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Articolo metodologico

Metodo basato sull'estrazione di Apoplast per migliorare la purezza delle proteine ricombinanti prodotte dalle piante

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DOI:

10.3791/66852

⸱

5 luglio 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Academy of Medical Sciences, Shandong First Medical University, 2State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 3College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, 4Beijing Life Science Academy

In questo articolo

Sommario

La purificazione delle proteine ricombinanti dai sistemi vegetali è solitamente messa alla prova dalle proteine vegetali. Questo lavoro fornisce un metodo per estrarre e purificare efficacemente una proteina ricombinante secreta dall'apoplasto di Nicotiana benthamiana.

Abstract

Le piante sono un sistema di espressione eucariotica in via di sviluppo che viene esplorato per produrre proteine terapeutiche. La purificazione delle proteine ricombinanti dalle piante è una delle fasi più critiche del processo di produzione. In genere, le proteine sono state purificate da proteine solubili totali (TSP) e la presenza di varie proteine intracellulari e citocromi pone sfide per le successive fasi di purificazione delle proteine. Inoltre, la maggior parte delle proteine terapeutiche come antigeni e anticorpi vengono secrete per ottenere una corretta glicosilazione e la presenza di proteine non completamente modificate porta a strutture incoerenti di antigeni o anticorpi. Questo lavoro introduce un metodo più efficace per ottenere proteine ricombinanti altamente purificate dallo spazio apoplastico delle piante. La proteina fluorescente verde ricombinante (GFP) è ingegnerizzata per essere secreta nell'apoplasto di Nicotiana benthamiana e viene quindi estratta utilizzando un metodo di infiltrazione-centrifugazione. La GFP-His dell'apoplasto estratto viene quindi purificata mediante cromatografia di affinità con nichel. A differenza dei metodi tradizionali del TSP, la purificazione dall'apoplast produce proteine ricombinanti altamente purificate. Questo rappresenta un importante miglioramento tecnologico per i sistemi di produzione degli impianti.

Introduzione

Al giorno d'oggi, sono in fase di studio varie proteine terapeutiche ricombinanti prodotte dalle piante, tra cui anticorpi, vaccini, proteine bioattive, enzimi e piccoli polipeptidi 1,2,3,4,5,6. Le piante stanno diventando una piattaforma sempre più utilizzata per la produzione di proteine terapeutiche grazie alla loro sicurezza, al basso costo e alla capacità di scalare rapidamente la produzione 7,8. L'espressione e la modificazione delle proteine nei sistemi vegetali, insieme alla purificazione delle proteine, sono fattori critici che determinano la produttività dei bioreattori delle piante 9,10. Migliorare la produttività delle piante e ottenere proteine target di elevata purezza sono le sfide principali che i sistemi di produzione a base vegetale devono affrontare11,12.

La localizzazione subcellulare e la modifica delle proteine ricombinanti dipendono dallo specifico peptide segnale codificato all'N-terminale, che indirizza la proteina alla sua destinazione finale nell'organello durante l'espressione genica. Le proteine ricombinanti sono progettate per localizzarsi nell'apoplasto, nel reticolo endoplasmatico (ER), nel cloroplasto, nel vacuolo o nel citoplasma, in base alle loro proprietà uniche13. Per gli antigeni e gli anticorpi, sono preferite le proteine secrete. Prima della secrezione, le proteine progrediscono attraverso l'ER e il Golgi per il corretto ripiegamento e le modifiche post-traduzionali 14,15,16.

Dopo la produzione nelle piante, le proteine ricombinanti devono essere purificate da estratti vegetali. Tipicamente, le proteine vengono purificate da estratti vegetali solubili totali, che contengono abbondanti proteine intracellulari, prodotti mal ripiegati e non modificati e citocromi17. Per rimuovere le impurità, gli estratti vegetali subiscono un frazionamento esteso, tra cui la cromatografia di affinità specifica per ribulosio-1,5-bisfosfato carbossilasi/ossigenasi (RuBisCO), la precipitazione dei fitati, la precipitazione del polietilenglicole e la regolazione della temperatura e del pH18,19. Tali passaggi di rimozione delle impurità sono laboriosi e possono compromettere la qualità delle proteine.

Il compartimento cellulare vegetale oltre la membrana plasmatica è definito come apoplasto, che comprende la parete cellulare, gli spazi intercellulari e lo xilema20. La fase acquosa è comunemente chiamata fluido di lavaggio apoplast (AWF). L'AWF contiene molecole secrete dalle cellule per regolare numerosi progressi biologici come il trasporto, il metabolismo della parete cellulare e le risposte allo stress21,22. A differenza del TSP, i costituenti molecolari dell'AWF sono meno complessi. L'estrazione di proteine ricombinanti da AWF può evitare la contaminazione da proteine intracellulari, prodotti mal ripiegati e residui citoplasmatici. In breve, il lipide di estrazione entra nelle foglie attraverso gli stomi a pressione negativa e l'AWF viene raccolto mediante centrifugazione delicata23. Sebbene l'isolamento dell'AWF sia ampiamente utilizzato per studiare il progresso biologico all'interno dell'apoplasto 24,25,26,27, non è stato sfruttato nei sistemi di produzione a base vegetale.

Migliorare la produttività delle piante e ottenere proteine target ad alta purezza sono sfide centrali per i sistemi di produzione vegetale28. Tipicamente, le proteine vengono purificate da estratti vegetali solubili totali contenenti grandi quantità di proteine intracellulari, prodotti mal ripiegati e non modificati e citocromi29, che richiedono grandi costi per la successiva purificazione30. L'uso di metodi di estrazione delle proteine AWF per l'estrazione di proteine ricombinanti esogene secrete nell'apoplast può migliorare efficacemente l'omogeneità delle proteine ricombinanti e ridurre il costo della purificazione delle proteine. Qui, utilizziamo un peptide segnale PR1a per abilitare la secrezione di proteine esogene nello spazio dell'apoplasto e introduciamo un metodo dettagliato per la purificazione di proteine ricombinanti dall'AWF di N. benthamiana.

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Protocollo

1. Preparazione delle piante di N. benthamiana

  1. Mettere i blocchi di piantina in un vassoio, aggiungere 1 L di acqua e immergere per circa 2 ore fino a completa saturazione.
  2. Cospargere uniformemente i semi di N. benthamiana selvatici sui blocchi della piantina, coprire con un coperchio e germinare per 1 settimana. Coltiva N. benthamiana in serra con fotoperiodo di 18 ore, 24 °C, 45% di umidità relativa e concima ogni 2 settimane.
  3. Una volta che i semi sono germogliati, usa una pinzetta per rimuovere delicatamente una piantina, facendo attenzione a non danneggiare le sue radici. Scava una piccola fossa al centro di un nuovo vassoio, mettici dentro la piantina e copri leggermente le radici con la terra. Coprite con un coperchio e continuate a crescere.
  4. Cresci fino a quando le piantine hanno tre foglie, con il coperchio. Togliete il coperchio quando emerge la 4a fogliavera.
  5. Lasciare che le piante continuino a crescere per altre due settimane prima dell'agroinfiltrazione.

2. Costruzione della GFP-His ricombinante

  1. Eseguire l'ottimizzazione del codone di N. benthamiana e la sintesi di GFP e PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) in base alle sequenze geniche.
  2. Effettuare la doppia digestione del vettore pCAMBIA1300 utilizzando gli enzimi Xba I e Sac I (vedi Tabella dei Materiali).
  3. Eseguire l'amplificazione di PR1a utilizzando primer a monte (TTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGATT
    TGTTCTCTTTTC) e primer a valle (TCCTCG
    CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA
    GTGGG), amplificazione della GFP mediante primer a monte (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGGGTCGACATGGTGAG
    CAAGGGCGAGGA) e primer a valle (GGGGAAATTCGAGCTCAGTGGTGATGGTGGTG
    GTGAGATCTTCCGGACTTGT).
  4. Utilizzando la ricombinazione omologa, clonare PR1a e GFP nel vettore di espressione della pianta pCAMBIA1300. Dopo il trasferimento in E. coli, selezionare i singoli cloni e inviarli all'azienda per il sequenziamento. Il confronto tra i risultati del sequenziamento e il plasmide giusto è il plasmide ricombinante pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, indicato come p35s-PR1a-GFP-His.

3. Produzione di GFP-His in N. benthamiana

  1. Aggiungere 1 μL di plasmide GFP in 50 μL di cellule del recettore dell'Agrobacterium GV3101, mescolare delicatamente e aggiungere alla coppa dell'elettrodo, rimuovere dopo l'elettrocuzione sull'elettroshocker.
  2. Distribuire l'Agrobacterium tumefaciens trasformato su una piastra di terreno solido LB contenente 50 μg/mL di kanamicina (Kan) e 50 μg/mL di rifampicina (Rif). Incubare capovolto a 28 °C per 48 h. Il vettore pCAMBIA1300 è kan-resistente e l'Agrobacterium è resistente al rif; solo l'Agrobacterium corretto può crescere su piastre con kan e rif. I cloni monoclonali erano i trasformanti positivi, denominati A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).
  3. Usa uno stuzzicadenti sterilizzato per prelevare una quantità appropriata di AtGPG e inocularela in 4 ml di LB liquido con Kan e Rif. Coltura a 28 °C, 220-300 giri/min per 24 h.
  4. Sottocoltura dei batteri 1:50 in LB fresco (50 μg/mL Kan, 10 mM 2-(N-Morpholino) acido etansolfonico (MES), 20 μM acetosiringone (AS)) e incubare a 28 °C, 220-300 rpm per 10-12 h.
  5. Raccogliere i batteri mediante centrifugazione a 1500 x g per 10 minuti e risospendere il pellet con 1 mL di MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 100 μM AS).
  6. Misura e regola la densità ottica (OD) di AtGPG a OD600=0,8 utilizzando MMA. Incubare i batteri per altre 2-4 ore a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione batterica con una siringa senza ago, premerla leggermente contro la parte posteriore delle foglie e fare pressione per far penetrare la soluzione nelle foglie. Inietta solo le 3-4 foglie centrali per pianta.
  7. Continua a coltivare N. benthamiana in serra per 3-4 giorni prima di raccogliere le foglie per l'estrazione delle proteine.

4. Osservazione della localizzazione subcellulare della GFP

  1. Dopo 48 h di agroinfiltrazione, selezionare un'anta piana e utilizzare un punzone da 6 mm per bloccare la lama per la punzonatura.
  2. Versare la soluzione di saccarosio al 30% su un vetrino, posizionare il campione di foglia con la parte posteriore rivolta verso l'alto e coprirlo con un vetro di copertura.
  3. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 488 nm e rilevare la fluorescenza verde a 490-550 nm dopo un ingrandimento di 400x. Scatta la prima foto una volta preparata la diapositiva e un'altra 10 minuti dopo.

5. Estrazione della GFP dalla pianta

  1. Estrazione AWF
    1. Raccogliere le foglie fresche intatte di N. benthamiana che esprimono GFP ricombinante a 3 giorni dall'agroinfiltrazione. Trattare delicatamente la foglia e mantenerne l'integrità per evitare l'efflusso di proteine intracellulari. Usa immediatamente le foglie raccolte per il passaggio successivo per evitare la degradazione delle proteine.
    2. Sciacquare la lama della foglia con ddH2O sterilizzato preraffreddato per rimuovere i detriti.
    3. Pesare le foglie fresche e immergere 20 g di foglie (lato abassiale rivolto verso il basso) in 100 mL di tampone fosfato 100 mM pre-raffreddato (PB 100 mM Na2HPO4 e 100 mM NaH2PO4 sono stati configurati separatamente e miscelati a un rapporto di 2,2:1 pH 7,0) in un becher a bocca larga da 200 mL. Coprire le foglie con filato di nylon a maglia fine da 100 maglie (vedi Tabella dei materiali) e una piastra di plastica.
      NOTA: Il pre-raffreddamento impedisce la degradazione delle proteine. I volumi tampone possono essere regolati in base alla scala sperimentale. Assicurati che tutte le foglie siano immerse.
    4. Posizionare il becher in una pompa a vuoto. Applicare il vuoto a 0,8 MPa per 1 minuto, quindi ripristinare rapidamente la pressione atmosferica.
    5. Rimuovere le foglie dal tampone e asciugare delicatamente con carta assorbente. Arrotolare le foglie, avvolgerle con il filo a rete e mettere 5 g di foglie in ogni provetta da centrifuga da 50 ml. Per raccogliere l'AWF, posizionare le foglie arrotolate con la punta rivolta verso l'alto in tubi con filo a rete fissato dai tappi dei tubi.
    6. Centrifugare a 4 °C, 500 x g per 5 min. Rimuovere le foglie e raccogliere l'AWF sul fondo della provetta utilizzando una pipetta. Da ciascuna provetta si possono ottenere circa 5 mL di AWF.
      NOTA: Al fine di ridurre al minimo l'interferenza delle proteine intracellulari e di estrarre la massima quantità di proteine AWF, l'estrazione può essere ripetuta 2x-3x, ma non più di 3x.
  2. Estrazione totale di proteine solubili
    1. Macinare 20 g di foglie in polvere fine in azoto liquido. Aggiungere il tampone di estrazione (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% glicerolo, 1% Triton X-100, 0,034% β-mercaptoetanolo (vedere la Tabella dei materiali)) in rapporto 1: 2.
    2. Agitare l'omogeneizzato in un mixer verticale per 30 minuti a 4 °C. Centrifugare omogeneizzare a 13.000 x g per 15 min a 4 °C.
    3. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e ripetere la centrifugazione per 15 minuti. Trasferire il surnatante chiarificato in un'altra provetta.
    4. Filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 μm (vedi Tabella dei materiali) per ottenere l'estratto proteico solubile totale.

  

6. Purificazione di GFP-His con cromatografia di affinità al nichel (Ni)

NOTA: Eseguire tutti i passaggi a 4 °C.

  1. Aggiungere la resina di Ni sefarosio excel (vedere la tabella dei materiali) a una provetta in un rapporto 1:1000 rispetto al volume dell'estratto proteico del passaggio 5.1.6. Il volume della resina è pari a 1/1000del volume dell'estratto proteico.
  2. Lavare separatamente la resina Ni 3x con un volume di resina 10x di ddH2O e PB (pH 7,0) separatamente e rimuovere il surnatante.
  3. Incubare l'estratto proteico con la resina di Ni per 2 ore per consentire il legame completo. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti per rimuovere le proteine non legate nel surnatante. Lavare 3 volte con 20 volte il volume di resina di PB. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
  4. Eluire GFP-His aggiungendo 10 volte il volume di resina di 250 mM di imidazolo (50 mM di Tris-HCl pH 7,4, 150 mM di NaCl, 10% di glicerolo, 250 mM di imidazolo) e raccogliere il surnatante.

7. Colorazione blu di Coomassie delle proteine

  1. Aggiungere 10 μL di tampone di caricamento SDS 5x a 40 μL di campioni proteici, far bollire per 10 minuti, quindi eseguire su SDS-PAGE al 15% a 110 V per 60 minuti.
  2. Colorare i gel proteici con soluzione di blu di Coomassie (0,1% R-250, 25% isopropanolo, 10% acido acetico glaciale) per 2 ore.
  3. Versare la soluzione e lavare con soluzione decolorante per 2 ore. Osservare il gel; Le proteine sul gel saranno colorate di blu.

8. Western blotting delle proteine

  1. Aggiungere 10 μL di tampone di caricamento SDS 5x a 40 μL di campioni proteici, far bollire per 10 minuti, quindi eseguire su SDS-PAGE al 15% a 110 V per 60 minuti.
  2. Trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa da 0,45 μm a 280 mA. Bloccare la membrana con latte scremato al 5% per 1 ora.
  3. Diluire gli anticorpi anti-His-tag a 1:5000 e incubare la membrana con gli anticorpi per 1 ora. Utilizzare la soluzione salina tris-tamponata e tween 20 (TBST) per lavare la membrana 4 volte per 5 minuti.
  4. Diluire gli anticorpi anti-topo a 1:10000 e incubare la membrana con gli anticorpi per 1 ora. Utilizzare TBST per lavare la membrana 4 volte per 5 minuti.
  5. Mescolare il rivelatore (vedi Tabella dei materiali) nel rapporto di 1:1. Aggiungere 400 μl alla membrana e lasciare agire per 1 minuto. Scatta fotografie dopo 1 minuto di esposizione con un visualizzatore.

9. Saggio della concentrazione proteica

  1. Aggiungere 5 μL di proteine a 1 mL di reagente colorante Bradford 1x e reagire per 5 minuti.
  2. Determinare il valore OD595 dopo l'azzeramento e calcolare la concentrazione proteica dalla curva standard.

10. Quantificazione delle proteine 31

  1. Eseguire il Western blotting di campioni proteici insieme agli standard.
  2. Esegui la quantificazione della GFP in rapporto agli standard utilizzando l'analisi della scala di grigi ImageJ 1.5.0.

  

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Risultati

GFP-His è bersaglio della secrezione nello spazio apoplastico di N. benthamiana
La GFP è stata clonata nel plasmide pCAMBIA1300 con un peptide segnale PR1a N-terminale per la secrezione e un His-tag C-terminale per la purificazione, generando p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). La proteina ricombinante è stata espressa transitoriamente in N. benthamiana e una banda di 30 kDa è stata rilevata mediante western blot utilizzando anticorpi anti-Hi...

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Discussione

L'uso delle piante per produrre proteine terapeutiche si è espanso rapidamente negli ultimi anni 1,2,3,4,5,6. I geni codificanti le proteine vengono clonati in vettori di espressione e trasportati nei tessuti vegetali tramite agroinfiltrazione. Dopo la produzione da parte delle cellule vegetali, le proteine vengono purificate...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è sostenuto dall'Associazione per la promozione dell'innovazione giovanile CAS (2021084) e dal Fondo di sostegno al progetto di distribuzione chiave del piano d'azione triennale dell'Istituto di microbiologia, Accademia cinese delle scienze.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
100 mesh nylon filato a maglia fineGuangzhou Huayu Trading società a responsabilità limitatahy-230724-2Per l'estrazione di proteine AWF
Provette da centrifuga da 50 mlVazymeTCF00150Per centrifuga
ClonExpress II kit di clonazione in un solo passaggioVazymeC112-02Per clone
FastDigest Sac1NEBR3156SPer clone
FastDigest XbaINEBFD0685Per clone
ImageJ 1.5.0//Perl'analisi della scala di grigi
Filtro grandeThermo FisherNESTPer il filtraggio
Microscopia confocale a scansione laserLeica SP8Per la localizzazione subcellulare
Ni sepharose excelCytiva10339806Per la purificazione delle proteine
Proteina prefabbricata più gelYEASEN36246ES10Per SDS-PAGE
Filtro piccoloNalgene1660045Per filtraggio
SuperSignal West Femto Substrato Kit di provaThermo Fisher34076Per western blotting
Triton X-100SCR30188928Per configurare il buffer di estrazione
Tipo pompa per vuoto rotativaZhejiang taizhouqiujing pompaper vuoto società a responsabilità limitata2XZ-2Per l'infiltrazione sottovuoto
Miscelatore verticaleHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing società a responsabilità limitataBE-1200Per la miscelazione
β-mercaptoetanoloSIGMABCBK8223VPer configurare il tampone di estrazione

Riferimenti

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