Articolo metodologico

Elettropenetragrafia AC-DC per lo studio dei comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Culex tarsalis sulle mani umane

DOI:

10.3791/66877

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29 novembre 2024

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1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

In questo articolo

Sommario

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Sono descritte le procedure per studiare i comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Culex tarsalis sulle mani umane utilizzando l'elettropenetragrafia AC-DC.

Abstract

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Le zanzare trasmettono agenti patogeni che influenzano negativamente la salute umana e animale. Una maggiore comprensione della loro biologia dell'alimentazione del sangue e delle interazioni con ospiti e agenti patogeni potrebbe essere sfruttata per sviluppare nuovi bersagli per il controllo delle malattie trasmesse dalle zanzare. Sfortunatamente, i comportamenti di sondaggio (cioè puntura) delle zanzare sono poco compresi perché si verificano all'interno dei tessuti dell'ospite. Qui, viene descritta una procedura non invasiva per l'utilizzo dell'elettropenetragrafia AC-DC (EPG) per visualizzare e quantificare indirettamente i comportamenti alimentari delle zanzare registrando i cambiamenti nei segnali elettrici generati durante il sondaggio e l'ingestione sulle mani umane. Sottili fili d'oro sono attaccati alle zanzare utilizzando colla d'argento conduttiva e collegati allo strumento EPG. L'ospite umano tiene in mano una sonda di tensione del substrato. L'indagine dell'ospite da parte della zanzara cablata completa il circuito elettrico e i segnali elettrici vengono registrati su un computer come "forme d'onda" che possono quindi essere misurate ed enumerate per l'analisi. Questa metodologia è stata utilizzata per caratterizzare i comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Aedes aegypti e Culex tarsalis e può essere applicata ad altre specie di zanzare. L'EPG può essere utilizzato per studiare gli effetti di agenti patogeni, insetticidi e altri fattori sui comportamenti alimentari delle zanzare.

Introduzione

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Le zanzare causano sofferenze e perdite economiche in tutto il mondo a causa del loro ruolo di vettori di malattie e fastidiosi parassiti1. Le zanzare anopheles trasmettono la malaria, che ogni anno causa circa 219 milioni di casi in tutto il mondo, più di 400.000 decessi2 e 12 miliardi di dollari USA in costi diretti3. Le zanzare Aedes sono i vettori più importanti di importanza per la salute pubblica perché hanno una presenza quasi globale e trasmettono agenti di Chikungunya, febbre dengue, filariosi linfatica, febbre della Rift Valley, febbre gialla e Zika, che mietono vittime, travolgono i sistemi sanitari e provocano sofferenza cronica, morbilità permanente e disabilità4,5. Inoltre, le zanzare Culex trasmettono agenti di encefalite equina, encefalite giapponese, filariosi linfatica, encefalite di Saint Louis e febbre del Nilo occidentale, che hanno un impatto sulla salute umana e animale3,4.

Il controllo dei vettori con approcci basati su insetticidi è il metodo principale per il controllo delle malattie trasmesse da vettori a livello globale6,7. Tuttavia, il numero di insetticidi disponibili per il controllo delle zanzare è limitato. Inoltre, la resistenza agli insetticidi si sta evolvendo in molte specie, specialmente nelle zanzare Aedes, influenzando la nostra capacità di combattere le malattie trasmesse da vettori e determinando la necessità di nuove strategie di controllo6,8. Una migliore comprensione della biologia delle zanzare, delle interazioni zanzara-ospite-patogeno e dei processi che regolano la trasmissione dei patogeni può facilitare lo sviluppo di nuovi strumenti per il controllo dei vettori6.

I comportamenti di sondaggio e ingestione nei tessuti dell'ospite possono influenzare la trasmissione di agenti patogeni e la patologia della malattia9,10,11,12. Ad esempio, sono state ingerite più microfilarie quando Aedes aegypti si nutriva direttamente dai capillari piuttosto che raccogliere sangue all'esterno dei vasi rotti13. Pertanto, la ricerca di base e applicata su questo argomento può aiutare a sviluppare, perfezionare e valutare le strategie di controllo delle zanzare e altre contromisure per la trasmissione di agenti patogeni. Tuttavia, esistono significative lacune di conoscenza nei dettagli dei comportamenti criptici di alimentazione del sangue che si verificano sotto la superficie della pelle dell'ospite perché questi comportamenti spesso richiedono procedure invasive su modelli animali vivi o impiegano substrati artificiali trasparenti o diete liquide9,11,14,15. Le tecniche di elettropenetragrafia non invasiva (EPG; chiamata anche grafo di penetrazione elettrica) sono state utilizzate per studiare i comportamenti alimentari degli insetti che si nutrono di piante correlate alla trasmissione di patogeni delle piante, alla resistenza delle piante ospiti e alle modalità d'azione degli insetticidi perché consentono ai ricercatori di osservare, registrare e quantificare indirettamente i movimenti e i comportamenti dell'apparato boccale che si verificano all'interno dei tessuti ospiti10,12.

Dagli anni '50, le tecniche di monitoraggio elettronico della penetrazione sono state applicate agli artropodi che si nutrono di sangue, comprese le zanzare16,17,18,19,20. Tuttavia, l'EPG non è mai stato ampiamente adottato per gli artropodi che si nutrono di sangue perché le attività biologiche corrispondenti alle forme d'onda non sono mai state verificate21. Inoltre, i progetti e l'elettronica dei primi strumenti hanno portato a un'eccessiva enfasi di alcuni segnali elettrici, ad alti rapporti rumore/segnale, bassa risoluzione e distorsione delle forme d'onda e irritazione per gli ospiti vertebrati12,22. Uno strumento più recente, il monitor AC-DC EPG23, ha impostazioni variabili e una migliore elaborazione del segnale, rendendolo più adatto per registrare artropodi che si nutrono di sangue e decifrare le origini biologiche delle forme d'onda negli studi di correlazione sperimentale10,12.

Per l'EPG, un segnale elettrico viene applicato all'host attraverso una sonda di tensione del substrato (ad esempio, un elettrodo di riferimento). L'artropode è attaccato a un elettrodo di registrazione e posizionato sull'ospite. Quando l'artropode inserisce il suo apparato boccale (cioè gli stiletti) nell'ospite, il segnale elettrico viene trasmesso al monitor AC-DC EPG per l'elaborazione del segnale. I segnali elettrici vengono quindi visualizzati su un computer come "forme d'onda" corrispondenti a comportamenti specifici come i movimenti dell'apparato boccale, l'ingestione, la salivazione e l'acquisizione/inoculazione di agenti patogeni10,12. Le variabili di risposta sequenziali e non sequenziali relative alla durata e al conteggio delle forme d'onda24,25 a diversi livelli gerarchici (famiglie, tipi e sottotipi) possono quindi essere calcolate in base alla frequenza e alla durata delle forme d'onda per ottenere informazioni sui comportamenti alimentari che si verificano all'interno e tra le specie e in risposta a fattori biotici e abiotici, come ospiti, agenti patogeni, pesticidi e condizioni ambientali10,12.

Finora, il monitor EPG AC-DC è stato utilizzato per caratterizzare i comportamenti di sondaggio e ingestione di Ae. aegypti26 e Culex tarsalis27 zanzare che si nutrono di mani umane e zecche Dermacentor variabilis e Amblyomma americanum che si nutrono di vitelli bovini28. Inoltre, è stato recentemente sviluppato un modello murino per EPG29 per facilitare gli studi sui patogeni utilizzando questo strumento. Le mani umane sono ideali per la caratterizzazione iniziale della forma d'onda della zanzara perché gli ospiti umani possono segnalare quando sentono il sondaggio della zanzara e altri comportamenti, rendendo più facile la correlazione delle forme d'onda con i comportamenti (Tabella 1). Inoltre, una migliore comprensione della plasticità nei comportamenti alimentari tra le zanzare in diverse popolazioni umane potrebbe contribuire allo sviluppo di interventi di gestione più specializzati per le zanzare e i patogeni che trasmettono.

Tabella 1: Descrizione delle famiglie di forme d'onda utilizzate per classificare i segnali elettrici registrati da Culex tarsalis sulle mani umane utilizzando AC-DC EPG. La fase di sondaggio e le attività biologiche corrispondenti a ciascuna famiglia di forme d'onda. Vedi Cooper et al.27 per maggiori informazioni. Abbreviazione: AC = corrente alternata, DC = corrente continua, EPG = elettropenetrografo. Clicca qui per scaricare questa Tabella.

Per facilitare l'uso dell'EPG per studiare la biologia delle zanzare e le interazioni ospite-vettore, qui viene presentata la metodologia per quantificare i comportamenti alimentari delle zanzare Cx. tarsalis sulle mani umane utilizzando il monitor EPG AC-DC. Questi protocolli si basano sulle procedure fondamentali AC-DC EPG descritte nelle risorse online30 e presuppongono che gli utenti abbiano una conoscenza operativa di base di AC-DC EPG e del software associato31. Le procedure descritte possono essere modificate per altre specie di zanzare e ospiti e forniscono una base per facilitare la ricerca basata su ipotesi sui comportamenti alimentari delle zanzare.

Tabella 2: Definizioni della terminologia comune AC-DC EPG. Le definizioni si basano su quelle fornite nelle risorse online30,31 e nella letteratura scientifica32. Abbreviazione: AC = corrente alternata, DC = corrente continua, EPG = elettropenetrografo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Protocollo

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Questo protocollo (IRB-10729) è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) for Human Research presso la Kansas State University27 ed è destinato esclusivamente all'uso con zanzare prive di agenti patogeni. I volontari umani hanno dato il loro consenso informato a partecipare allo studio e a pubblicare i loro dati. Prima di iniziare qualsiasi lavoro con animali, esseri umani o rischi biologici, assicurarsi che tutte le procedure siano state esaminate e approvate dai comitati di regolamentazione istituzionali appropriati o dalle persone di supervisione. Consulta la Tabella dei materiali per i dettagli su tutte le attrezzature e i materiali utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione iniziale e configurazione

  1. Configurare il monitor EPG AC-DC (Figura 1A), la gabbia di Faraday (Figura 1B,C) e il software come descritto in precedenza30,31 utilizzando le modifiche descritte di seguito (passaggi 1.1.1-1.1.5). Fare riferimento alle risorse online30 per tutorial passo-passo sulla configurazione e l'utilizzo dell'attrezzatura e del software. Salvare la configurazione desiderata come predefinita nel software di gestione hardware e di revisione della forma d'onda. Fare riferimento alla Tabella 2 per un elenco della terminologia comune AC-DC EPG e delle relative definizioni.
    1. Collegare un amplificatore dello stadio principale (head amp) e una sonda di tensione del substrato al canale 1 della scatola di controllo.
      NOTA: La registrazione da un singolo canale viene presentata anche se il monitor CA-CC può ospitare contemporaneamente quattro insetti e ospiti.
    2. Assicurarsi che il canale 1 sulla scatola di controllo sia acceso e che i canali Pre-1 e Post-1 corrispondenti sulla scatola di interfaccia dello switch siano accesi.
      NOTA: I canali non utilizzati devono rimanere spenti.
    3. Utilizzare il software di gestione hardware per abilitare i canali 1 e 3 sulla scheda A/D DI-710 (ma non altri) per registrare i segnali pre e post rettificati.
    4. Formattare il software di gestione hardware per visualizzare/sovrapporre le forme d'onda pre e post-rettificate (ad esempio, 1 = 1 per il pre-segnale e 2 = 3 per il post-segnale).
    5. Impostare la frequenza di campionamento sul software di gestione hardware su 100 campioni al secondo per canale (ad esempio, S/s/CHAN: 100).
  2. Costruisci stub di insetti26,27,29,30:
    1. Preriscaldare il saldatore alla temperatura consigliata per la saldatura specifica con nucleo di colofonia.
    2. Utilizzare uno strumento tagliafili per rimuovere il rivestimento in plastica a ~6 cm dall'estremità di un rotolo di filo di rame da 20 AWG, ma evitare di recidere o contrassegnare il fascio di filo di rame all'interno (Figura 2A). Quindi, tagliare il fascio di fili di rame esposto e srotolarlo in singoli fili (Figura 2B).
    3. Utilizzare una pinza ad ago per avvolgere un filo di rame attorno all'albero di un perno di bocchetta adatto sotto la testa (cioè la parte superiore piatta) in modo che la maggior parte del filo di rame si estenda oltre la testa del perno. Piegare la coda del filo sulla testa del perno per fissare il filo in posizione (Figura 2C).
      NOTA: Montare i pin della rosetta di prova per identificare quelli che si adattano perfettamente alla porta dell'head amp (quando è spento, scollegato e impostato su 106 Ohm (Ω)).
    4. Agganciare l'albero del perno della bocchetta nell'ausilio di saldatura delle mani che aiutano in modo che il filo di rame sia rivolto verso l'alto. Quindi, applicare una piccola quantità di disossidante idrosolubile (~0,2 cm) alla giunzione del perno della bocchetta e del filo di rame (Figura 2D).
      ATTENZIONE: Il flusso è tossico e deve essere maneggiato con cura.
    5. Srotolare ~10 cm di saldatura e raddrizzarlo. Tenere il saldatore caldo contro la testa del perno per alcuni secondi fino a quando il flusso non si scioglie e il metallo è caldo. Quindi, premere la punta della saldatura sulla testa del pin accanto al saldatore fino a quando la saldatura non si scioglie e ricopre completamente la giunzione, fondendo il pin e il filo in un tronchetto di insetti.
    6. Mentre il mozzo dell'insetto si raffredda, pulire la punta del saldatore con lana d'acciaio e una spugna umida.
    7. Una volta freddo, rimuovi il mozzicone di insetto dalle mani che aiutano. Sciacquare il mozzicone di insetto con etanolo al 70% e poi con acqua per rimuovere il flusso residuo. Tagliare il filo di rame alla lunghezza desiderata (~3 cm, Figura 2E).
    8. Ripetere i passaggi 1.2.3-1.2.7 fino a quando non vengono costruiti 20-30 stub di insetti.
  3. Assembla un aspiratore di insetti26,27:
    1. Passare la punta di una pipetta di vetro Pasteur attraverso una fiamma, ruotando leggermente la pipetta. Ripetere l'operazione fino a quando l'estremità della pipetta non raggiunge le dimensioni appropriate per adattarsi perfettamente all'addome dell'insetto.
    2. Coprire l'estremità grande della pipetta Pasteur modificata con una zanzariera, quindi inserirla direttamente nel tubo di silicone collegato a un aspiratore da laboratorio e fissare la giunzione con nastro isolante per formare un aspiratore di insetti (Figura 2H).
      NOTA: La pipetta e la rete Pasteur possono essere inserite in un breve pezzo di tubo di plastica dotato di un sezionatore rapido per passare facilmente da una dimensione all'altra (Figura 2H).

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Figura 1: La configurazione dell'apparecchiatura di monitoraggio EPG AC-DC per la registrazione su mani umane. (A) Componenti dell'EPG, tra cui (1) scatola di controllo, (2) scatola di interfaccia interruttore, (3) alimentatore, (4) scheda A/D DI-710, (5) computer, (6) regolatore di potenza e (B) gabbia di Faraday contenente (C) un microscopio digitale (7) su un supporto a collo d'oca, (8) pluriball e cuscini d'aria, (9) sonda di tensione del substrato e (10) amplificatore dello stadio principale su un supporto da laboratorio. Abbreviazioni: AC = corrente alternata, DC = corrente continua, EPG = elettropenetrografo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Elettrodi di registrazione per il cablaggio delle zanzare e un aspiratore di insetti per manipolare le zanzare durante il cablaggio. (A) Filo di rame da 20 AWG con 6 cm di rivestimento in plastica rimosso per esporre il fascio di filo di rame all'interno. (B) Singoli trefoli del fascio di fili di rame. (C) Un filo di rame avvolto attorno alla testa di un perno di ottone con la coda del filo piegata sopra la testa del perno. (D) Una piccola quantità di disossidante sulla giunzione del perno della rosetta in ottone e del filo di rame tenuto da un aiuto per la saldatura in preparazione alla saldatura. (E) Un tronchetto di insetto completo costruito con un chiodo di ottone saldato a un filo di rame. (F) Un elettrodo di registrazione costituito da un filo d'oro avvolto attorno alla punta del filo di rame di un tronchetto di insetto e fissato in posizione con colla d'argento. (G) Un primo piano dell'anello d'oro sulla punta dell'elettrodo di registrazione. (H) Un aspiratore per insetti assemblato (in alto) e smontato (in basso) realizzato con pipette Pasteur modificate, zanzariere, tubi di plastica, nastro isolante e sezionatori rapidi maschi, accanto al tubo dell'aspiratore da laboratorio dotato di sezionatore rapido femmina (in alto a destra). Barre della scala = 1 cm (A-F), 200 μm (G). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Cablaggio delle zanzare

  1. Preparare zanzare e colla d'argento (il pomeriggio/sera prima dell'EPG):
    1. Sostenere e mantenere le zanzare del ceppo KNWR di Cx. tarsalis come descritto in precedenza27.
    2. Zanzare femmine adulte veloci, 5-17 giorni dopo l'eclosione, per 8-12 ore per migliorare i tassi di sondaggio ma consentire l'accesso all'acqua per evitare la mortalità.
    3. Prepara colla d'argento fresca26,27,28,29,30:
      1. Aggiungere 510 mg di scaglie d'argento da 4-8 μm in un becher da 20 mL. Tarare l'equilibrio e aggiungere 1.100 mg di colla scolastica non tossica al becher sopra il fiocco d'argento.
      2. Tarare la bilancia, aggiungere 510 mg di scaglie d'argento da 8-10 μm al becher sopra la colla, quindi aggiungere 1.000 μL di acqua utilizzando una pipetta.
      3. Aggiungere delicatamente una barra di agitazione al bicchiere e posizionarla sulla piastra di agitazione. Iniziare a mescolare lentamente, aumentare gradualmente fino all'impostazione "veloce" e mescolare per 4 minuti. Assicurarsi che tutto il contenuto sia incorporato.
      4. Utilizzare una pipetta di trasferimento (con la punta tagliata) per trasferire la colla d'argento in provette da microcentrifuga da 1,5 mL.
      5. Avvolgere la parte superiore dei tubi di colla d'argento con Parafilm e riporre sul piano di lavoro fino al momento dell'uso.
        NOTA: La colla d'argento ha la consistenza corretta per un massimo di 2 giorni, ma si consiglia di preparare la colla fresca la sera prima dell'uso30.
  2. Prepara gli elettrodi di registrazione26,27,29,30:
    1. Agitare energicamente la colla d'argento prima dell'uso.
    2. Avvolgi un blocco di schiuma con un involucro di plastica fresco per contenere i mozziconi di insetti preparati e le zanzare cablate.
      NOTA: La schiuma deve essere abbastanza grande da consentire alle zanzare cablate di stare in superficie senza toccarsi, ma abbastanza piccola da stare all'interno di una scatola di stoccaggio. ATTENZIONE: Le goccioline escretrici rilasciate dopo l'alimentazione con il sangue possono contenere agenti patogeni. Gettare l'involucro di plastica/blocco di schiuma in modo appropriato dopo l'uso.
    3. Rimuovere l'ossidazione (e la vecchia colla d'argento se si riutilizzano mozziconi di insetti) dalla punta del filo di rame raschiando la parte superiore di 1 cm del filo di rame con una lama di rasoio fino a renderla lucida su tutti i lati. Prepara un mozzicone di insetti per ogni zanzara, più alcuni extra.
    4. Tagliare il filo d'oro di 0,025 mm di diametro in pezzi lunghi 4-5 cm. Tenere sempre il filo in una pinza a chiusura automatica mascherata con nastro adesivo per evitare di ammaccare il filo.
      NOTA: Il filo d'oro è molto più facile da vedere su uno sfondo nero.
    5. Posiziona l'estremità del filo d'oro lungo la punta pulita del filo di rame del tronco dell'insetto e avvolgi delicatamente il filo d'oro 3 volte attorno al filo di rame.
    6. Utilizzare una sonda di dissezione per applicare la colla d'argento per tenere in posizione il filo d'oro. Assicurarsi che non ci siano code o estremità libere. Metti il mozzicone di insetti nella schiuma fino a quando la colla non si asciuga.
    7. Accarezza delicatamente il filo d'oro attaccato al tronchetto dell'insetto per lisciarlo e modellarlo in un arco lungo e delicato (Figura 2F). Tagliare il filo alla lunghezza desiderata (~2,5-3 cm).
    8. Lavorando al microscopio da dissezione, utilizzare una pinza a punta fine per creare un anello d'oro sulla punta del filo d'oro e piegare l'anello a un angolo di 90° come descritto di seguito (passaggi 2.2.8.1-2.2.8.4; Figura 2E,F). Assicurati che il circuito dell'oro sia completamente chiuso. Rimetti il mozzicone dell'insetto nel blocco di schiuma.
      1. Usando la mano non dominante, tenere il mozzicone dell'insetto per il chiodo di ottone, con la punta del filo d'oro che tocca il tavolino del microscopio. Usando la mano dominante, afferra l'estremità del filo d'oro con una pinza a punta fine.
      2. Usando la pinza a punta fine, incrocia la punta del filo d'oro sul filo di rame del tronco d'insetto vicino al punto in cui è incollato il filo d'oro. Toccare l'estremità della pinza a punta fine e il filo d'oro contro il tavolino del microscopio.
      3. Tirare delicatamente il mozzicone dell'insetto fino a quando il filo d'oro non forma un piccolo anello d'oro attorno alla punta della pinza a punta fine (non tirare troppo). Rilasciare il filo d'oro e rimuovere con cautela la pinza.
      4. Tenendo ancora il mozzicone dell'insetto nella mano non dominante, afferrare l'anello d'oro con la pinza a punta fine in modo che la pinza sia ad un angolo perpendicolare al collo del filo e la punta della pinza si estenda al centro dell'anello d'oro, afferrando così entrambi i lati dell'anello. Tirare delicatamente il mozzo dell'insetto mentre si ruota leggermente la pinza lontano dal tronchetto dell'insetto fino a quando l'anello non viene piegato a un angolo di 90° rispetto al collo del filo (Figura 2G).
  3. Collegare gli elettrodi di registrazione alle zanzare26,27,29,30 (la mattina dell'EPG):
    1. Anestetizzare le zanzare a digiuno con gas CO2 fino a quando tutti i movimenti non si fermano. Posiziona le zanzare sulla schiena sul tampone per anestesia, con l'addome rivolto verso il ricercatore.
    2. Posizionare un pezzo di nastro da laboratorio di ~2 cm sotto un microscopio da dissezione, con il lato adesivo rivolto verso il basso. Applicare una goccia di 0,5 cm (~ 10 μL) di colla d'argento sul nastro.
    3. Aspirare l'addome di una zanzara anestetizzata nella pipetta Pasteur modificata utilizzando l'aspirazione solo il tempo necessario per posizionare l'addome in posizione. Tenere la zanzara sotto il cannocchiale da dissezione sopra la colla d'argento usando l'aspiratore.
      NOTA: Le ali possono essere all'interno o all'esterno della punta della pipetta Pasteur modificata, ma averle all'interno aiuterà a prevenire la caduta della zanzara. Evitare di piegare o danneggiare le ali.
    4. Lavorando velocemente, immergi uno spillo da minuzia nella colla d'argento e applica uno strato sottile sul pronoto della zanzara (cioè la superficie dorsale del torace). Procedere immediatamente al passaggio successivo, se possibile (o anestetizzare nuovamente la zanzara se necessario).
      NOTA: Si consiglia di rimuovere le squame sul pronoto strofinando il perno avanti e indietro per garantire la penetrazione della colla nei pori della cuticola. Evita di mettere la colla su qualsiasi altra parte della zanzara.
    5. Immergi rapidamente l'anello d'oro sulla punta dell'elettrodo di registrazione nella colla d'argento e posizionalo sul punto della colla d'argento sul pronoto della zanzara. Fai oscillare l'anello avanti e indietro per assicurarti che sia a filo contro il pronoto. Tenere premuto il filo fino a quando la colla non si asciuga (~20-25 s).
    6. Sostituisci il mozzicone dell'insetto nella schiuma con un angolo che consenta alla zanzara cablata di stare comodamente in piedi quando si sveglia. Procedi con il cablaggio del prossimo mosquito.
      NOTA: Si consiglia di prendere nota della qualità di ogni lavoro di cablaggio.
    7. Una volta cablato il numero desiderato di zanzare, posizionare il blocco di schiuma in una scatola di immagazzinaggio. Mantenere le zanzare in normali condizioni di allevamento fino all'uso.

3. Impostazione e preparazione EPG (la mattina prima dell'EPG)

  1. Accendere il monitor EPG AC-DC (ruotando l'interruttore sull'alimentatore) almeno 30 minuti prima della registrazione per consentire l'equilibrio dello strumento e la risoluzione dei problemi.
    NOTA: I canali in uso sulla scatola di controllo e sulla scatola di interfaccia dell'interruttore possono essere lasciati accesi.
  2. Accendi il computer e apri il software di gestione hardware.
    NOTA: Se i segnali non appaiono come linee sottili piatte, è necessaria la risoluzione dei problemi (vedere la sezione di discussione).
  3. Esegui il test tattile27,30 per verificare la funzionalità dell'apparecchiatura:
    1. Mentre si è a terra (cioè toccando la gabbia di Faraday con la pelle nuda), ruotare la manopola dell'head amp su 106 Ω e inserire l'asta di un tronchetto di insetti nella porta.
      NOTA: L'esecuzione del test tattile a un livello di resistenza di ingresso (Ri) più elevato può danneggiare l'head amp.
    2. Mentre è collegato a terra, accendere l'head amp e afferrare saldamente il filo di rame del tronchetto dell'insetto tra l'indice e il pollice tre volte. Se l'EPG funziona correttamente, sullo schermo appariranno tre grandi picchi sia nel pre che nel post segnale. In caso contrario, è necessaria la risoluzione dei problemi (vedere la sezione di discussione).
  4. Regolare le impostazioni dello strumento su 150 mV di corrente alternata (CA) con un Ri di 107 Ω, un guadagno hardware di 20-40x, un offset negativo, una linea di base nativa e un guadagno software di 8-16x27,30, come descritto di seguito (passaggi 3.4.1-3.4.3).
    1. Impostare la tensione, il tipo di corrente, il guadagno hardware (intervallo, guadagno e moltiplicatore), l'offset e la linea di base (zero) utilizzando gli interruttori e le manopole sul canale 1 della scatola di controllo.
      NOTA: L'impostazione appropriata del guadagno hardware dipende dalla qualità del lavoro di cablaggio e dalla colla d'argento, quindi è prevista una variazione delle impostazioni di guadagno ottimali da zanzara a zanzara e giorno per giorno. Potrebbe essere necessario regolare il guadagno hardware durante la registrazione se il segnale raggiunge il picco (definito nella Tabella 2 e mostrato in Figura 3A,C) o è troppo piccolo per essere visualizzato. Eventuali modifiche al guadagno hardware influenzeranno in modo permanente la registrazione (mostrata in Figura 3A,C).
    2. Impostare il livello Ri utilizzando la manopola sull'head amp.
    3. Impostare e regolare il guadagno del software utilizzando il software di gestione hardware (ad esempio, selezionare il segnale pre o post e quindi fare clic con il pulsante sinistro del mouse per aumentare il guadagno del software o fare clic con il pulsante destro del mouse per abbassare il guadagno del software).
      NOTA: Eventuali modifiche al guadagno apportate al software NON influiranno in modo permanente sulla registrazione.
  5. Impostare una nuova registrazione nel software di gestione hardware, ma non avviare la registrazione fino al passaggio 4.3 della sezione successiva.

4. EPG su mani umane26,27 :

  1. Dopo aver ottenuto il consenso informato (come specificato dall'IRB dell'istituto di origine), far sedere l'ospite accanto alla gabbia di Faraday con un braccio all'interno mentre afferra la sonda di tensione del substrato e la tiene sotto la testa amp.
    NOTA: Il braccio deve poggiare comodamente su pluriball o su un substrato simile non conduttivo. La sonda manuale e di tensione non deve entrare in contatto con la gabbia di Faraday o l'head amp durante la registrazione. Per evitare danni, è imperativo che il volontario non tocchi l'head amp una volta acceso. Se l'head amp viene toccato accidentalmente, eseguire il test tattile sopra descritto per valutarne la funzionalità.
  2. Una volta che l'host è in posizione, girare l'head amp di lato. Rimuovere una zanzara cablata dalla scatola di immagazzinaggio e collegarla allo strumento inserendo il perno di ottone del tronchetto dell'insetto nella porta dell'head amp. Lascia la zanzara a penzoloni.
    NOTA: Tenere a portata di mano un flacone spray di etanolo al 70% per controllare eventuali zanzare che si staccano dal filo.
  3. Avviare la registrazione utilizzando il software di gestione hardware. Posiziona l'head amp sopra la mano in modo che la zanzara possa stare comodamente in piedi e sondare.
  4. Accendere l'head amp mentre è collegato a terra. Avvia un timer di 10 minuti. Regolare la posizione della mano ospite secondo necessità per facilitare la verifica del successo.
    NOTA: Quando si utilizzano zanzare inclinate a sondare immediatamente, accendere l'head amp prima di posizionare la zanzara sulla mano. Un sottile tassello di legno o un manico di pennello non conduttivo possono essere utilizzati per piegare il filo di rame del tronchetto dell'insetto per regolare ulteriormente la posizione della zanzara. Una lente d'ingrandimento o un microscopio digitale su un supporto a collo d'oca possono aiutare a osservare la zanzara durante l'EPG, soprattutto per gli studi di correlazione comportamentale.
  5. Utilizzare il software di gestione hardware per effettuare osservazioni con timestamp (ad esempio, marcatori di eventi) durante la registrazione per quanto riguarda le risposte dell'host, i comportamenti delle zanzare, le modifiche del guadagno, ecc.). Regola la posizione dei segnali sullo schermo e il guadagno del software secondo necessità per mantenere entrambi i segnali chiaramente visibili sullo schermo. Regolare il guadagno hardware se il segnale (o i segnali) raggiunge il picco (Figura 3A, C e Tabella 2) o se le onde appaiono troppo piccole quando il guadagno del software è al massimo. Regolare l'offset se si osserva il foldover del raddrizzatore (Figura 3C,C' e Tabella 2). Fare riferimento al manuale del software31 e alle risorse online30 per istruzioni dettagliate su come effettuare queste regolazioni.
    1. Per regolare la posizione dei segnali sullo schermo, selezionare il segnale pre o post (ad esempio, facendo clic su
      1 = 1       o 2 = 3) e quindi trascinare il segnale nella posizione desiderata sullo schermo (idealmente vicino al centro dello schermo ma non sovrapposto).
    2. Per regolare il guadagno del software, utilizzare il software di gestione hardware descritto al punto 3.4.3.
    3. Per regolare il guadagno hardware, iniziare ruotando la manopola del guadagno per il canale 1 verso destra o verso sinistra per aumentare o diminuire il guadagno, rispettivamente. Se tale regolazione non è sufficiente per eliminare il peaking out (guadagno troppo alto; Figura 3A,C) o consentire di visualizzare chiaramente i dettagli del segnale (guadagno troppo basso), capovolgere l'intervallo del canale 1 e gli interruttori del moltiplicatore per regolare ulteriormente il guadagno.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare i marcatori di evento per registrare quando il guadagno hardware è stato regolato per facilitare l'interpretazione dei dati della forma d'onda.
    4. Per regolare l'offset, spostare l'interruttore di offset del canale 1 sulla scatola di controllo su neg, quindi ruotare la manopola di offset del canale 1 fino a quando i picchi nei segnali pre e post si verificano nella stessa direzione sullo schermo del computer. Se la manopola di offset viene ruotata troppo, il post-segnale si capovolgerà di nuovo.
  6. Se la zanzara non sonda entro 10 minuti (o un altro punto temporale definito), spegnere l'amplificatore in testa. Se la zanzara è a metà sonda al momento dell'ora, lasciarla terminare il sondaggio prima di spegnere l'head amp. Chiedi all'ospite di rimuovere con cura la mano, quindi rimuovi la zanzara con il mozzicone di insetto attaccato. Sostituisci la zanzara nella scatola di immagazzinaggio.
  7. Interrompere/chiudere la registrazione utilizzando il software di gestione hardware. Procedi con l'EPG sulla zanzara successiva (Passaggio 4.2).
    NOTA: Ricordati di cambiare il nome del file dopo ogni zanzara.
  8. Spegnere l'head amp e la fonte di alimentazione al termine della sessione e chiudere il software.
  9. Esamina la Dichiarazione di Debriefing del Partecipante o simile con il volontario come specificato nell'IRB approvato.
  10. Smaltire le zanzare secondo i requisiti del protocollo. Rimuovere l'involucro di plastica dal blocco di schiuma e gettarlo in modo appropriato.
  11. Al termine di tutta la raccolta dei dati, rivedere e misurare le forme d'onda e analizzare i dati come descritto in precedenza24,25,26,27,29,30. Fare riferimento alle risorse online30 per tutorial passo-passo per l'utilizzo del software di revisione delle forme d'onda, la creazione di figure che descrivono le forme d'onda, la misurazione delle forme d'onda, l'esportazione dei dati per l'analisi, l'esecuzione dell'analisi statistica e una spiegazione dettagliata delle variabili di risposta delle forme d'onda comuni.

figure-protocol-3
Figura 3: Esempi di registrazioni non ottimali a causa di peaking out, variazioni di guadagno della scatola di controllo, variazioni di tensione poco chiare da cablaggi inferiori, foldover del raddrizzatore e rumore. Forme d'onda delle zanzare Culex tarsalis che si nutrono fino alla ricarica sulle mani dell'uomo, distorte da (A) picco (freccia orizzontale blu) e successive variazioni di guadagno della scatola di controllo da 100x a 80x a 40x a 60x a 40x a 20x (frecce verticali arancioni), (B) variazioni di tensione poco chiare e (C) ripiegamento del raddrizzatore nel segnale post (nero) rispetto al segnale pre- (rosso) (vedi forma d'onda J, primo piano mostrato nel pannello C'), rumore di linea (onda sinusoidale a 11 Hz visibile solo nel segnale di pre-rettifica (rosso), primo piano mostrato nel pannello C'), peaking out (freccia orizzontale blu) e una variazione del guadagno della scatola di controllo da 500x a 200x (freccia verticale arancione). I nomi delle forme d'onda vengono visualizzati nella parte superiore di ciascun pannello. Le frecce viola nell'angolo in basso a destra del pannello C indicano quando l'head amp è stato spento dopo che la sonda è stata completata e forniscono un altro esempio di foldover del raddrizzatore. Le linee orizzontali rosse associate al segnale di pre-rettifica nel pannello C indicano quando i marcatori di evento sono stati utilizzati per registrare le note con data e ora. I livelli Ri, i segnali applicati, le scale temporali e i guadagni del software sono (A) 107 Ω, 150 mV CC, 13,2 s/div, 8x; (B) 107 Ω, 150 mV CC, 4,4 s/div, 128x; e (C) 107 Ω, 150 mV CA, 7,4 s/div, 2x; (C') 0,2 s/div, 8x. Abbreviazioni: AC = corrente alternata, DC = corrente continua, Ri = resistenza di ingresso, mV = millivolt, Ω = Ohm, s/div = secondi per divisione. Questa figura è stata preparata con i dati di Cooper et al.27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

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Le registrazioni EPG AC-DC del sangue delle zanzare Cx. tarsalis che si nutrono di mani umane (Figura 4) hanno generato forme d'onda interpretabili adatte per l'analisi e la pubblicazione27. Le forme d'onda interpretabili contenevano pattern ripetuti distinti e distinguibili che potevano essere classificati in famiglie di forme d'onda (Tabella 1 e Figura 4), tipi e sottotipi quando la compressione (definita nella Tabella 2) e il guadagno del software venivano regolati nella revisione della forma d'onda software27,31. Tutte le famiglie di forme d'onda (J, K, L, M, N) e i tipi (L1, L2, M1, M2) precedentemente descritti in Ae. aegypti che si nutrono di mani umane26 sono stati identificati nelle forme d'onda generate da Cx. tarsalis che si nutre di mani umane, verificando la validità dei metodi qui descritti. Inoltre, sono stati identificati tre nuovi tipi di forme d'onda (M3, N1, N2) e numerosi sottotipi di L1, L2, M1 e M227. Inoltre, la caduta di tensione alla linea di base quando l'apparato boccale viene ritirato dall'host è stata denominata famiglia di forme d'onda W27.

Variando sistematicamente le impostazioni dello strumento (tipo di corrente e livelli di Ri) seguendo le procedure qui descritte, è stato possibile determinare le impostazioni ottimali per la registrazione di Cx. tarsalis che si nutre sulle mani umane, le origini elettriche di ciascuna forma d'onda, la durata media in secondi di sonde complete e incomplete per zanzara e per il confronto statistico della durata della forma d'onda in secondi per insetto (WDI), il numero di eventi della forma d'onda per insetto (NWEI) e la durata della forma d'onda in secondi per evento per insetto (WDEI) nelle impostazioni27. Le zanzare sono state anche interrotte durante diverse forme d'onda e sezionate per determinare quale forma d'onda era correlata all'ingestione di sangue27. Un'indagine simile è stata eseguita per Ae. aegypti utilizzando una metodologia comparabile26.

A causa della natura sensibile e intricata dell'EPG, non tutte le registrazioni erano così incontaminate come quelle mostrate in Figura 4. Peaking out (Figura 3A,C), variazioni del guadagno hardware (Figure 3A,C), lavori di cablaggio inferiori (Figura 3B), foldover del raddrizzatore nella forma d'onda J (Figura 3C,C') e rumore elettrico (Figura 3C,C') occasionalmente distorceva e mascherava le forme d'onda, rendendole inadatte all'uso nelle figure di qualità della pubblicazione e rendendo difficile il punteggio e l'analisi. Pertanto, si consiglia lo sforzo front-end per perfezionare le capacità di cablaggio, ottimizzare le impostazioni di guadagno e tensione, regolare l'offset e controllare il rumore elettrico. È interessante notare che il foldover del raddrizzatore è stato osservato solo nella famiglia di forme d'onda J per Cx. tarsalis (Figura 3C,C') e non si è ripresentato una volta che l'offset è stato inizialmente regolato, anche quando sono state utilizzate altre specie di zanzare (Ae. aegypti e Culex quinquefasciatus) (dati non mostrati). Inoltre, la risoluzione dei problemi ha rivelato che il rumore elettrico incontrollato mostrato in Figura 3 (pannelli C e C') derivava da una gabbia di Faraday difettosa. Le registrazioni effettuate nella gabbia di Faraday difettosa erano ancora utilizzabili, ma i problemi di rumore sono stati risolti quando è stata costruita una gabbia di Faraday migliorata (Figura 1B).

Anche quando sono state prese tutte le precauzioni e le ottimizzazioni front-end, lievi variazioni nella qualità dell'attacco dell'elettrodo alla zanzara e altri fattori sconosciuti che distorcevano il segnale e alteravano periodicamente il rapporto segnale/rumore hanno reso necessario regolare il guadagno hardware durante la registrazione per garantire che il segnale fosse nell'intervallo visibile e la risoluzione dei picchi in ciascuna forma d'onda fossero sufficienti per l'identificazione e la caratterizzazione della forma d'onda. Sfortunatamente, la regolazione del guadagno hardware durante la registrazione può causare bruschi spostamenti di tensione (Figura 3A, C), rendendo le forme d'onda inadatte per la pubblicazione ma ancora utilizzabili (in tutto o in parte) per la misurazione e l'analisi.

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Figura 4: Forme d'onda rappresentative da una sonda Culex tarsalis su una mano umana registrate con un Ri di 107 Ω utilizzando un segnale applicato di 250 mV AC. I nomi delle forme d'onda a livello di famiglia (NP, J, K, L, M, W) sono visualizzati nella parte superiore di ciascun pannello. I pannelli inferiori mostrano gli ingrandimenti di regioni selezionate nel pannello A. I pannelli inseriti mostrano gli ingrandimenti delle regioni indicate. Le scale temporali e i guadagni del software sono (A) 7,0 s/div, 16x; (B) 1,0 s/div, 64x; (B') 0,2 s/div, 64x; (C) 1,0 s/div, 64x; (C') 0,2 s/div, 32x; (D) 1,0 s/div, 64x; (D') 0,2 s/div, 64x. Abbreviazioni: AC = corrente alternata, Ri = resistenza di ingresso, mV = millivolt, Ω = Ohm, s/div = secondi per divisione. Questa figura è stata preparata con i dati di Cooper et al.27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Quando si utilizza l'EPG AC-DC, è fondamentale avere una conoscenza di base del funzionamento hardware e software30 e seguire attentamente i protocolli qui descritti per evitare di danneggiare l'apparecchiatura. In particolare, evitare di toccare l'head amp quando è acceso a meno che non sia collegato a terra sulla gabbia di Faraday. Si consiglia di registrare il più indietro possibile nella gabbia di Faraday30. Le porte della gabbia non devono necessariamente essere chiuse per ottenere forme d'onda interpretabili, a meno che non si registri in un ambiente con rumore elettrico ambientale eccessivo. Nulla di motorizzato può essere nella gabbia di Faraday. È importante notare che la gabbia di Faraday stessa deve essere collegata a terra elettricamente esclusivamente attraverso l'head amp affinché funzioni correttamente. Ciò si ottiene collegando l'head amp a un supporto da laboratorio in metallo con la vernice levigata da un piede del supporto per consentire un percorso conduttivo per l'elettricità catturata dalla gabbia di Faraday per fluire verso il supporto da laboratorio, nell'involucro metallico dell'head amp, lungo il cavo fino alla scatola di controllo, attraverso l'alimentatore in una presa a muro adeguatamente messa a terra e nella terra attraverso il terreno dell'edificio30. Un multimetro può essere utilizzato per verificare la qualità della connessione tra i componenti all'interno della gabbia misurando la resistività (che è l'inverso della conducibilità) tra i vari punti. Una radio AM wireless può anche essere posizionata all'interno della gabbia di Faraday per verificare che il suono sia significativamente ridotto (o idealmente eliminato) quando le porte sono chiuse, confermando che la gabbia di Faraday stia catturando adeguatamente i segnali elettrici presenti nell'aria (E. Backus per. Comm.).

La preparazione corretta e standardizzata della colla d'argento e l'attaccamento degli elettrodi di registrazione agli insetti sono fondamentali per ottenere registrazioni utilizzabili. La cuticola dell'insetto è un isolante e funge da condensatore se la colla d'argento non penetra adeguatamente nei pori della cuticola per creare un percorso per l'elettricità che viaggia dall'interno dell'insetto al filo d'oro sulla superficie del pronoto30. Preparare la colla d'argento contemporaneamente prima di ogni sessione EPG, lavorare con colla d'argento fresca dal tubo e sostituirla frequentemente con colla d'argento a vortice vigoroso durante la procedura di cablaggio. Assicurati che l'anello d'oro sia posizionato contro il torace in modo che l'intero anello sia a contatto con la cuticola e non inclinato da un lato o separato da uno spesso strato di colla d'argento e squame per aiutare a formare una forte connessione elettrica e prevenire il distacco e la fuga della zanzara dal filo.

I protocolli qui descritti devono essere ottimizzati quando si lavora con diverse specie di zanzare. Le impostazioni EPG ottimali (livello Ri, tensione, tipo di corrente e guadagno hardware) per la registrazione su un determinato artropode devono essere determinate sperimentalmente12,30. Tuttavia, una volta regolato l'offset, non sarà necessario regolarlo nuovamente quando si lavora con zanzare simili. Sono state determinate le impostazioni ottimali per l'EPG AC-DC con Ae. aegypti26 e Cx. tarsalis27. Le librerie di forme d'onda (definite nella Tabella 2) per altre specie faciliteranno l'adozione dell'EPG per le zanzare. È inoltre necessario ottimizzare l'anestesia per la zanzara di interesse, poiché il comportamento di alimentazione del sangue può essere influenzato in modo differenziale in base alle specie di zanzara e alla scelta dell'anestesia. Ad esempio, Cx. tarsalis richiede un periodo di recupero di 4 ore dopo 15 minuti di anestesia con CO2, mentre per Ae. aegypti, un periodo di recupero di 15 minuti è sufficiente dopo un periodo di anestesia di 15 minuti con ghiaccio. I culex tarsalis, tuttavia, sono difficili da abbattere con l'esposizione al freddo, quindi la CO2 viene utilizzata prevalentemente nonostante il lungo periodo di recupero.

Sebbene il monitor EPG AC-DC sia semplice da usare dopo aver esaminato le risorse online30,31 o la formazione con un utente esperto, è necessaria una risoluzione dei problemi. Inizialmente, le registrazioni EPG dell'autore delle sonde di zanzara avevano un'onda inaspettata di 11 Hz nel pre-segnale che non era stata osservata o riportata da Wayadande e colleghi26. La consultazione con E. Backus ha indicato che la gabbia di Faraday era probabilmente il problema a causa dell'interferenza dei loop di terra. Una nuova gabbia di Faraday costruita con uno schermo di rame altamente conduttivo collegato a un telaio in alluminio imbullonato a una grande piastra di alluminio sostenuta da piedini in gomma per isolarla dalla tabella sottostante (Figura 1B), ha risolto il segnale di rumore a 11 Hz (Figura 3C,C'). Inoltre, occasionalmente, quando l'alimentatore EPG veniva acceso per la prima volta, i segnali pre e post-rettifica apparivano come linee spesse e sfocate invece che linee rette, lisce e sottili. Questo problema veniva solitamente risolto spegnendo lo strumento e controllando tutti i collegamenti dei cavi. In caso di errore, di solito è stato utile scollegare lo strumento per 1-3 minuti. Molto raramente, i segnali pre e post diventano spessi e sfocati durante il funzionamento, il che è stato risolto spegnendo lo strumento e collegandolo a una presa diversa o utilizzando un regolatore di tensione e un condizionatore di alimentazione per collegare l'EPG prima di collegarlo alla parete. Idealmente, una linea dedicata per il monitor EPG eliminerebbe il rumore di linea proveniente da frigoriferi e altre apparecchiature collegate allo stesso circuito elettrico dell'EPG30.

Attualmente, ci sono due limitazioni principali all'uso dell'EPG per studiare le zanzare. In primo luogo, sono stati eseguiti pochi studi di correlazione per verificare quali comportamenti di sondaggio corrispondono alle forme d'onda. Mentre ci sono forti ipotesi su ciò che sta accadendo durante ciascuna famiglia di forme d'onda (Tabella 1) e alcuni dei tipi di forme d'onda (M1 e M2), poche di queste ipotesi sono state confermate sperimentalmente, tranne che l'ingestione di sangue è correlata con la famiglia di forme d'onda M26,27. Ancora più importante, le forme d'onda corrispondenti agli eventi di salivazione devono essere identificate perché molti agenti patogeni vengono trasmessi nella saliva. La correlazione delle forme d'onda EPG con le attività biologiche nelle zanzare sarà necessaria per interpretare in modo significativo le differenze significative nella durata e nel conteggio delle forme d'onda tra i gruppi di trattamento. In secondo luogo, i tassi di sondaggio e di ingestione durante l'EPG possono essere molto più bassi del previsto27. Legare individualmente le zanzare a fili corti e posizionarle direttamente sull'ospite potrebbe prevenire comportamenti di ricerca dell'ospite e di alimentazione sociale a lunga distanza, che possono influenzare i comportamenti di sondaggio e ingestione. Gli insetti correttamente cablati possono camminare e volare normalmente. Tuttavia, le zanzare spesso tirano contro i fili e talvolta si aggrovigliano o si tengono ad angoli innaturali, indicando che essere cablate influisce in una certa misura sul loro comportamento. Gli autori hanno testato molte strategie per migliorare i tassi di sondaggio durante l'EPG e il digiuno delle zanzare durante la notte, utilizzando individui più anziani, esponendoli al respiro umano immediatamente prima di metterli sulla mano e applicando saliva umana alla mano sono stati i più efficaci, oltre a utilizzare ospiti che hanno costantemente apportato regolazioni su larga scala alla posizione della loro mano per garantire che la zanzara fosse nella posizione ideale per sondare27.

Nonostante queste limitazioni, l'EPG AC-DC presenta numerosi vantaggi rispetto ad altri approcci per lo studio dei comportamenti di sondaggio e ingestione. Sistemi come il BiteOScope11, il flyPAD15 e l'Automated Biomaterial Platform14, progettati per quantificare i comportamenti di sondaggio e ingestione e le secrezioni salivari durante l'alimentazione del sangue, utilizzano substrati artificiali trasparenti e diete liquide prive dei normali sistemi tissutali dell'ospite e dei segnali dell'ospite. Sebbene queste piattaforme sintetiche siano utili per molti scopi sperimentali, un chiaro vantaggio dell'EPG AC-DC è la capacità di studiare questi comportamenti degli artropodi e le variabili di interesse all'interno dei sistemi ospiti naturali. Inoltre, l'adattabilità definita dall'utente del sistema EPG AC-DC offre un ulteriore vantaggio rispetto ad altri strumenti EPG22,33 e dispositivi di monitoraggio elettronico simili all'EPG 16,21, che non hanno livelli di Ri regolabili, tipi di corrente e livelli di tensione necessari per ottenere forme d'onda con la massima quantità di informazioni e ridurre al minimo gli effetti negativi su un'ampia gamma di ospiti e artropodi22, 23. Le tecniche di elettromiografia (EMG) vengono utilizzate anche per studiare l'alimentazione del sangue. Tuttavia, il circuito elettrico di solito include solo l'artropode e vengono registrati solo i potenziali muscolari più vicini all'elettrodo di registrazione, quindi le forme d'onda non forniscono informazioni sulle attività dettagliate che si verificano all'interfaccia ospite-insetto come rotture cellulari, posizioni e attività dello stiletto e potenziali di flusso attraverso l'apparato boccale28,34. Le tecniche di microscopia intravitale possono essere utilizzate per visualizzare direttamente i movimenti dettagliati dell'apparato boccale e le attività nei tessuti ospiti viventi, ma queste tecniche comportano procedure invasive su modelli animali vivi9. Solo il monitor EPG AC-DC è in grado di fornire informazioni altamente dettagliate in tempo reale sui comportamenti di sondaggio, ingestione e salivazione che si verificano nei tessuti ospiti opachi viventi senza la necessità di procedure invasive ed è adattabile per l'uso in un'ampia varietà di artropodi 10,12.

Questa è la prima procedura dettagliata passo dopo passo per il cablaggio delle zanzare, la costruzione di un aspiratore di insetti e l'esecuzione di EPG su ospiti umani. Si prevede che questi protocolli faciliteranno l'adozione dell'EPG AC-DC sulle zanzare che si nutrono di ospiti umani. Esempi di futuri sforzi di ricerca che impiegano l'EPG AC-DC possono includere studi sui meccanismi fondamentali dell'alimentazione del sangue e del danno tissutaledell'ospite 10, tra cui l'identificazione di sequenze stereotipate di comportamenti di sondaggio che precedono l'ingestione di sangue, lo studio del flusso sanguigno attraverso l'apparato boccale e il confronto della plasticità dell'alimentazione all'interno e tra le specie di artropodi/gli stadi di sviluppo26. L'EPG può anche essere utilizzato per quantificare gli effetti di insetticidi, antifeedant e repellenti12. Le procedure qui presentate per l'utilizzo dell'EPG AC-DC per studiare le zanzare sulle mani umane accelereranno questi studi e consentiranno nuove intuizioni sulla biologia dell'alimentatore di sangue delle zanzare.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare. La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione ha il solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica una raccomandazione o un'approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. Le conclusioni di questo rapporto sono quelle degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni dell'USDA.

Ringraziamenti

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Siamo grati al Prof. Astri Wayadande dell'Oklahoma State University per aver aperto la strada alla procedura di cablaggio per le zanzare, e al Dr. Elaine Backus dell'USDA-ARS di Parlier, CA, e al Sig. Andrew Dowell della EPG Technologies Inc. di Gainesville, FL, per l'assistenza nella risoluzione dei problemi dell'apparecchiatura EPG. Ringraziamo anche il Dr. Dustin Swanson e il Sig. William Yarnell dell'USDA-ARS Insectary di Manhattan, KS, per aver fornito le zanzare, e la signorina Miriam Ruhinda della Kansas State University di Manhattan, KS per la sua assistenza nelle riprese dei video procedurali. Questo lavoro è stato reso possibile dall'accesso all'Integrated Molecular Entomology Core (IEMC) presso la Kansas State University. Questa ricerca è stata supportata dall'USDA Research, Education, and Economics Workforce Development Agreement (#58-3022-0-002) e dall'Hatch Multistate Project (NE1943). Questo manoscritto è il contributo n. 24-194-J della Kansas Agricultural Experiment Station, Kansas State University, Manhattan, KS, USA.

Materiali

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Strumentazione
Elettropenetrografo a 4 canali AC-DCEPG Technologies, Inc.Per l'EPG, include l'alimentatore, la scatola di controllo, la scatola di interfaccia dell'interruttore, quattro amplificatori dello stadio principale, quattro sonde di tensione del substrato e i relativi cavi I
cuscini d'ariaAmazon.comconsentire all'ospite umano di appoggiare la mano/il braccio durante l'EPG
DI-710 Hardware di acquisizione dati (AD Board)DATAQ Instruments Inc.per digitalizzare i segnali EPG analogici in modo che possano essere visualizzati su un computer
Lampada d'ingrandimento a LED dimmerabile, grande lente d'ingrandimento a mani libere 5X con luce e supporto per la lettura Hobby Artigianato Cucito Banco da lavoroper l'osservazione comportamentale durante l'EPG; utilizzare solo scollegato durante l'EPG o potrebbero verificarsi rumori
per l'osservazione comportamentale durante l'EPG
Dino-Lite Flex-arm Desktop StandDino-LiteMS22Bper tenere e manipolare la telecamera
Eisco Steel Retort Base Stand and Rod SetFisher ScientificS41740per tenere l'amplificatore dello stadio principale e mettere a terra la gabbia di Faraday (deve essere in metallo)
EPG Online WorkshopUF IFAS Extensionhttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022AKA, "risorse online" per l'apprendimento dell'EPG (configurazione dello strumento, raccolta e analisi dei dati, costruzione di Faraday, preparazione della colla d'argento, costruzione di tronchi di insetti, ecc.)
Furman P-1800 AR Regolatore di potenza/Condizionatore di potenzaAmazon.comper ridurre il rumore di linea
Amazon.comdi imbottitura a bolled'aria da utilizzare come barriera tra l'ospite e la gabbia di Faraday
Troemner Talboys Labjaws Regular Clamp HolderFisher Scientific02-217-121per contenere l'amplificatore dello stadio principale e mettere a terra la gabbia di Faraday (deve essere in metallo e non rivestita in plastica)
Computer WindowsBest Buyper EPG e analisi statistiche
Software
Backus 2.0 Programma SAS per l'analisi dei dati UF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/per l'analisi statistica dei dati delle forme d'onda
Ebert 1.0 File Manipulator e Error Checker Programmi SASUF IFAS Extension https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/per la preparazione di file per l'analisi statistica dei dati delle forme d'onda
SAS versione 9.4SAS Institute Inc.per l'analisi statistica dei dati delle forme d'onda
WinDaq Lite Strumenti DATAQ Inc.per la registrazione e la revisione dei dati EPG. Include il software WinDaq Hardware Manager (AKA, "software di gestione hardware") e il software WinDaq Waveform Browser (AKA, "software di revisione delle forme d'onda"). Per l'uso solo su computer Windows.
gabbia di Faraday
telaio dello schermo in alluminioHome DepotMSCF5167per le pareti della gabbia di Faraday
Foglio di alluminio, 0,125 (1/8) spessore 3003-H14Deposito metalliS318per la base della gabbia di Faraday
Bretelle angolari, 1" Home Depot339547per  le pareti della gabbia di Faraday
Viti a macchina Phillips a testa piatta, #6-32 x 1"Home Depot459999per la costruzione della gabbia di Faraday
Rondelle piatte, #6 Home Depot638977per la costruzione di gabbie di Faraday
Multimetro digitale Fluke 15B+, per applicazioni elettriche, misura misure di tensione e corrente CA/CC fino a 1000 V e 10 A, insieme a capacità di resistenza, continuità, diodo e capacitàAmazon.comper testare la gabbia
di FaradayRadio portatile AM FM, radio a transistor Goodes con altoparlante, jack per cuffie, radio a batteria 2AA per la ricezione a lungo raggio, radio tascabile per uso interno, esterno e di emergenzaAmazon.comdella gabbia di Faraday
, maglia 16 x 16 con diametro del filo 0,11, 36 "x 12'MetroScreenworksper le pareti della gabbia di Faraday
Viti a macchina combinate a testa tonda, #6-32 x 3/4 "Home Depot528466per la costruzione della gabbia di Faraday
Carta vetrata, 1/2" per 1", 150 GritHome Depot19036-20-CCper la rimozione della vernice dal fondo del supporto da laboratorio Angoli del
telaio dello schermo, 5/16" Home DepotWCORN516per le pareti della gabbia di Faraday
Scanalatura dello schermo, 0,14"Home Depot3034719per le pareti della gabbia di Faraday
Insect Stubs
Brass Escutcheon Pins HomeDepot801294 per la costruzione di stub di insetti...  
Filo di rame, 20 AWGAmazon.comper la costruzione di tronconi di insetti  
Influenza idrosolubile di HarrisHome Depot355398per aiutare a saldare, rivestire il filo di fusto degli insetti e formare una forte connessione
Pinze ad agoHome Depotper piegare il filo durante la costruzione di tronchetti di insetti Kit
Pro 900-015 Helping Hands Aiuto per la saldaturaAmazon.comper tenere i perni della rosetta durante la saldatura
Saldatura (con nucleo di colofonia)Home Depot296497per la costruzione di stub di insetti   
Home Depotper spelare e tagliare il filo di rame durante la costruzione di tronconi di insetti
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Aspiratore di insetti
AccurisV0020per l'applicazione dell'aspirazione all'aspiratore per insetti; include il controller del vuoto portatile, l'adattatore in acciaio inossidabile a punta fine (40 mm) e l'adattatore per puntali per pipette
Pipette Chemglass Life Sciences Pasteur, lunghe 5 3/4Fisher ScientificNC0230004per l'uso come aspiratore di insetti durante il cablaggio delle zanzare
Nastro isolante in vinile colorato elettrico commercialeHome Depotper il fissaggio della pipetta Pasteur modificata alla linea del vuoto
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Thermo Scientific Nalgene HDPE Sganciatine rapide (da 3/8 a 7/16 in. I.D.)Fisher Scientific15-315Bper passare rapidamente e facilmente da una pipetta Pasteur all'altra
Silver Glue 
Elmer's Glue-All Multi Purpose White GlueAmazon.comper la preparazione della colla d'argento
Silver Flake 99,9% puro,  4-8 &; mThermoFisher786.09per la preparazione della colla d'argento
Fiocco d'argento puro al 99,95%, 8-10 µ mInframat Advanced Materials47MR-12Fper la preparazione della colla d'argento
Insect Anesthesia
/sub> bubbler kit, 1000 mL, #9 Tappo in gommaFlyStuff59-181per prevenire l'essiccazione degli insetti durante l'utilizzo del
flypad Flypad  telaio, misura standardFlyStuff59-118per evitare che le zanzare cadano dal flypad
Flystation BrushFlyStuff59-205per ridurre l'elettricità statica quando si lavora su un fly pad
Flystuff  Flypad  dimensioni standardFlyStuff59-114AKA "tappetino per anestesia" per l'anestesia delle zanzare
Imbuto (diametro 4 pollici)Amazon.comper gassare le tazze di zanzare prima del trasferimento sul flypad
Vetro plexi o un coperchio piatto in plastica (tagliato a misura)Home DepotMC-27per coprire il flypad se le zanzare iniziano a svegliarsi
Chiusura dei tubi in plastica Fascette stringitubo Posizione singola e apertura regolabile (varietà da 1/8" a 1/2")Amazon.comper deviare il gas tra il flypad e l'imbuto
Regolatore CO2monostadio FlyStuff59-142per la regolazione del flusso di gas dal serbatoio CO2
" T” Raccordo per tubo ID da 1/8FlyStuff59-123per collegare sia il flypad che l'imbuto al serbatoio CO2
Tubo, trasparente FlyStuff59-124Cper il collegamento dell'imbuto e del flypad al regolatore sul serbatoio CO2
Insect Wiring
Cartoncino nero, (65Lb, 176 g/m2) 8.5" x 11"s Michael's Stores Inc.327826per rendere il filo d'oro più facile da visualizzare
da costruzione nera quadrata 3,5 "x 4,0"Graffette956221per rendere il filo d'oro più facile da visualizzare
Batuffoli di cotoneAmazon.comper le zanzare a digiuno
Schiuma artigianale # 12 blocco (3,1 cm x 17,2 cm x 30,2 cm)Joann Fabric and Craft Store1941079per tenere le zanzare cablate
Nastro deflesso Dispenser,Amazon.comper la conservazione del filo d'oro
Pinze per entomologia FeatherweightFisher ScientificS72110per la manipolazione degli insetti
Pinze fini (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)Fine Science Tools91150-20per creare un anello d'oro durante il cablaggio delle zanzare
Pennello a punta fineAmazon.comper manipolare le zanzare durante il cablaggio e l'EPG; deve avere un manico in plastica o legno se utilizzato per EPG
Pipette di trasferimento standard a punta fine, strette, 5,8 mLThomas Scientific7761D21per la preparazione della colla d'argento
Filo d'oro, puro al 99,99%, spessore 0,025 mmGoodfellowAU005121per il cablaggio delle zanzare
Spille minuziose, punta 0,2 mm, 1 cmFisher ScientificNC9681411per applicare la colla alle zanzare Bicchieri
carta di carta rigidoper zanzare a digiuno     
Morsa a spilloFisher Scientific50-996-811per tenere il perno minuzioso durante il cablaggio degli insetti
Scatola di stoccaggio in plastica con coperchio (7 pollici x 9 pollici x 14 pollici)Amazon.comper il trasporto di zanzare cablate
Vetro plexi o un coperchio piatto in plastica (tagliato a misura)Home DepotMC-27per coprire il cuscinetto antimosche se le zanzare iniziano a svegliarsi
Pinze a chiusura automaticaFisher Scientific08-906per contenere e manipolare filo d'oro
Gas compresso
CO2 gas serbatoioGas Mathesonper anestetizzare le zanzare con un flypad
Common Lab Items
Sacchetti monouso per autoclave a rischio biologico, 8 1/2" x 11"Fisher Scientific03-410-591per lo smaltimento delle zanzare alimentate con sangue
Bruciatore Bunsen o torcia a propanoAmazon.comper la modifica delle pipette Pasteur
Nastro da laboratorio coloratoDaigger FornisceEF9763Rper l'etichettatura, la preparazione della colla d'argento e le pinze per mascheratura
Puntali per pipette monouso, 1000 e micro; LFisher Scientific per aliquotare l'acqua durante la produzione di colla d'argento
Microscopio di dissezioneLeica Microsystemsper il cablaggio delle zanzare Sonda
dissezioneFisher ScientificNC9109673per agitare e applicare la colla d'argento
Pallone di Erlenmeyer, 1000 mLFisher Scientific per prevenire l'essiccazione degli insetti durante l'utilizzo del flypad
Etanolo, 70% Fisher Scientific04-355-122per il recupero delle zanzare fuggite Piastre
Petri in vetroFisher Scientific08-747Bper l'anestetizzazione delle zanzare con ghiaccio
GuantiFisher Scientificper la protezione personale
Kimwipes Tergicristalli delicati per attività a marchio KimTech ScienceFisher Scientific06-666per schiacciare le zanzare
Camici da laboratorioFisher Scientificper la protezione personale
Flaconi spray LiBa, flaconi spray vuoti ricaricabili (sicuri per l'alcol denaturato)Amazon.comper il recupero delle zanzare fuggite
Barra di agitazione magnetica, lunga 2 cmFisher Scientific per la miscelazione della colla d'argento
Pipetta meccanica monocanale, 1000 &; LFisher Scientific 13-690-032per l'aliquotazione dell'acqua durante la produzione di colla d'argento
Provette per microcentrifuga, 1,5 mLFisher Scientific 780420per la conservazione della colla d'argento
Parafilm M Fisher Scientific50-998-944per sigillare provette di colla d'argento
Involucro di plasticaAmazon.comper coprire il blocco di schiuma
Pyrex 20 mL becherFisher Scientific 07-250-051per mescolare la colla d'argento
Semi-Micro BalanceFisher Scientific 10-919-370per pesare colla e scaglie d'argento
Penna pennarello,Amazon.comper l'etichettatura
Lama di rasoio a filo singoloMicroscopia elettronica Scienze71980per la pulizia di mozziconi di insetti
Pipette di trasferimento monouso standardFisher Scientific 133-711-7mLper il trasferimento di colla d'argento in una provetta di stoccaggio 
Piastra di agitazioneFisher Scientific per la miscelazione della colla d'argento
Timer/cronometroFisher Scientificper cronometrare per quanto tempo l'ospite è esposto a ciascun insetto
Acqua ultrapura (18 MΩ)Fisher Scientific per la preparazione della colla d'argento
Forbici multiusoFisher Scientific08-945per il taglio del filo d'oro
Miscelatore a vorticeFisher Scientific per la miscelazione di colla d'argento
Study Organisms
Culex tarsalis zanzareUSDA ARS Center for Grain and Animal Health Research a Manhattan KSper l'uso come soggetti di studio
Amazon.com Microscopio digitale Dino-Lite Edge (ingrandimento 250x)Dino-Lite AF4915ZT Piccolo per testare lo schermo in rame puro di saldatura completamente digitale Strumenti " CO" Carta trasparente di Tubo di di a punta fine

Riferimenti

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