Articolo metodologico

Sviluppo di terapie combinatorie per le lesioni del midollo spinale utilizzando la somministrazione di cellule staminali

DOI:

10.3791/66872

⸱

7 giugno 2024

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, sono stati sviluppati e caratterizzati idrogel compositi nervo-mimetici che possono essere utilizzati per studiare e capitalizzare il comportamento pro-rigenerativo delle cellule staminali di derivazione adiposa per la riparazione delle lesioni del midollo spinale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La lesione traumatica del midollo spinale (SCI) induce un deficit sensomotorio permanente al di sotto del sito della lesione. Colpisce circa un quarto di milione di persone negli Stati Uniti e rappresenta un problema incommensurabile per la salute pubblica. Sono state condotte ricerche per fornire una terapia efficace; tuttavia, la lesione midollare è ancora considerata incurabile a causa della natura complessa del sito della lesione. Vengono studiate una varietà di strategie, tra cui la somministrazione di farmaci, il trapianto di cellule e i biomateriali iniettabili, ma una strategia da sola ne limita l'efficacia per la rigenerazione. Pertanto, le terapie combinatorie hanno recentemente guadagnato attenzione in grado di mirare a molteplici caratteristiche della lesione. È stato dimostrato che le matrici extracellulari (ECM) possono aumentare l'efficacia del trapianto di cellule per la lesione midollare. A tal fine, sono stati sviluppati e caratterizzati idrogel 3D costituiti da midollo spinale decellularizzato (dSC) e nervi sciatici (dSN) in diversi rapporti. L'analisi istologica delle dSC e delle dSN ha confermato la rimozione dei componenti cellulari e nucleari e le architetture tissutali native sono state mantenute dopo la decellularizzazione. Successivamente, sono stati creati idrogel compositi con diversi rapporti volumetrici e sottoposti ad analisi della torbidità, della cinetica di gelificazione, delle proprietà meccaniche e della vitalità delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano (hASC) incorporate. Non sono state riscontrate differenze significative nelle proprietà meccaniche tra i diversi rapporti tra idrogel e matrici del midollo spinale decellularizzate. Gli ASC umani incorporati nei gel sono rimasti vitali per tutta la coltura di 14 giorni. Questo studio fornisce un mezzo per generare idrogel combinatoriali di ingegneria tissutale che presentano ECM nervosamente specifica e cellule staminali mesenchimali pro-rigenerative. Questa piattaforma può fornire nuove informazioni sulle strategie neuro-rigenerative dopo la lesione midollare con indagini future.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circa 296.000 persone soffrono di lesione midollare traumatica e ogni anno si verificano circa 18.000 nuovi casi di lesione midollare negli Stati Uniti1. La lesione midollare traumatica è comunemente causata da cadute, ferite da arma da fuoco, incidenti stradali e attività sportive e spesso causa la perdita permanente della funzione sensomotoria al di sotto del sito della lesione. Le spese stimate per il trattamento della lesione midollare variano da uno a cinque milioni di dollari per individuo, con aspettative di vita significativamente più basse1. Tuttavia, la lesione midollare è ancora poco conosciuta e in gran parte incurabile, principalmente a causa delle complesse conseguenze fisiopatologiche dopo la lesione2. Sono state studiate varie strategie, tra cui il trapianto di cellule e gli scaffold basati su biomateriali. Sebbene il trapianto di cellule e biomateriali abbia dimostrato un potenziale, la natura multiforme della lesione midollare suggerisce che gli approcci combinatori potrebbero essere più vantaggiosi3. Di conseguenza, molte strategie combinatorie sono state studiate e hanno dimostrato una migliore efficacia terapeutica rispetto ai singoli componenti. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per fornire nuovi biomateriali per la somministrazione di cellule e farmaci3.

Un approccio promettente alla fabbricazione di idrogel naturali è la decellularizzazione dei tessuti. Il processo di decellularizzazione utilizza metodi ionici, non ionici, fisici e combinatori per rimuovere tutti o la maggior parte dei materiali cellulari e nucleici preservando i componenti della ECM. Rimuovendo tutti o la maggior parte dei componenti cellulari, gli idrogel derivati dalla ECM sono meno immunoreattivi per l'ospite dopo l'impianto/iniezione4. Ci sono diversi parametri da misurare per valutare la qualità dei tessuti decellularizzati: rimozione del contenuto cellulare/nucleico, proprietà meccaniche e conservazione della ECM. Per evitare risposte immunitarie avverse, sono stati stabiliti i seguenti criteri: 1) meno di 50 ng di DNA a doppio filamento (dsDNA) per mg di peso secco della MEC, 2) lunghezza del frammento di DNA inferiore a 200 bp e 3) materiale nucleare quasi visibile o assente colorato con 4'6-diamidino-2-fenuilindolo (DAPI)5. Le proprietà meccaniche possono essere quantificate mediante test di trazione, compressione e/o reologia e dovrebbero essere simili al tessuto originale6. Inoltre, la conservazione delle proteine può essere valutata mediante proteomica o saggi quantitativi incentrati sui principali componenti dei tessuti decellularizzati, ad esempio laminina, glicosaminoglicano (GAG) e condroitina solfato proteoglicano (CSPG) per il midollo spinale 7,8. Gli idrogel derivati dalla ECM verificati possono essere ricellularizzati con diversi tipi di cellule per aiutare la terapia cellulare9.

Una varietà di tipi di cellule, come le cellule di Schwann, le cellule di rivestimento olfattivo, le cellule staminali mesenchimali (MSC) derivate dal midollo osseo e le cellule staminali/progenitrici neurali, sono state studiate per la riparazione della LM 10,11,12. Tuttavia, l'uso clinico di queste cellule è limitato a causa di preoccupazioni etiche, scarsa integrazione con cellule/tessuti vicini, mancanza di fonti tissutali per un'elevata resa, incapacità di autorinnovarsi e/o limitata capacità proliferativa 13,14,15. A differenza di questi tipi di cellule, le MSC umane di derivazione adiposa (hASC) sono un candidato interessante perché sono facilmente isolabili in modo minimamente invasivo utilizzando lipoaspirati e si può ottenere un gran numero di cellule16. Inoltre, le hASC hanno la capacità di secernere fattori di crescita e citochine che hanno il potenziale di neuroprotezione, angiogenetica, guarigione delle ferite, rigenerazione tissutale e immunosoppressione 17,18,19,20,21.

Come è stato descritto, sono stati condotti diversi studi 22,23,24 e molto è stato imparato da essi, ma le caratteristiche eterogenee della lesione midollare hanno limitato la loro efficacia nel promuovere il recupero funzionale. Pertanto, sono stati proposti approcci combinatori per aumentare l'efficacia del trattamento per la lesione midollare. In questo studio, gli idrogel compositi sono stati sviluppati combinando midollo spinale decellularizzato e nervi sciatici per una coltura tridimensionale (3D) di hASC. Il successo della decellularizzazione è stato confermato da analisi istologiche e del DNA e diversi rapporti di idrogel compositi nervosi sono stati caratterizzati da cinetiche di gelificazione e test di compressione. La vitalità delle hASC negli idrogel compositi nervosi è stata studiata per dimostrare che questo idrogel può essere utilizzato come piattaforma di coltura cellulare 3D.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I tessuti suini sono stati ottenuti commercialmente, quindi l'approvazione non è stata richiesta dal comitato etico degli animali.

1. Decellularizzazione del midollo spinale suino (tempo stimato: 5 giorni)

NOTA: Eseguire la decellularizzazione utilizzando protocolli precedentemente stabiliti con modifiche25,26. Tutte le procedure devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza sterile a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione. Tutte le soluzioni devono essere filtrate in modo sterile utilizzando un filtro per flaconi (dimensione dei pori di 0,2 μm) in flaconi sterilizzati in autoclave. Le procedure da eseguire a 37 °C possono essere eseguite all'interno di un'incubatrice o di un forno pulito impostato a 37 °C.

  1. Preparazione di soluzioni di decellularizzazione
    NOTA: Tutte le soluzioni sono calcolate per 1 L. Gli utenti potrebbero dover regolare il volume finale richiesto in base alle loro esigenze sperimentali.
    1. Diluire 500 mL di tripsina/acido etilendiamminotetraacetico allo 0,05% (EDTA) con 500 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ottenere lo 0,025% di tripsina/EDTA.
    2. Diluire 300 mL di Triton X-100 al 10% con 700 mL di PBS per ottenere il 3% di Triton X-100. Mescolare 0,56 g di NaCl, 1,31 g di NaH2PO4H2O e 10,85 g di HNa2O4P·7H2O in 1 L di acqua deionizzata per ottenere 100 mM di tampone Na/50 mM di fos.
    3. Mescolare 32,4 g di saccarosio in 1 L di acqua deionizzata per ottenere 1 M di saccarosio. Mescolare 40 g di desossicolato di sodio (SD) in 1 L di acqua deionizzata per ottenere una soluzione SD al 4%. Diluire 6,7 mL di acido peracetico al 15% con 993,3 mL di etanolo al 4%.
  2. Preparazione del midollo spinale suino
    NOTA: I midollo spinali sono stati spediti congelati senza alcuna soluzione e mantenuti a -80 °C fino all'uso.
    1. Scongelare il midollo spinale a 4 °C in frigorifero per 18-24 ore prima della decellularizzazione. Utilizzare forbici sterili per rimuovere con cura la dura madre.
    2. Tagliare il midollo spinale in piccoli pezzi (circa 1 cm di lunghezza). Inserire un pezzo in una provetta da 15 ml o un massimo di tre pezzi in una provetta da 50 ml.
  3. Decellularizzazione del midollo spinale
    NOTA: Dopo ogni fase, le soluzioni di decellularizzazione vengono versate manualmente in un grande becher per essere scartate. Il piccolo filtro autoclavabile in acciaio inossidabile può essere utilizzato per scartare le soluzioni di decellularizzazione senza perdere i tessuti necessari per ogni fase. Il midollo spinale è stato agitato a 83 giri/min, se non diversamente specificato.
    1. Sciacquare il midollo spinale con acqua deionizzata per 18-24 ore a 4 °C e 60 giri/min.
    2. Sciacquare il midollo spinale con tripsina/EDTA allo 0,025% per 1 ora a 37 °C e 40 giri/min. Quindi, sciacquare il midollo spinale con PBS per 15 minuti, 2 volte.
    3. Sciacquare il midollo spinale con Triton X-100 al 3% per 2 ore. Sciacquare il midollo spinale con 100 mM di Na/50 mM di tampone phos per 15 min, 2x.
    4. Sciacquare il midollo spinale con 1 M di saccarosio per 1 ora. Quindi, sciacquare il midollo spinale con acqua deionizzata per 1 ora.
    5. Sciacquare il midollo spinale con il 4% di SD per 2 ore. Quindi, sciacquare il midollo spinale con 100 mM di Na/50 mM di tampone phos per 15 minuti, 2 volte.
    6. Sciacquare il midollo spinale con acido peracetico allo 0,1% in etanolo al 4% per 4 ore. Quindi, sciacquare il midollo spinale con PBS per 1 ora.
    7. Sciacquare il midollo spinale con acqua deionizzata per 1 ora, 2x. Quindi, sciacquare il midollo spinale con PBS per 1 ora.
    8. Liofilizzare il midollo spinale a 0,01 mbar e -56 °C per 3 giorni e conservare all'asciutto fino al momento dell'uso.

2. Decellularizzazione del nervo sciatico suino (tempo stimato: 5 giorni)

NOTA: Eseguire la decellularizzazione utilizzando un protocollo27 precedentemente stabilito. Tutte le procedure devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza sterile a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione. Tutte le soluzioni devono essere filtrate in modo sterile utilizzando un filtro per flaconi (dimensione dei pori di 0,2 μm) in flaconi sterilizzati in autoclave. Le procedure da eseguire a 37 °C possono essere eseguite all'interno di un'incubatrice o di un forno pulito impostato a 37°C.

  1. Preparazione di soluzioni di decellularizzazione
    NOTA: Tutte le soluzioni sono calcolate per 1 L. Gli utenti potrebbero dover regolare il volume finale richiesto in base alle loro esigenze sperimentali.
    1. Preparare 50 mM di Na/10 mM di tampone fos mescolando 1,86 g di NaCl, 0,262 g di d NaH2PO4H2O e 2,17 g di HNa2O4P·7H2O in 1 L di acqua deionizzata.
    2. Preparare 125 mM di soluzione di sulfobetaina-10 (SB-10) mescolando 38,4 g di SB-10 in 1 L di tampone fos 50 mM Na/10 mM.
    3. Preparare una soluzione di sulfobetaina-16 (SB-16) al 3% di SD/0,6 mM mescolando 30 g di SD e 0,24 g di SB-16 in 1 L di tampone fos 50 mM Na/10 mM.
  2. Preparazione del nervo sciatico suino
    NOTA: I nervi sciatici sono stati spediti congelati con PBS e mantenuti a -80 °C fino all'uso.
    1. Scongelare il nervo sciatico a 4 °C in frigorifero 18-24 h prima della decellularizzazione.
    2. Tagliare il nervo sciatico in piccoli pezzi (lunghi circa 1 cm). Inserire un pezzo in una provetta da 15 ml o un massimo di tre pezzi in una provetta da 50 ml.
  3. Decellularizzazione del nervo sciatico
    NOTA: Dopo ogni fase, le soluzioni di decellularizzazione vengono versate manualmente in un grande becher per essere scartate e un piccolo filtro in acciaio inossidabile autoclavabile può essere utilizzato per aiutare a scartare le soluzioni di decellularizzazione senza perdere i tessuti necessari per ogni fase. Il nervo sciatico è stato agitato a 15 giri/min se non diversamente specificato.
    1. Sciacquare il nervo sciatico con acqua deionizzata per 7 ore. Quindi, sciacquare il nervo sciatico con 125 mM di sulfobetaina-10 (SB-10) in 50 mM di tampone Na/10 mM di fos per 18 ore.
    2. Sciacquare il nervo sciatico con 100 mM di Na/50 mM di tampone phos per 15 min. Quindi, sciacquare il nervo sciatico con 3% SD/0,6 mM di sulfobetaina-16 (SB-16) in 50 mM Na/10 mM di tampone fos per 2 ore.
    3. Sciacquare il nervo sciatico con 100 mM di Na/50 mM di tampone phos per 15 min, 3x. Quindi, sciacquare il nervo sciatico con 125 mM SB-10 in 50 mM Na/10 mM di tampone phos per 7 ore.
    4. Sciacquare il nervo sciatico con 100 mM di Na/50 mM di tampone phos per 15 min. Quindi, sciacquare il nervo sciatico con il 3% di SD/0,6 mM SB-16 in 50 mM Na/10 mM di tampone phos per 1,5 ore.
    5. Sciacquare il nervo sciatico con 50 mM di Na/10 mM di tampone phos per 15 minuti, 3 volte. Quindi, sciacquare il nervo sciatico con 75 U/mL di desossiribonucleasi (DNasi) per 3 ore senza agitazione.
    6. Sciacquare il nervo sciatico con 50 mM Na/10 mM di tampone phos per 1 ora, 3 volte. Quindi, sciacquare il nervo sciatico con 0,2 U/mL di condroitinasi ABC per 16 ore senza agitazione a 37 °C.
    7. Sciacquare il nervo sciatico con PBS per 3 ore, 3 volte. Liofilizzare il nervo sciatico a 0,01 mbar e -56 °C per 3 giorni e conservare all'asciutto fino al momento dell'uso.

3. Digestione di tessuti decellularizzati e fabbricazione di idrogel compositi (Tempo stimato: 4 giorni)

  1. Tritare o macinare i tessuti decellularizzati in polvere utilizzando forbici o omogeneizzatore. Sterilizzare gli strumenti per tritare o macinare i tessuti utilizzando un'autoclave a 121 °C per 45 min. È applicabile anche il metodo dell'ossido di etilene.
  2. Digerire i tessuti separatamente in una soluzione di acido cloridrico 0,01 N (HCl) contenente 1 mg/mL di pepsina a una concentrazione di 15 mg/mL. I pesi stimati del midollo spinale decellularizzato e del nervo sciatico sono rispettivamente di 50-100 mg e 100-150 mg per pezzo.
  3. Posizionare la barra magnetica e agitare a 500 giri/min e 4 °C per almeno 4 giorni per generare soluzioni pregel.
  4. Mescolare il pregel per il nervo sciatico e il midollo spinale ai seguenti rapporti volumetrici: 2:1, 1:1 e 1:2. Regolare il pH 7,4 utilizzando 1 N di idrossido di sodio (NaOH) e HCl e diluire alla concentrazione desiderata utilizzando terreni M199 e 1x PBS. Incubare a 37 °C per 30 min.
    NOTA: Aggiungere NaOH 1 μl alla volta. Il terreno M199 può essere utilizzato come indicatore di pH poiché diventa rosa chiaro quando il pH è 7,4, ma è necessario utilizzare strisce di pH per confermare il livello di pH.

4. Verifica della decellularizzazione

  1. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E; Tempo stimato: 8 giorni)
    NOTA: Dopo ogni fase di risciacquo, le soluzioni vengono versate manualmente in un grande becher per essere scartate.
    1. Fissare il midollo spinale e il nervo sciatico freschi e decellularizzati in formaldeide al 3,7% a 4 °C per 18 ore. Mettere un pezzo in una provetta da 15 mL.
    2. Rimuovere la formaldeide e mettere i fazzoletti in saccarosio al 10% per 1 giorno. Rimuovere il 10% di saccarosio e mettere i fazzoletti nel saccarosio al 30% per 6 giorni.
    3. Riempire a metà un criomold di dimensioni adeguate con temperatura di taglio ottimale (OCT). Posizionare i tessuti decellularizzati, coprirli con OCT e lasciarli assorbire per 1 giorno.
    4. Dopo 1 giorno, congelare i tessuti per una notte a -80 °C. Criosezione dei tessuti a 10 μm di spessore utilizzando un criostato.
    5. Risciacquare con 1x PBS per 5 min, 2x. Quindi, sciacquare con acqua di rubinetto per 5 minuti.
    6. Colorare con la soluzione di ematossilina per 1 min. Sciacquare con acqua di rubinetto per 1 minuto, 3 volte.
    7. Colorare con la soluzione di eosina per 1 min. Sciacquare con etanolo al 95% per 1 minuto, 2 volte e con etanolo al 100% per 1 minuto, 3 volte.
    8. Risciacquare con xilene per 1 minuto, 2 minuti e poi 1 minuto. Lasciare asciugare i vetrini per 5 minuti.
    9. Utilizzare un batuffolo di cotone per gocciolare 3-4 gocce di soluzione di montaggio di polistirene xilene dibutilftalato (DPX) sui vetrini. Posizionare i vetrini coprioggetti sopra i vetrini ricoperti di DPX. Lasciare asciugare i vetrini per una notte.
  2. Analisi del DNA (Tempo stimato: 1 h)
    1. Pesare tessuti decellularizzati e liofilizzati. Isolare e quantificare il DNA utilizzando i kit disponibili in commercio secondo le istruzioni del produttore.

5. Caratterizzazione di idrogel compositi

  1. Test di torbidità di gelificazione (Tempo stimato: 1 h)
    1. Mettere 100 μL di soluzioni di pregel in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti su ghiaccio. Leggere l'assorbanza a 405 nm ogni 2 minuti per 45 minuti utilizzando un lettore di piastre.
    2. Calcolare l'assorbanza normalizzata utilizzando la seguente equazione:
      (Assorbanza -Assorbanza iniziale) / (Assorbanzamassima - Assorbanzainiziale)
    3. Calcola la pendenza della curva e il tempo per ottenere una gelificazione del 50% e del 95%, rispettivamente t1/2 e t95.
  2. Test di compressione (tempo stimato: 1 min per idrogel)
    1. Fabbricare idrogel compositi alla concentrazione di 12 mg/mL con diametro di 8 mm e altezza di 2 mm.
    2. Utilizzare un reometro per comprimere i campioni con un carico di 250 N tra piastre parallele in acciaio inossidabile a una velocità di deformazione del 10% dell'altezza del campione/min. Il software che fornisce le letture del reometro fornirà una curva sforzo-deformazione applicando la forza e misurando la deformazione fino alla rottura degli idrogel.
    3. Calcola il modulo di Young dalla pendenza della regione lineare delle curve sforzo-deformazione.

6. Coltura tridimensionale di ASC umane in idrogel compositi nervosi

  1. Allestimento della piattaforma tridimensionale (3D) (Tempo stimato: 3 h)
    1. Incidere il wafer di silicio con il fotoresist SU-8 per generare modelli circolari di 200 μm di profondità e 4 mm di diametro.
    2. Miscelare la base di polidimetilsilossano (PDMS) e l'agente indurente in un rapporto di 10:1. Versare il composto sul wafer di silicone e lasciarlo riposare per 20 minuti per rimuovere tutte le bolle che derivano dalla miscelazione della base PDMS e dell'agente indurente.
    3. Mettere in forno e polimerizzare per 2 ore a 70 °C. Sformare il foglio PDMS polimerizzato e punzonarlo utilizzando un punzone per biopsia di 8 mm di diametro per realizzare micropozzetti PDMS.
    4. Posizionare i micropozzetti in una piastra da 96 pozzetti e mettere la piastra a pozzetti in un pulitore al plasma ad aria per sterilizzare i micropozzetti PDMS.
    5. Funzionalizzare i micropozzetti PDMS con polietilenimmina (PEI) all'1% e glutaraldeide (GA) allo 0,1% rispettivamente per 10 minuti e 20 minuti. Lavare i micropozzetti con acqua distillata, 2x.
  2. Preparazione di hASC (Tempo stimato: 7 giorni)
    1. Cellule di passaggio di coltura per 2-5 passaggi nei terreni di crescita delle hASC (terreni basali delle hASC integrati con siero fetale bovino (FBS) e penicillina/streptomicina (Pen-strep)) fino a quando non sono confluenti. Passaggio e calcolo del numero di cellule utilizzando un ematocitometro o un contatore di cellule.
  3. Idrogel compositi nervosi carichi di ASC (Tempo stimato: 2 h)
    1. Mescolare il pregel del nervo sciatico e del midollo spinale con un rapporto volumetrico di 2:1, 1:1, 1:2 e preparare l'idrogel del solo midollo spinale senza mescolare alcun pregel del nervo sciatico.
    2. Aggiungere il terreno M199 e regolare il pH 7,4 utilizzando 1 N NaOH e HCl. Risospendere le hASC con i terreni di crescita nel pregel a una densità di 1 x 106 cellule/mL.
      NOTA: La quantità di M199 e la sospensione cellulare devono essere pari al 10% di pregel.
    3. Diluire il pregel a 12 mg/mL utilizzando 1x PBS. Posizionare il pregel su micropozzetti e incubare per 30 minuti. Coltura di idrogel carichi di ASC in terreni di crescita hASC.
  4. Test di vitalità cellulare (tempo stimato: 4 ore al giorno)
    1. Preparare le soluzioni per i test di vitalità utilizzando i reagenti disponibili in commercio secondo le istruzioni del produttore.
    2. Aspirare i terreni nei giorni 1, 4, 7 e 14. Aggiungere il reagente ai pozzetti e incubare a 37 °C per 3 ore seguendo le istruzioni del produttore.
    3. Lettura della fluorescenza ad eccitazione/emissione di 560/590 nm utilizzando un lettore di piastre. Calcola la differenza percentuale utilizzando la seguente equazione:
      [(campione di fluorescenza -bianco di fluorescenza) /bianco di fluorescenza] x 100

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I tessuti decellularizzati sono stati preparati utilizzando protocolli precedentemente stabiliti con lievi modifiche26,27. Dopo la decellularizzazione, la liofilizzazione e la digestione, sono stati fabbricati idrogel compositi nervosi con rapporti SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 e idrogel solo del midollo spinale (Figura 1). La rimozione dei componenti nucleari è stata confermata dalla colorazione H&E (Figura 2A). Per valutare quantitativamente la decellularizzazione, è stato misurato il DNA residuo all'interno della MEC. Il contenuto di dsDNA nella dura madre fresca era di 132,6 ± 21,3 ng di dsDNA/mg di tessuto secco, mentre il parenchima del midollo spinale fresco e decellularizzato conteneva rispettivamente 22,6 ± 8,3 ng di dsDNA/mg di tessuto secco e 23,74 ± 6,69 ng di dsDNA/mg di tessuto secco (Figura 2B). Indicava che la dura madre doveva essere rimossa prima della decellularizzazione. La quantità di dsDNA del nervo sciatico fresco e decellularizzato era rispettivamente di 222,5 ± 42,65 e 0,63 ng di dsDNA/mg di tessuto secco (Figura 2C).

La cinetica di gelificazione degli idrogel compositi nervosi è stata valutata per determinare la velocità di gelificazione (S) e i tempi per raggiungere il 50% e il 95% della torbidità finale (t1/2 e t95). La cinetica di gelificazione ha mostrato una forma sigmoidale per tutti i gruppi di idrogel (Figura 3A). La velocità di gelificazione (S) in tutti i gruppi di idrogel non era significativamente diversa l'uno dall'altro. Il tempo necessario per raggiungere la metà della torbidità finale, t1/2, è stato di 11,32 ± 0,57 minuti, 13,33 ± 0,6 minuti e 15,7 ± 0,92 minuti e 17,23 ± 1,13 minuti rispettivamente per SN:SC= 2:1, 1:1, 1:2 e idrogel solo per il midollo spinale. Il tempo necessario per raggiungere il 95% della torbidità finale, t95, è stato di 13,8 ± 0,83 min, 15,53 ± 0,83 min, 18,38 ± 0,79 min e 19,62 ± 1,27 rispettivamente per SN:SC= 2:1, 1:1, 1:2 e idrogel solo midollo spinale. Questi risultati indicano che gli idrogel con un contenuto maggiore di nervo sciatico raggiungono lo stato stazionario più velocemente e che la ECM del nervo sciatico può promuovere l'assemblaggio di idrogel. Il risultato del test di compressione ha mostrato una tendenza secondo cui gli idrogel con più contenuto di midollo spinale forniscono una maggiore rigidità; tuttavia, non era significativamente diverso in tutti i diversi rapporti di idrogel compositi (Figura 3B).

Infine, per determinare la vitalità cellulare delle hASC in tutti i gruppi di idrogel, sono state impostate colture 3D utilizzando micropozzetti PDMS microfabbricati, come mostrato nella Figura 4. Durante la coltura di 14 giorni, la vitalità dell'ASC è stata misurata utilizzando un test colorimetrico e metabolico a fluorescenza basato su terreni di coltura cellulare disponibili in commercio, in cui le differenze percentuali rispetto alle letture sono state calcolate in quattro diversi punti temporali: giorno 1, giorno 4, giorno 7 e giorno 14 (Figura 5). Il valore della differenza percentuale aumentava all'aumentare dei punti temporali e quello dell'idrogel del solo midollo spinale era inferiore rispetto al resto dei gruppi nei giorni 1, 4 e 14. Nel loro insieme, questi dati suggeriscono che la vitalità delle hASC è aumentata durante il periodo di coltura a causa della proliferazione cellulare e dell'aumento dell'attività metabolica cellulare.

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Figura 1: Fabbricazione di idrogel compositi nervosi. Il midollo spinale suino e i nervi sciatici sono stati decellularizzati, liofilizzati e digeriti per ottenere soluzioni di pregel. Le soluzioni di pregel del nervo sciatico e del midollo spinale sono state miscelate in un rapporto di 2:1, 1:1 e 1:2 ed è stato preparato anche il pregel del solo midollo spinale. Tutte le soluzioni di pregel sono state incubate a 37 °C per generare idrogel compositi nervini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Verifica della decellularizzazione. (A) Colorazione H&E del midollo spinale suino fresco e decellularizzato e dei nervi sciatici. Le frecce indicano la presenza di cellule nei tessuti. Barre della scala = 1 mm per le immagini wide-view e 500 μm per le immagini zoom-in (200 μm solo per le immagini del nervo sciatico decellularizzato zoom-in). (B) Analisi del DNA della dura madre fresca, del parenchima e del midollo spinale decellularizzato (n=10, 16 e 6, rispettivamente). (C) Analisi del DNA di nervi sciatici freschi e decellularizzati (n=8 e 3, rispettivamente). Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard. L'analisi statistica è stata effettuata tramite ANOVA unidirezionale con un test post-hoc di Tukey per (B) e un test t per (C). Abbreviazioni: ns = non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Caratterizzazione di idrogel compositi nervosi. (A) Assorbanza normalizzata di idrogel compositi nervosi (n = 5). (B) Modulo di Young di idrogel compositi decellularizzati del midollo spinale e dei nervi (n = 4 per il midollo spinale decellularizzato e 3 per ciascun gruppo di idrogel composito, rispettivamente). Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard. L'analisi statistica è stata effettuata tramite ANOVA unidirezionale con il test post-hoc di Tukey. Abbreviazioni: ns = non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Immagine schematica della coltura 3D. (A) I micropozzetti PDMS sono stati fabbricati su un wafer di silicio rivestito in SU-8. Ogni micropozzetto è stato perforato utilizzando un punzone per biopsia da 8 mm. (B) Decellularizzare il midollo spinale e il nervo sciatico a rapporti diversi, regolare il pH a 7,4, risospendere con hASC, posizionare il pregel su micropozzetto e incubare per 30 minuti a 37°C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Saggio di vitalità cellulare. La differenza percentuale di hASC coltivati in idrogel compositi nervosi ai giorni 1, 4, 7 e 14 (n = 3). Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard. L'analisi statistica è stata effettuata tramite ANOVA unidirezionale con il test post-hoc di Tukey. * pag<0,05; (i) p<0.01; pag<0,005; p<0,001; NS: Non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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È opinione diffusa che la fisiopatologia della lesione midollare sia complessa e sfaccettata. Anche se singole terapie come il trapianto di cellule, la somministrazione di farmaci e i biomateriali hanno fornito preziose informazioni sulla lesione midollare, la natura complicata della lesione midollare può limitarne l'efficacia individuale 28,29,30,31. Pertanto, gli sforzi per sviluppare terapie combinatorie efficaci sono aumentati. Gli idrogel compositi nervosi descritti in questo studio possono fungere da veicolo di consegna efficace per cellule o farmaci. Per quanto riguarda le cellule, le ASC sono uno dei candidati promettenti per il trapianto di cellule. Le ASC secernono fattori immunomodulatori come l'interleuchina-10 (IL-10) e il fattore di crescita trasformante beta (TGF-β), nonché fattori neurotrofici come il fattore di crescita nervoso (NGF), il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), il fattore neurotrofico derivato dalla glia (GDNF) e la neurotrofina-3 (NT-3) che portano ad un aumento della crescita dei neuriti dei gangli della radice dorsale in vitro e al recupero della funzione in vivo 17,19,32,33, 34. Le ASC somministrate in soluzioni acquose hanno promosso il recupero funzionale dopo lesione midollare nei ratti e nell'uomo; tuttavia, sono state osservate sfide con la mediazione della migrazione, la differenziazione, la sopravvivenza e la differenziazione degli ASC 35,36,37. Inoltre, ci sono rapporti contrastanti sul potenziale tumorigenico delle ASC trapiantate; mentre alcuni studi hanno indicato che gli ASC possono contribuire alla proliferazione e alle metastasi di diversi tipi di cancro, altri studi hanno anche dimostrato potenziali antitumorali 38,39,40,41 Pertanto, in futuro è necessario studiare un profilo di sicurezza a lungo termine degli ASC negli idrogel compositi nervosi. Qui, il midollo spinale decellularizzato e i nervi sciatici sono stati studiati separatamente per la riparazione della lesione midollare.

Il midollo spinale decellularizzato è stato iniettato in un modello di ratto di lesione midollare e ha stimolato la crescita assonale nella lesione e un elevato recupero funzionale; Tuttavia, a causa della rapida degradazione, si è formata una cisti e il recupero è diminuito dopo 4-8 settimane di trattamento4, 42. L'idrogel acellulare decellularizzato del nervo sciatico è stato iniettato nei ratti con lesione midollare e ha promosso la rigenerazione neurale, ma l'efficacia dell'idrogel era limitata a causa della rapida degradazione24. Pertanto, gli approcci combinatori che utilizzano tessuti decellularizzati hanno recentemente attirato l'attenzione. È stato riportato che gli idrogel decellularizzati del midollo spinale promuovono la proliferazione, la migrazione e la differenziazione delle cellule staminali neurali/cellule progenitrici nei neuroni4. Ha anche facilitato la crescita di neuriti 3D dalle cellule di neuroblastoma N1E-115, indicando che gli idrogel decellularizzati del midollo spinale potrebbero essere un'impalcatura attraente per promuovere la rigenerazione assonale26. I nervi sciatici decellularizzati sono stati studiati con l'incapsulamento di Schwann e hanno mostrato un potenziale come innesto nervoso dopo LM43. Nel complesso, ci si aspetta che una combinazione di midollo spinale decellularizzato e nervi sciatici promuova sia la rigenerazione assonale che il ripristino dei tessuti. L'attuale studio inoltre non include la valutazione degli effetti terapeutici degli idrogel nervosi carichi di ASC. Pertanto, è essenziale valutare i potenziali rigenerativi, come gli effetti pro-angiogenici e neurotrofici, della piattaforma attraverso studi in vitro e in vivo . Inoltre, gli idrogel compositi nervosi possono essere facilmente applicati per incapsulare altri tipi di cellule, come le cellule di Schwann, le cellule staminali olfattive e le cellule staminali neurali, per migliorare l'efficacia terapeutica del trapianto di cellule. Sarebbe intrigante studiare la sicurezza e l'efficacia di vari tipi di cellule all'interno dell'idrogel composito nervoso in diversi stadi della lesione midollare.

Uno dei passaggi critici nella creazione di idrogel compositi è preparare una quantità adeguata di tessuto, in particolare il midollo spinale. La resa del midollo spinale decellularizzato è significativamente bassa, come indicato nel protocollo (50-100 mg di pezzo di midollo spinale e 100-150 mg di pezzo di nervo sciatico); Pertanto, non è consigliabile prelevare o ottenere midollo spinale da piccoli animali come topi e ratti. Almeno gli animali di taglia media, come i conigli, sono suggeriti per ottenere una notevole quantità di matrici del midollo spinale. Inoltre, è importante controllare il pH quando si digeriscono tessuti decellularizzati poiché l'aggiunta di tessuto può spostare il pH oltre l'intervallo di attivazione della pepsina richiesto, che è di circa 1,5-2. I tempi di agitazione per la decellularizzazione del midollo spinale sono più lunghi rispetto al metodoprecedentemente stabilito 26 perché la velocità di agitazione è più lenta nel protocollo attuale. Il rotatore utilizzato in questo protocollo offre fino a 83 giri/min, mentre nei metodi precedentemente stabiliti veniva utilizzato un massimo di 200 giri/min. Pertanto, i tempi di agitazione sono stati aumentati due volte per lavare a fondo tutti i detriti cellulari. Per garantire che tutte le soluzioni di decellularizzazione possano penetrare nei tessuti e lavare tutto il contenuto cellulare e nucleare, i tempi e la velocità di agitazione devono essere ottimizzati utilizzando l'istologia o l'analisi del DNA da parte dell'utente. Si suggerisce che il rapporto tra i tessuti e la soluzione di decellularizzazione sia un minimo di 1:15 [p/v]. I tessuti decellularizzati nel protocollo26 precedentemente stabilito sono stati digeriti/agitati a temperatura ambiente; tuttavia, in questo protocollo, sono stati digeriti con una barra magnetica su una piastra di agitazione a 4 °C e 500 giri/min per 4 giorni. Il motore della piastra di agitazione potrebbe generare calore e introdurlo nella soluzione di pregel. Pertanto, si consiglia di digerire a basse temperature o di utilizzare una piastra di agitazione a temperatura controllabile.

Come notato nell'analisi del DNA (Figura 2B), è fondamentale rimuovere la dura madre del midollo spinale perché una quantità significativa di DNA può essere trovata all'interno della dura madre. La dura madre, a differenza del parenchima del midollo spinale, è costituita da tessuto fibroso; pertanto, dovrebbero essere utilizzati diversi metodi di decellularizzazione, come precedentemente documentato44,45. La colorazione H&E e l'analisi del DNA di tessuti decellularizzati sono state utilizzate per verificare l'efficacia del processo di decellularizzazione. I seguenti criteri devono essere soddisfatti per raggiungere gli obiettivi di una decellularizzazione di successo: 1. Meno di 50 ng di dsDNA/mg di peso secco della ECM, 2. Lunghezza del frammento di DNA inferiore a 200 bp, 3. Mancanza di materiale nucleare nelle sezioni di tessuto o H&E5. L'analisi qualitativa della colorazione H&E dopo la decellularizzazione ha mostrato una mancanza di colorazione dei nuclei, suggerendo una rimozione riuscita delle cellule. Inoltre, i componenti della MEC, come il collagene e altre proteine della matrice, sono stati mantenuti e l'intensità della colorazione è stata ridotta dopo la decellularizzazione, riflettendo la rimozione del materiale cellulare. Dopo la decellularizzazione, il contenuto di DNA era di 0,63 ng nel nervo sciatico e di 23,74 ± 6,69 ng nel midollo spinale per mg di peso secco della MEC, che è al di sotto della soglia accettabile per l'applicazione in vivo.

Le misurazioni reologiche degli idrogel compositi devono essere progettate con cura, poiché i reometri con un'elevata forza di compressione o tester di trazione non possono essere utilizzati per analizzare le proprietà meccaniche di materiali morbidi come gli idrogel compositi nervini creati in questo studio. I campioni verranno strappati/strappati quando vengono afferrati sul tester di trazione e la compressione con una forza elevata non fornirà dati sufficientemente sensibili da essere analizzati. In questo studio è stato utilizzato un reometro con una forza di compressione di 250 N e si consiglia di trovare un apparecchio con una forza simile o adeguata per gli scopi degli utenti. In alternativa, diverse misure reologiche, come la misurazione del taglio oscillatorio, possono aiutare a determinare i moduli di stoccaggio e perdita. Le ridotte proprietà meccaniche dopo la decellularizzazione sono un limite in questo studio. Anche se il modulo di Young di tutti i gruppi di idrogel è simile a quello del midollo spinale decellularizzato, è significativamente diverso da quello del midollo spinale fresco (dati non mostrati). Le cellule staminali neurali e le MSC coltivate su materiali relativamente morbidi hanno mostrato un aumento della differenziazione neuronale e dell'espressione di tubulina β-III, rispettivamente46,47. Tuttavia, è possibile rinforzare o reticolare i materiali decellularizzati con altri materiali come alginato, poli(glicole etilenico), genipina e glutaraldeide 48,49,50,51. L'ottimizzazione sarà necessaria per garantire che queste strategie per migliorare le proprietà meccaniche degli idrogel non influenzino il comportamento o la vitalità cellulare.

La variabilità da lotto a lotto degli idrogel compositi nervosi può essere osservata in parte a causa delle differenze di età, sesso, peso e specie degli animali. L'uso controllato e coerente dello stesso tipo di animali può contribuire a mitigare la variabilità. Il raggruppamento dei campioni di tessuto di diversi animali può anche aiutare a ridurre la variabilità tra i lotti52. Una delle potenziali sfide per la traduzione di questo studio in applicazioni cliniche è la scalabilità. La bassa resa della decellularizzazione del midollo spinale ostacolerebbe la produzione di una grande quantità di tessuti decellularizzati. Nuovi metodi dovrebbero essere sviluppati/ottimizzati per generare più tessuti, oppure la dura madre potrebbe essere decellularizzata insieme per aumentare la resa dopo la decellularizzazione. Un'altra potenziale sfida è l'autorizzazione normativa. Negli Stati Uniti, la FDA è responsabile dell'approvazione normativa delle terapie cellulari53. L'autorità regolatoria della Repubblica di Corea ha approvato l'ingresso sul mercato di CARTISTEM, che è un prodotto a base di MSC costituito da MSC allogeniche derivate dal sangue del cordone ombelicale e dal 4% di ialuronate idrogel per il trattamento del difetto della cartilagine del ginocchio54. Casi precedenti come questi possono aiutare a semplificare il processo di revisione normativa fornendo dati sulla sicurezza e sull'efficienza.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla PhRMA Foundation e dal National Institutes of Health attraverso il premio numero P20GM139768 e R15NS121884 assegnato a YS. Vogliamo ringraziare il Dr. Kartik Balachandran e il Dr. Raj Rao del Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università dell'Arkansas per averci permesso di utilizzare le loro apparecchiature. Inoltre, vogliamo ringraziare il Dr. Jin-Woo Kim e il Sig. Patrick Kuczwara del Dipartimento di Ingegneria Biologica e Agraria dell'Università dell'Arkansas per aver fornito formazione sui reometri.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3-(Decildimetilammonio)propano solfonato sale internoSigma-AldrichD4266Utilizzato durante la decellularizzazione del nervo sciatico, SB-10
3-(N,N-Dimetilpalmitilammonio)sulfonato di propanoSigma-AldrichH6883Utilizzato durante la decellularizzazione del nervo sciatico, SB-16
Reagente AlamarBlueFisher ScientificDAL1100Utilizzato durante il test di viabilità delle cellule AlamaBlue
Condroitinasi ABCSigma-AldrichC3667Utilizzato durante la decellularizzazione del nervo sciatico
CriostatoLeicaCM1860
DesossiribonuclasioSigma-AldrichD4263Utilizzato durante la decellularizzazione del nervo sciatico
Fosfato di idrogeno disodio eptaidratoVWRBDH9296Chimico per 100 mM Na/50 mM phos e 50 mM Na/10 mM phos buffer
DNeasy Blood & Blood Kit di fazzolettiQiagen69506Utilizzato durante l'analisi del DNA
Supporto DPX per istologia, mezzo di montaggio a carrelliSigma-Aldrich6522Utilizzato durante H& Colorazione E
EosinaSigma-AldrichHT110216Utilizzato durante H& Colorazione E
EtanoloVWR89125-172
FormaldeideSigma-Aldrich252549Utilizzato durante H& Colorazione E
Glutaraldeide (GA)Sigma-AldrichG6257Utilizzato durante la funzionalizzazione della superficie PDMS
Media di crescita hASCLonzaPT-4505Utilizzato per la coltivazione di hSC contenenti siero bovino fetale e penicillina/streptomicina
EmatossilinaVWR26041-06Utilizzato durante H& Colorazione E
Cellule staminali umane derivate dall'adiposoLonzaPT-5006
Acido cloridrico (HCl)Sigma-Aldrich320331Usata per digerire tessuti decellularizzati e regolare le soluzioni di Pregel
Media M199Sigma-AldrichM0650Usata per diluire i pregel alla concentrazione desiderata
Composto temperato ottimale per il taglioTissue-Tek4583
PepsinaSigma-AldrichP7000Usata per digerire tessuti decellularizzati
Acido peraceticoLab AlleyPAA1001Utilizzato durante la decellularizzazione del midollo spinale
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)VWR97062-948
Lettore di targheBioTek InstrumentsSynergy Mx
Polietilenemina (PEI)Sigma-Aldrich181978Utilizzato durante la funzionalizzazione della superficie PDMS
Nervo sciatico suinoTissue Source LLCMaiali vivi, senza informazioni identificabili e senza dettagli di tracciabilità
Midollo spinale suinoTissue Source LLCMaiali vivi, senza informazioni identificabili e senza dettagli di tracciabilità
Sistema QuantiFluor dsDNAPromegaE2670Utilizzato per analizzare il contenuto del DNA
ReometroTA InstrumentsDHR 2
Rotatore robustoGlas-co099A RD4512Utilizzato durante la decellularizzazione del midollo spinale
Cloruro di sodio (NaCl)VWRBDH9286Chimico per 100 mM Na/50 mM phos e 50 mM Na/10 mM phos buffer
Desossicolato di sodioSigma-AldrichD6750
Monoidrato di fosfato di diidrogenoVWRBDH9298Chimico per 100 mM Na/50 mM phos e 50 mM Na/10 mM phos buffer
Soluzione di idrossido di sodio (NaOH)Sigma-Aldrich415443Usata per regolare le soluzioni di Pregel
SU-8Materiali avanzati da KayakuSU8-100Usata per rivestire il wafer al silicio
SaccarosioSigma-AldrichS8501Utilizzato durante la decellularizzazione del midollo spinale
Kit elastomero in silicone Sylgard 184DOW1317318Base e agente polimerico polidimetilxilossano (PDMS)
Triton X-100Sigma-AldrichX100Utilizzato durante la decellularizzazione del midollo spinale
Tripsina-EDTA (0,05%), fenolo rossoThermo Fisher25300062Utilizzato durante il lavoro con hASC e durante la decellularizzazione del midollo spinale
Rotatore a tubo per revolverThermo Fisher88881001Utilizzato durante la decellularizzazione del nervo sciatico
XileneVWRMK866816Utilizzato durante H& Colorazione E

Riferimenti

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