Abbiamo stabilito un saggio di riassemblaggio della luciferasi divisa per monitorare i contatti reticolo endoplasmatico-mitocondri nelle cellule vive. Utilizzando questo saggio, descriviamo un protocollo per misurare quantitativamente il livello di questi accoppiamenti inter-organelli in cellule HEK293T, in condizioni di trattamento chimico.
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Articolo metodologico
Saggio di riassemblaggio della split-luciferasi per misurare i contatti reticolo-mitocondri endoplasmatici in cellule vive
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I siti di contatto tra reticolo endoplasmatico (ER) e mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nella salute cellulare e nell'omeostasi, come la regolazione del Ca2+ e dell'omeostasi lipidica, la dinamica mitocondriale, la biogenesi degli autofagosomi e dei mitofagosomi e l'apoptosi. L'incapacità di mantenere un normale accoppiamento ER-mitocondriale è implicata in molte malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica e la paraplegia spastica ereditaria. È di notevole importanza esplorare come la disregolazione dei contatti ER-mitocondriale possa portare alla morte cellulare e se la riparazione di questi contatti al livello normale possa migliorare le condizioni neurodegenerative. Pertanto, saggi migliorati che misurano il livello di questi contatti potrebbero aiutare a illuminare i meccanismi patogenetici di queste malattie. In definitiva, la messa a punto di saggi semplici e affidabili faciliterà lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Qui descriviamo un saggio di split-luciferasi per misurare quantitativamente il livello di contatti ER-mitocondri nelle cellule vive. Questo test può essere utilizzato per studiare il ruolo fisiopatologico di questi contatti e per identificare i loro modulatori nello screening ad alto rendimento.
Introduzione
Le interazioni tra l'ER e i mitocondri sono vitali per l'omeostasi cellulare e la sopravvivenza 1,2,3,4. Prove precedenti indicano che qualsiasi tipo di interruzione o disregolazione nei siti di contatto ER-mitocondri può contribuire a diverse malattie neurodegenerative, metaboliche e cardiovascolari, nonché al cancro 5,6,7,8,9,10.
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Protocollo
1. Mantenimento delle cellule e semina (Giorno 1)
- Mantenere HEK293T cellule in terreni di coltura cellulare contenenti Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS) (in piastre di coltura da 100 mm) in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.
- Prima di iniziare, controllare la confluenza della lastra osservandola al microscopio. Quando le cellule raggiungono circa l'80-90% di confluenza, prepararsi a seminare le cellule in una piastra di coltura a 6 pozzetti rimuovendo il terreno e lavando con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di ....
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Risultati
Abbiamo utilizzato il protocollo sopra descritto per misurare il livello di contatti ER-mitocondri con l'aggiunta di tre composti noti per inibire specifiche GTPasi. CDC42, RHO e RAC sono GTPasi che promuovono la polimerizzazione dell'actina28 quando attivate e sono inibite rispettivamente da ZCL278, Rhosin e Ehop-01624. HEK293T cellule trasfettate con split-Rluc sono state trattate con DMSO (controllo), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) o Ehop-016 (25 μM) e incubate .......
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Discussione
Abbiamo utilizzato un saggio di riassemblaggio split-Renilla luciferasi 8 (split-Rluc assay) per quantificare il livello di accoppiamenti ER-mitocondri. In questo studio, abbiamo modificato il costrutto originale split-Rluc24 generando un singolo vettore, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, codificante ogni componente split-Rluc (MitoRlucN e RlucC
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati al Dr. Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) per la revisione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato in parte dal National Institute of Neurological Disease and Stroke (NINDS, R01NS113516).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube | Sorenson | 16070 | |
| Piastra a 6 pozzetti TC Treated | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| 10 mL Puntali per pipette OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
| 10 μ L puntali per pipette OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
| 20-200 μ L Punte smussate OneTip | USA Scientific | 1111-1210 | |
| Provetta conica in polipropilene da 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Rack per microprovette flipper a 96 pozzetti | ThermoFisher Scientific | 8770-11 | |
| Piastra a 96 pozzetti TC Trattata | USA Scientific | CC7682-7596 | |
| 100 mm x 20 mm TC Piatto trattato | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 1250 μ L Tips OneTip | USA Scientific | 1112-1720 | |
| Centrifuga 5910 Ri - Centrifuga refrigerata | Eppendorf | 5943000131 | |
| Dimetilsolfossido, anidro, ≥ 99,9% | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| DMEM, alto glucosio | ThermoFisher Scientific 11965092 | ||
| DPBS, senza calcio, senza magnesio | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| EHop 016 | Bio-Techne Tocris | 6248 | Sciogliere in DMSO; conservare a -70 ° C |
| EnduRen Live Cell Substrato | Promega | E6481 | Conservare le aliquote a -70 ° C |
| Eppendorf 2-20 μ L. pipetta | Eppendorf | 3123000039 | |
| Eppendorf Research plus 100-1000 μ L pipetta | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus 1-10 &; L pipetta | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus 12 canali | Eppendorf | 3125000028 | |
| Eppendorf Research plus 200 μ L pipetta | Eppendorf | ||
| Siero fetale bovino, regioni qualificate, approvate dall'USDA | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubatrice, 184 L, Acciaio Inox Lucido | ThermoFisher Scientific | 381 | |
| Contatore di conteggio manuale | Sigma-Aldrich | HS6594 | |
| HEK 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Ematocitometro - Neubauer Bright Line, Camera di Conteggio Doppia LW | Scientific | CTL-HEMM-GLDR | |
| Invitrogen TE Buffer | ThermoFisher Scientific | 8019005 | |
| Microscopio | Zeiss | Axiovert 25 CFL | |
| Mini centrifuga | Benchmark Scientific | C1012 | |
| Tube Rack per provette coniche da 50 ml, coniche da 15 ml e per microcentrifuga | Boekel Scientific | 120008 | |
| PEI MAX - Polietilenenimina cloridrato lineare di trasfezione (MW 40.000) | Polysciences | 24765-100MG | |
| Pipet-Aid XP | USA Scientific | 4440-0101 | |
| Bromidrato di poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Rosina cloridrato | Bio-Techne Tocris | 5003 | Dissolvere in DMSO; conservare a -70 ° C |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Lettore di micropiastre multimodale Varioskan LUX | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | |
| Vortex | ThermoFisher Scientific | 2215365 | livello 8 |
| VWR Sistema di aspirazione sottovuoto | VWR | VWR 75870-734 | |
| ZCL 278 | Bio-Techne Tocris | 4794 | Sciogliere in DMSO; conservare a -70 gradi E |
Riferimenti
- Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).
- Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitoc....
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Ristampe e permessi
