Isolamento delle cellule immunitarie dal cervello e dal cranio del topo

Sommario

Per studiare la risposta immunitaria ai disturbi cerebrali, un approccio comune consiste nell'analizzare i cambiamenti nelle cellule immunitarie. Qui, vengono forniti due protocolli semplici ed efficaci per isolare le cellule immunitarie dal tessuto cerebrale murino e dal midollo osseo del cranio.

Abstract

Prove crescenti indicano che la risposta immunitaria innescata da disturbi cerebrali (ad esempio, ischemia cerebrale ed encefalomielite autoimmune) si verifica non solo nel cervello, ma anche nel cranio. Un passo fondamentale verso l'analisi dei cambiamenti nelle popolazioni di cellule immunitarie sia nel cervello che nel midollo osseo del cranio dopo un danno cerebrale (ad esempio, ictus) è ottenere un numero sufficiente di cellule immunitarie di alta qualità per le analisi a valle. Qui, vengono forniti due protocolli ottimizzati per isolare le cellule immunitarie dal cervello e dal midollo osseo del cranio. I vantaggi di entrambi i protocolli si riflettono nella loro semplicità, velocità ed efficacia nel produrre una grande quantità di cellule immunitarie vitali. Queste cellule possono essere adatte per una vasta gamma di applicazioni a valle, come lo smistamento cellulare, la citometria a flusso e l'analisi trascrittomica. Per dimostrare l'efficacia dei protocolli, sono stati eseguiti esperimenti di immunofenotipizzazione su cervelli colpiti da ictus e midollo osseo cranio cerebrale normale utilizzando l'analisi della citometria a flusso, e i risultati sono stati allineati con i risultati degli studi pubblicati.

Introduzione

Il cervello, il fulcro centrale del sistema nervoso, è protetto dal cranio. Sotto il cranio ci sono tre strati di tessuto connettivo noti come meningi: la dura madre, l'aracnoide e la pia madre. Il liquido cerebrospinale (CSF) circola nello spazio subaracnoideo tra l'aracnoide e la pia madre, ammortizzando il cervello e rimuovendo anche i rifiuti attraverso il sistema glinfatico ^1,2. Insieme, questa architettura unica fornisce un ambiente sicuro e di supporto che mantiene la stabilità del cervello e lo protegge da potenziali lesioni.

Il cervello è stato a lungo considerato immuno-privilegiato. Tuttavia, questa nozione è stata parzialmente abbandonata poiché prove crescenti indicano che, oltre alle microglia residenti nel parenchima, i bordi del cervello, compreso il plesso coroideo e le meningi, ospitano una vasta gamma di cellule immunitarie³. Queste cellule svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi, nella sorveglianza della salute del cervello e nell'avvio della risposta immunitaria alle lesioni cerebrali. In particolare, recenti scoperte indicano che il cranio è coinvolto nell'immunità delle meningi e può contribuire alla risposta immunitaria nel cervello dopo una lesione. Nel 2018, Herisson et al. hanno fatto una scoperta fondamentale dei canali vascolari diretti che collegano il midollo osseo del cranio alle meningi, stabilendo così un percorso anatomico per la migrazione dei leucociti ^4,5. Successivamente, Cugurra et al. hanno dimostrato che molte cellule mieloidi (ad esempio, monociti e neutrofili) e le cellule B nelle meningi non originano dal sangue⁶. Utilizzando tecniche come il trapianto di lembo osseo calvario e regimi di irradiazione selettiva, gli autori hanno fornito prove convincenti che il midollo osseo del cranio funge da fonte locale per le cellule mieloidi nelle meningi e per il parenchima del SNC dopo una lesione del SNC⁶. Inoltre, un altro studio ha proposto che le cellule B meningee siano costantemente fornite dal midollo osseo del cranio⁷. Più recentemente, una nuova struttura, chiamata uscita della cuffia aracnoidea (ACE), è stata identificata come una porta diretta tra la dura madre e il cervello per il traffico di cellule immunitarie⁸.

Questi interessanti risultati hanno importanti implicazioni per l'origine dell'infiltrazione delle cellule immunitarie nel cervello danneggiato (ad esempio, dopo un ictus ischemico). Un ampio corpus di prove ha indicato che dopo l'ictus, molte cellule immunitarie si infiltrano nel cervello, contribuendo sia al danno cerebrale acuto che al recupero cerebrale cronico. L'idea convenzionale è che queste cellule siano leucociti circolanti nel sangue che si infiltrano nel cervello, il che è in gran parte facilitato dal danno alla barriera emato-encefalica indotto dall'ictus. Tuttavia, questa nozione è stata messa in discussione. In uno studio, le cellule immunitarie nel cranio e nella tibia dei topi sono state etichettate in modo diverso e, a 6 ore dall'ictus, è stata riscontrata una diminuzione significativamente maggiore dei neutrofili e dei monociti nel cranio rispetto all'ictus. La tibia e altri neutrofili derivati dal cranio erano presenti nel cervello ischemico. Questi dati suggeriscono che nella fase acuta di ictus, i neutrofili nel cervello ischemico originano principalmente dal midollo osseo del cranio⁴. È interessante notare che il liquido cerebrospinale può guidare questa migrazione. Infatti, due recenti rapporti hanno dimostrato che il liquido cerebrospinale può trasmettere direttamente segnali di segnalazione dal cervello al midollo osseo del cranio attraverso i canali del cranio e istruire la migrazione cellulare e l'emopoiesi nel midollo osseo del cranio dopo una lesione del SNC ^9,10.

Alla luce di queste recenti scoperte, è diventato importante analizzare i cambiamenti nelle cellule immunitarie sia nel cervello che nel midollo osseo del cranio, quando si studia la risposta immunitaria ai disturbi cerebrali. In tali indagini, è necessario un numero sufficiente di cellule immunitarie di alta qualità per le analisi a valle come lo smistamento cellulare, l'analisi della citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq). Qui, l'obiettivo generale è quello di presentare due procedure ottimizzate per la preparazione di sospensioni unicellulari dal tessuto cerebrale e dal midollo osseo del cranio. È importante notare che la calvaria (osso frontale, osso occipitale e ossa parietali) del cranio viene tipicamente utilizzata per estrarre il midollo osseo e questo midollo osseo è specificamente indicato come midollo osseo del cranio in questo studio.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dal Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). Nel presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6 (3-4 mesi; 22-28 g). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Sospensione di una singola cellula dal cervello di topo

NOTA: La Figura 1 illustra la panoramica del protocollo di isolamento delle cellule cerebrali.

1. Anestetizzare, intubare e fissare il topo, come dimostrato in precedenza¹¹.
2. Praticare un'incisione addominale superiore attraverso la pelle e gli strati muscolari sottostanti e tagliare con cura il diaframma e le costole per creare l'apertura nella cavità toracica.
3. Riempire una siringa da 30 ml con PBS freddo e collegarla all'ago di perfusione smussato tramite un tubo di silicone. Inserire con cautela l'ago di perfusione nel ventricolo sinistro.
4. Eseguire un piccolo taglio nell'atrio destro per consentire il drenaggio del sangue e quindi perfondere¹² il topo a una velocità di flusso di ~ 10 ml/min per 3-4 minuti.
   NOTA: Per migliorare la clearance del sangue nel cervello, può essere preso in considerazione l'aumento del volume della soluzione di perfusione e l'aggiunta di eparina.
5. Decapita il topo e fai un'incisione sulla linea mediana attraverso la pelle sulla parte superiore della testa per esporre il cranio.
6. Raschiare via con cura il tessuto connettivo sovrastante il cranio utilizzando una pinza smussata.
7. Usa le forbici da dissezione affilate per tagliare con cura le suture del cranio lungo la linea mediana e su entrambi i lati, creando un lembo.
8. Sollevare delicatamente il lembo cranico per esporre il cervello e utilizzare una pinza smussata per rimuovere con cura il cervello dalla cavità cranica.
9. Immergere il cervello in una capsula di Petri contenente PBS ghiacciato e rimuovere eventuali residui di tessuto meningale.
   NOTA: Per preservare al meglio la vitalità cellulare, si consiglia di eseguire tutti i passaggi seguenti su ghiaccio o a 4 °C.
10. Mettere il cervello in un omogeneizzatore Dounce in vetro da 15 ml pre-raffreddato contenente 20 ml (cervello intero) o 12 ml (mezzo cervello) di tampone HBSS vecchio ghiaccio.
11. Usa il pestello Dounce sciolto per dissociare delicatamente e lentamente il tessuto cerebrale con circa 100-120 colpi di ghiaccio.
    NOTA: Questo passaggio è fondamentale per ottenere una grande quantità di cellule cerebrali sane. Questo passaggio dura circa 10 minuti. Interrompere l'omogeneizzazione quando non sono visibili pezzi sostanziali di tessuto cerebrale nella sospensione. A questo punto, il pestello può facilmente abbassarsi senza alcuna forza.
12. Filtrare la sospensione di tessuto cerebrale risultante attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta da centrifuga da 50 mL.
13. Sciacquare la provetta Dounce con 5 mL di HBSS e procedere con la filtrazione per massimizzare la raccolta cellulare.
14. Centrifugare la sospensione di tessuto filtrato a 550 x g per 6 minuti a 4 °C.
15. Rimuovere il surnatante utilizzando un aspiratore a vuoto e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di soluzione a gradiente di densità isotonica al 30%.
    NOTA: Per ottenere 15 mL di soluzione a gradiente di densità isotonica al 30%, miscelare 4,5 mL di terreno a gradiente di densità stock al 100%, 1,5 mL di 10× PBS e 9 mL di ddH₂O.
16. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e aggiungere 9 mL (cervello intero) o 6 mL (mezzo cervello) di soluzione con gradiente di densità al 30%.
17. Capovolgere delicatamente il tubo per garantire una miscelazione accurata.
18. Centrifugare immediatamente la provetta a 845 x g con accelerazione e freno impostati al livello 3, per 20 min a 4 °C.
19. Rimuovere delicatamente la provetta dalla centrifuga senza agitare e aspirare con cura lo strato di mielina superiore utilizzando una punta da 1 ml collegata al vuoto.
    NOTA: È di fondamentale importanza non disturbare questo strato. La mielina residua può avere un impatto negativo sulla salute delle cellule e compromettere le analisi a valle.
20. Aspirare il surnatante, lasciando 1-2 mL, e risospendere il pellet cellulare con un minimo di 10 mL di HBSS freddo.
21. Centrifugare a 550 x g per 6 min a 4 °C.
22. Lavare ancora una volta con un minimo di 7 ml di HBSS freddo.
23. Rimuovere la maggior parte possibile del surnatante e risospendere le cellule per l'analisi della citometria a flusso utilizzando 100-200 μl di tampone per citometria a flusso.
    NOTA: Il tampone FACS per citometria a flusso utilizzato per questo studio contiene lo 0,5% di BSA e 2 mM di EDTA in 1× PBS. Si consiglia una piastra con fondo a V a 96 pozzetti per la colorazione delle cellule per ridurre al minimo la perdita di cellule durante le fasi di lavaggio.
24. Eseguire l'analisi della citometria a flusso utilizzando un protocollo standard stabilito nei singoli laboratori¹³.
    1. In breve, miscelare 80 μl di sospensione cellulare con 20 μl di miscela di anticorpi in una piastra con fondo a V a 96 pozzetti e incubare per 25 minuti a 4 °C.
    2. Lavare con 200 μl di tampone FACS e quindi risospendere le cellule con 100 μl di HBSS più reagente per la colorazione della vitalità cellulare.
    3. Dopo un'incubazione di 15 minuti a 4 °C, lavare con tampone FACS e risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS per l'analisi di citometria a flusso.

2. Preparazione di una sospensione unicellulare di midollo osseo da calvaria di topo

NOTA: La Figura 2 illustra la panoramica della procedura di isolamento del midollo osseo del cranio.

1. Perfondere il mouse come descritto nel passaggio 1.4.
2. Decapita il topo e fai un'incisione cutanea sulla linea mediana sul cuoio capelluto per esporre il cranio.
3. Tagliare il cranio, partendo dal forame magno e avanzando lungo i lati laterali della calvaria con forbici affilate. Quindi, sollevare e rimuovere la calvaria.
   NOTA: Il cervello può essere prelevato dallo stesso topo ed elaborato utilizzando la fase 1, consentendo l'analisi delle cellule immunitarie sia dal cervello che dal midollo osseo del cranio.
4. Staccare con cura la dura madre dal cranio al microscopio da dissezione utilizzando una pinza smussata.
   NOTA: È più facile iniziare dai bordi dell'osso occipitale, staccarsi lentamente e progredire costantemente verso l'area frontale, lavorando verso l'interno.
5. Mettere la calvaria nella pirofila con ghiaccio e sciacquare la calvaria con una pipetta da 1 ml, assicurandosi di rimuovere i residui di sangue dalla sua superficie.
6. Trasferire la calvaria in un nuovo piatto con PBS fresco e freddo sufficiente per immergere la calvaria.
7. Utilizzare forbici sterili per tagliare la calvaria in frammenti di circa 3 mm x 3 mm in PBS freddo.
   NOTA: I metodi di ritaglio possono influire sull'efficienza dell'estrazione del midollo osseo calvaria. Si consiglia di utilizzare lo stesso metodo di ritaglio per ridurre al minimo la variabilità. È anche importante tagliare le suture. La Figura 2B illustra un approccio.
8. Praticare un foro sul fondo di una provetta da microcentrifuga da 500 μL utilizzando un ago da 18 G.
9. Inserire questa provetta in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 20 μL di PBS freddo.
10. Trasferire i frammenti di calvaria nella provetta da 500 μl.
    NOTA: I frammenti ossei devono essere impacchettati in modo lasco per aumentare l'efficienza dell'estrazione.
11. Centrifugare a 10.000 x g per 30 s a 4 °C.
    NOTA: Per massimizzare il recupero cellulare, utilizzare un ago da 18 G per mescolare delicatamente i frammenti di calvaria e ripetere questo passaggio altre 1-2 volte.
12. Risospendere le cellule del midollo osseo di calvaria raccolte in 500 μL di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare a temperatura ambiente per 30 s.
13. Trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 4 mL di PBS freddo.
14. Centrifugare a 400 x g per 6 min a 4 °C.
15. Lavare ancora una volta con 5 ml di PBS freddo.
16. Risospendere il pellet della cella in un tampone appropriato. Per la citometria a flusso, in genere utilizziamo 500 μL di tampone FACS.
17. Per l'analisi della citometria a flusso, eseguire il conteggio delle cellule e utilizzare circa 1 x 10⁶ cellule per la colorazione degli anticorpi.
    NOTA: Assicurarsi di includere il passaggio del blocco Fc prima della colorazione degli anticorpi¹³.

Risultati

Per preparare le cellule immunitarie dal tessuto cerebrale del topo, il protocollo produce generalmente cellule con un'elevata vitalità (84,1% ± 2,3% [media ± SD]). Circa il 70%-80% di queste cellule sono CD45 positive. Nel cervello di topo normale, quasi tutte le cellule CD45⁺ sono microglia (CD45^LowCD11b⁺), come previsto. Questo protocollo è stato utilizzato in laboratorio per varie applicazioni, tra cui l'analisi della citometria a flusso, la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e l'analisi scRNA-seq. Ad esempio, è stata condotta un'analisi di citometria a flusso in un modello di ictus (Figura 3). I topi sono stati sottoposti a un modello di ictus transitorio, occlusione dell'arteria cerebrale media del filamento di 30 minuti (MCAO)¹⁴. Il terzo giorno dopo l'ictus, le cellule sono state preparate da cervelli di topo e colorate con marcatori comuni della superficie delle cellule immunitarie. La strategia di gating è illustrata nella Figura 3A. Coerentemente con la ricerca precedente^13,15, è stato osservato un marcato aumento delle cellule^{CD45 High} nell'emisfero omolaterale (Figura 3B,C), indicando l'infiltrazione della cellula immunitaria nel cervello.

Per il protocollo del midollo osseo del cranio, è stata costantemente raggiunta una resa sostanziale di cellule del midollo osseo del cranio (circa 2 x 10⁶ cellule) con un'eccellente vitalità (93,8% ± 1,8% [media ± DS]). Come previsto, la maggior parte di queste cellule sono CD45 positive. Per illustrare l'utilità di questo protocollo, è stato condotto uno studio comparativo per caratterizzare la composizione delle cellule immunitarie sia nel midollo osseo del femore che nel midollo osseo del cranio di topi naïve (Figura 4). Come illustrato nei grafici rappresentativi, la composizione delle cellule immunitarie era simile tra il femore e il midollo osseo del cranio (Figura 4A, B). È interessante notare che la frequenza dei neutrofili sembra essere più alta nel femore che nell'osso del cranio (Figura 4C). Tuttavia, questo risultato richiede un'ulteriore convalida, poiché la dimensione del campione era piccola per questo studio pilota.

Figura 1: Panoramica del protocollo di isolamento delle cellule cerebrali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Il protocollo di isolamento delle cellule del midollo osseo del cranio. (A) Panoramica della procedura. (B) Il modello raccomandato per il taglio del cranio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi rappresentativa della citometria a flusso delle cellule immunitarie nel cervello dell'ictus. (A) Un esempio della strategia di gating. I grafici raffigurano le seguenti popolazioni di cellule immunitarie: microglia (CD45^LowCD11b⁺), cellule NK (CD45^HighNK1.1⁺), neutrofili (CD45^HighLy6G⁺), cellule T (CD45^HighCD11b-CD3⁺) e cellule B (CD45^HighCD11b-CD19⁺). Questo esempio rappresenta un'analisi delle cellule immunitarie cerebrali nell'emisfero omolaterale il giorno 3 dopo l'ictus. (B,C) Infiltrazione di cellule immunitarie nel cervello dell'ictus. I giovani topi maschi sono stati sottoposti a occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media (MCAO). Il giorno 3, i cervelli sono stati raccolti e divisi in emisferi sinistro (controlaterale) e destro (omolaterale). Le cellule cerebrali sono state preparate secondo il protocollo descritto e quindi sottoposte ad analisi di citometria a flusso. Grafici rappresentativi illustrano un aumento delle cellule immunitarie infiltranti nell'emisfero omolaterale (CD45^High cells; B). I dati quantitativi sono riportati nei grafici a barre (C). Il numero di cellule è stato calcolato in base alla conta cellulare e al volume registrati nei dati della citometria a flusso. I dati sono presentati come media ± SEM. *p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi rappresentativa della citometria a flusso delle cellule del midollo osseo del cranio. Per il confronto, è stata inclusa l'analisi delle cellule del midollo osseo del femore. I grafici raffigurano le seguenti popolazioni di cellule immunitarie: cellule NK (CD45⁺NK1.1⁺), neutrofili (CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺), cellule T (CD45⁺CD11b-CD3⁺) e cellule B (CD45⁺CD11b-CD19⁺). (A) Grafici rappresentativi per il midollo osseo del femore. (B) Grafici rappresentativi del midollo osseo del cranio. (C) Confronto della composizione delle cellule immunitarie tra femore e midollo osseo del cranio. I dati sono presentati come media ± SEM. *p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui, vengono presentati due protocolli semplici ma efficaci per isolare le cellule immunitarie dal cervello e dal midollo osseo del cranio. Questi protocolli possono produrre in modo affidabile una grande quantità di cellule immunitarie vitali che possono essere adatte per diverse applicazioni a valle, in particolare per la citometria a flusso.

Per studiare la neuroinfiammazione in vari disturbi cerebrali, sono stati stabiliti molti protocolli per i preparati di cellule immunitarie dal cervello e utilizzati in diversi laboratori 15,16,17. Gli approcci comuni prevedono la dissociazione cellulare basata su enzimi seguita dalla separazione a gradiente. Tipicamente, in questi protocolli, il tessuto cerebrale viene tritato e quindi incubato in una soluzione di digestione enzimatica contenente sia collagenasi che DNasi per 30-60 minuti a 37 °C con agitazione delicata. Dopo la digestione, le cellule subiscono un'ulteriore dissociazione utilizzando un metodo meccanico come il pipettaggio o l'omogeneizzazione Dounce. Dopo essere passate attraverso un filtro cellulare (ad esempio, un filtro da 70 μm), le cellule vengono sottoposte a centrifugazione in gradiente (spesso soluzione con gradiente di densità al 30%/70%) per rimuovere la mielina, i globuli rossi e i detriti e per arricchire i leucociti. Tuttavia, questo approccio richiede un'incubazione enzimatica prolungata a 37 °C che può alterare sostanzialmente il trascrittoma e il proteoma delle cellule immunitarie cerebrali. Infatti, un'indagine sistematica ha suggerito che l'approccio enzimatico introduce profonde alterazioni nel trascrittoma e nel proteotipo di specifiche cellule cerebrali¹⁸. Ciò potrebbe portare ad artefatti nelle successive analisi trascrittomiche come scRNA-seq. Al contrario, il protocollo qui riportato utilizza un approccio di dissociazione meccanica a basse temperature durante tutta la procedura, sopprimendo così il metabolismo cellulare. Ciò garantisce una migliore conservazione dello stato trascrizionale e proteomico, riducendo al minimo i potenziali artefatti. Durante lo sviluppo del protocollo, abbiamo notato che l'utilizzo di un grande omogeneizzatore Dounce per omogeneizzare il tessuto cerebrale è fondamentale per ottenere un numero maggiore di cellule con una minore morte cellulare. È probabile che durante l'omogeneizzazione di Dounce, la massiccia presenza di matrici extracellulari, detriti cellulari e componenti citoplasmatici sia tossica per le cellule. L'uso di una quantità eccessiva di tampone aiuta a diluire queste sostanze tossiche e, quindi, mitiga i loro effetti dannosi, portando a una migliore vitalità cellulare. I dati della citometria a flusso hanno confermato un tasso di vitalità di circa l'85% delle cellule immunitarie preparate con questo protocollo. Inoltre, è degno di nota che la centrifugazione con una soluzione con gradiente di densità del 30% arricchisce efficacemente le cellule immunitarie cerebrali e rimuove la mielina. Questo può anche ridurre il costo della preparazione delle cellule.

Gli studi sulle cellule immunitarie nel midollo osseo del cranio sono ancora limitati. Un metodo comunemente usato per isolare le cellule dal calvario del cranio di topo prevede il taglio del cranio in piccoli pezzi e quindi la frantumazione meccanica dei pezzi con un pestello⁶. Nel protocollo attuale viene utilizzata la centrifugazione breve. Questo metodo è adattato da un protocollo pubblicato per la preparazione del midollo osseo da femori e tibie¹⁹. Per queste ossa lunghe, è sufficiente tagliare un'estremità dell'osso per raccogliere il midollo osseo mediante centrifugazione. Per il cranio, questo passaggio viene modificato tagliandolo in diversi piccoli pezzi per aprire la cavità del midollo. Si consiglia di utilizzare un modello coerente per il taglio del cranio al fine di ottenere una conta cellulare riproducibile. Inoltre, per massimizzare il recupero delle cellule del midollo osseo, i pezzi del cranio possono essere sottoposti a 2-3 cicli di centrifugazione con miscelazione tra ogni centrifugazione.

Entrambi i protocolli hanno delle limitazioni. In primo luogo, l'uso della centrifugazione della soluzione con gradiente di densità al 30% potrebbe non rimuovere efficacemente i globuli rossi rimanenti nel cervello, il che può verificarsi a causa di una perfusione incompleta. Inoltre, se la struttura della mielina viene modulata in determinate condizioni, una soluzione con gradiente di densità del 30% potrebbe non essere una concentrazione ottimale per la loro rimozione. In questo caso, è necessario stabilire un'altra concentrazione di lavoro della soluzione del gradiente di densità. In secondo luogo, sebbene l'analisi della citometria a flusso indichi una buona vitalità cellulare delle cellule immunitarie cerebrali utilizzando il protocollo descritto, deve ancora essere valutata per altre applicazioni, come l'analisi trascrittomica in cui l'actinomicina D può essere utilizzata. In terzo luogo, la calvaria viene utilizzata per preparare il midollo osseo del cranio. Tuttavia, va notato che le cellule immunitarie esistono in molte altre parti del cranio. Infine, le meningi, in particolare la dura madre, ospitano diverse cellule immunitarie e svolgono un ruolo nell'omeostasi e nella disfunzione cerebrale²⁰. Per l'analisi immunitaria delle meningi, può essere adottato un protocollo pubblicato altrove 17,21,22,23.

In sintesi, vengono descritti due robusti protocolli per isolare le cellule immunitarie sia dal cervello che dal cranio del topo. Si prevede che questi protocolli siano utili per ottenere una grande quantità di celle di alta qualità, adatte a varie applicazioni a valle.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 diluizione
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 diluizione
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 diluizione
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 diluizione
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 diluizione
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 diluizione
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 diluizione
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 diluizione
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 diluizione
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 diluizione
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 diluizione
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 diluizione
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544