranno neri. Usa i doppi guanti. Lasciare agire per 1 ora.
  7. Rimuovere la soluzione precedente con una pipetta e coprire i campioni con acqua distillata. Lasciare agire per 30 minuti Ripetere questo passaggio 3 volte e utilizzare i guanti doppi.
  8. Rimuovere la soluzione precedente con una pipetta e coprire i campioni con la soluzione di acqua distillata 50/50 ed etanolo. Lasciare agire per 30 min. Ripetere questo passaggio con soluzioni di acqua distillata ed etanolo nelle seguenti serie: 30/70, 20/80, 10/90 e 2x al 100% di etanolo. I campioni in una di queste soluzioni possono essere lasciati per una notte a 4 °C.
  9. Rimuovere la soluzione precedente con una pipetta e coprire i campioni con 1/3 di soluzione di resina-etanolo. Mettere i campioni su una piastra miscelatrice e lasciare agire per 2 ore. Ripetere questo passaggio con soluzioni resina-etanolo nelle seguenti serie: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 e 2x al 100% di resina. I campioni in una di queste soluzioni possono essere lasciati per una notte a 4 °C.
  10. Coprire le cavità di uno stampo da inclusione piatto (16 cavità, dimensioni della cavità: 14 L x 4,8 L x 3 P (mm)) con resina al 100% e posizionare i campioni su un'estremità della cavità. Prepara etichette di carta scritte a matita per ogni campione e posizionale sull'altra estremità della cavità.
  11. Riempi completamente tutte le cavità con resina al 100% e raddrizza i campioni e le etichette se si sono spostati. Coprire lo stampo con pellicola da incasso, e polimerizzare in forno secondo le linee guida del prodotto in resina acrilica.
  12. Posizionare il blocco polimerizzato con il campione nel portacampioni dell'ultramicrotomo. Tagliare il blocco con un coltello da vetro ruvido fino a quando il tessuto diventa visibile e la resina in eccesso viene eliminata.
  13. Tagliare sezioni semisottili trasversalmente (1 μm) utilizzando un coltello da vetro o diamantato. Raccogliere le sezioni utilizzando un anello di inoculazione metallico dalla superficie dell'acqua e posizionarle su un vetrino. Asciugare il vetrino su una piastra calda (60 °C) per fissare le sezioni sul vetro.
  14. Colorare le sezioni fisse con blu di toluidina (soluzione acquosa all'1%) per 5 s prima di risciacquare con acqua distillata e asciugare nuovamente sulla piastra calda.
    NOTA: Assicurarsi che il processo di fissazione chimica venga eseguito sotto una cappa aspirante. I coltelli di vetro devono essere sostituiti periodicamente per garantire tagli netti che consentano sezioni senza strappi o distorsioni.

4. Imaging dei campioni

  1. Imaging di sezioni di foglie fresche
    1. Configurare il microscopio ottico composto con il software in dotazione come da manuale.
    2. Posiziona il vetrino sul tavolino. Regolare l'oculare e visualizzare la sezione a 10x per ottenere una panoramica, quindi a obiettivi 20x e 40x.
    3. Ad ogni obiettivo, naviga nel canale Live, concentrati sull'area di interesse e individua le cellule della guaina del fascio attorno alla vena.
    4. Una volta messo a fuoco, fai clic sul pulsante Blocca e aggiungi la scala premendo il pulsante Barra della scala nella scheda Strumenti. Salvate l'immagine in formato . Formato TIF per l'analisi delle immagini.
  2. Imaging di sezioni infiltrate di resina
    1. Impostare il microscopio ottico automatizzato in combinazione con il software in dotazione sul computer.
    2. Caricare il canale trasparente e posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio. Metti a fuoco la sezione utilizzando un ingrandimento dell'obiettivo 40x e regola la luminosità per assicurarti che tutte le strutture cellulari siano visibili.
    3. Impostare l'area di posizione della sezione utilizzando la funzione navigatore per assicurarsi che l'intera sezione sia riprodotta e fare clic sul pulsante Unisci .
    4. Fare clic su Fine , quindi su Avvia per consentire al microscopio di visualizzare l'intera sezione. Aprire il software di analisi delle immagini e aprire le tessere scattate dal microscopio.
    5. Utilizzando la funzione Allinea, assicurarsi che le tessere non si sovrappongano. Dopo aver generato l'immagine, regolare il posizionamento, la luminosità e la rotazione utilizzando la scheda Regola.
    6. Stampare la scala sull'immagine prima di salvarla in formato . Formato TIF.
  3. Misurazioni anatomiche con il software ImageJ
    1. Aprire il software ImageJ e caricare l'immagine trascinandola nella finestra.
    2. Utilizzando lo strumento Linea, calibrare la scala come segue: Disegna una linea sopra la barra della scala, scegli Analizza > Imposta scala, modifica la distanza nota alla lunghezza della barra della scala e modifica l'unità di lunghezza all'unità corretta.
    3. Misura il tratto potenziale selezionando lo strumento Linea, tracciando una linea attraverso l'area di interesse e premendo il tasto M .
    4. Per le misurazioni dell'area, selezionare lo strumento di selezione poligonale e disegnare intorno al tessuto di interesse. Concludere premendo il tasto M . Le misurazioni vengono visualizzate come una finestra pop-up, che può essere copiata in un foglio di calcolo per un'ulteriore analisi dei dati.

Risultati

La Figura 1A mostra l'orientamento corretto per il sezionamento della foglia sia per il sezionamento fresco che per la microscopia ottica. Il metodo per tagliare sezioni fresche utilizzando un rasoio su un lato e un foglio di cera dentale può essere visto nella Figura 1B. Le sezioni risultanti sono mostrate nella Figura 1C.

La Figura 2 mostra sezioni a mano libera di foglie rappresentative della pianta C3 T. aestivum e della pianta C4 Z. mays. Le cellule della guaina del fascio sono visibili intorno alla vena, con il mais che ha cellule più rotonde e più verdi, indicando una maggiore presenza di cloroplasti. Da queste immagini è possibile ricavare lo spessore fogliare e l'area totale della guaina del fascio; Tuttavia, un'ulteriore caratterizzazione del mesofillo non è possibile con questo metodo.

La Figura 3 mostra sezioni trasversali semisottili di T. aestivum e Z. mays. Con questo metodo, tutti i tessuti della foglia sono visibili e misurabili. L'anatomia di Kranz è evidente in Z. mays, con cellule mesofille disposte attorno alle vene. Le guaine dei fasci sono ingrandite e riempite di cloroplasti, in particolare concentrati verso le cellule del mesofillo. Ciò consente un rapido scambio di metaboliti tra le cellule della guaina del fascio e le cellule del mesofillo. Da queste immagini, sono stati misurati i seguenti tratti strutturali delle foglie: distanza interveinale tra vene piccole e grandi, diametro della guaina del fascio, area totale della guaina del fascio, area delle vene, frazione dell'area delle celle della guaina del fascio, area delle celle della guaina del fascio, frequenza delle vene entro 500 μm e spessore della foglia. I box plot nella Figura 4 mostrano la differenza in tali caratteri tra T. aestivum e Z. mays. Tutti i caratteri tranne uno, la distanza interveinale tra le grandi vene, sono significativamente diversi a un intervallo di confidenza del 95% con un valore p < 0,05.

La Figura 4 mostra una raccolta di grafici a scatola che rappresentano le differenze dei tratti anatomici tra T. aestivum e Z. mays, esemplificando le differenze tra le strutture della guaina del fascio C3 e C4 . C'è una distinzione significativa tra le distanze interveinali tra le specie di colture, il diametro della guaina del fascio (nelle stesse condizioni di crescita), la frazione delle cellule della guaina del fascio e del materiale non fotosintetico (cioè le vene) e la frequenza delle vene in una sezione di 500 μm - tutti fattori che sono fortemente indicativi di ciò che ci si aspetta tra l'anatomia delle foglie C3 e C4 .

La Figura 5 mostra alcuni esempi di errori che possono verificarsi durante il taglio o la preparazione dei campioni. L'anatomia delle foglie in queste immagini è mascherata o deformata e quindi non è affidabile per la caratterizzazione. La sovracolorazione con blu di toluidina può verificarsi in sezioni tagliate con l'ultramicrotomo in cui la colorazione viene lasciata troppo a lungo, oscurando così la struttura cellulare (Figura 5A, B). Errori comuni possono verificarsi durante il protocollo di infiltrazione in cui la resina non penetra completamente nei tessuti fogliari (Figura 5C, D). Le sezioni trasversali delle foglie che vengono tagliate lungo il grano danno luogo a celle oblunghe in cui le cellule del mesofillo e della guaina del fascio non possono essere localizzate né misurate correttamente (Figura 5F, G, H).

Le analisi statistiche sono state condotte in R (versione 4.3.1) per creare boxplot. I caratteri anatomici delle foglie sono stati misurati in triplicato (3 foglie per pianta, 3 piante per specie).

Impostazione cromatografica della sezione fogliare; Estrazione del pigmento verde. Schema dei passaggi per la separazione dei pigmenti.
Figura 1: Metodo corretto per tagliare le sezioni trasversali delle foglie fresche. (A) L'orientamento delle sezioni dell'anta al fine di ottenere una sezione trasversale. (B) Tecnica per sezionare le foglie utilizzando una lama di rasoio su un pezzo di cera dentale piatta. (C) Le sezioni trasversali risultanti appaiono come sottili schegge di foglia pronte per essere montate su un vetrino e visualizzate al microscopio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Microscopia a sezione trasversale della struttura fogliare delle piante, scale da 50μm e 100μm, dettaglio del tessuto vascolare.
Figura 2: Sezioni a mano libera di foglie rappresentative. (A) La pianta C3 Triticum aestivum (ingrandimento 400x); e (B) la pianta C4 Zea mays a (ingrandimento 200x). Il tipo di cellula è indicato da frecce, dove V = vena, BSC = cellula della guaina del fascio e MC = cellula del mesofillo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diagramma di anatomia vegetale che mostra la sezione trasversale del fascio vascolare con etichette per tessuti e strutture.
Figura 3: Sezioni trasversali semisottili. (A) Zea mays e (B) Triticum aestivum per mostrare le differenze nelle guaine dei fasci e nelle posizioni dei cloroplasti nelle specie C4 con anatomia di Kranz (A) e nelle specie C3 senza anatomia di Kranz (B). Abbreviazioni: Tl = spessore fogliare, BS = guaina a fascio, SV = vena piccola, ID = distanza interveinale e LV = vena grande. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Box plot che confrontano T. aestivum e Z. mays utilizzando il T-test; le metriche includono SY-HD, LV-ID e VBA.
Figura 4: Box-plot che mostrano la differenza nei tratti anatomici tra Triticum aestivum e Zea mays. (A) distanza interveinale tra piccole vene, (B) distanza interveinale tra grandi vene, (C) diametro della guaina del fascio, (D) area totale della guaina del fascio, (E) area delle vene, (F) frazione dell'area delle cellule della guaina del fascio, (G) area delle cellule della guaina del fascio, (H) frequenza delle vene entro 500 μm e (I) spessore dell'anta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Immagini microscopiche di sezioni trasversali di tessuti vegetali, evidenziando la struttura cellulare e l'anatomia.
Figura 5: Esempi di errori comuni che potrebbero verificarsi nella lavorazione dei tessuti, indicati da frecce rosse. Sovracolorazione in campioni incorporati in resina acrilica LR White (A) Triticum aestivum e (B) Zea mays; lacerazioni in resina in sezioni incorporate nella resina epossidica di Spurr (C) Ceratozamia robusta e (D) Dioon mejiae; Sezioni a mano libera di T. aestivum che mostrano (E) sezione trasversale e (F) sezione longitudinale; bias nel sezionamento dovuto a tagli obliqui in (G) Annona muricata e (H) Encephalartos villosus. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

SoluzionePreparazioneVolume finale
Base per Buffer 1Sciogliere 7,12 g di Na2HPO4 . 2H2O in 200 mL di acqua distillata200 ml
Base per Buffer 2Sciogliere 7,12 g di NaH2PO4 . 2H2O in 200 ml di acqua distillata200 ml
Soluzione tampone fosfatoMiscelare 36 mL di Base 1, 14 mL di Base 2 e 50 mL di acqua distillata100 ml
Soluzione fissativaMiscelare 9,25 mL di glutaraldeide al 5% (attenzione: vedere la tabella dei materiali), 12,5 mL di tampone fosfato e 28,25 mL di acqua distillata. Conservare a 4 °C.50 ml

Tabella 1: Ricetta per la soluzione fissativa.

PassoDescrizioneDurataRipetere
1Risciacquo con tamponeRimuovere delicatamente il fissativo con una pipetta e aggiungere il tampone fosfato fino a coprire il campione. Lasciare agire per 30 min.30 minuti3 volte
2Colorazione con tetrossido di osmio all'1%(Attenzione: vedere la Tabella dei materiali): Rimuovere il tampone fosfato con una pipetta e aggiungere il tetrossido di osmio fino a coprire il campione. I campioni e altra materia organica diventeranno neri. Usa i doppi guanti.60 minuti1
3Risciacquo dei campioni con acqua distillataRimuovere la soluzione precedente con una pipetta e coprire i campioni con acqua distillata. Lasciare agire per 30 min. Ripeti questo passaggio 3 volte. Usa i doppi guanti.30 minuti3 volte
4Infiltrazione in serie di etanoloRimuovere la soluzione precedente con una pipetta e coprire i campioni con la soluzione di acqua distillata 50/50 ed etanolo. Lasciare agire per 30 min. Ripetere questo passaggio con soluzioni di acqua distillata ed etanolo nelle seguenti serie: 30/70, 20/80, 10/90 ed etanolo al 100%.30 minuti1
5Infiltrazione in serie resina-etanoloRimuovere la soluzione precedente con una pipetta e coprire i campioni con 1/3 di soluzione di resina-etanolo. Mettere i campioni su una piastra miscelatrice e lasciare agire per 2 ore. Ripetere questo passaggio con soluzioni resina-etanolo nelle seguenti serie: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 e 100% resina.120 minuti1
6Conservare in frigo per 72 h prima della polimerizzazione
7Polimerizzare le sezioni di foglia infiltrate secondo le specifiche del prodotto per ottenere campioni incorporati nella resina.

Tabella 2: Protocollo di infiltrazione della resina.

Discussione

In questo articolo, discutiamo i metodi quantitativi e qualitativi per misurare l'anatomia delle foglie e i modi in cui possono essere ottimizzati. Inoltre, la metodologia viene applicata a specie di colture rappresentative in modo da determinare quali tratti anatomici sono più utili per distinguere tra sezioni trasversali C3 e C4 . Comprendere questi tratti è essenziale poiché le specie ibride, denominate fotosintesi C2 , stanno diventando una via di ricerca più promettente. Al momento, è stata identificata solo una specie di coltura, Diplotaxis tenuifolia (rucola), che utilizza la fotosintesi C2 , ma è probabile che ce ne siano più di quanto indicanoi dati attuali. Alti livelli di diversità fotosintetica intraspecifica e plasticità sono presenti all'interno delle linee C2 . Ciò implica che la conferma della presenza della fotosintesi del C2 richiede molteplici linee di evidenza, come il punto di compensazione del CO2 , le analisi ultrastrutturali e l'immunoistochimica30.

Le sezioni a mano libera e semisottili sono state utilizzate per molti anni nell'identificazione e nella misurazione di specifici tessuti vegetali, ma questo articolo mira a discutere il particolare caso d'uso delle strutture fogliari anatomiche che influenzano la differenziazione fotosintetica tra le piante coltivate C3 e C4 . Ci sono avvertimenti sia per il sezionamento a mano libera che per quello semisottile che dovrebbero essere considerati. Le sezioni a mano libera, sebbene facili da ottenere, possono portare a sezioni di foglie con spessori incoerenti, ostacolando le analisi quantitative. Questo può essere evitato utilizzando attrezzature specializzate per il sezionamento di materiale vegetale fresco (ad esempio, vibratomo o criostato). Le sezioni più spesse del sezionamento manuale possono portare a più strati di cellule uno sopra l'altro, offuscando le cellule e, quindi, l'anatomia. Se lo scopo del sezionamento è puramente qualitativo, le sezioni a mano libera offrono il vantaggio del trattamento chimico dei tessuti vegetali (cioè l'istochimica)31. Ciò consente l'indicazione qualitativa della presenza di particolari composti nelle cellule vegetali. Al contrario, le sezioni semisottili si traducono quasi sempre in sezioni costantemente spesse. Tuttavia, i processi sono più lunghi, delicati e quindi soggetti a errori. I problemi che possono sorgere, così come i modi per evitarli, vengono discussi ulteriormente.

Fissaggio
Il materiale fresco deve essere utilizzato sia per le sezioni a mano libera che per quelle semisottili, cioè per le foglie di piante sufficientemente idratate. Le sezioni delle foglie appassite non hanno integrità strutturale poiché le celle hanno una pressione di turgore ridotta. Quando si ottengono sezioni semisottili da materiale incorporato in resina, è fondamentale assicurarsi che le sezioni delle foglie siano fissate sotto vuoto in modo da sostituire l'aria all'interno della foglia. Ciò consente l'integrità strutturale e l'osmosi durante il processo di infiltrazione. Se questo passaggio non viene eseguito correttamente, è probabile che le cellule collassino, portando a sezioni trasversali che non rappresentano accuratamente la struttura reale della foglia e di conseguenza a misurazioni anatomiche errate32.

Al contrario, l'alta pressione del vuoto può danneggiare le foglie con i tessuti molli (come i cotiledoni), con conseguente restringimento delle cellule o distruzione dei campioni. Questo può essere evitato utilizzando un'impostazione appropriata della pompa a vuoto o saltandola del tutto e immergendo semplicemente i campioni nella soluzione fissativa. Se si preferisce quest'ultimo, i campioni possono essere tagliati da tutti i lati, in modo da facilitare l'infiltrazione del fissativo nel tessuto.

Pre-infiltrazione
Lo spessore della parete cellulare e il tessuto sclereide sono i tratti anatomici più influenti per la permeazione delle soluzioni che consentono una fissazione e un'infiltrazione ottimali del campione. Lo scopo degli sclereidi nei tessuti vegetali è il supporto meccanico e la protezione, che possono influire sul processo di infiltrazione33. Poiché questi tessuti hanno pareti cellulari lignificate altamente ispessite, la permeazione delle soluzioni può essere ostacolata. I campioni che presentano problemi di infiltrazione provocano sezioni semisottili con celle rotte e lacerazioni nella resina (Figura 5C, D). Il sezionamento longitudinale provoca cellule distorte, causando distorsioni nelle analisi anatomiche e nella misurazione dei tratti fogliari come le dimensioni e la densità delle cellule (Figura 5F-H).

Infiltrazione di resina
Il sezionamento di qualità è fondamentale per l'osservazione dei tessuti anatomici, che sono direttamente influenzati dal mezzo in cui è incorporato il campione. I mezzi di inclusione più comuni utilizzati nell'istologia vegetale sono la cera di paraffina, la resina epossidica e le resine acriliche34,35. L'inclusione in cera richiede la preparazione di campioni mediante fissativo chimico e l'infiltrazione con cera liquida, che viene indurita a temperatura ambiente. Questi tagli si traducono in genere in sezioni di 5-10 μm di spessore, che, come dimostrato qui, possono essere ottenute altrettanto bene a mano (Figura 2) e richiedono solo tessuto fresco non fissato. In questo caso, la disposizione delle cellule attorno alla guaina del fascio è fondamentale per distinguere tra piante C3 e C4, il che richiede l'uso di un mezzo di inclusione più robusto e rigido. In questo studio la resina epossidica (Spurr's resin36) e la resina acrilica (LR White) sono state testate sia per la durezza, la longevità, l'infiltrazione del campione che la durata del sezionamento. La resina epossidica è stata utilizzata per l'incorporazione di materiale biologico per decenni37. Le resine acriliche sono relativamente nuove e sono state inizialmente prese in considerazione per l'inclusione di esemplari di piante grazie alla loro resilienza nel tempo poiché, a differenza delle resine epossidiche, non scoloriscono a causa dell'esposizione ai raggi UV e sono meno soggette a restringimento38. La resina acrilica bianca LR (grado duro) è stata selezionata per la sua atossicità e la sua formula stabile ai raggi UV. Le resine acriliche tendono ad essere considerevolmente meno viscose delle resine epossidiche, il che consente un'infiltrazione più rapida del campione, e la durezza del materiale consente un taglio più pulito con un microtomo39. La Figura 5C,D mostra i risultati della resina epossidica in esemplari di foglie con una grande quantità di tessuto strutturale, dove le lacerazioni sono inevitabili a causa della morbidezza della resina epossidica, rispetto alla resina acrilica (Figura 3).

Ultramicrotomia
La rimozione della resina in eccesso può creare crepe nella resina che penetrano nel campione. Per evitare ciò, è fondamentale considerare la densità e la fragilità della resina scelta per l'inclusione. Tagliando più in profondità nella sezione si dovrebbero evitare artefatti causati dal taglio a mano o dal taglio ruvido del coltello. Il campione deve essere allineato perpendicolarmente al portacampione e convalidato aumentando l'ingrandimento attraverso l'oculare, oltre a visualizzare una sezione fissa e colorata. Le cellule vegetali non tagliate ad angolo retto appaiono come cellule affusolate per cui un'estremità è più grande delle altre40.

Post-colorazione
Il blu di toluidina (1% in soluzione acquosa) è stato utilizzato per colorare sezioni semisottili tagliate sull'ultramicrotomo. Se la macchia viene lasciata asciugare sulla sezione troppo a lungo, si verifica una colorazione eccessiva, causando una sovrasaturazione della sezione durante l'imaging (Figura 5A). Quando la macchia non viene filtrata bene, le particelle non disciolte si seccano sulla sezione, ostacolando la visualizzazione delle strutture anatomiche (Figura 5B). Questo problema può essere evitato utilizzando un filtro fine quando si prepara la soluzione di blu di toluidina e limitando l'esposizione della sezione alla macchia. I campioni vengono essiccati su una piastra calda a 60 °C prima della colorazione per garantire che la sezione aderisca al vetrino del microscopio, ma non devono essere esposti per più di 10 secondi al blu di toluidina prima di essere risciacquati e asciugati nuovamente41.

Considerazioni sulle misure anatomiche
Le misure mostrate in questo articolo sono solo un esempio dei molti tratti anatomici che possono essere valutati quantitativamente utilizzando sezioni semi-sottili, tra cui una frazione dello spazio aereo intercellulare, lo spessore medio del mesofillo (senza tessuto vascolare) e l'area della superficie del mesofillo esposta agli spazi aerei intercellulari per unità di area fogliare42. Tuttavia, mentre la dimensione delle cellule della guaina del fascio è un indicatore importante per differenziare tra il metabolismo del C3 e del C4, lo spessore della parete cellulare della guaina del fascio è un altro tratto importante che non può essere visualizzato sulla base della sola microscopia ottica, poiché determina il grado di permeabilità delle cellule della guaina del fascio, cioè la quantità di CO2 che si diffonde nelle cellule del mesofillo42, 43. L'elevata perdita riduce l'efficienza fotosintetica, poiché una grande frazione dell'energia utilizzata per la fissazione della CO2 da parte della PEP carbossilasi viene persa 44,45,46. Per tali analisi ultrastrutturali, sono necessarie la microscopia elettronica a trasmissione e l'analisi delle immagini. Sebbene per il presente studio sia stata presa in considerazione solo la microscopia ottica, il protocollo include il trattamento con tetrossido di osmio, un agente di contrasto e fissante che è una pietra miliare per la microscopia TEM. I campioni polimerizzati possono quindi essere ancora utilizzati per l'analisi TEM ogni volta che se ne presenta la necessità, anche se non considerata al momento della preparazione.

Sebbene la diagnosi anatomica possa facilmente rilevare strutture simili a Kranz, la presenza di C4 può essere ulteriormente diagnosticata mediante misurazioni di scambio gassoso che possono mostrare la fisiologia tipica del C4, cioè un basso punto di compensazione di CO2, una limitata inibizione di O2 della fotosintesi e una diversa composizione isotopica del carbonio 2,4,47.

Va anche notato che l'anatomia di Kranz non è necessaria per lo sviluppo della fotosintesi del C4, come dimostrato dalla scoperta di piante C4 unicellulari 48,49,50. L'analisi anatomica da sola potrebbe, quindi, non essere sufficiente per rilevare la fisiologia del C4 in taxa meno studiati. L'abbinamento della caratterizzazione anatomica con l'analisi fisiologica offre potenti strumenti per studiare i caratteri fogliari e la loro relazione struttura-funzione sia nelle colture che nelle piante selvatiche.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono il Programma H2020 dell'Unione Europea (progetto GAIN4CROPS, GA n. 862087). Il Centro di Eccellenza AgroCropFuture Agroecology and new crops in future climates è finanziato dal Ministero dell'Istruzione e della Ricerca dell'Estonia. Desideriamo ringraziare il professor Evelin Loit-Harro per aver fornito i semi di T. aestivum e Z. mays, Paula Palmet e Vaiko Vainola per la loro assistenza nella preparazione delle sezioni trasversali delle foglie, e João Paulo de Silva Souza per l'assistenza nell'analisi. Tutte le immagini sono state ottenute dall'unità di microscopia dell'Università estone di scienze della vita nell'ambito di vari progetti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Idrogeno fosfato disodico diidrato (Na2HPO42H2O) puroPENTA, CZ10028-24-7
Pellicola da incasso, 7,8 mil di spessore, 8 x 12,5, (203 x 318 mm)ACLAR, US10501-10
Etanolo, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000Pericolo: Liquido e vapori altamente infiammabili.
EVOS Invitrogen FL Auto 2 Sistema di imagingThermo Fisher Scientific, US
Stampo piatto in PTFE per inclusione con telaio in metallo, 16 cavitàPELCO, US10501
Fiala di vetro 2 mlVWR Life Science, US548-0045
Soluzione di glutaraldeide al 50%VWR Life Science, US23H2856331Pericolo: Fatale se inalato. Tossico se ingerito. Provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Può causare irritazione delle vie respiratorie. Indossare guanti, indumenti protettivi, protezione per gli occhi e il viso.
Coltello diamantato HistoDiatome, US
LEICA EM UC7Leica Vienna, AT
LR Resina bianca di grado duroMicroscopia elettronica Sciences, US14383Pericolo: provoca irritazione della pelle. Provoca grave irritazione oculare Può causare irritazione respiratoria. Può causare sonnolenza o vertigini Indossare guanti, indumenti protettivi, protezione per gli occhi e il viso.
Vetrini per microscopioNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 e Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Osmium Tetroxide (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019Pericolo: Fatale se ingerito, a contatto con la pelle o se inalato. Provoca gravi ustioni cutanee e lesioni agli occhi Indossare doppi guanti, indumenti protettivi, protezione per gli occhi e il viso.
Pipette e puntali per pipetteThermo Scientific, FIKJ16047
Sodio diidrogeno fosfato diidrato (NaH2PO4 . 2H2O) puroPENTA, CZ13472-35-0
Siringa 10 mlEcoject, DE20010
Blu di toluidina, grado per uso generaleFisher Scientific, GB2045836

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