Istituzione di un modello di impianto embrionale in vitro

Sommario

Questo protocollo descrive le metodologie per stabilire un modello di impianto embrionale in vitro semplice ed efficiente per valutare le molecole rilevanti che influenzano il processo di impianto dell'embrione.

Abstract

L'impianto dell'embrione è il primo passo per l'instaurazione di una gravidanza di successo. Un modello in vitro per l'impianto dell'embrione è fondamentale per la ricerca biologica di base, lo sviluppo di farmaci e lo screening. Questo articolo presenta un modello in vitro semplice, rapido e altamente efficiente per l'impianto dell'embrione. In questo protocollo, introduciamo prima l'acquisizione di blastocisti di topo e la preparazione di cellule di adenocarcinoma endometriale umano (Ishikawa) per l'impianto, seguita dal metodo di co-coltura per embrioni di topo e cellule di Ishikawa. Infine, abbiamo condotto uno studio per valutare l'impatto di concentrazioni variabili di 17-β-estradiolo (E₂) e progesterone (P4) sui tassi di adesione degli embrioni sulla base di questo modello. I nostri risultati hanno rivelato che alte concentrazioni di E₂ riducono significativamente l'adesione dell'embrione, mentre l'aggiunta di progesterone potrebbe ripristinare il tasso di adesione. Questo modello offre una piattaforma semplice e veloce per la valutazione e lo screening delle molecole coinvolte nel processo di adesione, come citochine, farmaci e fattori di trascrizione che controllano l'impianto e la ricettività endometriale.

Introduzione

L'impianto dell'embrione, la fase iniziale di una gravidanza di successo, è fondamentale per comprenderne le basi biologiche e affrontare le sfide dell'infertilità. Tuttavia, i vincoli etici pongono limiti significativi nella raccolta di campioni di embrioni clinici umani, ostacolando la ricerca sulle intricate interazioni tra embrioni umani ed endometrio durante l'inizio della gravidanza^. Una profonda comprensione di questi complessi meccanismi è vitale per far progredire la ricerca biologica fondamentale, la scoperta di farmaci e la salute riproduttiva.

I precedenti modelli in vitro utilizzavano modelli di adesione....

Protocollo

La manipolazione dei topi e gli studi sperimentali sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal Comitato per gli animali dell'Istituto di Shanghai per le tecnologie biomediche e farmaceutiche. Garantire le procedure di sicurezza: Indossare sempre dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati quando si maneggiano prodotti chimici o materiali biologici.

1. Acquisizione di embrioni di topo

NOTA: Questa sezione descrive il processo per ottenere embrioni di topo. Topi femmina adulta (6-8 settimane di età, ibridi C57BL/6 e DBA/2) sono stati mantenuti in condizioni ambientali standard di ....

Risultati

Nel processo delle tecniche di riproduzione assistita, l'iperstimolazione ovarica controllata (COH) è un passaggio cruciale, che porta a livelli di estrogeni significativamente elevati nelle pazienti di oltre 10-20 volte rispetto ai cicli naturali¹¹. Dato questo contesto, ci siamo chiesti se alte concentrazioni sieriche di estrogeni influiscano sull'impianto dell'embrione durante il trasferimento di embrioni freschi. Sulla base di questo modello di impianto embrionale, abbiamo studiato gli effetti.......

Discussione

La semplicità e la rapidità del modello in vitro proposto per l'impianto dell'embrione offrono notevoli vantaggi per lo screening farmacologico in fase iniziale e altre applicazioni di ricerca. Il protocollo semplice, unito alla natura ad alto rendimento delle linee cellulari Ishikawa, lo rende un candidato ideale per screening su larga scala, in particolare nelle prime fasi della scoperta di farmaci. Liang¹³ ha scoperto che il knockdown di TAGLN2 diminuisce la capacità di invasione delle.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
17-β-estradiolo	SIGMA	3301	Il più potente ormone estrogenico per mammiferi
BD Falcon	BD	353001	Piastre di Petri batteriologiche stile 35 x 10 mm con coperchio ermetico, polistirene vergine di grado cristallino,
sterile Armadio di biosicurezza	ESCO	classe BSC	Operazioni asettiche, preparazione di piatti di coltura, aliquotazione di reagenti, ecc
CO2 Incubatrice	Thermo	8000DH	Coltura embrionale
Piastra	di coltura Corning	3506	Coltura cellulare
DMEM/F12	Gibco	1133032	DMEM/F12 (1x), liquido 1:1, Contiene L-glutammina e 15 mM di tampone HEPES
Siero fetale bovino Gibco		10099141	Siero fetale bovino, qualificato, gelatina di origine australiana
	SIGMA	G9391	Tipo B, polvere, bioreagente, adatto per colture cellulari
HCG	Nanjing Aibei	M2520	Reagente di sterilizzazione, iniezione intraperitoneale, 50 UI/mL
ialuronidasi	SIGMA	V900833	Reagente, polvere
KSOM	Merck	MR-020P-D	(1x), polvere, senza fenolo rosso, 5 x 10 mL
L-glutammina	Gibco	25030081	L-glutammina-200 mM (100x), liquido
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 Medium (1x), liquido, con olio minerale rosso fenolo
	L'olio minerale SIGMA	M8410	è adatto per l'uso come strato di copertura per controllare l'evaporazione e la contaminazione incrociata in varie applicazioni di biologia molecolare
Penicillina-streptomicina, liquido	Gibco	15140122	10.000 unità di penicillina (base) e 10.000 unità di streptomicina (base), utilizzando penicillina G (sale di sodio) e streptomicina solfato in soluzione salina allo 0,85%
PMSG	Nanjing Aibei	M2620	Reagente di sterilizzazione, iniezione intraperitoneale, 50 UI/mL
Progesterone	SIGMA	5341	Ormone steroideo secreto dal corpo luteo durante la seconda metà del ciclo mestruale
Piruvato di sodio	Gibco	11360070	Il piruvato di sodio viene comunemente aggiunto ai terreni di coltura cellulare come fonte di carbonio in aggiunta al glucosio
Stereomicroscopio	Olympus	SZX7	Prelievo degli embrioni e osservazione dello sviluppo degli embrioni

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