Isolamento delle cellule immunitarie dal cervello e dal cranio del topo

Il cervello, il fulcro centrale del sistema nervoso, è protetto dal cranio. Sotto il cranio ci sono tre strati di tessuto connettivo noti come meningi: la dura madre, l'aracnoide e la pia madre. Il liquido cerebrospinale (CSF) circola nello spazio subaracnoideo tra l'aracnoide e la pia madre, ammortizzando il cervello e rimuovendo anche i rifiuti attraverso il sistema glinfatico ^1,2. Insieme, questa architettura unica fornisce un ambiente sicuro e di supporto che mantiene la stabilità del cervello e lo protegge da potenziali lesioni.

Il cervello è stato a lungo considerato immuno-privilegiato. Tuttavia, questa nozione è stata parzialmente abbandonata poiché prove crescenti indicano che, oltre alle microglia residenti nel parenchima, i bordi del cervello, compreso il plesso coroideo e le meningi, ospitano una vasta gamma di cellule immunitarie³. Queste cellule svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi, nella sorveglianza della salute del cervello e nell'avvio della risposta immunitaria alle lesioni cerebrali. In particolare, recenti scoperte indicano che il cranio è coinvolto nell'immunità delle meningi e può contribuire alla risposta immunitaria nel cervello dopo una lesione. Nel 2018, Herisson et al. hanno fatto una scoperta fondamentale dei canali vascolari diretti che collegano il midollo osseo del cranio alle meningi, stabilendo così un percorso anatomico per la migrazione dei leucociti ^4,5. Successivamente, Cugurra et al. hanno dimostrato che molte cellule mieloidi (ad esempio, monociti e neutrofili) e le cellule B nelle meningi non originano dal sangue⁶. Utilizzando tecniche come il trapianto di lembo osseo calvario e regimi di irradiazione selettiva, gli autori hanno fornito prove convincenti che il midollo osseo del cranio funge da fonte locale per le cellule mieloidi nelle meningi e per il parenchima del SNC dopo una lesione del SNC⁶. Inoltre, un altro studio ha proposto che le cellule B meningee siano costantemente fornite dal midollo osseo del cranio⁷. Più recentemente, una nuova struttura, chiamata uscita della cuffia aracnoidea (ACE), è stata identificata come una porta diretta tra la dura madre e il cervello per il traffico di cellule immunitarie⁸.

Questi interessanti risultati hanno importanti implicazioni per l'origine dell'infiltrazione delle cellule immunitarie nel cervello danneggiato (ad esempio, dopo un ictus ischemico). Un ampio corpus di prove ha indicato che dopo l'ictus, molte cellule immunitarie si infiltrano nel cervello, contribuendo sia al danno cerebrale acuto che al recupero cerebrale cronico. L'idea convenzionale è che queste cellule siano leucociti circolanti nel sangue che si infiltrano nel cervello, il che è in gran parte facilitato dal danno alla barriera emato-encefalica indotto dall'ictus. Tuttavia, questa nozione è stata messa in discussione. In uno studio, le cellule immunitarie nel cranio e nella tibia dei topi sono state etichettate in modo diverso e, a 6 ore dall'ictus, è stata riscontrata una diminuzione significativamente maggiore dei neutrofili e dei monociti nel cranio rispetto all'ictus. La tibia e altri neutrofili derivati dal cranio erano presenti nel cervello ischemico. Questi dati suggeriscono che nella fase acuta di ictus, i neutrofili nel cervello ischemico originano principalmente dal midollo osseo del cranio⁴. È interessante notare che il liquido cerebrospinale può guidare questa migrazione. Infatti, due recenti rapporti hanno dimostrato che il liquido cerebrospinale può trasmettere direttamente segnali di segnalazione dal cervello al midollo osseo del cranio attraverso i canali del cranio e istruire la migrazione cellulare e l'emopoiesi nel midollo osseo del cranio dopo una lesione del SNC ^9,10.

Alla luce di queste recenti scoperte, è diventato importante analizzare i cambiamenti nelle cellule immunitarie sia nel cervello che nel midollo osseo del cranio, quando si studia la risposta immunitaria ai disturbi cerebrali. In tali indagini, è necessario un numero sufficiente di cellule immunitarie di alta qualità per le analisi a valle come lo smistamento cellulare, l'analisi della citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq). Qui, l'obiettivo generale è quello di presentare due procedure ottimizzate per la preparazione di sospensioni unicellulari dal tessuto cerebrale e dal midollo osseo del cranio. È importante notare che la calvaria (osso frontale, osso occipitale e ossa parietali) del cranio viene tipicamente utilizzata per estrarre il midollo osseo e questo midollo osseo è specificamente indicato come midollo osseo del cranio in questo studio.

Il protocollo è stato approvato dal Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). Nel presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6 (3-4 mesi; 22-28 g). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Sospensione di una singola cellula dal cervello di topo

NOTA: La Figura 1 illustra la panoramica del protocollo di isolamento delle cellule cerebrali.

1. Anestetizzare, intubare e fissare il topo, come dimostrato in precedenza¹¹.
2. Praticare un'incisione addominale superiore attraverso la pelle e gli strati muscolari sottostanti e tagliare con cura il diaframma e le costole per creare l'apertura nella cavità toracica.
3. Riempire una siringa da 30 ml con PBS freddo e collegarla all'ago di perfusione smussato tramite un tubo di silicone. Inserire con cautela l'ago di perfusione nel ventricolo sinistro.
4. Eseguire un piccolo taglio nell'atrio destro per consentire il drenaggio del sangue e quindi perfondere¹² il topo a una velocità di flusso di ~ 10 ml/min per 3-4 minuti.
   NOTA: Per migliorare la clearance del sangue nel cervello, può essere preso in considerazione l'aumento del volume della soluzione di perfusione e l'aggiunta di eparina.
5. Decapita il topo e fai un'incisione sulla linea mediana attraverso la pelle sulla parte superiore della testa per esporre il cranio.
6. Raschiare via con cura il tessuto connettivo sovrastante il cranio utilizzando una pinza smussata.
7. Usa le forbici da dissezione affilate per tagliare con cura le suture del cranio lungo la linea mediana e su entrambi i lati, creando un lembo.
8. Sollevare delicatamente il lembo cranico per esporre il cervello e utilizzare una pinza smussata per rimuovere con cura il cervello dalla cavità cranica.
9. Immergere il cervello in una capsula di Petri contenente PBS ghiacciato e rimuovere eventuali residui di tessuto meningale.
   NOTA: Per preservare al meglio la vitalità cellulare, si consiglia di eseguire tutti i passaggi seguenti su ghiaccio o a 4 °C.
10. Mettere il cervello in un omogeneizzatore Dounce in vetro da 15 ml pre-raffreddato contenente 20 ml (cervello intero) o 12 ml (mezzo cervello) di tampone HBSS vecchio ghiaccio.
11. Usa il pestello Dounce sciolto per dissociare delicatamente e lentamente il tessuto cerebrale con circa 100-120 colpi di ghiaccio.
    NOTA: Questo passaggio è fondamentale per ottenere una grande quantità di cellule cerebrali sane. Questo passaggio dura circa 10 minuti. Interrompere l'omogeneizzazione quando non sono visibili pezzi sostanziali di tessuto cerebrale nella sospensione. A questo punto, il pestello può facilmente abbassarsi senza alcuna forza.
12. Filtrare la sospensione di tessuto cerebrale risultante attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta da centrifuga da 50 mL.
13. Sciacquare la provetta Dounce con 5 mL di HBSS e procedere con la filtrazione per massimizzare la raccolta cellulare.
14. Centrifugare la sospensione di tessuto filtrato a 550 x g per 6 minuti a 4 °C.
15. Rimuovere il surnatante utilizzando un aspiratore a vuoto e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di soluzione a gradiente di densità isotonica al 30%.
    NOTA: Per ottenere 15 mL di soluzione a gradiente di densità isotonica al 30%, miscelare 4,5 mL di terreno a gradiente di densità stock al 100%, 1,5 mL di 10× PBS e 9 mL di ddH₂O.
16. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e aggiungere 9 mL (cervello intero) o 6 mL (mezzo cervello) di soluzione con gradiente di densità al 30%.
17. Capovolgere delicatamente il tubo per garantire una miscelazione accurata.
18. Centrifugare immediatamente la provetta a 845 x g con accelerazione e freno impostati al livello 3, per 20 min a 4 °C.
19. Rimuovere delicatamente la provetta dalla centrifuga senza agitare e aspirare con cura lo strato di mielina superiore utilizzando una punta da 1 ml collegata al vuoto.
    NOTA: È di fondamentale importanza non disturbare questo strato. La mielina residua può avere un impatto negativo sulla salute delle cellule e compromettere le analisi a valle.
20. Aspirare il surnatante, lasciando 1-2 mL, e risospendere il pellet cellulare con un minimo di 10 mL di HBSS freddo.
21. Centrifugare a 550 x g per 6 min a 4 °C.
22. Lavare ancora una volta con un minimo di 7 ml di HBSS freddo.
23. Rimuovere la maggior parte possibile del surnatante e risospendere le cellule per l'analisi della citometria a flusso utilizzando 100-200 μl di tampone per citometria a flusso.
    NOTA: Il tampone FACS per citometria a flusso utilizzato per questo studio contiene lo 0,5% di BSA e 2 mM di EDTA in 1× PBS. Si consiglia una piastra con fondo a V a 96 pozzetti per la colorazione delle cellule per ridurre al minimo la perdita di cellule durante le fasi di lavaggio.
24. Eseguire l'analisi della citometria a flusso utilizzando un protocollo standard stabilito nei singoli laboratori¹³.
    1. In breve, miscelare 80 μl di sospensione cellulare con 20 μl di miscela di anticorpi in una piastra con fondo a V a 96 pozzetti e incubare per 25 minuti a 4 °C.
    2. Lavare con 200 μl di tampone FACS e quindi risospendere le cellule con 100 μl di HBSS più reagente per la colorazione della vitalità cellulare.
    3. Dopo un'incubazione di 15 minuti a 4 °C, lavare con tampone FACS e risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS per l'analisi di citometria a flusso.

2. Preparazione di una sospensione unicellulare di midollo osseo da calvaria di topo

NOTA: La Figura 2 illustra la panoramica della procedura di isolamento del midollo osseo del cranio.

1. Perfondere il mouse come descritto nel passaggio 1.4.
2. Decapita il topo e fai un'incisione cutanea sulla linea mediana sul cuoio capelluto per esporre il cranio.
3. Tagliare il cranio, partendo dal forame magno e avanzando lungo i lati laterali della calvaria con forbici affilate. Quindi, sollevare e rimuovere la calvaria.
   NOTA: Il cervello può essere prelevato dallo stesso topo ed elaborato utilizzando la fase 1, consentendo l'analisi delle cellule immunitarie sia dal cervello che dal midollo osseo del cranio.
4. Staccare con cura la dura madre dal cranio al microscopio da dissezione utilizzando una pinza smussata.
   NOTA: È più facile iniziare dai bordi dell'osso occipitale, staccarsi lentamente e progredire costantemente verso l'area frontale, lavorando verso l'interno.
5. Mettere la calvaria nella pirofila con ghiaccio e sciacquare la calvaria con una pipetta da 1 ml, assicurandosi di rimuovere i residui di sangue dalla sua superficie.
6. Trasferire la calvaria in un nuovo piatto con PBS fresco e freddo sufficiente per immergere la calvaria.
7. Utilizzare forbici sterili per tagliare la calvaria in frammenti di circa 3 mm x 3 mm in PBS freddo.
   NOTA: I metodi di ritaglio possono influire sull'efficienza dell'estrazione del midollo osseo calvaria. Si consiglia di utilizzare lo stesso metodo di ritaglio per ridurre al minimo la variabilità. È anche importante tagliare le suture. La Figura 2B illustra un approccio.
8. Praticare un foro sul fondo di una provetta da microcentrifuga da 500 μL utilizzando un ago da 18 G.
9. Inserire questa provetta in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 20 μL di PBS freddo.
10. Trasferire i frammenti di calvaria nella provetta da 500 μl.
    NOTA: I frammenti ossei devono essere impacchettati in modo lasco per aumentare l'efficienza dell'estrazione.
11. Centrifugare a 10.000 x g per 30 s a 4 °C.
    NOTA: Per massimizzare il recupero cellulare, utilizzare un ago da 18 G per mescolare delicatamente i frammenti di calvaria e ripetere questo passaggio altre 1-2 volte.
12. Risospendere le cellule del midollo osseo di calvaria raccolte in 500 μL di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare a temperatura ambiente per 30 s.
13. Trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 4 mL di PBS freddo.
14. Centrifugare a 400 x g per 6 min a 4 °C.
15. Lavare ancora una volta con 5 ml di PBS freddo.
16. Risospendere il pellet della cella in un tampone appropriato. Per la citometria a flusso, in genere utilizziamo 500 μL di tampone FACS.
17. Per l'analisi della citometria a flusso, eseguire il conteggio delle cellule e utilizzare circa 1 x 10⁶ cellule per la colorazione degli anticorpi.
    NOTA: Assicurarsi di includere il passaggio del blocco Fc prima della colorazione degli anticorpi¹³.

Per preparare le cellule immunitarie dal tessuto cerebrale del topo, il protocollo produce generalmente cellule con un'elevata vitalità (84,1% ± 2,3% [media ± SD]). Circa il 70%-80% di queste cellule sono CD45 positive. Nel cervello di topo normale, quasi tutte le cellule CD45+ sono microglia (CD45LowCD11b+), come previsto. Questo protocollo è stato utilizzato in laboratorio per varie applicazioni, tra cui l'analisi della citometria a flusso, la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e l'analisi scRNA-seq. Ad esempio, è stata condotta un'analisi di citometria a flusso in un modello di ictus (Figura 3). I topi sono stati sottoposti a un modello di ictus transitorio, occlusione dell'arteria cerebrale media del filamento di 30 minuti (MCAO)14. Il terzo giorno dopo l'ictus, le cellule sono state preparate da cervelli di topo e colorate con marcatori comuni della superficie delle cellule immunitarie. La strategia di gating è illustrata nella Figura 3A. Coerentemente con la ricerca precedente13,15, è stato osservato un marcato aumento delle celluleCD45 High nell'emisfero omolaterale (Figura 3B,C), indicando l'infiltrazione della cellula immunitaria nel cervello.

Per il protocollo del midollo osseo del cranio, è stata costantemente raggiunta una resa sostanziale di cellule del midollo osseo del cranio (circa 2 x 106 cellule) con un'eccellente vitalità (93,8% ± 1,8% [media ± DS]). Come previsto, la maggior parte di queste cellule sono CD45 positive. Per illustrare l'utilità di questo protocollo, è stato condotto uno studio comparativo per caratterizzare la composizione delle cellule immunitarie sia nel midollo osseo del femore che nel midollo osseo del cranio di topi naïve (Figura 4). Come illustrato nei grafici rappresentativi, la composizione delle cellule immunitarie era simile tra il femore e il midollo osseo del cranio (Figura 4A, B). È interessante notare che la frequenza dei neutrofili sembra essere più alta nel femore che nell'osso del cranio (Figura 4C). Tuttavia, questo risultato richiede un'ulteriore convalida, poiché la dimensione del campione era piccola per questo studio pilota.

Figura 1: Panoramica del protocollo di isolamento delle cellule cerebrali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Il protocollo di isolamento delle cellule del midollo osseo del cranio. (A) Panoramica della procedura. (B) Il modello raccomandato per il taglio del cranio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi rappresentativa della citometria a flusso delle cellule immunitarie nel cervello dell'ictus. (A) Un esempio della strategia di gating. I grafici raffigurano le seguenti popolazioni di cellule immunitarie: microglia (CD45LowCD11b+), cellule NK (CD45HighNK1.1+), neutrofili (CD45HighLy6G+), cellule T (CD45HighCD11b-CD3+) e cellule B (CD45HighCD11b-CD19+). Questo esempio rappresenta un'analisi delle cellule immunitarie cerebrali nell'emisfero omolaterale il giorno 3 dopo l'ictus. (B,C) Infiltrazione di cellule immunitarie nel cervello dell'ictus. I giovani topi maschi sono stati sottoposti a occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media (MCAO). Il giorno 3, i cervelli sono stati raccolti e divisi in emisferi sinistro (controlaterale) e destro (omolaterale). Le cellule cerebrali sono state preparate secondo il protocollo descritto e quindi sottoposte ad analisi di citometria a flusso. Grafici rappresentativi illustrano un aumento delle cellule immunitarie infiltranti nell'emisfero omolaterale (CD45High cells; B). I dati quantitativi sono riportati nei grafici a barre (C). Il numero di cellule è stato calcolato in base alla conta cellulare e al volume registrati nei dati della citometria a flusso. I dati sono presentati come media ± SEM. *p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi rappresentativa della citometria a flusso delle cellule del midollo osseo del cranio. Per il confronto, è stata inclusa l'analisi delle cellule del midollo osseo del femore. I grafici raffigurano le seguenti popolazioni di cellule immunitarie: cellule NK (CD45+NK1.1+), neutrofili (CD45+CD11b+Ly6G+), cellule T (CD45+CD11b-CD3+) e cellule B (CD45+CD11b-CD19+). (A) Grafici rappresentativi per il midollo osseo del femore. (B) Grafici rappresentativi del midollo osseo del cranio. (C) Confronto della composizione delle cellule immunitarie tra femore e midollo osseo del cranio. I dati sono presentati come media ± SEM. *p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nessuno.