Questo protocollo fornisce una tecnica per raccogliere e coltivare il ganglio radicale dorsale (DRG) espiantato da ratti Sprague Dawley adulti in un dispositivo multicompartimentale (MC).
Articolo metodologico
Raccolta, inclusione e coltura dei gangli della radice dorsale in dispositivi multicompartimentali per studiare le caratteristiche neuronali periferiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
La caratteristica neuronale periferica più comune del dolore è una soglia di stimolazione abbassata o ipersensibilità dei nervi terminali dai gangli della radice dorsale (DRG). Una delle cause proposte di questa ipersensibilità è associata all'interazione tra le cellule immunitarie nel tessuto periferico e i neuroni. I modelli in vitro hanno fornito conoscenze fondamentali per comprendere come questi meccanismi determinano l'ipersensibilità ai nocicettori. Tuttavia, i modelli in vitro devono affrontare la sfida di tradurre l'efficacia nell'uomo. Per affrontare questa sfida, è stato sviluppato un modello in vitro fisiologicamente e anatomicamente rilevante per la coltura di gangli della radice dorsale intatti (DRG) in tre compartimenti isolati in una piastra a 48 pozzetti. I DRG primari vengono raccolti da ratti Sprague Dawley adulti dopo l'eutanasia umana. Le radici nervose in eccesso vengono tagliate e il DRG viene tagliato in dimensioni appropriate per la coltura. I DRG vengono poi coltivati in idrogel naturali, consentendo una crescita robusta in tutti i compartimenti. Questo sistema multicompartimentale offre un isolamento anatomicamente rilevante dei corpi cellulari DRG dai neuriti, tipi di cellule fisiologicamente rilevanti e proprietà meccaniche per studiare le interazioni tra cellule neurali e immunitarie. Pertanto, questa piattaforma di coltura fornisce uno strumento prezioso per studiare le strategie di isolamento del trattamento, portando in ultima analisi a un migliore approccio di screening per la previsione del dolore.
Introduzione
Il dolore cronico è la principale causa di disabilità e perdita del lavoro a livello globale1. Il dolore cronico colpisce circa il 20% degli adulti a livello globale e impone un onere sociale ed economico significativo2, con costi totali stimati tra i 560 e i 635 miliardi di dollari ogni anno negli Stati Uniti3.
La principale caratteristica periferica esibita dai pazienti con dolore cronico è una soglia di stimolazione dei nervi abbassata, che porta il sistema nervoso ad essere più reattivo agli stimoli 4,5. L'abbassamento della soglia di stimolazione può provocare una risposta dolorosa a uno stimolo precedentemente non doloroso (allodinia) o una risposta aumentata a uno stimolo doloroso (iperalgesia)6. Gli attuali trattamenti per il dolore cronico hanno un'efficacia limitata e i trattamenti che hanno successo nei modelli animali spesso falliscono negli studi sull'uomo a causa delle differenze meccanicistiche nella manifestazione del dolore7. I modelli in vitro in grado di imitare più accuratamente i meccanismi di sensibilizzazione periferica hanno il potenziale per aumentare la traduzione di nuove terapie 8,9. Inoltre, modellando gli aspetti chiave dei nervi sensibilizzati in un sistema di coltura, i ricercatori potrebbero sviluppare una comprensione più profonda dei meccanismi che guidano le soglie abbassate e identificare nuovi bersagli terapeuticiche le invertono.
Le piattaforme in vitro ideali o i sistemi microfisiologici incorporerebbero la separazione fisica dei neuriti distali e del corpo cellulare dei gangli della radice dorsale (DRG), un ambiente cellulare tridimensionale (3D) e la presenza di cellule di supporto native per imitare da vicino le condizioni in vivo . Tuttavia, un recente articolo di Caparaso et al.11 mostra che le attuali piattaforme di coltura DRG mancano di una o più di queste caratteristiche chiave, il che le rende insufficienti nel replicare le condizioni in vivo . Anche se queste piattaforme sono facili da configurare, non imitano le basi biologiche della sensibilizzazione periferica e quindi potrebbero non tradursi in efficacia in vivo . Per affrontare questa limitazione, è stato sviluppato un modello in vitro fisiologicamente rilevante per la coltura dei gangli delle radici dorsali (DRG) all'interno di una matrice di idrogel con tre compartimenti isolati per consentire l'isolamento fluidico temporale dei neuriti e dei corpi cellulari DRG11. Questo modello offre rilevanza sia fisiologica che anatomica, che ha il potenziale per studiare la sensibilizzazione periferica dei neuroni in vitro.
Il crescente interesse per l'uso di espianti di DRG in una coltura 3D è dovuto alla loro capacità di facilitare una robusta crescita dei neuriti, che funge da indicatore indiretto della vitalità dei DRG12. Mentre gli espianti primari di DRG neonatali o embrionali sono prevalentemente utilizzati nelle attuali piattaforme di coltura in vitro 13,14, l'utilizzo di espianti da roditori adulti fornisce un modello migliore di fisiologia neuronale matura, che imita da vicino la fisiologia umana del DRG rispetto agli espianti da roditori neonatali o embrionali15. I DRG di espiantazione si riferiscono alla conservazione del tessuto cellulare e molecolare del tessuto DRG nativo, principalmente mantenendo le cellule di supporto non neuronali native. In questo documento, questo protocollo descrive la metodologia per raccogliere e coltivare espianti di DRG da ratti adulti Sprague Dawley in un dispositivo multicompartimento (MC) (Figura 1).
L'efficacia è stata dimostrata nella coltura di DRG dalla colonna cervicale, toracica e lombare senza differenze osservabili nella crescita dei neuriti. Per questa applicazione, l'obiettivo era quello di suscitare la crescita di neuriti nei compartimenti esterni del dispositivo; pertanto, questo articolo non ha discriminato tra i livelli di DRG. Tuttavia, se necessario per un esperimento specifico, il livello DRG può essere personalizzato per soddisfare le esigenze degli sperimentatori. Attualmente esistono altri modelli di coltura compartimentati per la coltura 3D di DRGs16, tuttavia, questi dispositivi non contengono cellule di supporto non neuronali native conservate, il che può limitare la traduzione. Preservare la struttura nativa dei DRG raccolti è importante perché garantisce la ritenzione delle cellule di supporto non neuronali, le cui interazioni con i neuroni DRG sono essenziali per mantenere le proprietà funzionali di questi neuroni. Diversi studi hanno co-coltivato DRG dissociati con cellule neuronali non native come le cellule di Schwann per promuovere la mielinizzazione dei neuroni 17,18,19.
Protocollo
La raccolta del DRG è stata eseguita in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Nebraska-Lincoln. Per lo studio sono state utilizzate femmine di ratti Sprague Dawley di 12 settimane (~250 g). I dettagli degli animali, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Fabbricazione e assemblaggio di dispositivi multiscomparto
- Progettazione assistita da computer e stampa 3D del dispositivo multiscomparto
NOTA: Il dispositivo MC è costituito da tre compartimenti per l'isolamento dei corpi cellulari DRG e dei neuriti (Figura 2A). Il dispositivo MC non è disponibile in commercio; tuttavia, il file STL è fornito qui (File di codifica supplementare 1) per consentire la stampa 3D. La stampa del MC richiede un (1) giorno per essere completata. - Carica il file STL dell'MC su una stampante 3D in resina utilizzando un software compatibile.
NOTA: Il materiale ideale per la stampa è una resina per alte temperature. Un vantaggio chiave dell'utilizzo di resina ad alta temperatura è che è biocompatibile e può essere sterilizzata in autoclave e riutilizzata. Per stampare il dispositivo è possibile utilizzare anche una stampante 3D DLP (Digital Light Processing) o altre stampanti 3D. - Trasferire i dispositivi stampati in una soluzione di lavaggio per 30 minuti in isopropanolo (>96%) per rimuovere la resina residua dalla superficie del dispositivo MC stampato.
- Polimerizzare i dispositivi a 80 °C per 120 minuti utilizzando un agente indurente disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali). L'agente indurente migliora le proprietà meccaniche del dispositivo MC stampato esponendolo alla temperatura e ai raggi UV.
- Polimerizzare termicamente i dispositivi MC in forno a 160 °C per 180 min.
- Sterilizzare i dispositivi in autoclave per 45 minuti con ciclo a gravità.
2. Preparazione dell'idrogel
- Sintetizzare l'acido ialuronico metacrilato (MAHA, 85%-115% metacrilazione) e caratterizzare utilizzando un protocollo descritto da Seidlits et al.20.
NOTA: Per supportare la crescita dei DRG, vengono comunemente utilizzati idrogel tripli composti da acido ialuronico metacrilato, collagene di tipo I e laminina. I risultati indicano che i DRG crescono comunemente nel MAHA, variando da 1,25 a 2,5 mg/mL e il collagene da 2,0 a 4,5 mg/mL. Per la laminina, si è riscontrato che 0,75 mg/mL è sufficiente per garantire una robusta crescita dei DRG. Qui, vengono descritti in dettaglio i metodi per creare un triplo gel con 1,25 mg/mL di MAHA, 4,5 mg/mL di collagene e 0,75 mg/mL di laminina. La preparazione dell'idrogel deve essere eseguita in una cappa a flusso laminare per fornire uno spazio di lavoro asettico.
3. Preparazione della soluzione fotoiniziatrice
NOTA: È necessario un fotoiniziatore per reticolare il MAHA sotto luce UV. È comunemente usato in percentuali dallo 0,3% allo 0,6%.
- Preparare la soluzione del fotoiniziatore 3 giorni prima della raccolta del DRG.
- Preriscaldare il bagno d'acqua sonicante a 37 °C prima di preparare la soluzione fotoiniziatrice.
- Lavorando con la tecnica sterile in una cappa a flusso, preparare una soluzione di bicarbonato di sodio (NaHCO3) da 23,125 mg/mL sciogliendo NaHCO3 in 5 soluzioni Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)-HEPES.
- In una fiala di vetro, miscelare il fotoiniziatore allo 0,6% peso/volume (p/v) in una soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) al 20% vol/vol e 5X DMEM/HEPES all'80% vol/vol.
- Per proteggerlo dalla luce, avvolgere la fiala di vetro in un foglio di alluminio. Tuttavia, assicurarsi di rimuovere il foglio di alluminio prima di trasferire la fiala nel bagno d'acqua sonicante riscaldato a 37 °C con sonicazione tra 30-40 minuti.
NOTA: La soluzione del fotoiniziatore deve essere protetta dalla luce perché può scomporsi in radicali e avviare il processo di polimerizzazione se esposta alla luce21. - Filtrare sterile la soluzione con un filtro per siringa da 0,22 μm in una nuova fiala di vetro sterile.
4. Dissoluzione dell'acido ialuronico metacrilato
- Sciogliere l'acido ialuronico metacrilato (preparato nella fase 2) lo stesso giorno in cui viene preparata la soluzione fotoiniziatrice (fase 3).
- Mettere il MAHA liofilizzato congelato in un essiccatore per 15 minuti fino a raggiungere la temperatura ambiente.
- Lavorando in una cappa a flusso laminare e utilizzando la tecnica di pesatura sterile, pesare il MAHA liofilizzato in una fiala di vetro.
- Aggiungere il volume necessario di soluzione filtrata del fotoiniziatore al MAHA per raggiungere la concentrazione di MAHA desiderata. La concentrazione finale comune di gel è di 1,25 mg/mL di MAHA e 4,5 mg/mL di collagene.
- Sigillare il tappo con una pellicola sigillante da laboratorio, avvolgere la fiala di vetro con un foglio di alluminio e posizionarla su una piastra agitatrice orbitale a temperatura ambiente fino a completa dissoluzione (di solito 3 giorni). Di tanto in tanto, agitare la soluzione per rompere grandi grumi di MAHA per garantire una dissoluzione uniforme del MAHA.
5. Assemblaggio del dispositivo
- Posizionare il dispositivo MC in una piastra a 48 pozzetti un giorno prima del raccolto DRG.
- Applicare una linea sottile di gel di silicone nella scanalatura sotto il dispositivo MC (Figura 2B) utilizzando una siringa da 3 ml. Ciò aiuterà il dispositivo a fissarsi saldamente alla piastra del pozzetto.
- Con l'aiuto di una pinza #3, posizionare delicatamente il dispositivo MC nel pozzetto di una piastra a 48 pozzetti, come mostrato nella Figura 2C.
NOTA: Le dimensioni del dispositivo possono essere modificate per adattarle all'applicazione prevista e, se lo si desidera, è possibile utilizzare una piastra di dimensioni diverse. I dispositivi possono essere riutilizzati. Per riutilizzarlo, l'idrogel deve essere lavato delicatamente da tutti i tunnel e la scanalatura di caricamento sotto il dispositivo deve essere utilizzata con etanolo al 70% con una leggera agitazione. Al termine, i dispositivi possono essere nuovamente sterilizzati in autoclave prima dell'uso.
6. Preparazione degli animali
- Autoclavare in autoclave tutti gli strumenti di dissezione necessari prima dell'inizio della raccolta.
- Ottieni un maschio adulto o una femmina di ratto Sprague Dawley di età compresa tra 12 e 20 settimane. Il sesso del ratto non influisce sulla crescita dei DRG.
- Eutanasia del ratto secondo il protocollo IACUC approvato utilizzando il sovradosaggio di CO2 come metodo primario di eutanasia e la puntura bilaterale dello pneumotorace come metodo secondario di eutanasia secondo le linee guida dell'American Veterinary Medical Association22.
- Posizionare il ratto su un sottopiede sterile su un tavolo da dissezione con il lato ventrale rivolto verso il basso. Spruzzare il piumino di pelliccia con etanolo al 70%.
7. Raccolta dei gangli della radice dorsale (DRG)
- Preparare i terreni di rifilatura contenenti l'86% di terreno Neurobasal A, il 10% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di penicillina-streptomicina (PS), l'1% di glutammina e il 2% di B27 più 50x e trasferirli in una piastra a 24 pozzetti. Questo terreno e la piastra a pozzetti saranno utilizzati per lo stoccaggio temporaneo dei DRG raccolti prima di incorporarli nell'idrogel.
- Indossare un camice da laboratorio, una maschera chirurgica, una cuffia, occhiali di sicurezza e guanti.
- Usando grandi forbici a naso smussato, taglia la pelle alla base del rachide cervicale e poi lungo la lunghezza della colonna vertebrale.
- Per drenare ulteriormente il sangue dal canale spinale, tagliare sotto le scapole e verso il basso attraverso il muscolo per recidere i principali vasi sanguigni.
- Usa forbici grandi e affilate per tagliare il muscolo lontano dalla colonna vertebrale. Libera quanto più muscolo possibile per visualizzare la colonna vertebrale.
- Rimuovere i segmenti dorsale e laterale delle vertebre. Usa un Rongeur dritto e forbici dal naso affilato per rimuovere i processi spinosi e trasversali delle vertebre, iniziando dall'estremità cervicale e spostandoti verso l'estremità lombare.
- Rimuovere il midollo spinale. Usa piccole forbici affilate per tagliare con cura le radici nervose collegate ai DRG lungo entrambi i lati del midollo spinale. Tagliare l'estremità cervicale del midollo spinale e sollevarla con cautela dal canale spinale gradualmente, tagliando tutte le radici nervose rimanenti collegate ai DRG.
NOTA: Le capacità motorie sono essenziali per garantire che il corpo DRG non venga reciso durante il processo. - Per esporre i DRG, utilizzare il Rongeur curvo per rimuovere più parti laterali delle vertebre. Tirare verso l'esterno dalla linea mediana, alternando i lati. Fare attenzione a non tagliare il corpo DRG poiché potrebbe causare danni ai corpi cellulari e agli assoni.
- Usando la pinza #3 e le forbici a molla a lama dritta, rimuovi i DRG tra ogni livello delle vertebre. Afferrare le radici del nervo spinale dal DRG, estrarle con cautela dalla tasca e tagliare l'altra estremità del nervo spinale. Fare attenzione a non afferrare direttamente il corpo DRG.
- Posizionare i DRG nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti (contenente il mezzo di rifilatura, passaggio 7.1) su ghiaccio.
- Dopo aver raccolto tutti i DRG, ripulire l'area di lavoro, posizionare la carcassa in un sacchetto per autoclave e conservarla/smaltirla in modo appropriato secondo il protocollo IACUC.
8. Rifilatura e taglio DRG
- Riempire una piastra di Petri da 60 mm su un banco pulito con il mezzo di rifilatura (passaggio 7.1). Installa il cannocchiale da dissezione e lo sterilizzatore a microsfere di vetro e posiziona una cassetta degli attrezzi autoclavata con strumenti di rifinitura (pinze #3 e forbici a molla a lama dritta) vicino al cannocchiale.
- Sotto l'endoscopio da dissezione, rimuovere il tessuto in eccesso attorno al DRG e tagliare le radici nervose vicino al corpo DRG (in genere leggermente più scure dei nervi circostanti).
- Riempire una seconda piastra Petri da 60 mm con terreno fresco. Sotto il cannocchiale da dissezione, tagliare i DRG tagliati a circa 0,5 mm (o tra 0,5 mm e 0,8 mm). Un righello viene posizionato sotto la piastra di Petri durante il taglio per avere la corretta dimensione stimata dei DRG tagliati.
- Trasferire i DRG tagliati in una piastra fresca a 24 pozzetti con il terreno su ghiaccio.
NOTA: Il taglio, il taglio e l'inclusione DRG devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare per fornire uno spazio di lavoro asettico. In assenza di una cappa a flusso laminare, devono essere osservate tecniche asettiche, raccomandando un minimo di dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati (camice da laboratorio, mascherine, occhiali e guanti) e tutti gli strumenti sterilizzati durante il processo per mitigare la potenziale contaminazione.
9. Neutralizzazione del collagene
- Neutralizzare il collagene lo stesso giorno del raccolto DRG dopo aver tagliato e tagliato i DRG.
- Lavorando sul ghiaccio, pipettare ~8,16% di acqua ultrapura, ~1,84% di idrossido di sodio (NaOH) 1 M, ~10% 10x PBS e ~80% di collagene del volume totale della soluzione in una fiala di vetro.
- Mescolare lentamente utilizzando una punta di pipetta sterile a bassa ritenzione per pipettare il collagene (solitamente aggiunto per ultimo) nella miscela. Assicurarsi di mantenere il puntale della pipetta nella soluzione durante la miscelazione per evitare la formazione di bolle. Controlla il pH del collagene neutralizzato utilizzando strisce di pH per assicurarti che sia ~7.
NOTA: Il collagene neutralizzato può essere conservato in ghiaccio per 2-3 ore senza gelificare; Pertanto, la fabbricazione dell'idrogel deve essere eseguita rapidamente una volta neutralizzato il collagene.
10. Fabbricazione di idrogel
- Lavorando su ghiaccio, pipettare la laminina (fino a una concentrazione finale di 0,75 mg/mL) e 1x PBS in una fiala di vetro.
- Utilizzando puntali sterili per pipette a bassa ritenzione, la pipetta ha neutralizzato il collagene e la soluzione MAHA nella miscela per ottenere la concentrazione desiderata.
- Mescolare lentamente e controllare il pH dell'idrogel risultante (dovrebbe essere ~7).
11. Incorporamento DRG
- Eseguire l'incorporamento multi-scomparto.
- Pipettare 65,1 μl e 52,8 μl di idrogel premiscelato rispettivamente nei compartimenti soma e neurite.
NOTA: Ciò presuppone l'uso di dispositivi MC in una piastra a 48 pozzetti. Questi volumi possono essere modificati in base alle dimensioni del dispositivo MC utilizzato. - Incorporare delicatamente i DRG tagliati nello scomparto soma (Figura 2A), assicurandosi che non graffino il fondo della piastra a pozzetti. Posiziona il DRG al centro in modo che i neuriti possano crescere nei compartimenti adiacenti attraverso i tunnel.
- Reticolazione termica dell'idrogel nell'incubatore a 37 °C per 30 min. Mentre ciò accade, accendi la lampada UV per riscaldarla.
- Dopo la reticolazione termica, reticolare UV l'idrogel per 90 s.
- Aggiungere il terreno di coltura DRG all'idrogel e al DRG ed eseguire un cambio completo del terreno dopo un'ora per eliminare le tracce non reagite o rimanenti di fotoiniziatore che persistono nel terreno.
- Eseguire un mezzo cambio del supporto ogni 3 giorni e monitorare la crescita dei DRG visualizzandoli al microscopio.
- Dopo ~4 settimane, quando i neuriti DRG iniziano a crescere (Figura 3A), acquisire immagini con l'imager a piastra fluorescente e quantificare la lunghezza dei neuriti utilizzando FIJI (ImageJ).
- Pipettare 65,1 μl e 52,8 μl di idrogel premiscelato rispettivamente nei compartimenti soma e neurite.
12. Controllare l'incorporamento di DRG
- Pipettare 250 μl di idrogel in una piastra a 48 pozzetti (senza MC).
- Posizionare delicatamente il DRG tagliato al centro del pozzetto e a metà nell'idrogel, assicurandosi che non graffi il fondo della piastra del pozzetto.
- Reticolazione termica dell'idrogel nell'incubatore a 37 °C per 30 min.
- Reticolazione UV dell'idrogel per 90 s.
- Aggiungere il terreno di coltura DRG all'idrogel e al DRG ed eseguire un cambio completo del terreno dopo un'ora.
- Esegui la sostituzione del mezzo supporto ogni 3 giorni e monitora la crescita del DRG visualizzandolo al microscopio.
- Dopo ~4 settimane, quando i neuriti DRG iniziano a crescere (Figura 3B), catturare le immagini con l'imager a piastra fluorescente.
NOTA: Qualsiasi microscopio a campo chiaro funzionerà per l'imaging. Un microscopio automatizzato a piastre rende questo processo più veloce. L'inclusione di controllo in gel semplici senza il dispositivo viene eseguita per confrontare la crescita dei neuriti DRG in multicompartimenti. Una volta che gli utenti hanno verificato che i DRG crescono in modo simile nei gel MC e di controllo, potrebbero non aver bisogno di ripetere i gel di controllo ogni volta.
13. Imaging DRG
- Acquisisci immagini in campo chiaro con ingrandimento 4x utilizzando un imager a lastra fluorescente a una gamma di distanze focali per visualizzare l'intero dispositivo DRG e MC.
- Regola la luminosità e il contrasto dell'immagine per facilitare la visualizzazione dei neuriti.
- Salva l'immagine come file .tiff.
14. Quantificazione dei neuriti DRG
- Scarica e installa FIJI (ImageJ).
- Aprire ImageJ. Apri il file immagine e assicurati che il file sia monocromatico.
- Migliora il contrasto in modo che i neuriti più piccoli siano visibili. Fallo aprendo l'opzione di luminosità e contrasto utilizzando la scorciatoia Ctrl+Maiusc+C.
- Regola i cursori del controller secondo necessità per visualizzare i neuriti e fai clic su Applica per ottenere la luminosità e il contrasto desiderati.
- Apri il tracciatore di neurite aprendo il menu Plugin , selezionando Segmentazione e facendo clic su Tracciante neurite semplice.
- Avvia una nuova traccia facendo clic su un'estremità del neurite proprio contro il corpo DRG.
- Fare clic su un altro punto lungo il neurite per aggiungere una traccia fino a quando il neurite non viene tracciato da un capo all'altro. Fare clic su Termina percorso dopo aver tracciato il neurite.
- Converti la lunghezza tracciata in unità reali e salva i risultati copiandoli e incollandoli in Excel.
- Usa lo strumento linea retta nelle FIJI per disegnare una linea della stessa lunghezza della barra della scala (senza lasciare andare la fine della linea) e guarda il valore della lunghezza visibile sotto la barra degli strumenti. Il valore della lunghezza viene utilizzato per la conversione.
- Misurare la lunghezza di sei neuriti lunghi che si estendono da entrambi i lati del DRG (Figura 3C, D) e calcolare la lunghezza media di questi neuriti per ottenere una lunghezza media rappresentativa del DRG, come mostrato nella Figura 4.
NOTA: L'immunocolorazione è stata testata su espianti di DRG in gel semplici per mostrare la presenza di cellule di supporto non neuronali7. I DRG sono fissati in paraformaldeide al 4% (PFA) a temperatura ambiente, lavati tre volte con 1x PBS per 15 minuti e conservati in 1x PBS a 4 °C fino all'immunocolorazione. - Per gli espianti nei dispositivi MC, rimuovere il dispositivo MC e seguire la stessa procedura descritta sopra7.
Risultati
Il presente protocollo descrive una tecnica per raccogliere e coltivare DRG da ratti adulti Sprague Dawley in un dispositivo multicompartimentale (MC). Come mostrato nella Figura 1, il DRG raccolto da ratti adulti è stato tagliato e tagliato in ~0,5 mm. I DRG tagliati e tagliati sono stati quindi incorporati in un idrogel nella regione soma del dispositivo MC (Figura 2) e coltivati per 27 giorni prima della quantificazione dei neuriti. Il DRG è stato coltivato in gel semplice per fungere da controllo. La concentrazione della formulazione di idrogel utilizzata per questo esperimento era di 4,5/1,25 mg/mL di collagene: MAHA. Nei giorni 27 e 21 rispettivamente per i gel multicompartimentali e semplici, c'è stata una robusta crescita di neuriti (Figura 3). La lunghezza media dei neuriti in MC (894,22 μm ± 308,75 μm) era paragonabile alla lunghezza dei neuriti nei gel semplici di controllo (864,26 μm ± 362,84 μm) (Figura 4). Ciò dimostra la capacità del dispositivo MC di supportare la coltura DRG e la crescita dei neuriti. Le lunghezze dei neuriti sono state quantificate utilizzando il software ImageJ.
Figura 1: Diagramma schematico che mostra la procedura sperimentale. (A) Raccolta dei gangli radicali dorsali (DRG) da ratti Sprague Dawley adulti. (B) Rifilatura e taglio dei DRG raccolti. (C) Formulazione dell'idrogel, inclusione di DRG e coltura in idrogel all'interno di MC inseriti in una piastra a 48 pozzetti. (D) Crescita dei neuriti DRG dopo 21-30 giorni di coltura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Multiscomparto stampato con tre scomparti isolati e può essere utilizzato in una piastra a 48 pozzetti. (A) Un'immagine rappresentativa che mostra la vista dall'alto del dispositivo MC stampato mostra i compartimenti DRG e neurite (linee rosse) e l'area di inclusione DRG (verde). (B) Vista laterale di MC. (C) Un'immagine di MC inserita in una piastra a 48 pozzetti. Barra della scala = 10 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Crescita della neurite in un dispositivo multicompartimentale (MC) e gel semplici di controllo. (A) Un'immagine rappresentativa che mostra la crescita di neuriti tracciata in un dispositivo multicompartimentale (MC) in campo chiaro. (Sotto) I neuriti che sono cresciuti attraverso i tunnel di MC sono indicati con frecce. (B) Immagine della crescita dei neuriti in gel semplici di controllo (senza MC). (C) Un'immagine rappresentativa che mostra il tracciamento dei neuriti di dodici neuriti lunghi in gel semplici di controllo (linee viola). Sei neuriti lunghi su entrambi i lati del DRG sono stati quantificati per ottenere la lunghezza media dei neuriti. Le immagini sono state catturate con un imager a lastra fluorescente con ingrandimento 4x e i neuriti sono stati quantificati utilizzando FIJI (ImageJ). Barre di scala = 1000 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Lunghezza della neurite nel multicompartimento (MC) rispetto a quella del gel semplice (PG). Grafico a dispersione che mostra le lunghezze dei singoli neuriti con medie e deviazioni standard rappresentate da barre di errore. La lunghezza media dei neuriti in MC era di 1204,40 μm ± 690,43 μm (media ± DS) rispetto a 864,26 μm ± 362,84 μm (media ± SD) nel gel semplice, indicando la crescita dei neuriti di supporto MC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File di codifica supplementare 1: file STL di un dispositivo multiscomparto (MC) generato utilizzando un software di progettazione assistita da computer. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
Questo protocollo delinea un metodo per raccogliere i DRG Sprague Dawley adulti e coltivarli in idrogel naturali 3D. A differenza di questo metodo, altri approcci alla raccolta di DRG da topi e ratti prevedono l'isolamento della colonna vertebrale. La colonna vertebrale asportata viene dimezzata e il midollo spinale viene rimosso per esporre i DRG 23,24,25. Il danno al midollo spinale limita l'afflusso di sangue, che colpisce i DRG e i neuroni interni26. Ciò riduce l'attività dei DRG, rendendo gli approcci chirurgici più appropriati. Inoltre, è stato delineato un metodo per stampare in 3D un robusto dispositivo MC che consente una coltura fisiologicamente rilevante di DRG.
Questo protocollo delinea un metodo per coltivare DRG in vitro, enfatizzando lo studio della sensibilizzazione periferica dei neuroni in un modello anatomicamente e fisiologicamente rilevante. Questo metodo di coltura può stabilire una separazione fisica dei neuriti distali e del corpo cellulare DRG in un ambiente 3D. Il dispositivo MC imita l'ambiente in vivo poiché gli espianti di DRG con le cellule sono conservati e possono essere co-coltivati con cellule gliali native. L'espianto di DRG contiene cellule neuronali non native, che potrebbero essere co-coltivate con altre cellule per imitare le condizioni fisiologiche. Questa rilevanza fisiologica promuove studi su come le cellule non neuronali regolano l'attività dei neuriti e aiuta nella comprensione dei meccanismi di base coinvolti nella nocicezione. L'incorporazione di queste interazioni non neuronali dovrebbe produrre previsioni più accurate dei risultati della segnalazione cellulare rispetto ai modelli di coltura semplificati con DRG dissociati. La presenza di due compartimenti neuritici massimizza la rilevanza fisiologica perché i singoli DRG innervano diversi tessuti in vivo. Questo design consente il trattamento di un compartimento neuritico mentre l'altro funge da controllo. I compartimenti di controllo e di trattamento collegati a un singolo soma potrebbero essere utilizzati per studiare gli effetti cross-compartimentali, imitando le condizioni in vivo in cui i neuriti si estendono da un singolo soma e sperimentano stimoli diversi mentre innervano tessuti diversi, fornendo informazioni sul cross-talk tra neuriti. Se si verifica una diafonia tra neuriti in compartimenti adiacenti, i DRG non trattati possono fungere da vero controllo.
Questo dispositivo potrebbe essere utilizzato per l'isolamento del trattamento o per studiare l'interazione tra neuroni e DRG nel contesto del dolore. Poiché i neuriti distali possono essere trattati selettivamente separatamente dal soma DRG e dai neuriti prossimali, questo sistema potrebbe essere utilizzato per trattamenti periferici come terapie articolari mirate, in cui l'estremità terminale dei neuroni sensoriali periferici viene trattata direttamente.
Un vantaggio chiave del dispositivo MC è rappresentato dagli esperimenti ad alto rendimento su più pozzetti della stessa piastra, poiché il dispositivo MC è progettato per adattarsi a una piastra da 48 pozzetti. Un ulteriore vantaggio della piattaforma in vitro è la capacità di alterare la rigidità dell'idrogel all'interno del MC regolando le concentrazioni di collagene e MAHA per imitare le proprietà di vari microambienti tissutali. Una potenziale limitazione di questo protocollo è che l'isolamento fluidico tra i compartimenti neurite e soma DRG non è l'ideale per colture oltre le 72 ore senza un cambio di terreno. Uno studio precedente ha confermato che l'isolamento fluidico viene mantenuto nei compartimenti fino a 72 ore senza cambi di fluido11. Studi precedenti hanno dimostrato che l'aumento della concentrazione di acido ialuronico migliora significativamente la densità di reticolazione del collagene, limitando così la diffusività delle macromolecole attraverso la matrice di idrogel27. Pertanto, per migliorare l'isolamento fluidico per le colture oltre le 72 ore, la concentrazione di MAHA può essere aumentata, come dimostrato in uno studio di Caparaso et al.7, dove un aumento di MAHA ha comportato un migliore isolamento fluidico. L'inclusione di controllo viene eseguita per garantire una crescita comparabile dei neuriti DRG in MC e gel semplice. Questo per garantire che la MC non abbia alcun impatto sulla crescita del DRG. Non è consigliabile ripetere l'incorporamento dei controlli con ogni esperimento una volta convalidata la crescita del DRG in MC.
Gli autori riconoscono che i DRG umani sono più grandi, contengono più cellule e hanno proporzioni variabili di sottotipo neuronale rispetto ai DRG di ratto28. L'uso di DRG per roditori è una limitazione di questo studio in termini di traduzione in clinica; Tuttavia, questo sistema potrebbe essere prezioso come piattaforma di screening per identificare i composti che influiscono sull'eccitabilità neuronale. Sebbene esistano differenze composizionali tra DRG di roditori e umani, esiste anche un'elevata sovrapposizione all'interno del proteoma tra DRG di ratto e umani29. Questa sovrapposizione nel proteoma - e la presenza degli stessi sottotipi neuronali - suggerisce che il DRG di ratto può essere utilizzato per lo screening terapeutico ad alto livello, e ulteriori test possono essere condotti per sondare se i cambiamenti nel DRG di ratto si traducono meccanicamente nel DRG umano.
Questa piattaforma consente una stimolazione farmacologica mirata e lo studio di neuroni o corpi cellulari con controllo temporale. I cambiamenti nell'eccitabilità neuronale e nella trasmissione del segnale possono essere facilmente misurati manipolando i neuriti o il DRG. È stata dimostrata la capacità di valutare l'eccitabilità neuronale utilizzando l'imaging del calcio in idrogel di controllo semplici con DRG espiantati7. Metodi simili possono essere impiegati nel dispositivo MC per valutare l'eccitabilità neuronale.
Questo metodo può essere utilizzato per studiare varie condizioni di dolore in cui la stimolazione dei neuroni sensoriali primari periferici è un fattore trainante, come la lombalgia associata al disco. Lo screening dell'ipersensibilità dei nocicettori può essere uno strumento promettente per scoprire nuovi farmaci per ridurre l'ipereccitabilità. La riduzione dell'ipereccitabilità ha il potenziale per tradursi clinicamente in una riduzione del dolore. Questa piattaforma è in grado di esaminare farmaci ad alto rendimento per identificare i candidati più efficaci per la convalida in vivo utilizzando saggi comportamentali simili al dolore.
Dichiarazioni
Gli autori di questo studio dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da un NSF Grant (2152065) e da un NSF CAREER Award (1846857). Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri attuali e passati del Wachs Lab per aver contribuito a questo protocollo. I diagrammi nella Figura 1 sono stati realizzati in Biorender.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| #5 pinze | Fine Science Tools | 11252-00 | Per rifilare e tagliare DRG |
| 10x DMEM | MilliporeSigma | D2429 | |
| 1x PBS (autoclavato) | Preparato in laboratorio | 7,3 - 7,5 pH | |
| 24 piastre a pozzetti | VWR | 82050-892 | Per conservare temporaneamente DRG raccolti e tagliati |
| 3 mL Siringa sterile e monouso | BD | 309657 | |
| Piastre a 48 pozzetti | Greiner Bio-One | 677180 | |
| Piastra di Petri da 60 mm | Fisher | Scientific FB0875713A | Per contenere terreni per rifilare e tagliare |
| Foglio di alluminio | Fisherbrand | 01-213-104 | |
| B27 Plus 50x | ThermoFisher | 17504044 | Per terreni DRG |
| Collagene tipo I | Ibidi | 50205 | |
| Curvo tazza Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16221-14 | Per la dissezione |
| Dumont #3 pinze | Fine Science Tools | 11293-00 | Per la dissezione |
| Siero fetale bovino (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | Per terreni DRG |
| Form cure | Form Labs agente polimerizzante | Labs | |
| Lavaggio della forma | Form Labs | Per lavare via le resine in eccesso MC | |
| Sterilizzatore a microsfere di vetro | Fisher Scientific | NC9531961 | |
| Fiale di vetro (8 mL) | DWK Life Sciences (Wheaton) | 224724 | |
| GlutaMax | ThermoFisher | 35050-061 | Per terreni DRG |
| HEPES (1M) | Millipore Sigma | H0887 | |
| Resina V2 ad alta temperatura | FormLabs | FLHTAM02 | |
| Acido ialuronico Sale sodico | MilliporeSigma | 53747 | Utilizzato per realizzare MAHA |
| Irgacure | MilliporeSigma | 410896 | |
| Laminin | R& D Systems | 344600501 | |
| Forbici a naso smussato grandi | Militex | EG5-26 | Per la dissezione |
| Pinza grande (punte seghettate) | Militex | 9538797 | Per la dissezione |
| Forbici grandi a naso affilato | Fine Science Tools | 14010-15 | Per la dissezione |
| Puntali per pipette a bassa ritenzione | Fisher Scientific | 02-707-017 | Per il pipettaggio di collagene e MAHA |
| Acido ialuronico metacrilato (MAHA) | Preparato in laboratorio | N/A | 85 - 115 % metacrilazione |
| Nerve Growth Factor (NGF) | R& D Systems | 556-NG-100 | Per terreni DRG |
| Neurobasal A Media | ThermoFisher | 10888022 | Per terreni DRG |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Penicillina/Streptomicina (PS) | EMD Millipore | 516106 | Per terreni DRG |
| Strisce reattive per pH | VWR International | BDH35309.606 | |
| Puntali per pipette (1000 & micro; L) | USA Scientific | 1111-2021 | |
| Preform 3.23.1 software | Formslab | Per caricare il file STL | |
| Rat | Charles River | ||
| Stampante 3D in resina | Form Labs | Form 3L | Dispositivo MC per la stampa 3D |
| Piccole forbici dal naso affilato | scienza fine | 14094-11 | Per la dissezione |
| Bicarbonato | di sodioMilliporeSigma | S6014 | |
| Rongeur a tazza diritta | Strumenti per la scienza | 16004-16 | Per la dissezione |
| Forbici a molla a lama dritta | Fine Science Tools | 15024-10 | Per la dissezione |
| Lama per scaplel chirurgica (n. 10) | Fisher Scientific | 22-079-690 | |
| Filtri a siringa, PES (0,22 &; m) | Celltreat | 229747 | |
| Minuscole forbici a molla | World Precision Instruments | 14003 | Per rifilare e tagliare la |
| lampada UV | Analytik Jena US | To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2) |
Riferimenti
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