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Articolo metodologico

Saggio di riassemblaggio della split-luciferasi per misurare i contatti reticolo-mitocondri endoplasmatici in cellule vive

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⸱

DOI:

10.3791/66862

⸱

11 ottobre 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Abbiamo stabilito un saggio di riassemblaggio della luciferasi divisa per monitorare i contatti reticolo endoplasmatico-mitocondri nelle cellule vive. Utilizzando questo saggio, descriviamo un protocollo per misurare quantitativamente il livello di questi accoppiamenti inter-organelli in cellule HEK293T, in condizioni di trattamento chimico.

Abstract

I siti di contatto tra reticolo endoplasmatico (ER) e mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nella salute cellulare e nell'omeostasi, come la regolazione del Ca2+ e dell'omeostasi lipidica, la dinamica mitocondriale, la biogenesi degli autofagosomi e dei mitofagosomi e l'apoptosi. L'incapacità di mantenere un normale accoppiamento ER-mitocondriale è implicata in molte malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica e la paraplegia spastica ereditaria. È di notevole importanza esplorare come la disregolazione dei contatti ER-mitocondriale possa portare alla morte cellulare e se la riparazione di questi contatti al livello normale possa migliorare le condizioni neurodegenerative. Pertanto, saggi migliorati che misurano il livello di questi contatti potrebbero aiutare a illuminare i meccanismi patogenetici di queste malattie. In definitiva, la messa a punto di saggi semplici e affidabili faciliterà lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Qui descriviamo un saggio di split-luciferasi per misurare quantitativamente il livello di contatti ER-mitocondri nelle cellule vive. Questo test può essere utilizzato per studiare il ruolo fisiopatologico di questi contatti e per identificare i loro modulatori nello screening ad alto rendimento.

Introduzione

Le interazioni tra l'ER e i mitocondri sono vitali per l'omeostasi cellulare e la sopravvivenza 1,2,3,4. Prove precedenti indicano che qualsiasi tipo di interruzione o disregolazione nei siti di contatto ER-mitocondri può contribuire a diverse malattie neurodegenerative, metaboliche e cardiovascolari, nonché al cancro 5,6,7,8,9,10. Ad esempio, un aumento anomalo dell'assorbimento di Ca2+ nei mitocondri può portare alla morte cellulare aprendo i pori di transizione della permeabilità dei mitocondri, che sono comunemente osservati in alcuni modelli di malattia di Alzheimer 5,11. Allo stesso modo, la riduzione dei contatti tra ER e mitocondri può comportare una diminuzione della produzione di ATP e una compromissione dell'assunzione di Ca2+, come si è visto nei modelli di sclerosi laterale amiotrofica 5,11,12. Man mano che vengono condotti ulteriori studi nell'ambito dei contatti ER-mitocondri, vengono scoperte ulteriori proteine e geni correlati alla malattia che potrebbero influenzare questi contatti. Nonostante le attuali conoscenze e prove che mostrino il ruolo dei siti di contatto ER-mitocondri, c'è ancora molto lavoro da fare per chiarire come questi contatti possano portare alla perdita della funzione cellulare e, in ultima analisi, alla morte cellulare.

Sono stati sviluppati vari metodi per valutare la vicinanza delle due membrane, la morfologia strutturale e la distanza tra i due siti di contatto degli organelli 3,4,13. Gli approcci per monitorare l'accoppiamento ER-mitocondri includono l'imaging basato su marcatori di fluorescenza14,15, l'imaging basato su FRET-reporter16 e l'imaging basato su sonda a fluorescenza divisa17,18, che utilizzano l'epifluorescenza e la microscopia confocale. Anche la microscopia a super-risoluzione e la microscopia a risoluzione atomica sono strumenti potenti per visualizzare con precisione i contatti inter-organelli, sebbene il loro utilizzo nell'analisi del sito di contatto sia ancora limitato poiché richiedono microscopi altamente dedicati e competenze tecniche19. Inoltre, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), la microscopia elettronica a scansione (SEM) e altre tecniche EM come la tomografia elettronica (ET) e la microscopia crioelettronica, sono comunemente utilizzate in quanto forniscono immagini ultrastrutturali ad alta risoluzione dei siti di contatto, che sono spesso impossibili da esplorare utilizzando altri approcci sperimentali 20,21,22. Tuttavia, questi metodi basati su EM sono una tecnica a bassissima produttività che può anche essere influenzata dalle procedure di fissazione chimica. Più recentemente, sono stati utilizzati metodi basati sull'etichettatura di prossimità per rilevare i siti di contatto e per identificare nuove proteine del sito di contatto. Ad esempio, il saggio di legatura di prossimità (PLA) è stato utilizzato per quantificare le prossimità degli organelli23,24, mentre una versione rivista del test dell'ascorbato perossidasi (APEX) è stata utilizzata per identificare nuove proteine del sito di contatto25,26. È importante riconoscere che tutti questi metodi sopra descritti hanno punti di forza e limiti intrinseci nel rilevare i contatti tra gli organelli. Pertanto, è necessario l'abbinamento di diverse tecniche per ottenere un'interpretazione approfondita dei siti di contatto degli organelli.

In precedenza abbiamo stabilito il saggio di riassemblaggio split-Renilla luciferasi 8 (split-Rluc assay) per monitorare il livello dei contatti di membrana ER-mitocondri (Figura 1A)24,26,27. In breve, ogni metà divisa della Renilla luciferasi è coniugata con una sequenza di targeting ER o mitocondri. Quando vengono trasfettati insieme, ogni metà divisa dell'enzima viene espressa nell'ER o nella membrana mitocondriale. Quando l'ER e i mitocondri sono posizionati in stretta vicinanza l'uno all'altro, le metà divise si uniscono e ricostituiscono l'intero enzima con attività luciferasi. Per il costrutto split-Rluc, abbiamo usato Renilla luciferasi 8 (Rluc8) in pBAD/Myc-His27 per il modello iniziale. Il sito di divisione (tra gli amminoacidi 91 e 92) è stato determinato sulla base di precedenti rapporti27. Per la metà N-terminale dell'Rluc8, le sequenze di DNA per gli amminoacidi 1-91 dell'Rluc8 sono state fuse all'estremità 3' del tag FLAG e alla sequenza di targeting mitocondriale AKAP1 del topo di topo nel vettore TOPO pcDNA3.1 mediante PCR27. Per la metà C-terminale mirata all'ER, le sequenze di DNA che codificano gli amminoacidi 92-311 sono state fuse all'estremità 5' del tag myc e alla sequenza di localizzazione UBC6 ER del lievito. Qui, abbiamo aggiornato il costrutto plasmidico split-Rluc in modo tale che le metà divise della luciferasi Renilla siano espresse in un singolo vettore (pCAG) sotto lo stesso promotore e successivamente scisse in due frammenti quando T2A, una sequenza di peptide 2A auto-scissa dal virus Thosea asigna, viene inserita tra le due metà divise (Figura 1B). La mappa e le sequenze del DNA plasmidico sono fornite nel File Supplementare 1 e nella Figura Supplementare S1. Utilizzando questo sistema, abbiamo misurato gli effetti di tre sostanze chimiche (che inibiscono le GTPasi coinvolte nella polimerizzazione dell'actina) sui contatti ER-mitocondri. Questo saggio split-Rluc è un sistema di analisi semplice ma robusto per lo screening ad alto rendimento per modulatori di contatto inter-organelli24.

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Protocollo

1. Mantenimento delle cellule e semina (Giorno 1)

  1. Mantenere HEK293T cellule in terreni di coltura cellulare contenenti Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS) (in piastre di coltura da 100 mm) in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.
  2. Prima di iniziare, controllare la confluenza della lastra osservandola al microscopio. Quando le cellule raggiungono circa l'80-90% di confluenza, prepararsi a seminare le cellule in una piastra di coltura a 6 pozzetti rimuovendo il terreno e lavando con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS).
  3. Rimuovere il DPBS dalla piastra di coltura e trattare le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA fenolo rosso allo 0,05%. Incubare per 3 minuti, quindi estrarre la piastra dall'incubatore e aggiungere 9 mL di terreno di coltura (DMEM con il 10% di FBS) per fermare la reazione della tripsina. Pipettare lentamente su e giù per assicurarsi che le cellule ancora attaccate alla piastra vengano rimosse. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 50 mL.
  4. Centrifugare a 300 × g per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere il terreno e risospendere i pellet cellulari con 1 mL di terreno fresco (DMEM + 10% FBS).
  5. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
    1. Garantire una distribuzione uniforme delle cellule facendo roteare delicatamente la provetta. Estrarre immediatamente 10 μl della sospensione cellulare e metterli in una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL. Aggiungere 90 μl di terreno nella stessa provetta.
    2. Dopo aver miscelato delicatamente le cellule e i terreni, prelevare la sospensione cellulare e applicare 10 μl in ciascuna delle camere dell'emocitometro pipettando delicatamente sotto il vetrino coprioggetti.
    3. Utilizzando un obiettivo 10x, mettere a fuoco le linee della griglia dell'emocitometro al microscopio. Una volta messo a fuoco, conta il numero di celle in una serie di 16 quadrati (4 x 4 quadrati) usando un contatore di conteggio manuale. Ripeti fino a contare tutte e quattro le serie da 16 caselle.
    4. Calcola il numero totale di cellule/mL prendendo il numero medio di cellule (da ciascuno dei 16 quadrati d'angolo) e moltiplicandolo per 105.
      NOTA: Invece di utilizzare un emocitometro per contare le cellule, è possibile utilizzare un contatore di cellule automatizzato secondo le istruzioni del produttore.
  6. Una volta completato il conteggio delle cellule, preparare a piastrare, le cellule in una piastra a 6 pozzetti a 7,5 × 105 cellule/pozzetto con 2 mL di terreno/pozzetto. In una provetta da 50 mL, aggiungere il volume necessario di cellule insieme a 13 mL di terreno. Erogare 2 mL della sospensione cellulare diluita in ciascuno dei 6 pozzetti.
    1. Prima di procedere alla piastratura, calcolare il numero di cellule necessarie per 7,5 × 105 cellule/pozzetto utilizzando C1V1 = C2V2 dove C1 è il numero iniziale di cellule (numero di cellule/mL), V1 è il volume necessario dalla sospensione iniziale della cellula, C2 è la densità della cellula target desiderata (numero di cellule/mL), e V2 è il volume finale necessario per la semina cellulare.
  7. Dopo l'erogazione, picchiettare delicatamente la piastra su tutti i lati per allargare le cellule, quindi posizionarla in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 per una notte.

2. Trasfezione cellulare mediata da polietilenimmina (PEI) e semina cellulare post-trasfezione (Giorno 2)

  1. Rimuovere la piastra a 6 pozzetti dall'incubatore e aspirare il terreno di coltura esistente da ciascun pozzetto. Aggiungere 2 ml di terreno fresco per pozzetto.
  2. Trasfettare le cellule con DNA plasmidico split-Rluc (pCAG-Mito,Rluc, N-T2A-R, luc,CER-IRES-mCherry) disciolto in tampone TE (pH 8.0).
    1. Per ogni pozzetto, mescolare il DNA (750 ng) e il PEI (rapporto DNA/PEI = 1:3) in 200 μL di DMEM in una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL. Agitare rapidamente il DNA/PEI al livello 8 per circa 2 s per assicurarsi che si mescolino bene insieme per formare un complesso. Dopodiché, centrifugare brevemente in una mini centrifuga (<3 s).
    2. Lasciare incubare la miscela di DNA/PEI a temperatura ambiente per 15 minuti, quindi aggiungere la miscela (facendola cadere) sulla superficie del terreno di coltura nella piastra a 6 pozzetti contenente le cellule. Picchiettare delicatamente la piastra (per distribuire uniformemente la miscela) e incubarla in un'incubatrice umidificata a 37 °C con il 5% di CO2 per 6 ore.
  3. Durante l'incubazione, preparare una piastra a 96 pozzetti rivestita di poli-D-lisina (PDL) aggiungendo prima 70 μL di PDL (50 μg/mL in DPBS) a ciascun pozzetto e incubando in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 per almeno 1 ora. Rimuovere la soluzione PDL e quindi lavare ogni pozzetto 2 volte con 100 μL di DPBS. Al termine del secondo lavaggio, assicurarsi che tutto il DPBS rimanente sia stato rimosso.
  4. A 6 ore dalla trasfezione, preparare a seminare le cellule trasfettate in una piastra a 96 pozzetti rivestita in PDL.
    1. Estrarre la piastra a 6 pozzetti contenente le cellule trasfettate dall'incubatore, aspirare il terreno e lavare ogni pozzetto con 2 mL di DPBS. Dopo aver rimosso il DPBS, aggiungere 350 μl di tripsina-EDTA fenolo rosso allo 0,05% e incubare per 1-2 minuti. Per fermare la reazione della tripsina, aggiungere 1,7 ml di terreno in ciascun pozzetto.
    2. Dopo aver trasferito le cellule insieme al terreno in una provetta da 50 ml, centrifugare la provetta a 300 × g per 5 minuti in una centrifuga da tavolo. Aspirare il terreno e risospendere il pellet di cella con 1 mL di terreno fresco. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro (come descritto al punto 1.5).
  5. Seminare le cellule in una piastra a 96 pozzetti rivestita con PDL a una densità di 4 × 104 cellule/pozzetto in 100 μL di terreno di coltura. A tal fine, in una provetta da 50 mL, aggiungere il volume necessario di cellule (vedere di seguito per il calcolo) insieme al volume appropriato di terreno (12 mL di volume totale). Utilizzando una pipetta multicanale, erogare 100 μl della sospensione cellulare diluita in ciascuno dei 96 pozzetti. Incubare le cellule per 18 ore in un incubatore umidificato a 37 °C con CO2 al 5%.
    1. Calcolare il numero di cellule necessarie per 4 × 104 cellule/pozzetto utilizzando C1V1 = C2V2 dove C1 è il conteggio iniziale delle cellule (numero di cellule/mL), V1 è il volume necessario dalla sospensione iniziale delle cellule, C2 è la densità delle cellule target desiderata (numero di cellule/mL) e V2 è il volume finale necessario per la semina delle cellule.

3. Trattamento chimico e dosaggio della luciferasi in cellule vive (Giorno 3)

  1. In una provetta per microfuge da 1,7 mL, preparare le tre soluzioni fresche di 50 μM di Rhosin (50 mM di stock in DMSO), 25 μM di Ehop-016 (25 mM di stock in DMSO) e 50 μM di ZCL278 (50 mM di stock in DMSO) diluendo ciascuna soluzione madre (50 mM di Rhosin, 25 mM di Ehop-016 e 50 mL di ZCL278; tutte in DMSO) 1:1.000 nella quantità richiesta (50 μL/pozzetto × numero di pozzetti) di terreni di coltura. A ciascuna soluzione, aggiungere il substrato di cellule vive (50 mM stock in DMSO) per Renilla luciferasi diluita 1:2.000 a una concentrazione finale di 25 μM. Per ottenere soluzioni ZCL278 da 0,5, 5 e 50 μM, eseguire diluizioni seriali utilizzando il 50 μM iniziale di ZCL278 in terreni di coltura.
    NOTA: Se si desidera un tempo di incubazione chimica inferiore a 1-1,5 ore, le cellule possono essere preincubate con substrato di cellule vive (per Renilla luciferasi) per 1-1,5 ore prima di essere trattate con ciascuna sostanza chimica. Aggiungiamo contemporaneamente sostanze chimiche e substrato di cellule vive per ottimizzare il protocollo per lo screening di farmaci ad alto rendimento.
  2. Rimuovere il terreno da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenente le cellule trasfettate e aggiungere 50 μL di miscela di terreni chimici e substrati a ciascun pozzetto.
  3. Dopo aver incubato le cellule per 1 ora, 2 ore o 5 ore, estrarre la piastra di coltura dall'incubatore, caricarla sul lettore di piastre di luminescenza e misurare la luminescenza.
    1. Prima di iniziare, assicurarsi che il lettore di piastre sia acceso. Accedi al software di lettura delle micropiastre e crea un nuovo file facendo clic su Nuova sessione. Impostare la temperatura del lettore di piastre a 37 °C facendo clic su Incubatore, selezionando l'opzione di temperatura e digitando 37 °C. In Layout piastra, scegliere l'opzione Sconosciuto e specificare i pozzetti da misurare facendo clic e trascinando.
    2. In Protocollo, fare clic su Luminescenza e mantenere le impostazioni predefinite. Una volta terminata la configurazione, caricare la piastra con il coperchio nel lettore di piastre e scegliere Run Plate In. Fare clic su Avvia e verrà visualizzata la finestra di salvataggio del file. Salvare il file sul desktop rinominandolo e facendo clic su Salva.
      NOTA: La luminescenza continuerà ad essere prodotta per >24 ore dopo l'aggiunta del substrato di cellule vive.
  4. Una volta completata la lettura, rimuovere la piastra dal lettore di lastre, quindi fare clic su Esegui piastra in per reinserire il lettore. Una volta completata, riposizionare la piastra nell'incubatore umidificato (37 °C, 5% CO2) fino alla lettura successiva.
  5. Al termine, trasferire i dati di luminescenza a un programma grafico per tracciare l'unità di luminescenza relativa (RLU) (asse y) per ogni variabile (ad esempio, sostanze chimiche o concentrazioni) (asse x) e analizzare i dati.

4. Validazione del saggio split-Rluc con altri metodi.

  1. Eseguire altri saggi come il saggio di legatura di prossimità (PLA), la microscopia elettronica a trasmissione e il monitoraggio dell'assorbimento di calcio mitocondriale per convalidare i risultati ottenuti dal saggio split-Rluc come descritto in precedenza24.

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Risultati

Abbiamo utilizzato il protocollo sopra descritto per misurare il livello di contatti ER-mitocondri con l'aggiunta di tre composti noti per inibire specifiche GTPasi. CDC42, RHO e RAC sono GTPasi che promuovono la polimerizzazione dell'actina28 quando attivate e sono inibite rispettivamente da ZCL278, Rhosin e Ehop-01624. HEK293T cellule trasfettate con split-Rluc sono state trattate con DMSO (controllo), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) o Ehop-016 (25 μM) e incubate ...

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Discussione

Abbiamo utilizzato un saggio di riassemblaggio split-Renilla luciferasi 8 (split-Rluc assay) per quantificare il livello di accoppiamenti ER-mitocondri. In questo studio, abbiamo modificato il costrutto originale split-Rluc24 generando un singolo vettore, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, codificante ogni componente split-Rluc (MitoRlucN e RlucC

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori sono grati al Dr. Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) per la revisione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato in parte dal National Institute of Neurological Disease and Stroke (NINDS, R01NS113516).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,7 mL SafeSeal Microcentrifuge TubeSorenson16070
Piastra a 6 pozzetti TC TreatedUSA ScientificCC7682-7506
10 mL Puntali per pipette OneTipUSA Scientific1110-3700
10 μ L puntali per pipette OneTipUSA Scientific1110-3700
20-200 μ L Punte smussate OneTipUSA Scientific1111-1210
Provetta conica in polipropilene da 50 mLFalcon352070
Rack per microprovette flipper a 96 pozzettiThermoFisher Scientific8770-11
Piastra a 96 pozzetti TC Trattata USA ScientificCC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Piatto trattatoUSA ScientificCC7682-3394
1250 μ L Tips OneTipUSA Scientific1112-1720
Centrifuga 5910  Ri - Centrifuga refrigerataEppendorf5943000131
Dimetilsolfossido, anidro, ≥ 99,9%Sigma-Aldrich276855-100ML
DMEM, alto glucosioThermoFisher Scientific 11965092
DPBS, senza calcio, senza magnesioThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248Sciogliere in DMSO; conservare a -70 ° C
EnduRen Live Cell SubstratoPromegaE6481Conservare le aliquote a -70 ° C
Eppendorf 2-20 μ L. pipettaEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μ L pipettaEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 &; L pipettaEppendorf3123000020
Eppendorf Research plus 12 canaliEppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 μ L pipettaEppendorf 
Siero fetale bovino, regioni qualificate, approvate dall'USDAThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2  Incubatrice, 184 L, Acciaio Inox LucidoThermoFisher Scientific381
Contatore di conteggio manualeSigma-AldrichHS6594
HEK 293T CellsATCCCRL-3216
Ematocitometro - Neubauer Bright Line, Camera di Conteggio Doppia LWScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE BufferThermoFisher Scientific8019005
MicroscopioZeissAxiovert 25 CFL
Mini centrifugaBenchmark ScientificC1012
Tube Rack per provette coniche da 50 ml, coniche da 15 ml e per microcentrifugaBoekel Scientific120008
PEI MAX - Polietilenenimina cloridrato lineare di trasfezione (MW 40.000)Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPUSA Scientific4440-0101
Bromidrato di poli-D-lisinaSigma-AldrichP6407-5MG
Rosina cloridratoBio-Techne Tocris5003Dissolvere in DMSO; conservare a -70 ° C
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenoloThermoFisher Scientific25300054
Lettore di micropiastre multimodale Varioskan LUXThermoFisher ScientificVL0000D0
VortexThermoFisher Scientific2215365livello 8
VWR Sistema di aspirazione sottovuotoVWRVWR 75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794Sciogliere in DMSO; conservare a -70 gradi E
3123000055 Multi

Riferimenti

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