Questo protocollo presenta una tecnica ottimizzata di perfusione epatica della collagenasi in due fasi in un modello di ratto e mostra l'uso di epatociti isolati per la coltura in vitro a lungo termine di organoidi 3D.
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Articolo metodologico
Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D all'avanguardia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli epatociti primari sono uno strumento comunemente usato per gli studi in vitro correlati al fegato. Tuttavia, il mantenimento di queste cellule è sempre stato una sfida a causa della rapida perdita di morfologia, vitalità e funzionalità in coltura. Un approccio recente alla coltura a lungo termine è la generazione di organoidi tridimensionali (3D), uno strumento in vitro in grado di ricapitolare i tessuti in un piatto basato sulla meravigliosa capacità del fegato di rigenerarsi. I protocolli pubblicati sono stati progettati per ottenere organoidi 3D funzionali a lungo termine da epatociti adulti primari (Hep-Org). Lo strumento all'avanguardia per organoidi 3D richiede la capacità di isolare le cellule dal tessuto adulto e questo passaggio iniziale è fondamentale per un risultato finale di alta qualità. La perfusione collagenasi a due stadi, introdotta negli anni '70, è ancora una procedura valida per ottenere singoli epatociti. Il presente articolo si propone di descrivere tutte le fasi cruciali della procedura chirurgica, ottimizzando così la procedura di isolamento degli epatociti primari nel modello di ratto. Inoltre, particolare attenzione è rivolta alle linee guida PREPARE per aumentare la probabilità di successo delle procedure e garantire risultati di alta qualità. Un protocollo dettagliato consente ai ricercatori di accelerare e ottimizzare il lavoro a valle per stabilire organoidi 3D da epatociti di ratto adulti primari. Rispetto agli epatociti 2D, gli Hep-Org erano ancora vitali e in proliferazione attiva al giorno 15, dimostrando un potenziale a lungo termine.
Introduzione
Gli epatociti primari sono uno strumento importante e ampiamente utilizzato per gli studi in vitro correlati al fegato. Tuttavia, la loro espansione e manutenzione sono state storicamente impegnative, poiché perdono morfologia e funzionalità dopo pochi giorni nella coltura1. La coltura 2D è una condizione limitante, in particolare, per gli epatociti che hanno una forma poligonale e una struttura polarizzata con membrane apicali e basolaterali differenziate. Infatti, l'adesione degli epatociti alla piastra interferisce con la loro normale attività perché porta ad un citoscheletro piatto con interazione ....
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Protocollo
Tutte le procedure e la stabulazione degli animali sono state condotte secondo le linee guida della legge italiana e della direttiva della Comunità Europea. Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato per la Cura degli Animali e dal Ministero della Salute (autorizzazione n° 321/2022-PR) ai sensi dell'art.31 del decreto 26/2014.
1. Preparazione per la procedura con gli animali
NOTA: Fare riferimento alla Tabella 1 per la composizione del mezzo e del tampone e alla Tabella dei materiali per i dettagli commerciali.
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Risultati
Al termine delle procedure di set-up (fase 6.13), abbiamo ottenuto una resa cellulare fino a 1 x 108 cellule per isolamento dal fegato di circa 300 g di un ratto. La vitalità cellulare tra il 78% e il 97% è stata stabilita mediante la conta del blu di tripano.
Come già descritto in studi precedenti 1,18,19, gli epatociti primari in coltura perdono la loro morfologia, le funzioni specifiche .......
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Discussione
Gli organoidi 3D sono una frontiera per la medicina personalizzata e consentono una coltura di epatociti a lungo termine. La qualità di questa tecnica innovativa richiede una buona resa di epatociti primari vitali e una perfusione epatica e un isolamento degli epatociti ben eseguiti. Questa vecchia procedura è ancora ampiamente utilizzata; Tuttavia, comprende diversi passaggi che possono essere impegnativi. Avvicinandoci alla procedura, abbiamo riscontrato problemi critici come la contam.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori hanno segnalato tutti i conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. Davide Selvestrel e il Prof. Giovanni Sorrentino del SorrentinoLab dell'Università di Trieste per averci aiutato a eseguire il saggio di proliferazione dell'EdU. Il lavoro è stato sostenuto da un grant ad hoc della Banca d'Italia e da contributi FIF intramurali.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| A83-01- Inibitore ALK5 IV | Doppia Elica | T3031 | |
| B27 | Thermofisher Scientific | 0080085SA | |
| CFX Connect Sistema di rilevamento PCR in tempo reale | Kit di imaging Bio-Rad | ||
| CHIR99021 | Twin Helix | T2310 | |
| Click EdU Alexa 488 | Thermofisher Scientific | C10499 | |
| Collagene, tipo I, soluzione da coda di ratto | Merck | C3867-1VL | |
| Desametasone | Merck | D4902 | |
| EGF | Merck | E9644 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Euroclone | ECS0180L | |
| GELTREX LDEV FREE RGF BME | Thermofisher Scientific | A1413202 | |
| Eparina sodica 25000 UI/5 ml | B. Braun Melsungen AG | B01AB01 | |
| HGF | Peprotech | 100-39 ore | |
| Soluzione di insulina-transferrina-selenio 100x | Thermofisher Scientific 41400045 | ||
| Soluzione di L-Glutammina | Euroclone | ECB3000D | |
| Digerito Fegato Medium | Thermofisher Scientific | 17703-034 | |
| Perfusione epatica Media | Thermofisher Scientific 17701038 | ||
| integratore di N2 | Thermofisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetilcisteina | Merck | A9165 | |
| Nicotinamide | Merck | N-0636 | |
| Aminoacidi non essenziali | Merck | M7145 | |
| Normocin | Aurogene | ant-nr-1 | |
| tampone PBS 1X | PanReac AppliChem | A0964,9050 | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina 100x | Euroclone | ECB3001D | |
| Percoll | Santa Cruz | sc-296039A | |
| Pompa peristaltica | Ismatec™ | MS-4/12 Reglo Pompa | |
| TNFa | Peprotech | 300-01A | |
| Reagente TRI | Tubo Merck | T9424 | |
| Ismatec™ | ID.2,79mm | ||
| Williams' E Medium, senza glutammina | Thermofisher Scientific | 31415029 | |
| Y27632 | Twin Helix | T1725 |
Riferimenti
- Heslop, J. A., et al. Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile. Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).
- Ietto, G., et al.
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Ristampe e permessi
