Una pipeline versatile per l'analisi dei cambiamenti dinamici nei corpi nucleari in una varietà di tipi di cellule

Summary

Questo metodo descrive un protocollo di immunofluorescenza e una pipeline di quantificazione per valutare la distribuzione proteica con vari modelli di organizzazione nucleare nei linfociti T umani. Questo protocollo fornisce una guida passo dopo passo, a partire dalla preparazione del campione e proseguendo attraverso l'esecuzione di analisi semi-automatizzate nelle Fiji, concludendo con la gestione dei dati da parte di un taccuino Google Colab.

Abstract

Vari processi nucleari, come il controllo trascrizionale, si verificano all'interno di strutture discrete note come focolai che sono distinguibili attraverso la tecnica dell'immunofluorescenza. Lo studio della dinamica di questi focolai in diverse condizioni cellulari tramite microscopia fornisce preziose informazioni sui meccanismi molecolari che regolano l'identità e le funzioni cellulari. Tuttavia, l'esecuzione di saggi di immunofluorescenza su diversi tipi di cellule e la valutazione delle alterazioni nell'assemblaggio, nella diffusione e nella distribuzione di questi focolai presentano numerose sfide. Queste sfide comprendono complessità nella preparazione dei campioni, nella determinazione dei parametri per l'analisi dei dati di imaging e nella gestione di volumi di dati sostanziali. Inoltre, i flussi di lavoro di imaging esistenti sono spesso personalizzati per utenti esperti, limitando così l'accessibilità a un pubblico più ampio.

In questo studio, introduciamo un protocollo di immunofluorescenza ottimizzato su misura per lo studio delle proteine nucleari in diversi tipi di cellule T primarie umane che possono essere personalizzate per qualsiasi proteina di interesse e tipo di cellula. Inoltre, presentiamo un metodo per quantificare in modo imparziale la colorazione delle proteine, sia che formino focolai distinti sia che mostrino una distribuzione nucleare diffusa.

Il metodo proposto offre una guida completa, dalla colorazione cellulare all'analisi, sfruttando una pipeline semi-automatizzata sviluppata a Jython ed eseguibile nelle Fiji. Inoltre, forniamo uno script Python di facile utilizzo per semplificare la gestione dei dati, accessibile pubblicamente su un notebook Google Colab. Il nostro approccio ha dimostrato efficacia nel produrre analisi di immunofluorescenza altamente informative per proteine con diversi modelli di organizzazione nucleare in diversi contesti.

Introduction

L'organizzazione del genoma eucariotico è governata da più strati di modificazioni epigenetiche¹, coordinando diverse funzioni nucleari che possono verificarsi all'interno di compartimenti specializzati chiamati corpi nucleari o condensati². All'interno di queste strutture, avvengono processi come l'inizio della trascrizione³, l'elaborazione dell'RNA ^4,5,6, la riparazione del DNA ^7,8, la biogenesi dei ribosomi ^9,10,11 e la regolazione dell'eterocromatina^12,13. La regolazione dei corpi nucleari si adatta sia alle dimensioni spaziali che temporali per soddisfare le esigenze cellulari, guidata dai principi della separazione di fase^14,15. Di conseguenza, questi corpi funzionano come fabbriche transitorie in cui i componenti funzionali si assemblano e si smontano, subendo cambiamenti nelle dimensioni e nella distribuzione spaziale. Pertanto, la comprensione delle caratteristiche delle proteine nucleari al microscopio, compresa la loro propensione a formare corpi e la loro disposizione spaziale in diverse condizioni cellulari, offre preziose informazioni sui loro ruoli funzionali. La microscopia a fluorescenza è un metodo ampiamente utilizzato per lo studio delle proteine nucleari, consentendo la loro rilevazione attraverso anticorpi fluorescenti o esprimendo direttamente bersagli con un reporter di proteine fluorescenti^16,17.

In questo contesto, i corpi nucleari appaiono come focolai luminosi o punti, con un notevole grado di sfericità, che li rende facilmente distinguibili dall'ambiente circostante^16,18. Tecniche di super-risoluzione come STORM e PALM, fornendo una risoluzione migliorata (fino a 10 nm)¹⁹, consentono una caratterizzazione più precisa della struttura e della composizione di specifici condensati²⁰. Tuttavia, la loro accessibilità è limitata dalle spese per le attrezzature e dalle competenze specialistiche necessarie per l'analisi dei dati. Pertanto, la microscopia confocale rimane popolare grazie al suo favorevole equilibrio tra risoluzione e utilizzo più ampio. Tale popolarità è facilitata dalla rimozione intrinseca della luce sfocata, che riduce la necessità di ampie procedure di post-elaborazione per una segmentazione accurata, la sua ampia disponibilità negli istituti di ricerca, il suo tempo di acquisizione effettivo e la preparazione del campione che è tipicamente efficiente. Tuttavia, la misurazione accurata della distribuzione, dell'assemblaggio o della diffusione delle proteine utilizzando saggi di immunofluorescenza in diverse condizioni cellulari pone delle sfide, poiché molti metodi esistenti non forniscono indicazioni sulla selezione di parametri adeguati per proteine con modelli di distribuzione variabili²¹. Inoltre, la gestione del grande volume di dati risultante può essere scoraggiante per gli utenti con esperienza limitata nell'analisi dei dati, compromettendo potenzialmente il significato biologico dei risultati.

Per affrontare queste sfide, introduciamo un protocollo dettagliato passo dopo passo per la preparazione dell'immunofluorescenza e l'analisi dei dati, con l'obiettivo di fornire un metodo imparziale per quantificare la colorazione delle proteine con vari modelli di organizzazione (Figura 1). Questa pipeline semi-automatizzata è progettata per utenti con competenze limitate nell'analisi computazionale e di imaging. Combina le funzionalità di due affermati plug-in delle Fiji: FindFoci²² e 3D suite²³. Integrando la capacità di identificazione precisa dei punti focali di FindFoci con le funzionalità di identificazione e segmentazione degli oggetti nello spazio 3D offerte dalla suite 3D, il nostro approccio genera due file CSV per canale per ogni campo di acquisizione. Questi file contengono informazioni complementari che facilitano il calcolo di metriche adatte a vari tipi di distribuzione del segnale, come il conteggio dei focolai per cellula, la distanza dei focolai dal centroide nucleare e il coefficiente di disomogeneità (IC), che abbiamo introdotto per la colorazione diffusa delle proteine. Inoltre, riconosciamo che l'estrapolazione dei dati può richiedere molto tempo per gli utenti con limitate capacità di gestione dei dati. Per semplificare questo processo, forniamo uno script Python che compila automaticamente tutte le misurazioni raccolte in un unico file per ogni esperimento. Gli utenti possono eseguire questo script senza la necessità di installare alcun software di linguaggio di programmazione. Forniamo un codice eseguibile su Google Colab, una piattaforma basata su cloud che permette la scrittura di script Python direttamente nel browser. Ciò garantisce che il nostro metodo sia intuitivo e facilmente accessibile per un uso immediato.

Dimostriamo l'efficacia del nostro protocollo nell'analizzare e quantificare le alterazioni nella distribuzione del segnale di due proteine nucleari: la proteina 4 contenente il bromodominio (BRD4) e il soppressore di zeste-12 (SUZ12). BRD4 è una proteina coattivatrice ben documentata all'interno del complesso mediatore nota per formare condensati associati all'inizio trascrizionale dipendente dalla polimerasi II^24,25. SUZ12 è un componente proteico del Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) responsabile della regolazione della deposizione della modificazione istonica H3K27me3^26,27. Queste proteine mostrano modelli diversi all'interno di due tipi cellulari distinti: le cellule T umane CD4⁺ naive appena isolate, che sono quiescenti e mostrano bassi tassi di attività trascrizionale, e le cellule T_H1 CD4⁺ differenziate in vitro, che sono cellule effettrici specializzate e proliferanti che mostrano un aumento della trascrizione²⁸.

Protocol

L'utilizzo di campioni umani a fini di ricerca è stato approvato dai Comitati Etici della Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milano) ed è stato ottenuto il consenso informato di tutti i soggetti (numeri di autorizzazione: 708_2020). Il protocollo è organizzato in tre sezioni principali: esecuzione dell'immunofluorescenza, acquisizione delle immagini e analisi delle immagini. In media, richiede 4 giorni lavorativi per essere completato (Figura 1).

1. Preparazione all'immunofluorescenza

NOTA: Questo protocollo di immunofluorescenza può essere facilmente personalizzato per vari tipi di cellule e bersagli proteici regolando le condizioni di fissazione e permeabilizzazione. La preparazione dell'immunofluorescenza richiede in genere meno di 3 giorni per essere completata, con la durata dell'incubazione degli anticorpi primari che varia in base alla qualità dell'anticorpo e alla proteina bersaglio (Figura 1).

1. Preparazione del campione
   1. Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) attraverso una centrifugazione in gradiente di densità tramite un terreno di circa 1,077 g/mL di densità secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
   2. Isolare le cellule T CD4⁺ dalle PBMC con microsfere magnetiche, seguendo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
   3. Colorare le cellule con anticorpi per CD4, CD45RA e CD45RO (Tabella dei materiali) e procedere con la selezione FACS delle cellule T CD4⁺ naive come cellule CD4⁺/CD45RA⁺/CD45RO^-, come descritto altrove^29,30.
      NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per le specifiche dello smistatore FACS utilizzato in questo protocollo.
   4. Indurre la differenziazione delle cellule T CD4⁺ naive in T helper 1 (cellule T_H1 CD4⁺ ) come descritto in ²⁹. In breve, coltivare 1,5 x 10⁶ cellule/mL di cellule T CD4⁺ naive selezionate FACS in terreno T_H1 stimolandole con biglie magnetiche anti-CD3/anti-CD28 in un rapporto 1:1. Contare le cellule e dividerle quando raggiungono 1,5 × 10⁶ cellule/mL ogni 2-3 giorni (vedere la Tabella 1 per la composizione del terreno T_H1).
   5. Valutare la secrezione di citochine con funzione effettrice dopo 7 giorni di differenziazione, come descritto in ²⁹.
2. Fissazione e permeabilizzazione cellulare
   NOTA: Tutte queste procedure sono state descritte in ^30,31 con piccoli adattamenti.
   1. Per garantire un'adesione ottimale delle celle, trattare i vetrini coprioggetti in vetro (10 mm, spessore 1,5 H) con una soluzione di rivestimento (Tabella 1) come segue:
      1. Pulire i vetrini coprioggetti lavandoli inizialmente con acqua distillata (ddH₂O), quindi con un risciacquo con etanolo al 70% (EtOH) e lasciandoli asciugare all'aria.
      2. Posizionare i vetrini coprioggetti lavati in una piastra a 24 pozzetti per i passaggi 1.2.1.3-1.3.
      3. Applicare una goccia di 200 μl di soluzione di rivestimento sul vetrino coprioggetti. Dopo 5 minuti, rimuovere la goccia e lasciarla asciugare all'aria.
      4. Lavare i vetrini coprioggetti applicando una goccia di 200 μL di ddH₂O. Dopo 5 minuti, rimuovere la goccia e asciugare all'aria.
      5. Ripetere 3 passaggi 1.2.1.3-1.2.1.4.
   2. Risospendere le cellule T CD4⁺ naive e le cellule T_H1 CD4⁺ in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a una concentrazione di 2 × 10⁶ cellule/mL.
      NOTA: La concentrazione indicata è consigliata specificamente per le piccole cellule come i linfociti T primari umani. Per le celle aderenti, il trattamento di rivestimento del vetro non è necessario. Procedere invece direttamente con la crescita delle cellule sulla superficie di vetro utilizzando il terreno di coltura cellulare appropriato.
   3. Applicare una goccia di 200 μl della sospensione cellulare sul vetrino coprivetro. Lasciare seminare le cellule a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti; Quindi, rimuovi la goccia.
   4. Fissare le cellule con paraformaldeide al 3% appena filtrata (soluzione PFA, Tabella 1) per 10 minuti a RT.
   5. Lavare il vetrino coprioggetti in vetro con TPBS (Tabella 1) per 3 x 5 minuti a RT.
   6. Rimuovere il TPBS e aggiungere la soluzione di permeabilizzazione (Tabella 1) per 10 minuti a RT.
   7. Scartare la soluzione di permeabilizzazione e incubare il campione nella soluzione di conservazione (Tabella 1) da 1 ora a una notte (ON) a 4 °C.
      NOTA: In questa fase, il protocollo può essere interrotto in sicurezza e i vetrini di copertura possono essere conservati in soluzione di conservazione in una piastra da 24 pozzetti per 3-4 settimane.
3. Immunofluorescenza
   1. (Facoltativo) Rimuovere il vetrino coprioggetti dalla piastra a 24 multipozzetti e congelare rapidamente su ghiaccio secco per 30 secondi, scongelare a RT, quindi lavare il vetrino coprioggetti in un pozzetto preriempito con soluzione di conservazione.
   2. (Facoltativo) Ripetere 3 passaggi 1.3.1.
   3. Lavare in soluzione di permeabilizzazione per 5 minuti a RT. Quindi, lavare per 2 x 5 minuti con TPBS a RT.
   4. Incubare in HCl 0,1 N per 12 minuti a RT.
   5. Eseguire due lavaggi rapidi in 1x PBS.
      NOTA: Le condizioni di permeabilizzazione cellulare specificate, comprese le fasi di congelamento e disgelo e il trattamento con HCl, sono ottimali per la colorazione dei componenti nucleari in cellule caratterizzate da cromatina densamente impacchettata. Tuttavia, quando si ha a che fare con celle caratterizzate da cromatina meno compatta, è consigliabile ridurre o evitare questi passaggi. Inoltre, per mirare ai componenti citoplasmatici, considerare la riduzione o l'eliminazione del trattamento con HCl.
   6. Incubare le cellule con l'anticorpo primario (BRD4, 1:500, o SUZ12, 1:100) diluito in tampone di diluizione anticorpale (Tabella 1) (200 μl per ciascun vetrino coprioggetti) ON a 4 °C.
      NOTA: L'immunofluorescenza può essere eseguita multiplexando più di un anticorpo primario a seconda delle esigenze sperimentali, degli anticorpi secondari e dei sistemi di rilevamento.
   7. Lavare 3 x 5 minuti con PBS-T (Tabella 1) a RT con agitazione leggerre.
   8. Incubare le cellule con anticorpo secondario diluito in tampone di diluizione anticorpale (200 μl per ogni vetrino coprioggetti) per 1 ora a RT.
      NOTA: Scegliere l'anticorpo secondario più adatto alle esigenze sperimentali e ai sistemi di rilevamento disponibili. Assicurarsi che ogni anticorpo secondario sia destinato alla specie da cui deriva l'anticorpo primario. Inoltre, selezionare fluorofori compatibili con i filtri e la sorgente luminosa del microscopio. È fondamentale evitare la sovrapposizione spettrale tra il fluoroforo scelto e lo spettro di emissione della colorazione nucleare.
   9. Lavare 3 x 5 minuti con PBS-T a RT agitando leggermente.
   10. Colorante con 1 ng/mL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluito in 1x PBS per 5 minuti a RT.
       NOTA: I coloranti alternativi possono essere utilizzati per la colorazione nucleare purché non si sovrappongano allo spettro di emissione degli anticorpi secondari.
   11. Eseguire diversi lavaggi rapidi in 1x PBS.
   12. Montare il vetrino coprioggetti su un vetrino per microscopia con mezzi di montaggio antisbiadimento.

2. Acquisizione delle immagini

NOTA: La durata dell'acquisizione dell'immagine dipende dallo strumento e dalle impostazioni selezionate.

1. Acquisizione al microscopio confocale
   1. Acquisisci immagini 3D utilizzando un microscopio confocale, impostando una dimensione del passo di 0,25 μm in z e una dimensione dei pixel di 0,1-0,2 μm.
      NOTA: Per ottenere una risoluzione ottimale limitata alla diffrazione della luce con il nostro obiettivo 63x 1.4 NA Oil, abbiamo impostato la dimensione del foro stenopeico a 0.8 UA, 2x la media della linea e la dimensione del fotogramma 1024 × 1024 pixel. Il laser di eccitazione e la sequenza di acquisizione del canale sono stati selezionati deliberatamente per evitare interferenze o diafonia tra i fluorofori utilizzati. Tuttavia, la regolazione dei parametri deve essere adattata alle caratteristiche specifiche del microscopio e del campione. Vedere la Tabella dei materiali per le specifiche del microscopio confocale utilizzato in questo protocollo.
   2. Acquisisci un numero costante di campi casuali per comprendere circa 50 cellule per replicato biologico.

3. Analisi delle immagini

1. Installazione del software
   1. Scarica e installa l'ultima versione disponibile delle Figi dalla pagina di download ufficiale delle Figi (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   2. Installa 3D Suite tramite il sito di aggiornamento delle Figi o seguendo manualmente le istruzioni sul sito Web di 3D Suite (https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download).
   3. Installa GDSC (FindFoci) tramite il sito di aggiornamento delle Fiji o manualmente seguendo le istruzioni sul repository GitHub (https://github.com/aherbert/gdsc).
2. Conversione TIFF
   1. Scaricare lo script "convert_to_TIFF.py" (File supplementare 1).
   2. Trascina e rilascia lo script su Fiji ed esegui il codice.
   3. Nel pannello visualizzato, passa al percorso in cui è memorizzato l'esperimento. La sottocartella contenente i file TIFF convertiti viene creata nella stessa cartella dell'esperimento.
3. Inizializza le impostazioni su 3D Manager.
   1. Apri il pannello delle opzioni di 3D Manager facendo clic su Plugin | 3DSuite | Opzioni di 3D Manager.
   2. All'interno della finestra delle opzioni di 3D Manager, selezionare le caselle di controllo corrispondenti alle seguenti misure: Volume (unità), Valore medio di grigio, Riquadro di delimitazione (pix), Valore di grigio Std Dev, Baricentro (pix) e Baricentro (unità).
   3. Selezionare le seguenti opzioni: Escludi oggetti sui bordi XY ed Escludi oggetti sui bordi Z e fare clic su OK.
      NOTA: questo passaggio deve essere eseguito una sola volta per configurare inizialmente le metriche che verranno memorizzate nei file di informazioni spaziali e quantitative. Le metriche selezionate sono essenziali per garantire il corretto funzionamento della pipeline. In questo passaggio è possibile includere metriche aggiuntive facoltative, come descritto in dettaglio nella sezione Discussione.
4. Imposta i parametri sulla GUI di FindFoci.
   NOTA: questo passaggio deve essere eseguito una sola volta per configurare la pipeline semi-automatizzata con parametri ottimali, che verranno quindi incorporati negli script.
   1. Aprire l'immagine di prova. Duplicare il canale proteico, incluso lo stack (Ctrl + Maiusc + D), selezionare la casella di controllo hyperstack e specificare il numero di canale appropriato all'interno della casella Canali (c) e rinominarlo di conseguenza.
   2. Avvia il registratore di macro Fiji navigando su Plugin | Macro | Registrare.
   3. Apri il plugin FindFoci (clicca su Plugin | GDSC | TrovaFoci | FindFoci GUI) e selezionare l'immagine da analizzare dal menu a discesa "Immagine".
   4. Impostare i parametri come segue (Figura 2A): Sfocatura gaussiana = 1,5; metodo di sfondo = SD sopra la media; parametro di sfondo = 9; metodo di ricerca = frazione di picco - sfondo; parametro di ricerca = 0.7; metodo del picco = relativo sopra lo sfondo; parametro di picco = 0,2; dimensione minima = 5; Picchi massimi = 1.000.000.
      NOTA: I parametri indicati sono stati selezionati in base ai nostri casi di studio e potrebbero non essere adatti per altre procedure di colorazione.
   5. Per migliorare l'identificazione dei fuochi, regolare i seguenti parametri:
      1. La sfocatura gaussiana definisce l'entità dell'attenuazione per segmentare meglio i fuochi. Tienilo vicino al diametro dei fuochi (pixel).
      2. Il parametro di sfondo imposta una soglia per distinguere lo sfondo dal segnale dei fuochi. Aumentare i valori per imporre soglie più stringenti.
      3. Il parametro di ricerca definisce la percentuale di fluorescenza dal picco inclusa nel riconoscimento del segnale. Diminuire i valori per includere le aree più lontane dal picco di fluorescenza.
      4. Il parametro di picco determina il grado in cui due picchi di segnale sono considerati continui o separati. Diminuendo il valore si otterrà la separazione dei picchi.
      5. Picchi massimi specifica il numero massimo di fuochi identificabili. Imposta numeri alti per includere tutti i punti focali nell'immagine.
   6. Eseguire FindFoci e copiare la stringa visualizzata nella finestra del registratore (Passaggio 3.4.2, Figura 2B) che contiene i parametri selezionati, escluse le virgolette. Per ulteriori informazioni relative alle impostazioni, fare riferimento alle istruzioni del manuale del plugin ²².
5. Pipeline di quantificazione delle proteine nucleari
   1. Scaricare lo script "nuclear_prot_q.py" (File supplementare 2).
   2. Trascina e rilascia lo script su Fiji e fai clic su Esegui per eseguire il codice.
   3. Seguire le istruzioni all'interno della finestra di dialogo visualizzata per elaborare le immagini.
      1. Canale del nucleo: inserire il numero corrispondente al canale di DAPI (o qualsiasi colorazione nucleare).
      2. Sfocatura gaussiana del nucleo: inserire il valore di sigma necessario per sfocare l'immagine per la segmentazione.
         NOTA: Mantenere questo parametro più vicino al diametro del nucleo (cioè 5-6 μm). Valori sigma più alti sono indicati per la colorazione disomogenea.
      3. Canale proteico: inserire il numero corrispondente al canale della colorazione di interesse.
      4. Parametro FindFoci: incolla la stringa ottenuta dallo step di registrazione della macro nel passaggio 3.4.6 (Figura 2B).
      5. (Facoltativo) Controllo qualità: verifica la qualità dei nuclei segmentati. In questo modo lo script verrà messo in pausa e sarà possibile controllare manualmente ogni regione nucleare di interesse (ROI) generata.
      6. Selezionare una directory di immagini: fare clic sul pulsante Sfoglia per accedere alla cartella contenente i file TIFF da analizzare.
   4. Una volta compilate tutte le caselle, fare clic su OK per continuare l'esecuzione.
   5. Se un nucleo non è segmentato correttamente e non soddisfa i requisiti di qualità, eliminarlo o modificarlo come indicato nella Figura 2C.
      1. Controlla l'elenco ROI nella finestra ROIManager3D; se l'elenco è vuoto, selezionare la finestra di unione e fare clic su Quantifica 3D per aggiornare il gestore. Quindi, chiudere la tabella dei risultati Quantify 3D. Seleziona il canale dei nuclei e fai clic su Live-ROI su ON.
      2. Seleziona la ROI appartenente allo stesso nucleo e premi Unisci o premi Elimina nel caso di nuclei indesiderati.
      3. Fate clic su Seleziona tutto (Select All ) e procedete con l'analisi facendo clic su OK nella finestra di controllo della maschera (Mask check ).
      4. Per i risultati, cercare nella cartella Quantification all'interno del percorso del file indicato nel passaggio 3.5.3.6, contenente un file txt con i record del parametro utilizzato per l'analisi.
6. Pipeline su Google Colab
   1. Scaricare il notebook "final_nuclear_protein_metrics.ipynb" (file supplementare 3).
   2. Apri il taccuino su Google Colab (https://colab.research.google.com/).
   3. Carica tutte le cartelle contenenti i file .csv di ciascun campo immagine in una cartella di preferenza in Google Drive.
   4. Indicare nel taccuino il percorso della cartella in cui sono memorizzate le sottocartelle dei risultati ed eseguire tutte le celle. Al termine della compilazione del codice, il file del foglio di calcolo finale contenente tutti i dati compilati viene creato nella stessa cartella in cui sono stati caricati i file .csv.

Results

Il protocollo delineato in questo metodo facilita la visualizzazione e la quantificazione delle alterazioni nella colorazione delle proteine nucleari all'interno delle cellule T primarie umane e può essere personalizzato per diversi tipi di cellule e bersagli proteici. Come casi di studio, abbiamo condotto e analizzato la colorazione di BRD4 e SUZ12 in cellule CD4⁺ naive e T_H1.

BRD4 mostra un pattern di colorazione ben punteggiato sia nelle cellule CD4⁺ T_H1 quiescenti naive che in quelle differenziate, consentendo l'uso di parametri progettati per l'identificazione dei focolai per entrambi i tipi di cellule (Figura 3A). La nostra pipeline consente la quantificazione di vari parametri, tra cui il numero, il volume, il segnale di fluorescenza (espresso come intensità media di fluorescenza (MFI)), la copertura e la disposizione spaziale dei focolai di BRD4 all'interno del nucleo (Figura 3B-F). Inoltre, abbiamo introdotto un calcolo automatico per determinare la percentuale del volume nucleare dei focolai, facilitando il confronto tra celle con diverse dimensioni nucleari (Figura 3E).

Infine, abbiamo fornito l'opzione di mappare le distanze dei fuochi dal centro nucleare, aiutando a comprendere il loro posizionamento nucleare (Figura 3F). I risultati ottenuti dalla quantificazione evidenziano notevoli alterazioni nei focolai BRD4 tra le cellule T_H1 e le cellule T CD4⁺ quiescenti, che comprendono un aumento del numero, delle dimensioni, della luminosità e del volume dei focolai, nonché differenze nella loro distribuzione e localizzazione. Questi risultati sono coerenti con l'aumentata attività trascrizionale delle cellule T attivate/proliferanti rispetto alla loro controparte quiescente²⁸.

Al contrario, SUZ12 non partecipa alla formazione della condensa. Nella nostra indagine, abbiamo osservato una disparità significativa nel pattern di colorazione di SUZ12 tra i due stati cellulari: un pattern puntato nelle cellule T naive passa a un pattern diffuso nelle cellule T_H1 CD4⁺ (Figura 4A). Questo cambiamento significativo nel comportamento delle proteine ostacola la comparabilità delle caratteristiche dei focolai utilizzando parametri identici poiché l'identificazione dei punti nelle cellule T_H1 CD4⁺ è in gran parte infruttuosa (Figura 4A). Sebbene sia generalmente raccomandato mantenere la coerenza sia nei parametri di acquisizione che in quelli di analisi quando si confronta la colorazione in immunofluorescenza in condizioni cellulari distinte, si rendono necessari aggiustamenti in caso di modifiche sostanziali del target di interesse.

In questo scenario specifico, come illustrato nella Figura 4B, nonostante la sperimentazione di varie combinazioni di parametri, tra cui l'aggiustamento dei parametri di sfondo, la sfocatura gaussiana e i parametri di ricerca (come suggerito nel passaggio 3.4.5 del protocollo), FindFoci incontra difficoltà nel distinguere i picchi di segnale reali da quelli insignificanti a causa della natura di distribuzione intrinseca della proteina. Inoltre, sottolineiamo che le misure convenzionali come l'MFI nucleare possono essere fuorvianti (Figura 4C), non considerando le alterazioni nella distribuzione del segnale.

Quindi, per misurare tali cambiamenti, suggeriamo l'uso del coefficiente di variazione, una metrica che abbiamo introdotto in questo protocollo per caratterizzare la diffusione delle proteine, indicata come coefficiente di disomogeneità (IC). L'IC cattura accuratamente la diffusione dei focolai di SUZ12 nelle cellule T_H1 CD4⁺ senza forzarne l'identificazione con approcci di segmentazione errati (vedi Figura 4D). Infine, utilizzando DAPI come controllo, che rimane uniformemente distribuito in entrambe le condizioni cellulari, convalidiamo ulteriormente l'efficacia di questo parametro (Figura 4E).

Figura 1: Rappresentazione schematica della preparazione dell'immunofluorescenza e dell'analisi dei dati. Il protocollo per la colorazione e l'analisi dell'immunofluorescenza delle proteine nucleari consiste in tre fasi principali: preparazione del campione, acquisizione dell'immagine e analisi, che coprono circa 4 giorni lavorativi. Lo script utilizza due plugin, 3D Suite per condurre la segmentazione dei nuclei e FindFoci per elaborare il canale proteico. Le informazioni spaziali e quantitative riguardanti i focolai e il nucleo sono raccolte in file csv separati. Uno script eseguibile su Google Colab collega le misurazioni dei focolai con i nuclei corrispondenti utilizzando il riquadro di delimitazione del nucleo e calcola le misurazioni derivate in base ai dati raccolti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rappresentazione delle impostazioni della pipeline di quantificazione delle proteine nucleari. (A) Finestra popup FindFoci che illustra i parametri per l'identificazione dei focolai (sezione 3.4.3 del protocollo). (B) Finestra popup che rappresenta la macro che registra i parametri selezionati di FindFoci. La stringa copiata viene incollata all'interno della finestra di avvio (passaggi di protocollo 3.4.6-3.5.3.4). (C) Pannello che mostra la fase di controllo della qualità della segmentazione dei nuclei per la rimozione o la modifica manuale delle regioni nucleari di interesse utilizzando il gestore 3D (passaggi del protocollo 3.5.5.1 -3.5.5.3). Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Figura 3: Confronti tra condizioni cellulari distinte basate sull'analisi dei focolai BRD4. (A) Immagini rappresentative al microscopio a fluorescenza confocale della colorazione in immunofluorescenza di BRD4 (grigio) in cellule T CD4⁺ primarie naive umane e cellule CD4⁺ T_H1. I nuclei sono controcolorati con DAPI (blu). Ingrandimento originale 63x; barra di scala = 5 μm. In basso, i fuochi BRD4, identificati dalla tubazione, sono contrassegnati da punte di freccia bianche e contrastati in giallo (in basso). (B) Box plot che rappresenta il numero/nucleo di focolai BRD4 in cellule CD4⁺ naive e T_H1 (n = 2 individui). (C) Rappresentazione box plot del volume (μm³) dei focolai di BRD4 in cellule CD4⁺ naive e T_H1 (n = 2 individui). (D) Rappresentazione box plot di focolai MFI di focolai BRD4 in cellule CD4⁺ naive e T_H1 (n = 2 individui). (E) Box plot che rappresenta la percentuale del volume nucleare occupato dai focolai di BRD4 in relazione al volume totale del nucleo (n = 2 individui). (F) Rappresentazione delle frequenze di distanza dei focolai di BRD4 dal centroide nucleare alla periferia nucleare (n = 2 individui). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Coefficiente di disomogeneità, una metrica per quantificare la transizione da un pattern punteggiato a uno disperso nei segnali di immunofluorescenza SUZ12. (A) Immagini rappresentative al microscopio a fluorescenza confocale della colorazione in immunofluorescenza per SUZ12 (magenta) in cellule T CD4⁺ primarie naive umane e T_H1 CD4⁺ cellule. I nuclei sono controcolorati con DAPI (blu). Ingrandimento originale 63x; barra di scala = 5 μm. In basso, i fuochi SUZ12 identificati dalla tubazione sono contrassegnati da una punta di freccia bianca e contrastati in arancione (B). Esempi di identificazione errata dei focolai nelle cellule T_H1 CD4⁺ mostrate da frecce bianche e maschera arancione con due diverse impostazioni dei parametri. (C) Rappresentazione box plot dell'MFI nucleare di SUZ12 in cellule CD4⁺ naive e T_H1 (n = 2 individui). (D) Rappresentazione box plot di SUZ12 IC in cellule CD4⁺ naive e T_H1 (n = 2 individui). (E) Rappresentazione box plot di DAPI IC in cellule CD4⁺ naive e T_H1 (n = 2 individui). Abbreviazioni: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilidolo; MFI = intensità media della fluorescenza; IC = coefficiente di disomogeneità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Soluzione	Composizione		Commenti/Descrizione
TH1 medio	RPMI con GlutaMAX-I, 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS), 1% (v/v) di aminoacidi non essenziali, 1 mM di piruvato di sodio, 50 UI/mL di penicillina, 50 μg/mL di streptomicina, 20 UI/mL di IL-2 ricombinante, 10 ng/mL di IL-12 ricombinante, 2 mg/mL di anti-IL-4 neutralizzante.		Passaggio 1.1.4.
Soluzione di rivestimento	0,1% poli-L-lisina in ddH2O		Passaggio 1.2.1.
PBS-T	1x PBS/0,1% TWEEN 20 pH 7,0		Passaggio 1.3.
Soluzione di PFA per il fissaggio	Paraformaldeide (PFA) al 3% diluita in PBS-TWEEN allo 0,1%		Passaggio 1.2.4.
Archivio TPBS	0,05% Triton X-100 diluito in 1x PBS		Passaggio 1.2., 1.3.
Soluzione di permeabilizzazione	0,5% TPBS diluito in 1x PBS		Passaggio 1.2., 1.3.
Soluzione di archiviazione	20% glicerolo/1x PBS		Passaggio 1.2.7., 1.3.1.
Tampone di diluizione degli anticorpi	0,1% PBS-TWEEN/2% siero di capra/1% BSA		Passaggio 1.3.6., 1.3.8.

Tabella 1: Composizione dei media e dei buffer utilizzati in questo protocollo.

File supplementare 1: "convert_to_TIFF.py". Questo file contiene lo script per convertire qualsiasi file immagine (ad esempio, ND2, LIF, ecc.) in file TIFF necessari per processi di quantificazione accurati. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: "nuclear_prot_q.py". Questo file contiene lo script che permette di misurare e quantificare immagini contenenti almeno due canali (colorazione nucleosa, colorazione di proteine nucleari). Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: "final_nuclear_protein metrics.ipynb". Questo file contiene un notebook Jupyter che estrae e compila un riepilogo di tutti i parametri rilevanti in un unico file Excel, utilizzando l'output di "nuclear_prot_q.py" come input. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

In questo studio, presentiamo un metodo per eseguire esperimenti di immunofluorescenza su proteine nucleari nei linfociti T umani. Questo metodo offre flessibilità per l'uso con vari tipi di cellule attraverso piccole modifiche nelle fasi di fissazione e permeabilizzazione, come descritto in precedenza^30,31.

Il nostro flusso di lavoro di imaging si basa su tecniche consolidate descritte in letteratura, in particolare FindFoci e 3D Suite^22,23. A differenza delle pubblicazioni precedenti, forniamo un codice Jython eseguibile integrato in Fiji per una pipeline semi-automatizzata, che consente un meticoloso monitoraggio dei parametri e controlli visivi della qualità. In particolare, abbiamo introdotto la capacità opzionale di regolare la qualità della segmentazione dei nuclei nella sezione 3.5.3.5 del protocollo e implementato un passaggio correttivo nella sezione 3.5.5 del protocollo. Con lo script eseguibile su Google Colab, gli utenti possono recuperare misurazioni complete e scegliere quelle più adatte ai loro specifici scenari biologici.

La pipeline di analisi fornita è scritta in Jython (Java + Python) e richiede l'installazione di Fiji per l'esecuzione, insieme a due plug-in distinti: 3D Suite e FindFoci (Figura 1). La pipeline inizia con la conversione dell'immagine in formato TIFF e la pre-elaborazione del canale contenente i nuclei con un filtro di sfocatura gaussiana per migliorare la segmentazione dei nuclei. 3D Suite consente di acquisire sia i) informazioni spaziali, come il volume nucleare, il baricentro e le coordinate del riquadro di delimitazione (che rappresentano il riquadro più piccolo che racchiude l'oggetto e utilizzate per associare i fuochi al nucleo destro), sia ii) informazioni quantitative, tra cui MFI e deviazione standard del segnale. Successivamente, la pipeline utilizza FindFoci per identificare i massimi locali nel segnale dei focolai, eliminando la dipendenza dai metodi di soglia globale (che spesso si basano sulla discrezione dell'utente e possono mancare di precisione) e registra informazioni sia spaziali che quantitative relative ai fuochi. La cartella di output conterrà quindi due file CSV per canale, che comprendono metriche spaziali ("M_.csv") e quantitative ("Q_.csv").

Il file finale, contenente tutte le misurazioni raccolte e derivate, viene generato eseguendo uno script Python su Google Colab. Questo file include metriche come il numero di focolai per nucleo, l'MFI dei focolai, il coefficiente di disomogeneità (IC), l'MFI nucleare, la distanza dei focolai dal centroide nucleare e la percentuale di volume nucleare occupato. Stimiamo un tempo di elaborazione di circa 1 minuto per immagine, comprese le fasi di controllo della qualità visiva. Questo tempo di elaborazione può essere ulteriormente accelerato attraverso l'ottimizzazione delle impostazioni di immunofluorescenza e dei parametri di analisi.

La pipeline calcola i parametri per le proteine nucleari che presentano modelli sia ben punteggiati che diffusi, consentendo agli utenti di selezionare il parametro più appropriato. Si consiglia di utilizzare il coefficiente di disomogeneità per descrivere la dissoluzione dei focolai proteici.

Un passaggio fondamentale per garantire una corretta identificazione dei fuochi prevede l'impostazione di parametri per discriminare i picchi di segnale reali dal rumore di fondo. È fondamentale condurre test approfonditi su immagini casuali prima di eseguire la pipeline. Sebbene il nostro studio si concentri principalmente su un singolo canale, la pipeline supporta l'introduzione di varie combinazioni di coloranti mirati a diverse proteine in esperimenti di immunofluorescenza. Non supporta l'analisi simultanea di più canali e deve essere eseguito separatamente per ciascun canale. Inoltre, abbiamo scelto di presentare misure specifiche in questo protocollo; Tuttavia, nella sezione 3.3.2 possono essere incorporate nella tubazione anche metriche aggiuntive, come l'intensità integrata per valutare le variazioni assolute del segnale di fluorescenza o parametri fisici come la circolarità e la compattezza. L'inclusione di metriche non attualmente integrate in questa pipeline richiede competenza nella programmazione Python per integrarle nel file delle metriche finali; in caso contrario, saranno automaticamente inclusi nei file di informazioni spaziali ("M_.csv") e quantitative ("Q_.csv").

La tempistica di questa pipeline dipende da fattori quali le dimensioni e la quantità dell'immagine, il numero di canali per analisi e le impostazioni del microscopio. Inoltre, le prestazioni della macchina influenzano il tempo di esecuzione, con passaggi visivi che potenzialmente rallentano il processo.

Vale la pena notare che, sebbene la microscopia confocale offra informazioni preziose, rimane una tecnologia limitata dalla diffrazione che può limitare la precisione delle strutture nucleari osservate o dei focolai proteici. Per migliorare la robustezza dell'analisi, suggeriamo di aumentare il numero di nuclei e campioni biologici esaminati. All'aumentare del numero di nuclei analizzati, qualsiasi cambiamento notevole nella morfologia nucleare o nella distribuzione delle proteine diventa più evidente, indipendentemente dai limiti di risoluzione.

In termini di potenziali applicazioni future, questo metodo mostra versatilità e adattabilità a vari tipi di cellule e protocolli di colorazione. Ad esempio, può essere facilmente impiegato in esperimenti di radiobiologia, dove la quantificazione accurata dei focolai indotti da radiazioni ionizzanti (IRIF) funge da indicatore diretto del danno al DNA³². Sebbene la nostra enfasi principale sia sull'analisi nucleare, il protocollo può essere facilmente personalizzato incorporando un colorante citoplasmatico e sostituendolo con il canale nucleare all'interno dello script. Inoltre, l'analisi può integrarsi perfettamente in altre metodologie sperimentali come DNA e RNA FISH ^30,31, sfruttando i parametri predefiniti per l'analisi della topologia nucleare.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette Safe-Lock da 1,5 mL	Eppendord	#0030121503	Sezione di protocollo 1
Pipette sierologiche da 10 mL	VWR	#612-3700	Sezione di protocollo 1
20 &; Puntale per pipetta a barriera L	Thermo Scientific	#2149P-HR	Sezione del protocollo 1
Provetta conica in polipropilene da 50 mL	Falcon	#352070	del protocollo 1
200 &; Puntale per pipetta con barriera L	Thermo Scientific	#2069-HR	Protocollo sezione 1
soluzione antisbiadimento - ProlongGlass - terreno di montaggio	Invitrogen	#P36984	Passaggio 1.3.12
BSA (albumina sierica bovina)	Sigma	#A7030	Passaggio 1.3.6., 1.3.8.
Kit di isolamento cellulare CD4+ T	Miltenyi Biotec	#130-096-533	Passaggio 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindolo)	Invitrogen	Cat#D1306	Passaggio 1.3.10.
Ghiaccio			Passaggio 1.3.1.
Perlina Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28	Life Technologies	#1131D	perline magnetiche passaggio 1.1.4.
EtOH	Carlo Erba	#4146320	Passaggio 1.2.1.1.
FACSAria SORP	BD Bioscences		Passaggio 1.1.3. Dotato di BD FACSDiva Software versione 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Passaggio 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Passaggio 1.1.1.
FIJI Versione 2.14.0	-	-	Protocollo sezione 3
Vetrino coprioggetti (10 mm, spessore 1,5 H)	Microscopia elettronica Sciences	#72298-13	Passaggio 1.2.1.
Glicerolo	Sigma	#G5516	Passaggio 1.2.7-1.3.1.
Anticorpo secondario anti-coniglio di capra AF568	Invitrogen	A11036	Passaggio 1.3.8.
HCl	Sigma	#320331	Passaggio 1.3.4.
neutralizzante umano anti-IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	Passaggio 1.1.4.
IL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	Passaggio 1.1.4.
Miltenyi Biotec	ricombinante umano	Cat#130-097-744	Passaggio 1.1.4.
Leica TCS SP5 Microscopio confocale	Leica Microsystems-Protocol		sezione 2, dotato di HCX PL APO 63x, obiettivo a immersione in olio da 1,40 NA, con zoom 3x aggiuntivo. Dimensione del foro stenopeico: 0,8 AU. Media della linea 2×. Dimensione del telaio 1024&volte; 1024 pixel.
vita	soluzione di aminoacidi non essenziali	#11140035	Passaggio 1.1.4.
Vetrini per microscopio	VWR	#631-1552	Passaggio 1.3.12.
Mouse monoclonale anti-umano CD4 APC-Cy7 (clone RPA-T4)	BD Bioscience	#557871	Passaggio 1.1.3.
Mouse monoclonale anti-umano CD45RA PECy5 (clone 5H9)	BD Bioscience	#552888	Passaggio 1.1.3.
Mouse monoclonale anti-umano CD45RO APC (clone UCHL1)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Passaggio 1.1.3.
Multiwell 24 pozzetti	Falcon	#353047	Protocollo sezione 1
Siero di capra normale	Invitrogen	PCN5000	Passaggio 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	Protocollo sezione 1
Soluzione di penicillina/streptomicina	Life Technologies	#15070063	Passaggio 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	Passaggio 1.2.4.
poli-L-lisina	Sigma	#P8920	1.2.1.
Anticorpo primario - BRD4	Abcam	#ab128874	Passaggio 1.3.6.
Anticorpo primario - MAb di segnalazione SUZ12	Cel #	3737	Passaggio 1.3.6.
RPMI 1640 con Glutamax-I	Life Technologies	#61870010	Passaggio 1.1.4.
Tecnologie di vita	del piruvato di sodio	#11360039	Passaggio 1.1.4.
Triton X-100	Sigma	#T8787	Passaggio 1.2., 1.3.
TWEEN 20	Sigma	#P9416	Passaggio 1.3.
Pinzette	-	-	Protocollo sezione 1