Per studiare la risposta immunitaria ai disturbi cerebrali, un approccio comune consiste nell'analizzare i cambiamenti nelle cellule immunitarie. Qui, vengono forniti due protocolli semplici ed efficaci per isolare le cellule immunitarie dal tessuto cerebrale murino e dal midollo osseo del cranio.
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Articolo metodologico
Isolamento delle cellule immunitarie dal cervello e dal cranio del topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Prove crescenti indicano che la risposta immunitaria innescata da disturbi cerebrali (ad esempio, ischemia cerebrale ed encefalomielite autoimmune) si verifica non solo nel cervello, ma anche nel cranio. Un passo fondamentale verso l'analisi dei cambiamenti nelle popolazioni di cellule immunitarie sia nel cervello che nel midollo osseo del cranio dopo un danno cerebrale (ad esempio, ictus) è ottenere un numero sufficiente di cellule immunitarie di alta qualità per le analisi a valle. Qui, vengono forniti due protocolli ottimizzati per isolare le cellule immunitarie dal cervello e dal midollo osseo del cranio. I vantaggi di entrambi i protocolli si riflettono nella loro semplicità, velocità ed efficacia nel produrre una grande quantità di cellule immunitarie vitali. Queste cellule possono essere adatte per una vasta gamma di applicazioni a valle, come lo smistamento cellulare, la citometria a flusso e l'analisi trascrittomica. Per dimostrare l'efficacia dei protocolli, sono stati eseguiti esperimenti di immunofenotipizzazione su cervelli colpiti da ictus e midollo osseo cranio cerebrale normale utilizzando l'analisi della citometria a flusso, e i risultati sono stati allineati con i risultati degli studi pubblicati.
Introduzione
Il cervello, il fulcro centrale del sistema nervoso, è protetto dal cranio. Sotto il cranio ci sono tre strati di tessuto connettivo noti come meningi: la dura madre, l'aracnoide e la pia madre. Il liquido cerebrospinale (CSF) circola nello spazio subaracnoideo tra l'aracnoide e la pia madre, ammortizzando il cervello e rimuovendo anche i rifiuti attraverso il sistema glinfatico 1,2. Insieme, questa architettura unica fornisce un ambiente sicuro e di supporto che mantiene la stabilità del cervello e lo protegge da potenziali lesioni.
Il cervello è stato a lungo considerato immuno-pr....
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Protocollo
Il protocollo è stato approvato dal Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). Nel presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6 (3-4 mesi; 22-28 g). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Sospensione di una singola cellula dal cervello di topo
NOTA: La Figura 1 illustra la panoramica del protocollo di isolamento delle cellule cerebrali.
- Anestetizzare, intubare e fissare il topo, come dimostrato in precedenza11.
- Praticare ....
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Risultati
Per preparare le cellule immunitarie dal tessuto cerebrale del topo, il protocollo produce generalmente cellule con un'elevata vitalità (84,1% ± 2,3% [media ± SD]). Circa il 70%-80% di queste cellule sono CD45 positive. Nel cervello di topo normale, quasi tutte le cellule CD45+ sono microglia (CD45LowCD11b+), come previsto. Questo protocollo è stato utilizzato in laboratorio per varie applicazioni, tra cui l'analisi della citometria a flusso, la selezione cellulare attivata dalla fluoresc.......
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Discussione
Qui, vengono presentati due protocolli semplici ma efficaci per isolare le cellule immunitarie dal cervello e dal midollo osseo del cranio. Questi protocolli possono produrre in modo affidabile una grande quantità di cellule immunitarie vitali che possono essere adatte per diverse applicazioni a valle, in particolare per la citometria a flusso.
Per studiare la neuroinfiammazione in vari disturbi cerebrali, sono stati stabiliti molti protocolli per i preparati di cellule immunitarie dal cervell.......
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Ringraziamenti
Ringraziamo Kathy Gage per il suo eccellente contributo editoriale. Le figure illustrative sono state create con BioRender.com. Questo studio è stato supportato da fondi del Dipartimento di Anestesiologia (Duke University Medical Center) e da sovvenzioni NIH NS099590, HL157354 e NS127163.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 76332-066 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 76332-068 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| 18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305195 | |
| 1x HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| 96-well V-bottom microplate | SARSTEDT | 82.1583 | |
| AURORA flow cytometer | Cytek bioscience | ||
| BSA | Fisher | BP9706-100 | |
| CD11b-AF594 | BioLegend | 101254 | 1:500 diluizione |
| CD19-BV785 | BioLegend | 115543 | 1:500 diluizione |
| CD19-FITC | BioLegend | 115506 | 1:500 diluizione |
| CD3-APC | BioLegend | 100312 | 1:500 diluizione |
| CD3-PE | BioLegend | 100206 | 1:500 diluizione |
| CD45-Alex 700 | BioLegend | 103128 | 1:500 diluizione |
| CD45-BV421 | Biolegend | 103133 | 1:500 diluizione |
| Cell Strainer 70 um | Avantor | 732-2758 | |
| Dressing Forceps | V. Mueller | NL1410 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fc Block | Biolegend | 101320 | 1:100 diluizione |
| Forceps | Roboz | RS-5047 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | N7167 | 1:500 diluizione |
| Ly6G-BV421 | BioLegend | 127628 | 1:500 diluizione |
| Ly6G-PerCp-cy5.5 | BioLegend | 127615 | 1:500 diluizione |
| NK1.1-APC-cy7 | BioLegend | 108723 | 1:500 diluizione |
| Percoll (density gradient medium) | Cytiva | 17089101 | |
| Phosphate buffer saline (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | BioLegend | 420302 | |
| Scissors | SKLAR | 64-1250 | |
| WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size | DWK Life Sciences | 357544 |
Riferimenti
- Bohr, T., et al. The glymphatic system: Current understanding and modeling. iScience. 25 (9), 104987(2022).
- Jiang-Xie, L. F., et al. Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance. Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).
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Ristampe e permessi
