Articolo metodologico

Trasformazione mitocondriale in Baker

2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/66856

⸱

7 giugno 2024

 ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo lavoro spiega come trasformare i mitocondri del lievito utilizzando un metodo biolistico. Mostriamo anche come selezionare e purificare i trasformanti e come introdurre la mutazione desiderata nella posizione target all'interno del genoma mitocondriale.

Abstract

Il lievito di birra Saccharomyces cerevisiae è stato ampiamente utilizzato per decenni per comprendere la biologia mitocondriale. Questo modello ha fornito conoscenze sulle vie mitocondriali essenziali e conservate tra gli eucarioti e sulle vie specifiche dei funghi o dei lieviti. Una delle molte capacità di S. cerevisiae è la capacità di manipolare il genoma mitocondriale, che finora è possibile solo in S. cerevisiae e nelle alghe unicellulari Chlamydomonas reinhardtii. La trasformazione biolistica dei mitocondri del lievito ci permette di introdurre mutazioni sito-dirette, effettuare riarrangiamenti genici e introdurre reporter. Questi approcci sono utilizzati principalmente per comprendere i meccanismi di due processi altamente coordinati nei mitocondri: la traduzione da parte dei mitoribosomi e l'assemblaggio di complessi respiratori e ATP sintasi. Tuttavia, la trasformazione mitocondriale può potenzialmente essere utilizzata per studiare altri percorsi. Nel presente lavoro, mostriamo come trasformare i mitocondri del lievito mediante bombardamento di microproiettili ad alta velocità, selezionare e purificare il trasformante desiderato e introdurre la mutazione desiderata nel genoma mitocondriale.

Introduzione

Il lievito Saccharomyces cerevisiae è un modello ampiamente riconosciuto utilizzato per studiare la biogenesi mitocondriale. Poiché il lievito è un organismo anaerobio e facoltativo, è possibile studiare ampiamente le cause e le conseguenze dell'introduzione di mutazioni che compromettono la respirazione. Inoltre, questo organismo possiede strumenti genetici e biochimici amichevoli per studiare le vie mitocondriali. Tuttavia, una delle risorse più potenti per esplorare i meccanismi dell'assemblaggio dei complessi respiratori e della sintesi proteica mitocondriale è la capacità di trasformare i mitocondri e modificare il genoma dell'organello. In precedenza, è stato utile introdurre nel DNA mitocondriale (mtDNA) mutazioni puntiformi o piccole delezioni/inserzioni 1,2,3,4,5, eliminare i geni 6,7, effettuare riarrangiamenti genici 7,8, aggiungere epitopi alle proteine mitocondriali 9,10, trasferire geni dal nucleo ai mitocondri11,12, e introducono geni reporter come BarStar13, GFP14,15, luciferasi16 e il più utilizzato ARG8m17,18. Le modificazioni del genoma mitocondriale ci hanno permesso di sezionare e identificare meccanismi che altrimenti sarebbero stati difficili da comprendere. Ad esempio, il gene reporter ARG8m inserito nel locus COX1 nel DNA mitocondriale è stato fondamentale per capire che Mss51 ha un duplice ruolo nella biogenesi di Cox1. In primo luogo, è un attivatore traduzionale dell'mRNA COX1 e, in secondo luogo, è un chaperone di assemblaggio per la proteinaCox1 7,19 di nuova produzione. Questo lavoro presenta un metodo dettagliato per trasformare i mitocondri di S. cerevisiae. Sebbene il protocollo di trasformazione mitocondriale sia stato pubblicato in precedenza il 16,20,21,22,23, un approccio visivo attraverso un video è essenziale per comprendere a fondo le diverse fasi e i dettagli del metodo. Il metodo si compone di varie fasi e si articola in quattro fasi generali:

Diagramma del processo di editing genetico; particelle di tungsteno, rivestimento del DNA, fasi di integrazione del genoma mitocondriale.
Figura 1: Panoramica della procedura di trasformazione mitocondriale mediante bombardamento di microproiettili ad alta velocità: 1) Le particelle di tungsteno vengono sterilizzate e preparate prima del rivestimento del DNA. 2) Due diversi plasmidi vengono precipitati sulla superficie dei WP. Uno è un plasmide batterico contenente il costrutto che sarà diretto alla matrice mitocondriale. L'altro è un vettore di espressione del lievito nucleare che trasporta un marcatore di auxotrofia. 3) Un ceppo di lievito recettore privo di DNA mitocondriale (rho0) viene coltivato su una fonte di carbonio fermentativa come il galattosio o il raffinosio, che non esercita alcuna repressione del glucosio dell'espressione genica mitocondriale34,35. La coltura è diffusa su piastre di Petri contenenti il mezzo di bombardamento. 4) I WP rivestiti con plasmidi vengono sparati al ceppo del recettore mediante bombardamento di microproiettili ad alta velocità. 5) Le colonie di Rho- sintetiche positive contenenti il plasmide mitocondriale vengono selezionate mediante accoppiamento con un ceppo tester. 6) Il costrutto mitocondriale è integrato nel genoma mitocondriale nel locus desiderato accoppiando il ceppo sintetico di Rho- (donatore) con il ceppo accettore mediante un processo noto come citoduzione. 7) Il recettore positivo, il ceppo aploide che trasporta il costrutto mitocondriale, viene selezionato e purificato in diversi mezzi. Abbreviazioni: WPs = particelle di tungsteno; mtDNA = DNA mitocondriale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Trasformazione di cellule con il costrutto di DNA destinato ad integrarsi nel genoma mitocondriale (Figura 1, passaggi 1-4)
Sebbene sia possibile trasformare direttamente un lievito contenente un genoma mitocondriale completo (rho+), la trasformazione è 10-20 volte più efficiente se le cellule mancano di DNA mitocondriale (rho0)24. Le particelle di tungsteno (WP) sono rivestite con due diversi plasmidi che saranno co-trasformati. Il primo è un vettore di espressione di lievito 2 μ che trasporta un marcatore di auxotrofia, come LEU2 o URA3 (ad esempio, YEp351 o YEp352, rispettivamente). Se l'introduzione biolistica del DNA nelle cellule di lievito ha successo, i trasformanti cresceranno sul mezzo di auxotrofia (cioè un mezzo privo di leucina o uracile). Questo plasmide è utile per effettuare la prima selezione delle cellule che hanno acquisito il plasmide nucleare; in caso contrario, il numero di colonie risultanti saturerebbe la piastra. Il secondo plasmide è un plasmide batterico (come pBluescript o simili) contenente la costruzione mitocondriale destinata ad essere integrata nel genoma mitocondriale. Il costrutto deve contenere almeno 100 nt di sequenze mitocondriali fiancheggianti 5' e 3' per la ricombinazione con la regione mitocondriale di interesse. Nella nostra esperienza, è più probabile che sequenze fiancheggianti più grandi si ricombinino con successo con il locus bersaglio nel genoma mitocondriale.

Un esempio specifico è mostrato nella Figura 225. In questo esempio, l'obiettivo era quello di eliminare la regione del gene COX1 mitocondriale che codifica per gli ultimi 15 amminoacidi della proteina corrispondente (Cox1ΔC15) (Figura 2A). Il plasmide batterico portatore della mutazione COX1ΔC15 conteneva rispettivamente 395 nt e 990 nt delle regioni 5' e 3' non tradotte del gene. Il plasmide è stato derivato da pBluescript (pXPM61) e, insieme al plasmide YEp352 a 2 μ, sono stati coprecipitati sulla superficie dei WP (Figura 2B). I WP sono stati quindi introdotti mediante bombardamento di microproiettili nel ceppo ricevente selezionato (Figura 2C). Questo ceppo, chiamato NAB6926, è un ceppo MATa, rho0 che porta gli alleli kar1-1 e ade2 (l'importanza di queste caratteristiche è discussa di seguito). Le cellule sono state piastrate su un terreno di bombardamento privo di uracile per selezionare quelle che hanno acquisito il plasmide a 2 μ (Figura 2C). Le cellule sono state coltivate per 5-7 notti a 30 °C.

Selezione delle cellule che hanno acquisito il plasmide batterico contenente il costrutto mitocondriale e il plasmide nucleare 2 μ che trasporta il marcatore di auxotrofia (Figura 1, fase 5)
Le colonie positive manterranno molte copie del plasmide batterico nei loro mitocondri22. Poiché le cellule trasformate sono originariamente rho0, nessuna sequenza mitocondriale supporta la traduzione del costrutto mitocondriale presente nel plasmide; quindi, il gene mitocondriale trasformato non sarà espresso. È necessario accoppiare i trasformanti con un ceppo tester per rilevare le colonie di lievito che hanno acquisito il plasmide mitocondriale. Il genoma mitocondriale del ceppo tester contiene una versione mutata non funzionale del gene di interesse. Dopo l'accoppiamento, i mitocondri si fonderanno e la sequenza mitocondriale inclusa nel plasmide trasformato si ricombinerà con il gene mitocondriale mutato del ceppo tester; di conseguenza, il recupero del gene WT ricostituirà la funzione. Il diploide risultante avrà un fenotipo positivo rilevabile (di solito la capacità di crescere in un mezzo respiratorio o un terreno privo di arginina). Le cellule positive che trasportano il plasmide batterico nei mitocondri sono chiamate "rho-cells sintetiche". Nell'esempio specifico della Figura 2D, le rho- cell sintetiche che trasportano il costrutto COX1ΔC15 (chiamato XPM199) sono state replicate su un terreno privo di uracile (questa è la piastra master da cui sono state purificate le colonie positive). Sono stati anche replicati su un prato del ceppo tester L4527 , che contiene la mutazione non funzionale cox1D369N. Dopo l'accoppiamento per due notti, il genoma mitocondriale di L45 e XPM199 si è ricombinato, dando luogo a un gene COX1 funzionale; Pertanto, i diploidi hanno recuperato la capacità di crescere sui mezzi respiratori. Dalla piastra principale, abbiamo raccolto le colonie positive. Sono stati striati su piastre prive di uracile e i test selettivi sono stati ripetuti per ottenere cellule Rho- sintetiche pure (Figura 2E). È importante notare che la piastra di prova serve solo per l'identificazione di colonie di rho-colonie sintetiche e i mutanti non possono essere recuperati da queste piastre.

Integrazione del costrutto nel genoma mitocondriale del ceppo previsto
Questo passaggio si ottiene mediante un processo chiamato citoduzione28,29 (Figura 1, passaggio 6). In questo approccio, il ceppo sintetico rho- (ceppo donatore) viene accoppiato con il ceppo accettore previsto del tipo di accoppiamento opposto. Un requisito essenziale è che almeno uno dei due ceppi di accoppiamento sia portatore della mutazione kar1-1 per impedire la fusione nucleare30. Quindi, l'accoppiamento delle due cellule produce uno zigote binucleato (Figura 3). La rete mitocondriale delle cellule parentali (donatore e accettore) si fonde e le molecole di DNA mitocondriale si ricombinano. Gli zigoti binucleati vengono incubati/recuperati per consentire la gemmazione, che produrrà cellule aploidi. Questi aploidi portano il background nucleare di una delle cellule parentali. Allo stesso modo, gli aploidi possono trasportare il DNA mitocondriale dalla cellula parentale o dal DNA mitocondriale ricombinato di interesse. Tuttavia, la mutazione kar1-1 non è efficace al 100% e alcuni veri diploidi si formeranno durante l'accoppiamento28,29. Il ceppo sintetico rho- (donatore, XPM199) portava l'allele kar1-1 nell'esempio. Come marcatore selettivo, aveva l'allele ade2, che lo rendeva un auxotropo per l'adenina (Figura 4). Il ceppo accettore era XPM10, un ceppo rho+ che portava il costrutto cox1Δ::ARG8m, dove il reporter ARG8m ha sostituito i codoni COX1 nel genoma mitocondriale7. La miscela di entrambe le colture cellulari è stata aggiunta a una piastra YPD come goccia per consentire l'accoppiamento. Dopo 3-5 ore, le cellule sono state osservate al microscopio ottico per rilevare la formazione di shmoos (Figura 3B), una forma cellulare associata all'accoppiamento. Dopo il tempo di incubazione/recupero, gli zigoti binucleati sono stati piastrati su un terreno privo di adenina per prevenire la crescita delle cellule del donatore.

Selezione del ceppo aploide che trasporta il genoma mitocondriale di interesse (Figura 1, fase 7)
Dopo la citoduzione è presente una miscela di cellule donatrici, accettori e diploidi. Pertanto, dopo l'incubazione/recupero degli zigoti binucleati, le cellule devono essere coltivate in diversi terreni selettivi per identificare e purificare gli aploidi di interesse. I terreni selettivi dipendono dai genotipi del donatore, dai ceppi accettori e dalla costruzione mitocondriale prevista. Tuttavia, in generale, il ragionamento per la scelta del terreno selettivo è: i) dopo l'incubazione/recupero, la miscela di citoduzione viene coltivata su un terreno selettivo dove il ceppo parentale donatore non può crescere. Nell'esempio specifico nella Figura 4A, B, il donatore (ceppo sintetico di Rho) trasporta l'allele ade2 non funzionale. Pertanto, la miscela di citoduzione deve essere incubata su una piastra media priva di adenina. Questa è la targa principale. ii) Una volta che le colonie crescono, la piastra master viene replicata nuovamente su un terreno privo di adenina (per generare una nuova piastra master da cui verranno purificate le colonie positive di interesse) e, successivamente, su un terreno in cui possono crescere solo i diploidi. Ciò è necessario per evitare un'ulteriore purificazione involontaria delle colonie diploidi. Nel caso dell'esempio della Figura 4C, solo i diploidi possono crescere su terreni privi di leucina. iii) La piastra master viene anche replicata su terreni dove cresceranno solo quegli aploidi accettori che incorporano il DNA mitocondriale di interesse. Nell'esempio della Figura 4C, gli aploidi crescono su mezzi respiratori contenenti etanolo/glicerolo come fonte di carbonio poiché la proteina Cox1ΔC15 è funzionale. Il ceppo rho+ risultante che portava il mtDNA di interesse è stato chiamato XPM20925. I ceppi utilizzati nella Figura 2 e nella Figura 4 sono elencati nella Tabella 1.

Processo di editing genico del lievito, diagramma con mtDNA e COX1ΔC15, plasmide URA3, ceppo sintetico rho⁻.
Figura 2: Diagramma che descrive un esempio specifico di trasformazione mitocondriale e selezione di cellule rho- -positive positive. (A) La modifica intenzionale del genoma mitocondriale era una delezione della regione che codifica per gli ultimi 15 amminoacidi della subunità Cox1 (Cox1ΔC15). (B) I WP sono stati rivestiti con due plasmidi per trasformare le cellule di lievito. Uno era il plasmide Yep352 a 2 μ che era diretto ed espresso nel nucleo. L'altro era il plasmide pXPM61, che contiene l'allele COX1ΔC15 più 395 nt e 990 nt dei COX1 5' e 3'-UTR, rispettivamente. (C) I WP sono stati introdotti in cellule del ceppo NAB69, che manca di DNA mitocondriale (ceppo rho0 ). Le colonie di trasformanti ottenute dalle piastre di bombardamento sono state replicate su un mezzo privo di uracile, il marcatore auxotrofico del plasmide nucleare YEp352. (D) Per selezionare le colonie rho- positive, la piastra -URA è stata replicata su un terreno privo di uracile. Questa era la piastra principale da cui venivano raccolte e isolate le colonie positive. È stato anche replicato su piastre con rich media (YPD) e un prato di un ceppo tester. Durante l'accoppiamento, il DNA mitocondriale sintetico è stato ricombinato con il DNA mitocondriale del ceppo tester, L4527, che porta una mutazione nel gene COX1 (D369N). I diploidi che crescevano sui mezzi respiratori contenevano il DNA trasformato. Le colonie corrispondenti venivano prelevate dalla piastra principale per riposarle e purificarle. Per aiutare a identificare le colonie positive nella piastra principale in tutte le repliche di placcatura, sono stati fatti dei segni con un pennarello indelebile sui bordi delle piastre (linee verdi). (E) Le colonie positive selezionate sono state conservate su un terreno privo di uracile. Questa era la nuova targa principale. Come in D, sono stati effettuati altri due cicli di test per purificare le colonie di rho- sintetiche. Abbreviazioni: WPs = particelle di tungsteno; mtDNA = DNA mitocondriale; -URA/Sorb = privo di uracile/ contenente Sorbitolo; WT = tipo selvaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Processo di fusione delle cellule di lievito; diagramma e immagine al microscopio; trasferimento Rho+; fasi di accoppiamento; Biologia cellulare.
Figura 3: Diagramma che descrive la procedura di citoduzione. (A) Panoramica generale su come le cellule si accoppiano durante la citoduzione. Durante la citoduzione, i mitocondri dei ceppi donatore e accettore si fondono in modo che il DNA mitocondriale di entrambi i ceppi si ricombini. Poiché la fusione nucleare è ridotta a causa della mutazione kar1-1 30, si formano zigoti binucleari. Dopo un certo periodo di incubazione/recupero, vengono selezionate le gemme di zigoti binucleari e gli accettori aploidi contenenti la mutazione mitocondriale intenzionale. (B) L'accoppiamento del ceppo sintetico rho- (donatore) e del ceppo accettore attraverso la citoduzione permette la formazione di shmoos (frecce rosse), una forma caratteristica del lievito di accoppiamento. L'immagine è stata scattata al microscopio ottico con un obiettivo 100x. Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diagramma di incrocio genetico del lievito che mostra il donatore XPM199 e l'accettore XPM10, evidenziando la placcatura master ADE e il processo di crescita ricombinante per l'integrazione del DNA.
Figura 4: Diagramma che descrive un esempio specifico di citoduzione per integrare la mutazione COX1ΔC15 nel genoma mitocondriale. (A) Le colture liquide del ceppo sintetico rho- (donatore, XPM199) e del ceppo di interesse (accettore, XPM10) sono state mescolate per accoppiarsi. Dopo la formazione dello shmoo, la miscela è stata recuperata in una coltura liquida per 2-4 ore. Successivamente, la miscela di citoduzione è stata spalmata su una piastra con un terreno privo di adenina per prevenire la crescita delle cellule del donatore. (B) Rappresentazione schematica degli eventi di ricombinazione del DNA mitocondriale dal donatore (XPM199) e dall'accettore (XPM10) durante la citodottazione. (C) La piastra master è stata replicata su diversi terreni selettivi per identificare e purificare quegli aploidi che integravano il gene mitocondriale previsto nel DNA dell'organello (XPM209)25. Abbreviazioni: -ADE = carente di adenina; -LEU = carente di leucina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

NOTA: Si consiglia di effettuare sei trasformazioni per ogni costrutto poiché l'efficienza della trasformazione mitocondriale è solitamente bassa. La composizione dei diversi mezzi di crescita è mostrata nella Tabella 2.

1. Preparazione delle particelle di tungsteno

  1. Pesare 30 mg di particelle di tungsteno da 0,7 μm (WP, microcarrier) in una microprovetta. Aggiungere 1,5 ml di etanolo al 70% (EtOH) per sterilizzare. Agitare i WP e lasciarli riposare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  2. Centrifugare a 13.200 x g per 15 min a temperatura ambiente. Lavare i WP aggiungendo 1,5 ml di acqua sterile alle particelle, agitandole e centrifugando a 13.200 × g per 15 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.
  3. Aggiungere 500 μL di glicerolo sterile al 50% (la concentrazione finale è di 60 μg di WP/μL).
    NOTA: I WP possono essere conservati a -20 °C per almeno 6 mesi. Da questo stock, prelevare la quantità necessaria per sei trasformazioni (100 μl).

2. Rivestimento del DNA WPs

  1. Aggiungere 5 μg del plasmide a 2 μ e 15 μg del plasmide batterico contenente la sequenza mitocondriale a un microtubo su ghiaccio.
    NOTA: Il volume finale non deve superare i 50 μl per evitare di diluire ulteriormente i reagenti necessari per il rivestimento del DNA.
  2. Aggiungere 100 μl della sospensione di WP e vorticare per 5 s (6 mg di WP).
  3. Aggiungere 4 μL di spermidina 1 M. Brevemente vortice.
  4. Aggiungere 100 μl di 2,5 M CaCl2 ghiacciato, brevemente vortice. Incubare su ghiaccio per 10 min; Agitare brevemente il mix ogni 3 minuti.
    NOTA: La soluzione di CaCl2 è sterilizzata con filtro e non deve essere sterilizzata in autoclave.
  5. Centrifugare i WP per 30 s a 13.200 × g a 4 °C ed eliminare il surnatante. Lavare le particelle rispendendole delicatamente in 200 μL di 100% EtOH a -20 °C.
  6. Centrifugare i WP per 30 s a 13.200 × g a 4 °C ed eliminare il surnatante. Ripetere il lavaggio.
  7. Risospendere i WP in 60-70 μL di temperatura ambiente 100% EtOH utilizzando un puntale per pipetta; non vortice.
    NOTA: Per garantire la qualità dei plasmidi, il rivestimento del DNA deve essere eseguito lo stesso giorno della trasformazione biolistica.

3. Preparazione del materiale biolistico

  1. Prima del bombardamento, sterilizzare sei supporti macrocarrier (Figura 5) in autoclave e asciugarli accuratamente. In alternativa, immergili in EtOH e sterilizzali usando una fiamma con l'aiuto di una pinza. Metteteli su un piatto di vetro sterile.
  2. Durante la precipitazione del DNA (10 minuti di incubazione su ghiaccio nella fase 2.4), inserire sei macrocarrier (o dischi volanti) in ciascuno dei sei supporti macrocarrier con l'aiuto di una pinza sterile.
    NOTA: Non sterilizzare i macrocarrier.
  3. Miscelare i WP rivestiti di DNA con la pipetta. Aggiungere 10 μl di WP su ciascuna superficie del macrocarrier e distribuire su tutta la superficie con il puntale della pipetta. Se necessario, aggiungere qualche microlitro in più di EtOH al 100% sulla superficie del macrocarrier per ottenere una distribuzione uniforme dei WP. Lasciare asciugare la sospensione a temperatura ambiente per ~20 min.

4. Preparazione di cellule di lievito e piastre di bombardamento

  1. Inoculare il ceppo del recettore rho0 su 2 mL di terreno YPR (Tabella 2). Coltiva per una notte a 30 °C in una ruota rotante.
  2. Diluire 300 μl di coltura in 30 mL di terreno YPR fresco. Coltivare a 30 °C e 200 giri/min su uno shaker rotante per due notti fino a quando la coltura non è satura.
  3. Centrifugare le cellule di lievito a 600 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere le cellule di lievito in 600 μL di terreno YPD (Tabella 2).
  4. Utilizzando un manico di vetro sterile, stendere 100 μl di sospensione cellulare di lievito su una piastra di terreno di bombardamento solido.
    NOTA: Il mezzo di bombardamento deve essere privo del marcatore di selezione del plasmide a 2 μ che verrà utilizzato per la trasformazione.
  5. Ripetere il passaggio 4.4 per le altre cinque piastre.
  6. Incubare per 1-3 ore a temperatura ambiente prima del bombardamento per assicurarsi che il mezzo liquido sia completamente assorbito sulla superficie della piastra.

5. Generazione di un ceppo sintetico di Rho- mediante trasformazione biolistica

NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di leggere il manuale dell'utente dell'apparecchiatura biolistica. Descriveremo il protocollo dell'apparecchiatura di riferimento (Tabella dei materiali e Figura 5).

  1. Pulire la camera del sistema di erogazione di particelle biolistiche con etanolo al 70% per evitare contaminazioni e lasciarla riposare per almeno 10 minuti. Poco prima del bombardamento, pulire la superficie con un tovagliolo di carta pulito.
  2. Aprire le valvole del serbatoio dell'elio per impostare circa 2.000 psi.
  3. Accendere l'apparecchiatura e accendere la fonte di vuoto.
  4. Usando una pinza, posizionare il macrocarrier rivolto verso il basso sul supporto del macrocarrier.
    NOTA: Non utilizzare la schermata di arresto fornita con l'apparecchiatura.
  5. Avvitare il coperchio del macrocarrier sulla parte superiore del macrocarrier. Tutte le parti insieme costituiscono il sistema di lancio della microportante (Figura 5).
  6. Posizionare il sistema di lancio del microcarrier all'interno della camera a vuoto al quinto livello dal basso.
  7. Posizionare una delle piastre contenenti il prato rho0 strain al secondo livello dal fondo della camera. Assicurarsi che il piatto sia rivolto verso l'alto e sia senza coperchio.
  8. Utilizzando una pinza sterile, posizionare un disco di rottura sul cappuccio di fissaggio. Avvitare il tappo di ritegno sul tubo di accelerazione; Assicurarsi che il tappo di fissaggio sia ben saldo.
    NOTA: Non trattare i dischi rotti con isopropanolo come suggerito nel manuale poiché abbiamo osservato che l'efficienza di trasformazione diminuisce.
  9. Chiudere lo sportello della camera a vuoto.
  10. Mettere l'interruttore VAC/VENT/HOLD in posizione VAC . Quando viene raggiunto il vuoto di 25-28 inHg , portare l'interruttore VAC/VENT/HOLD in posizione HOLD .
    NOTA: Tenere presente che il vuoto raggiungibile può variare in base al livello del mare. Abbiamo riscontrato il successo raggiungendo i 25 inHg.
  11. Premi l'interruttore FIRE per sparare ai WP. Attendi che la pressione si accumuli nel tubo di accelerazione fino a raggiungere i 1.300 psi, quando il disco di rottura si romperà, emettendo un suono pop.
  12. Immediatamente dopo la rottura del disco di rottura, l'interruttore FIRE e il vuoto vengono rilasciati portando l'interruttore VAC/VENT/HOLD in posizione VENT .
  13. Con cautela, con una pinza sterile, rimuovere eventuali detriti del disco di rottura presenti sulla superficie della placca e coprire la placca con il suo coperchio.
  14. Ripetere la procedura per le restanti cinque piastre, posizionando un nuovo disco di rottura e un nuovo macrocarrier in ogni giro.
  15. Al termine, chiudere la valvola principale del serbatoio dell'elio.
  16. Chiudere la camera e creare un vuoto portando l'interruttore VAC/VENT/HOLD in posizione VAC . Liberare il sistema da qualsiasi pressione dell'elio premendo e rilasciando l'interruttore FIRE alcune volte. Ripetere con la porta aperta.
  17. Spegnere la pompa del vuoto e l'attrezzatura di bombardamento.
  18. Pulire il sistema di erogazione con il 70% di EtOH. Lavare i supporti macrocarrier con una soluzione SDS allo 0,1%; risciacquare con acqua distillata sterile ed EtOH al 100%.

6. Selezione sintetica delle colonie di rho-colonie

  1. Incubare le piastre di bombardamento per 5-7 notti a 30 °C.
    NOTA: È importante controllare quotidianamente le piastre per verificare la presenza di contaminazioni. Se necessario, la regione contaminata può essere tagliata con una spatola sterile per evitare ulteriori contaminazioni.
  2. Inoculare il ceppo tester del tipo di accoppiamento opposto in 2 mL di terreno YPD per una notte (vedere l'esempio specifico nella Figura 2D, E).
  3. Inoculare 150 μl di coltura di deformazione del tester su una piastra YPD. Utilizzando un manico di vetro sterile, stendere uniformemente il tester sulla superficie della piastra. Lasciare asciugare la piastra per almeno 5 minuti.
  4. Crea repliche delle piastre di bombardamento usando cuscinetti replicanti in velluto e un timbro replicatore.
    1. Replicare su una piastra di terreno di dropout corrispondente al marcatore di auxotrofia plasmidico a 2 μ trasformato. La crescita richiede un'incubazione notturna a 30 °C. Successivamente, conservare a 4 °C fino a nuovo utilizzo. Questa piastra è la piastra principale.
    2. Replicare sulla piastra YPD contenente il prato del tester dal passaggio 6.3. Incubare a 30 °C per due notti. Successivamente, replicare questa piastra sul terreno selettivo per rilevare la presenza del gene mitocondriale di interesse, ad esempio un mezzo respiratorio o un terreno privo di arginina, e incubare per una notte a 30 °C. Solo le cellule che ospitavano il plasmide batterico sintetico nei mitocondri cresceranno sul terreno selettivo dopo l'accoppiamento con il ceppo tester.
  5. Identificare sulla piastra principale (passaggio 6.4.1) le colonie corrispondenti che sono cresciute nel passaggio 6.4.2.
    NOTA: Poiché la piastra di bombardamento (e quindi la piastra principale) è affollata di colonie trasformanti, può essere difficile identificare quelle colonie positive osservate sulla piastra di accoppiamento del tester. Per questo motivo, si consiglia vivamente di tracciare un paio di piccole linee su ciascun lato di tutte le piastre con un pennarello indelebile. Disegna linee simili sull'anello del timbro replicante. Queste linee saranno utili per orientare e localizzare le colonie positive sulla piastra principale (vedere l'esempio nella Figura 2D).
  6. Purificare le colonie positive striandole dalla piastra master a una seconda piastra di dropout selettiva, come al punto 6.4.1. Incubare per due notti a 30 °C.
    NOTA: È essenziale che lo striature consenta la crescita di singole colonie per garantire un ceppo puro.
  7. Ripetere il processo di selezione (passaggi 6.2-6.5) per confermare la presenza del plasmide batterico nei mitocondri.
    NOTA: Di solito, questo processo può essere ripetuto altre due volte per selezionare ceppi sintetici stabili.
  8. Una volta che il ceppo sintetico rho- mantiene stabilmente il DNA plasmidico nei mitocondri, selezionare 3-5 diverse colonie positive e inocularle in 2 mL di YPD. Utilizzare questa coltura per preparare un ceppo crioviale (mescolando 600 μL di coltura e 600 μL di glicerolo al 50% da conservare a -70 °C) e per inserire la sequenza plasmidica nel mtDNA di interesse mediante citoduzione (passaggio 6.7).
    NOTA: Poiché non vi è alcuna pressione selettiva per mantenere il plasmide trasformato nei mitocondri dal ceppo sintetico di Rhostrain, il plasmide può essere facilmente perso. Pertanto, si consiglia di effettuare la citoduzione il prima possibile.

7. Integrazione della costruzione presente nel ceppo sintetico di rho- nel sito bersaglio nel genoma mitocondriale mediante citoduzione

  1. Inoculare due provette con 3 mL di terreno YPD, una con le cellule donatrici (cellule rho- sintetiche) e una con le cellule accettore (cellula di lievito dove è prevista la costruzione finale). Incubare per una notte a 30 °C.
  2. Miscelare 750 μl del ceppo donatore e 250 μl del ceppo recettore in una microprovetta sterile (rapporto 3:1).
  3. Centrifugare la miscela per 1 minuto a 13.200 × g; Eliminare il surnatante. Utilizzando un puntale per pipetta da 1 mL con l'estremità tagliata, prelevare una goccia di pellet cellulare e posizionarla su una piastra YPD. Incubare a 30 °C per 2-4 ore.
    NOTA: Per evitare la contaminazione incrociata, non mettere più di due sospensioni cellulari in una singola piastra (vedere l'esempio nella Figura 4A).
  4. Prelevare una piccola quantità della miscela di cellule, risospenderla in 15 μL di acqua sterile su un vetrino e posizionare un vetrino coprioggetti. Verificare al microscopio ottico la presenza di shmoo con obiettivo 40x o 100x; questa forma caratteristica si manifesta quando sono presenti due tipi di accoppiamento (Figura 3B).
  5. Se sono presenti shmoo, risospendere una piccola quantità (~0,5 mm3) della massa cellulare in 2 mL di terreno YPD. Incubare per 2 ore a 30 °C in una ruota rotante per consentire il recupero degli zigoti binucleati.
  6. Agitare la miscela e diluire 10 μl della sospensione cellulare in 990 μl di acqua sterile (diluizione 1:100). Utilizzare perle di vetro o un manico di vetro sterile per distribuire 100 μl di diluizione cellulare su un terreno di dropout in cui crescono solo il ceppo accettore (e i diploidi sporadici). Incubare per 2-3 notti a 30 °C.
  7. Replicare le colonie risultanti sui terreni selettivi necessari, come spiegato nell'introduzione (fase 4; vedere la Figura 4C per un esempio specifico).
  8. Dopo l'identificazione delle colonie positive, rimuoverle sullo stesso terreno selettivo per purificare il ceppo aploide che trasporta il mtDNA di interesse.
  9. Selezionare almeno due colonie positive e farle crescere su 2 mL di terreno YPD a 30 °C per una notte. Effettuare un backup criogenico mescolando 600 μl di glicerolo al 50% con 600 μl di coltura YPD satura. Conservare a -70 °C.
  10. Isolare il DNA dei ceppi risultanti 31,32. Amplificare la regione desiderata mediante PCR e sequenziare per confermare la presenza della mutazione mitocondriale.
    NOTA: Ogni colonia positiva è una replica tecnica che deve essere confermata in modo indipendente per garantire la corretta sequenza nel genoma mitocondriale.

Risultati

Questa sezione presenta alcuni risultati rappresentativi delle diverse fasi della trasformazione mitocondriale. La Figura 6 mostra una procedura di bombardamento. Le cellule rho- sintetiche portavano un plasmide batterico con il gene reporter ARG8m, che sostituirà la sequenza codificante di un gene mitocondriale (Figura 6A). Dopo il bombardamento, la placca è stata replicata su un mezzo privo di uracile (-URA); questa è la piastra principale (Figura 6B). Le colonie in crescita hanno il vettore di espressione del lievito con il marcatore auxotrofia URA3 . Secondo la sezione 6 del protocollo, la piastra di bombardamento è stata replicata anche su un mezzo YPD contenente un prato del ceppo tester. In questo caso, il ceppo tester ospitava un allele difettoso del gene ARG8m nel genoma mitocondriale (ARG8m-1)1. Dopo 2 notti di incubazione, il prato del tester e le cellule trasformanti si sono accoppiate e i mitocondri si sono fusi. Questa piastra è stata replicata su un terreno privo di arginina. Solo i diploidi contenenti il plasmide mitocondriale sono stati in grado di crescere su questo terreno selettivo perché il gene ARG8m presente nel ceppo sintetico rho- ha sostituito il difettoso ARG8m-1 dal genoma mitocondriale del ceppo tester.

Il numero di colonie positive varia generalmente da zero a 20 per piastra. Nel presente esempio, sono state ottenute quattro colonie di rocolonie sintetiche positive, che sono state purificate striandole su un terreno privo di uracile. Nel primo ciclo di purificazione, sono state ottenute molte colonie negative insieme a quelle positive. Tuttavia, dopo due o tre cicli di purificazione, è possibile ottenere il ceppo sintetico positivo puro. Nella Figura 6C, abbiamo mostrato un paio di colonie di Rho sintetiche positive dopo tre cicli di purificazione e test. La maggior parte delle colonie della piastra master -URA sono positive per la sonda tester. È interessante notare che non tutte le cellule di una colonia positiva contengono il plasmide mitocondriale, indicando che il plasmide trasformato è stato perso in una popolazione della colonia. Questo risultato è atteso poiché non c'è pressione selettiva per mantenere il plasmide mitocondriale, rendendolo instabile. Tuttavia, un ceppo sintetico di rho- come quelli mostrati nella Figura 6C può essere portato avanti alla fase successiva, la citoduzione (sezione 7 del protocollo), e utilizzato per preparare il materiale da conservare a -70 °C. La Figura 6D mostra anche il terzo ciclo di purificazione di un ceppo sintetico di rho-strain. Tuttavia, in questo caso, poiché i trasformanti non erano praticamente in grado di mantenere il plasmide mitocondriale, sono stati scartati.

Abbiamo descritto una strategia generale per selezionare colonie di rho- sintetiche positive, che è presentata nella Figura 7A. In questo caso, il costrutto mitocondriale presente nelle cellule rho- sintetiche ha diverse centinaia di nucleotidi per ricombinarsi con il DNA mitocondriale del ceppo tester (ad esempio, il costrutto COX1ΔC15 nel ceppo rho- sintetico si ricombina con il gene mutato cox1D369N sul DNA mitocondriale del tester (Figura 2D); o il costrutto cox1Δ::ARG8m nel ceppo sintetico rho- con il gene mutato ARG8m-1 nel DNA mitocondriale del tester (Figura 6A). Tuttavia, se non c'è disponibilità di un ceppo tester per selezionare le cellule rho- sintetiche positive di interesse, c'è un approccio indiretto per selezionarle33. In questo caso, il plasmide batterico deve contenere anche un frammento di un gene mitocondriale, come COX2 o COX3. Il ceppo tester contiene una copia non funzionale del gene mitocondriale cox2 o cox3 . Nell'esempio fornito, la sequenza del frammento di cox3 presente nel plasmide batterico può completare la sequenza cox3 presente nei mitocondri del tester e, dopo la ricombinazione, fornire un gene COX3 funzionale. Dopo aver incrociato le rho- cell sintetiche con il ceppo tester, i diploidi possono respirare solo se le rho- cell sintetiche contengono il plasmide batterico all'interno dei mitocondri (Figura 7B).

La Figura 8 esemplifica il processo di citoduzione. I ceppi donatori e accettori hanno auxotrofia rispettivamente di leucina e adenina. Quindi, dopo la citoduzione, la miscela è stata placcata su un terreno privo di leucina, impedendo la crescita delle cellule del donatore. Questa è la targa principale. A questo punto, cresceranno solo gli aploidi con il background nucleare del ceppo accettore e i diploidi sporadici. Per escludere i diploidi, la piastra master è stata replicata su terreni privi di adenina, dove solo i diploidi possono crescere. In questo esempio, il DNA mitocondriale risultante dopo la citoduzione è mutato e gli aploidi intenzionali non possono crescere sul mezzo respiratorio di etanolo/glicerolo. Pertanto, la piastra master deve essere replicata su piastre YPD con un prato di un ceppo tester. La posizione dei diploidi respiranti positivi indica quali colonie purificare dalla piastra master. Sono necessari due cicli di purificazione per ottenere il ceppo finale puro. L'integrazione mitocondriale è solitamente corroborata dall'amplificazione PCR della regione circostante di interesse e dal sequenziamento.

Infine, i geni possono essere inseriti nel locus specifico nel genoma mitocondriale. Ad esempio, i geni reporter possono essere inseriti all'estremità 3' della sequenza codificante di un gene mitocondriale o sostituire la regione codificante del gene mitocondriale, tra le altre opzioni (Figura 9A). Tuttavia, i geni possono anche essere inseriti in siti ectopici all'interno di regioni non codificanti del genoma mitocondriale. Il sito comunemente usato è 295 nt a monte del codone iniziale del gene COX2 . L'alterazione in questa regione non codificante è innocua13. Per esprimere con successo il gene nel sito ectopico, deve essere affiancato da un promotore mitocondriale e da un terminatore. Le sequenze fiancheggianti di COX2 sono le più ottimali poiché COX2 è il gene dei mitocondri con le sequenze non tradotte 5' e 3' più corte (73 nt del 5' UTR e 119 nt del 3' UTR) (Figura 9B). Per questa costruzione, il plasmide batterico ha le seguenti caratteristiche: il modello è un plasmide che contiene la regione codificante COX2 , con 1120 nt a valle del codone di stop e 670 nt a monte del codone di start AUG , denominato pXPM5025. Il gene di interesse è progettato per essere affiancato da 73 nt della COX2 5'-UTR e 119 nt della COX2 3'-UTR. Successivamente, è stato inserito, come precedentemente indicato, a 295 nt a monte del codone di inizio COX2 AUG, che è una regione non codificante (Figura 9B). Si noti che questo plasmide e, di conseguenza, nel genoma mitocondriale risultante, gli UTR COX2 5' e 3' sono duplicati. Dopo il bombardamento di questo plasmide, le cellule rho- sintetiche vengono accoppiate per la citoduzione con un ceppo recettoriale che ha un'estesa delezione della regione COX2 (allele cox2-62 )1. Durante la citoduzione, il plasmide mitocondriale del ceppo sintetico di Rho- si ricombina con il DNA mitocondriale dell'accettore. Il genoma mitocondriale risultante ha la costruzione ectopica e un gene WT COX2 . Pertanto, le colonie positive saranno in grado di crescere in un mezzo respiratorio (Figura 9B).

Schema del sistema di lancio dei microcarrier, configurazione della pressione dell'elio, piastra del campione, tubo di accelerazione.
Figura 5: Rappresentazione schematica dell'attrezzatura per bombardamento a microproiettili ad alta velocità. Il nostro laboratorio utilizza il sistema di erogazione delle particelle Biolistic-PDS-1000/He (tabella dei materiali). Abbreviazione: WPs = particelle di tungsteno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diagramma di trasformazione del lievito e risultati della capsula di Petri che mostrano la funzionalità del gene ARG nel mtDNA sintetico.
Figura 6: Esempio di una piastra di trasformazione per microproiettili ad alta velocità. (A,B) Dopo il bombardamento, le piastre sono state incubate per 5-7 notti a 30 °C. Se cresce un contaminante (indicato da una freccia blu), può essere tagliato con una spatola sterile. Dopo aver replicato le piastre sul mezzo marcatore di selezione (-URA in questo caso), la piastra master è stata anche testata per la presenza del plasmide mitocondriale accoppiandola con un ceppo tester. In questo caso, il ceppo tester ha l'allele non funzionale ARG8m-1 1. Dopo l'accoppiamento per 2 notti e la replica della piastra su un terreno privo di arginina (-ARG), sono sorte quattro colonie positive (indicate con frecce rosse). (C) Le colonie di rho- sintetiche positive sono state purificate rimettendole su terreno -URA, e il test di replica è stato eseguito come precedentemente descritto. Queste piastre rappresentano il terzo ciclo di purificazione. (D) Alcune colonie di Rho- sintetiche positive hanno perso il costrutto mitocondriale. Abbreviazioni: mtDNA = DNA mitocondriale; -URA = privo di uracile; -ARG = carente di arginina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diagramma del processo di integrazione dei plasmidi batterici; trasferimento genico al mtDNA; concetto di ingegneria genetica.
Figura 7: Diagramma che mostra come selezionare le colonie di Rho- sintetiche positive dopo il bombardamento. (A) Il plasmide batterico contiene una versione mutata non funzionale di un gene mitocondriale. Per la rilevazione, le colonie di rho- sintetiche vengono accoppiate con un ceppo tester contenente una diversa mutazione non funzionale dello stesso gene nel DNA mitocondriale. Dopo l'accoppiamento, i mtDNA mutanti si ricombinano e un gene funzionale può essere recuperato per complementazione. Qui, il diploide cresce su un terreno selettivo dove né il ceppo sintetico rho- né il tester possono crescere. (B) In questo caso, il plasmide contiene una sequenza aggiuntiva di un gene mitocondriale (cioè un pezzo di COX3). Dopo la trasformazione, il ceppo sintetico rho- viene selezionato in base alla sua capacità di integrare una mutazione COX3 nel ceppo tester, quindi solo i diploidi possono crescere su un mezzo selettivo (cioè il mezzo respiratorio). Questo metodo è utile se non è disponibile un ceppo tester per il gene di interesse. Il rilevamento di colonie sintetiche positive in questo caso è indiretto. Abbreviazione: mtDNA = DNA mitocondriale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Esperimento con piastra di Petri; processo di citoduzione; osservazione della crescita del lievito; Valutazione del trasferimento genetico.
Figura 8: Esempio di citoduzione per integrare un costrutto nel locus target nel DNA mitocondriale. Dopo l'accoppiamento e il recupero, le cellule miste e gli zigoti binucleati sono stati placcati su un terreno privo di leucina. In questo caso, poiché il ceppo donatore ha l'allele leu2,3-112, questo mezzo impedisce la crescita del donatore. Questa piastra è stata replicata sullo stesso terreno (piastra master), in un terreno in cui possono crescere solo i diploidi (-ADE) e in un terreno in cui può crescere l'accettore con la mutazione desiderata (frecce rosse). In questo caso, né le cellule del donatore né quelle del recettore possono crescere sui mezzi respiratori. Solo il diploide risultante dopo l'accoppiamento con un prato di un ceppo tester può crescere su un mezzo respiratorio. Queste colonie diploidi traspiranti sono una guida per selezionare e purificare le colonie positive dalla piastra principale. Abbreviazioni: -LEU = carente di leucina; -ADE = carenza di adenina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diagramma di trasferimento genico mitocondriale con processo sintetico da donatore rho a accettore di mtDNA.
Figura 9: Diagramma che mostra come integrare il costrutto mitocondriale mutato (presente nel ceppo sintetico rho- ) nel ceppo accettore. (A) In questo esempio, il ceppo accettore trasporta il gene reporter ARG8m che sostituisce i codoni dal gene di interesse. Il rho-DNA sintetico contiene una versione mutata di questo gene. Il plasmide e il DNA mitocondriale si ricombinano attraverso le regioni fiancheggianti 5' e 3' e il reporter ARG8m viene sostituito con la sequenza mutata del gene di interesse. (B) I geni estranei possono essere inseriti ectopicamente in regioni specifiche del genoma mitocondriale 7,13,36. In questo esempio, un gene può essere introdotto in una posizione 295 nt a monte del gene COX2. Questa è una regione non codificante del mtDNA. Un gene estraneo di interesse è affiancato da 73 nt e 119 nt della COX2 5' UTR e 3' UTR, rispettivamente. Questa costruzione è inserita in un plasmide contenente il gene COX2 più 670 nt e 1120 nt delle regioni UTR 5' e 3'. Il ceppo sintetico rho- (donatore) trasporta questo costrutto nei mitocondri. In questo caso, il ceppo accettore (XPM13)7 presenta una delezione significativa del gene cox2 (allele cox2-62)1. Dopo la citoduzione, il DNA mitocondriale del donatore e dell'accettore si ricombina. Il gene COX2 viene ripristinato e il gene di interesse viene inserito nel sito ectopico (295 nt a monte del gene COX2). Abbreviazioni: mtDNA = DNA mitocondriale; nt = nucleotidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Ceppo di lievitoGenotipoREF
NAB69Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho0)1
NB71Matα, ade2-101, ura3-52, leu2-delta, arg8-delta::URA3, kar1-1, (cox3Δ:ARG8m-1)1
XPM10bMatα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG, ura3-52 (rho+ , cox1∆::ARG8m)7
XPM209Matα, lys2, arg8::hisG, ura3-52, leu2-3, 112, (rho+, ΔΣai, COX1ΔC15)26
XPM199Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho-, pXPM61)26
XPM13Matα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG,ura3-52, his3-deltaHindIII (rho+,cox2-62, cox1∆::ARG8m)7
L45Matα, ade1, op1 (rho+, cox1-D369N)28

Tabella 1: Esempi di ceppi di lievito utilizzati nella trasformazione biolistica e nella citoduzione.

Mezzi di crescitaComponenti
YPD2% glucosio, 2% bactopeptone, 1% estratto di lievito
YPR2% Raffinosio, 2% bactopeptone, 1% estratto di lievito
YPEG*3% Glicerolo, 3% Etanolo*1, 2% Bactopeptone, 1% Estratto di lievito
Supporti drop-out2% glucosio, 6,8% base azotata di lievito con (NH4)2SO4, miscela di aminoacidi drop-out*2
Mezzi di bombardamento5% glucosio, 6,8% base azotata di lievito con (NH4)2SO4, 1 M sorbitolo, miscela di aminoacidi drop-out*2,3.
*1 Aggiungere etanolo dopo la sterilizzazione in autoclave quando il terreno è caldo.
*2 La quantità di miscela di aminoacidi può variare in base alle scorte disponibili o alla quantità indicata dal produttore.
*3 Per i mezzi di bombardamento, aggiungere gli amminoacidi e le basi azotate secondo necessità, a seconda del ceppo di lievito. Assicurarsi che la composizione sia specifica per l'auxotrofia sul plasmide da 2μL utilizzato per la selezione.

Tabella 2: Terreni di crescita del lievito utilizzati in questo protocollo.

Discussione

Il presente lavoro descrive come trasformare con successo i mitocondri dal lievito S. cerevisiae. Il processo, dal bombardamento di microproiettili ad alta velocità fino alla purificazione del ceppo di lievito previsto, richiede ~8-12 settimane, a seconda di quanti cicli di purificazione del ceppo sintetico di rho- sono necessari. Alcuni dei passaggi critici del metodo sono i seguenti. In primo luogo, più grandi sono le regioni fiancheggianti aggiunte intorno al sito di mutazione nel costrutto genico mitocondriale, maggiore è la probabilità di integrazione riuscita della mutazione bersaglio. La dimensione minima delle regioni di fiancheggiamento è di ~100 nt; Tuttavia, l'uso di più di 500 NT su ciascun lato della mutazione è altamente raccomandato. In secondo luogo, quando si selezionano le colonie rho-sintetiche dopo la trasformazione, si raccomanda che non vengano effettuati più di 3-4 cicli di purificazione; In caso contrario, c'è un alto rischio che alla fine il costrutto mitocondriale vada perso, poiché non c'è pressione selettiva per mantenere il plasmide nei mitocondri. In terzo luogo, per evitare di danneggiare l'utente o l'apparecchiatura, è necessario leggere attentamente il manuale della macchina da bombardamento prima di iniziare la procedura. Questa apparecchiatura è delicata e utilizza l'alta pressione e il vuoto.

Una limitazione di questa procedura è che finora solo il lievito e l'alga verde C. reinhardtii sono candidati a trasformare i mitocondri con questo metodo. Sarebbe rilevante se potessimo introdurre mutazioni sito-dirette sul genoma mitocondriale da altri organismi. Un'altra limitazione è che è difficile trasformare molti costrutti diversi nella stessa sessione. Si consiglia di effettuare sei trasformazioni per ogni costruzione, ognuna delle quali deve essere testata, selezionata e purificata. Ciò si traduce in oltre 50 piastre di terreno per ottenere solo colonie di Rho- pure di una singola mutazione mitocondriale.

Nonostante queste limitazioni, la capacità di manipolare il genoma mitocondriale del lievito ha contribuito in modo significativo alla comprensione di molte vie della biogenesi dei complessi respiratori. Questo approccio può essere utilizzato per introdurre geni reporter per monitorare e quantificare la traduzione mitocondriale 1,7,36,37, interrompere i geni mitocondriali 38, identificare gli chaperoni di assemblaggio dei complessi respiratori39, comprendere meglio i meccanismi di traduzione e assemblaggio mitocondriale accoppiati 7,11,12,36 , e cercare soppressori quando seguono l'espressione di un gene mitocondriale mutato40. Finora, sebbene alcuni approcci per manipolare il genoma mitocondriale nei mammiferi siano stati riportati in precedenza41, non esiste un metodo diffuso per trasformare il DNA mitocondriale per questi organismi.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questa pubblicazione è stata sostenuta da Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 a XP-M]. UPD è un borsista CONAHCYT (CCU:883299). Vogliamo ringraziare la dottoressa Ariann Mendoza-Martínez per l'aiuto tecnico con le immagini del microscopio ottico. Licenze Biorender: DU26OMVLUU (Figura 2); BK26TH9GXH (Figura 3); GD26TH80R5 (Figura 4); PU26THARYD (Figura 7); ML26THAIFG (Figura 9).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Puntali per pipette da 1 mLAxygenT-1000-B
Microprovetta da 1,5 mLAxygenMCT-150-C
10 μ L puntali per pipetteAxygenT-10-C
15 mL provetta a fondo conico AxygenSCT-25ML-25-S
200 μ L puntali per pipetteAxygenT-200-Y
50 mL fondo conico  provettaAxygenSCT-50ML-25-S
AfiIINew England BioLabsR0520S
AgaroseSeaKem50004
Bilancia analiticaOHAUSARA520
AutoclaveTOMYES-315
Bacto agarBD214010
Bacto peptoneBD211677
Supporto per macrocarrier biolisitico BIO-RAD1652322
Bruciatore BunsenVWR89038-528
Cloruro di calcioFisher ScientificC79-500
CSM -ADEFormediumDCS0049
CSM -ARGFormediumDCS0059
CSM -LEUFormediumDCS0099
CSM -URAFormedium
Pallone di vetro per coltureKIMAX KIMBLE25615
Tubo di vetro per colturePyrex9820
DestrosioBD215520
EtanoloJT Baker 9000
PinzeMillipore620006
Perle di vetroSigmaZ265926
Manico in vetroSigmaS4647
GliceroloJT BAKER2136-01
Serbatoio di elio grado 5 (99,99 %)--
HSTaq  KitPCR BIO
MicrocentrifugaEppendorf022620100
NdeINew England BioLabsR0111L
Agitatore orbitaleNew Brunswick scientificNB-G25
Provette per PCRAxygenPCR-02-C
PDS-1000/He TM Sistema di somministrazione di particelle biolisticheBIO-RAD165-2257
Piastre di Petri (100X10)BD252777
QIAprep Spin MiniprepQiagen27106
RaffinoseFormediumRAF03
Replica platerSciencewareZ363391
Dischi di rottura 1350 PsiBIO-RAD1652330
SorbitoloSigmaS7547
SpermidinaSigmaS0266
T4 DNA LigasiThermo ScientificEL0011
Rotatore per colture tissutaliThermo Scientific88882015
Microcarrier di tungsteno M10BIO-RAD1652266
Pompa per vuoto con capacità di 100 l/min-
Cuscinetti in vellutoBel-ArtH37848-0002
Vortice Scientifc IndustriesSI-0236
Bastone per aplicativi in legnoPROMA1820060
Estratto di lievitoBD212750
Lievito a base azotata senza aminoacidiBD291920
DCS0169

Riferimenti

  1. Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
  2. Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules. J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).
  3. Flores-Mireles, D., et al. The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly. Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).
  4. Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome. Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).
  5. García-Villegas, R., et al. The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria. J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).
  6. Rak, M., et al. Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology. J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).
  7. Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p. EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).
  8. Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs. EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).
  9. Saracco, S. A., Fox, T. D. Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane. Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).
  10. McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase. J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).
  11. Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).
  12. Franco, L. V. R., et al. Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase. Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965(2023).
  13. Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria. Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).
  14. Cohen, J. S., Fox, T. D. Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).
  15. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
  16. Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast. STAR Protoc. 3 (2), 101359(2022).
  17. Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).
  18. Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation. Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).
  19. Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).
  20. Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria. Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).
  21. Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).
  22. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination. Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).
  23. Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun. Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).
  24. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).
  25. Shingú-Vázquez, M., et al. The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).
  26. Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide. Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).
  27. Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase. Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).
  28. Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. Cytoduction and plasmiduction in yeast. Bio Protoc. 11 (17), 4146(2021).
  29. Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast. Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).
  30. Conde, J., Fink, G. R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).
  31. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory manual. 2000 ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  32. Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. : a. Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. 2015 edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2015).
  33. Ding, M. G., et al. Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species. Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).
  34. Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology (Reading). 144, Pt 1 13-24 (1998).
  35. Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).
  36. Gruschke, S., et al. The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria. J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).
  37. Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis. Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).
  38. Rak, M., Tzagoloff, A. F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).
  39. He, S., Fox, T. D. Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix. Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).
  40. Rak, M., et al. Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p. Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).
  41. Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. Mitochondrial genome engineering coming-of-age. Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Saccharomyces cerevisiaetraduzione mitocondrialebombardamento biolisticofunzione del mitoribosomafosforilazione ossidativaediting del genoma mitocondrialemitocondri del lievito

Articoli correlati