Articolo metodologico

Elettropenetragrafia AC-DC per lo studio dei comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Culex tarsalis sulle mani umane

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DOI:

10.3791/66877

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29 novembre 2024

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1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

In questo articolo

Sommario

Sono descritte le procedure per studiare i comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Culex tarsalis sulle mani umane utilizzando l'elettropenetragrafia AC-DC.

Abstract

Le zanzare trasmettono agenti patogeni che influenzano negativamente la salute umana e animale. Una maggiore comprensione della loro biologia dell'alimentazione del sangue e delle interazioni con ospiti e agenti patogeni potrebbe essere sfruttata per sviluppare nuovi bersagli per il controllo delle malattie trasmesse dalle zanzare. Sfortunatamente, i comportamenti di sondaggio (cioè puntura) delle zanzare sono poco compresi perché si verificano all'interno dei tessuti dell'ospite. Qui, viene descritta una procedura non invasiva per l'utilizzo dell'elettropenetragrafia AC-DC (EPG) per visualizzare e quantificare indirettamente i comportamenti alimentari delle zanzare registrando i cambiamenti nei segnali elettrici generati durante il sondaggio e l'ingestione sulle mani umane. Sottili fili d'oro sono attaccati alle zanzare utilizzando colla d'argento conduttiva e collegati allo strumento EPG. L'ospite umano tiene in mano una sonda di tensione del substrato. L'indagine dell'ospite da parte della zanzara cablata completa il circuito elettrico e i segnali elettrici vengono registrati su un computer come "forme d'onda" che possono quindi essere misurate ed enumerate per l'analisi. Questa metodologia è stata utilizzata per caratterizzare i comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Aedes aegypti e Culex tarsalis e può essere applicata ad altre specie di zanzare. L'EPG può essere utilizzato per studiare gli effetti di agenti patogeni, insetticidi e altri fattori sui comportamenti alimentari delle zanzare.

Introduzione

Le zanzare causano sofferenze e perdite economiche in tutto il mondo a causa del loro ruolo di vettori di malattie e fastidiosi parassiti1. Le zanzare anopheles trasmettono la malaria, che ogni anno causa circa 219 milioni di casi in tutto il mondo, più di 400.000 decessi2 e 12 miliardi di dollari USA in costi diretti3. Le zanzare Aedes sono i vettori più importanti di importanza per la salute pubblica perché hanno una presenza quasi globale e trasmettono agenti di Chikungunya, febbre dengue, filariosi linfatica, febbre della Rift Valley, febbre gialla e Zika, che mietono vittime, travolgono i sistemi sanitari e provocano sofferenza cronica, morbilità permanente e disabilità4,5. Inoltre, le zanzare Culex trasmettono agenti di encefalite equina, encefalite giapponese, filariosi linfatica, encefalite di Saint Louis e febbre del Nilo occidentale, che hanno un impatto sulla salute umana e animale3,4.

Il controllo dei vettori con approcci basati su insetticidi è il metodo principale per il controllo delle malattie trasmesse da vettori a livello globale6,7. Tuttavia, il numero di insetticidi disponibili per il controllo delle zanzare è limitato. Inoltre, la resistenza agli insetticidi si sta evolvendo in molte specie, specialmente nelle zanzare Aedes, influenzando la nostra capacità di combattere le malattie trasmesse da vettori e determinando la necessità di nuove strategie di controllo6,8. Una migliore comprensione della biologia delle zanzare, delle interazioni zanzara-ospite-patogeno e dei processi che regolano la trasmissione dei patogeni può facilitare lo sviluppo di nuovi strumenti per il controllo dei vettori6.

I comportamenti di sondaggio e ingestione nei tessuti dell'ospite possono influenzare la trasmissione di agenti patogeni e la patologia della malattia9,10,11,12. Ad esempio, sono state ingerite più microfilarie quando Aedes aegypti si nutriva direttamente dai capillari piuttosto che raccogliere sangue all'esterno dei vasi rotti13. Pertanto, la ricerca di base e applicata su questo argomento può aiutare a sviluppare, perfezionare e valutare le strategie di controllo delle zanzare e altre contromisure per la trasmissione di agenti patogeni. Tuttavia, esistono significative lacune di conoscenza nei dettagli dei comportamenti criptici di alimentazione del sangue che si verificano sotto la superficie della pelle dell'ospite perché questi comportamenti spesso richiedono procedure invasive su modelli animali vivi o impiegano substrati artificiali trasparenti o diete liquide9,11,14,15. Le tecniche di elettropenetragrafia non invasiva (EPG; chiamata anche grafo di penetrazione elettrica) sono state utilizzate per studiare i comportamenti alimentari degli insetti che si nutrono di piante correlate alla trasmissione di patogeni delle piante, alla resistenza delle piante ospiti e alle modalità d'azione degli insetticidi perché consentono ai ricercatori di osservare, registrare e quantificare indirettamente i movimenti e i comportamenti dell'apparato boccale che si verificano all'interno dei tessuti ospiti10,12.

Dagli anni '50, le tecniche di monitoraggio elettronico della penetrazione sono state applicate agli artropodi che si nutrono di sangue, comprese le zanzare16,17,18,19,20. Tuttavia, l'EPG non è mai stato ampiamente adottato per gli artropodi che si nutrono di sangue perché le attività biologiche corrispondenti alle forme d'onda non sono mai state verificate21. Inoltre, i progetti e l'elettronica dei primi strumenti hanno portato a un'eccessiva enfasi di alcuni segnali elettrici, ad alti rapporti rumore/segnale, bassa risoluzione e distorsione delle forme d'onda e irritazione per gli ospiti vertebrati12,22. Uno strumento più recente, il monitor AC-DC EPG23, ha impostazioni variabili e una migliore elaborazione del segnale, rendendolo più adatto per registrare artropodi che si nutrono di sangue e decifrare le origini biologiche delle forme d'onda negli studi di correlazione sperimentale10,12.

Per l'EPG, un segnale elettrico viene applicato all'host attraverso una sonda di tensione del substrato (ad esempio, un elettrodo di riferimento). L'artropode è attaccato a un elettrodo di registrazione e posizionato sull'ospite. Quando l'artropode inserisce il suo apparato boccale (cioè gli stiletti) nell'ospite, il segnale elettrico viene trasmesso al monitor AC-DC EPG per l'elaborazione del segnale. I segnali elettrici vengono quindi visualizzati su un computer come "forme d'onda" corrispondenti a comportamenti specifici come i movimenti dell'apparato boccale, l'ingestione, la salivazione e l'acquisizione/inoculazione di agenti patogeni10,12. Le variabili di risposta sequenziali e non sequenziali relative alla durata e al conteggio delle forme d'onda24,25 a diversi livelli gerarchici (famiglie, tipi e sottotipi) possono quindi essere calcolate in base alla frequenza e alla durata delle forme d'onda per ottenere informazioni sui comportamenti alimentari che si verificano all'interno e tra le specie e in risposta a fattori biotici e abiotici, come ospiti, agenti patogeni, pesticidi e condizioni ambientali10,12.

Finora, il monitor EPG AC-DC è stato utilizzato per caratterizzare i comportamenti di sondaggio e ingestione di Ae. aegypti26 e Culex tarsalis27 zanzare che si nutrono di mani umane e zecche Dermacentor variabilis e Amblyomma americanum che si nutrono di vitelli bovini28. Inoltre, è stato recentemente sviluppato un modello murino per EPG29 per facilitare gli studi sui patogeni utilizzando questo strumento. Le mani umane sono ideali per la caratterizzazione iniziale della forma d'onda della zanzara perché gli ospiti umani possono segnalare quando sentono il sondaggio della zanzara e altri comportamenti, rendendo più facile la correlazione delle forme d'onda con i comportamenti (Tabella 1). Inoltre, una migliore comprensione della plasticità nei comportamenti alimentari tra le zanzare in diverse popolazioni umane potrebbe contribuire allo sviluppo di interventi di gestione più specializzati per le zanzare e i patogeni che trasmettono.

Tabella 1: Descrizione delle famiglie di forme d'onda utilizzate per classificare i segnali elettrici registrati da Culex tarsalis sulle mani umane utilizzando AC-DC EPG. La fase di sondaggio e le attività biologiche corrispondenti a ciascuna famiglia di forme d'onda. Vedi Cooper et al.27 per maggiori informazioni. Abbreviazione: AC = corrente alternata, DC = corrente continua, EPG = elettropenetrografo. Clicca qui per scaricare questa Tabella.

Per facilitare l'uso dell'EPG per studiare la biologia delle zanzare e le interazioni ospite-vettore, qui viene presentata la metodologia per quantificare i comportamenti alimentari delle zanzare Cx. tarsalis sulle mani umane utilizzando il monitor EPG AC-DC. Questi protocolli si basano sulle procedure fondamentali AC-DC EPG descritte nelle risorse online30 e presuppongono che gli utenti abbiano una conoscenza operativa di base di AC-DC EPG e del software associato31. Le procedure descritte possono essere modificate per altre specie di zanzare e ospiti e forniscono una base per facilitare la ricerca basata su ipotesi sui comportamenti alimentari delle zanzare.

Tabella 2: Definizioni della terminologia comune AC-DC EPG. Le definizioni si basano su quelle fornite nelle risorse online30,31 e nella letteratura scientifica32. Abbreviazione: AC = corrente alternata, DC = corrente continua, EPG = elettropenetrografo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Protocollo

Questo protocollo (IRB-10729) è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale (IRB) per la Ricerca Umana della Kansas State University27 ed è destinato all'uso esclusivo con zanzare libere da patogeni. I volontari umani hanno prestato il loro consenso informato a partecipare allo studio e alla pubblicazione dei loro dati. Prima di iniziare qualsiasi attività con animali, esseri umani o agenti biologici pericolosi, assicurarsi che tutte le procedure siano state esaminate e approvate dai comitati regolatori istituzionali competenti o dai responsabili preposti alla supervisione. Consultare la Tabella dei Materiali per i dettagli su tutte le attrezzature e i materiali utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione iniziale e configurazione

  1. Configurare il monitor EPG AC-DC (Figura 1A), la gabbia di Faraday (Figura 1B,C) e il software come descritto in precedenza30,31, utilizzando le modifiche descritte di seguito (passaggi 1.1.1-1.1.5). Consultare le risorse online30 per tutorial passo dopo passo sull'installazione e l'utilizzo dell'apparecchiatura e del software. Salvare la configurazione desiderata come predefinita nel software di gestione dell'hardware e di revisione delle forme d'onda. Fare riferimento alla Tabella 2 per un elenco della terminologia comune dell'EPG AC-DC e delle relative definizioni.
    1. Collegare un amplificatore di testa (head amp) e una sonda per il voltaggio del substrato al canale 1 del box di controllo.
      NOTA: Viene presentata la registrazione da un singolo canale anche se il monitor AC-DC può ospitare contemporaneamente quattro insetti e piante ospiti.
    2. Assicurarsi che il canale 1 sul box di controllo sia acceso e che i canali corrispondenti Pre-1 e Post-1 sul box di interfaccia di commutazione siano anch'essi accesi.
      NOTA: I canali non utilizzati devono rimanere spenti.
    3. Utilizzare il software di gestione dell'hardware per abilitare i canali 1 e 3 sulla scheda A/D DI-710 (ma non altri) per registrare i segnali pre e post rettificati.
    4. Configurare il software di gestione dell'hardware in modo da visualizzare/sovrapporre le forme d'onda pre e post rettificate (ad esempio, 1 = 1 per il segnale pre e 2 = 3 per il segnale post).
    5. Impostare la frequenza di campionamento nel software di gestione dell'hardware a 100 campioni al secondo per canale (cioè S/s/CHAN: 100).
  2. Costruire i supporti per insetti26,27,29,30:
    1. Riscaldare il saldatore alla temperatura raccomandata per la specifica saldatura con anima di resina.
    2. Utilizzare uno strumento taglia-spalatori per rimuovere il rivestimento in plastica da circa 6 cm dall'estremità di un rotolo di filo di rame da 20 AWG, evitando di recidere o danneggiare il fascio di fili di rame all'interno (Figura 2A). Successivamente, tagliare il fascio di rame esposto e sfilacciarlo in singoli filamenti (Figura 2B).
    3. Utilizzare pinze a becco lungo per avvolgere un filamento di rame intorno all'asta di un apposito perno a testa piatta, posizionandolo sotto la testa (cioè la parte piatta), in modo che la maggior parte del filo di rame si estenda oltre la testa del perno. Piegarne l'estremità sulla testa del perno per fissare il filo in posizione (Figura 2C).
      NOTA: Effettuare un test di adattamento dei perni a testa piatta per identificare quelli che si inseriscono saldamente nel connettore del head amp (quando è spento, scollegato e impostato a 106 Ohm (Ω)).
    4. Fissare l'asta del perno a testa piatta nell'aiuto per saldatura con pinze regolabili in modo che il filo di rame sia orientato verso l'alto. Applicare quindi una piccola quantità (~0,2 cm di diametro) di flussante solubile in acqua sul giunto tra il perno e il filo di rame (Figura 2D).
      ATTENZIONE: Il flussante è tossico e deve essere maneggiato con cautela.
    5. Srotolare circa 10 cm di saldatura e raddrizzarla. Appoggiare il saldatore caldo sulla testa del perno per alcuni secondi finché il flussante non si scioglie e il metallo non è sufficientemente caldo. Premere quindi la punta della saldatura sulla testa del perno accanto al saldatore finché la saldatura non si fonde e ricopre completamente il giunto, unendo il perno e il filo in un supporto per insetto.
    6. Mentre il supporto per insetto si raffredda, pulire la punta del saldatore con lana d'acciaio e una spugna umida.
    7. Una volta raffreddato, rimuovere il supporto per insetto dalle pinze regolabili. Risciacquare il supporto in etanolo al 70% e poi in acqua per rimuovere il flussante residuo. Tagliare il filo di rame alla lunghezza desiderata (~3 cm, Figura 2E).
    8. Ripetere i passaggi 1.2.3-1.2.7 fino a costruire 20-30 supporti per insetti.
  3. Assemblare un aspiratore per insetti26,27:
    1. Fare passare la punta di una pipetta di Pasteur in vetro attraverso una fiamma, ruotando leggermente la pipetta. Ripetere l'operazione finché l'estremità della pipetta non raggiunge la dimensione adatta per adattarsi saldamente intorno all'addome dell'insetto.
    2. Coprire l'estremità larga della pipetta di Pasteur modificata con una rete per zanzare, quindi inserirla direttamente nel tubo di silicone collegato a un aspiratore da laboratorio e fissare il giunto con nastro isolante per formare un aspiratore per insetti (Figura 2H).
      NOTA: La pipetta di Pasteur e la rete possono essere inserite in un breve tratto di tubo di plastica dotato di connettore rapido per facilitare il passaggio tra diverse dimensioni (Figura 2H).

Impostazione del laboratorio di elettrofisiologia per la registrazione dell'EEG; comprende amplificatore, computer, gabbia di Faraday e sensori.
Figura 1: Impostazione dell'apparecchiatura del monitor EPG AC-DC per la registrazione su mani umane. (A) Componenti dell'EPG, inclusi (1) scatola di controllo, (2) scatola dell'interfaccia di commutazione, (3) alimentatore, (4) scheda A/D DI-710, (5) computer, (6) regolatore di tensione e (B) gabbia di Faraday contenente (C) un microscopio digitale (7) su un supporto flessibile, (8) materiale imbottito in polietilene espanso e cuscini d'aria, (9) sonda per la misurazione della tensione del substrato e (10) amplificatore di testa su un supporto da laboratorio. Abbreviazioni: AC = corrente alternata, DC = corrente continua, EPG = elettropenetrografia. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Processo di assemblaggio del catetere con tubo, filo e strumenti; diagramma del setup sperimentale per il trasferimento di fluidi.
Figura 2: Elettrodi di registrazione per il cablaggio delle zanzare e un aspiratore per insetti per manipolare le zanzare durante il cablaggio. (A) Filo di rame 20 AWG con 6 cm di rivestimento in plastica rimossi per esporre il fascio di fili di rame all'interno. (B) Singoli filamenti del fascio di fili di rame. (C) Un filamento di filo di rame avvolto attorno alla testa di un perno in ottone con la coda del filo piegata sulla testa del perno. (D) Una piccola quantità di flussante applicata al giunto tra il perno in ottone e il filo di rame, tenuti da un supporto per saldatura a mani libere, in preparazione della saldatura. (E) Un puntale per insetto completato, costruito saldando un chiodo in ottone a un filo di rame. (F) Un elettrodo di registrazione costruito avvolgendo un filo d'oro attorno alla punta del filo di rame del puntale per insetto e fissandolo con colla conduttiva d'argento. (G) Un primo piano del cappio d'oro alla punta dell'elettrodo di registrazione. (H) Un aspiratore per insetti assemblato (in alto) e smontato (in basso), realizzato con pipette Pasteur modificate, rete per zanzare, tubo di plastica, nastro isolante ed estremità maschio con connettore rapido, accanto al tubo dell'aspiratore da laboratorio dotato di connettore rapido femmina (in alto a destra). Barre della scala = 1 cm (A-F), 200 µm (G). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Cablaggio delle zanzare

  1. Preparare le zanzare e la colla d'argento (il pomeriggio/sera prima della EPG):
    1. Allevare e mantenere Cx. tarsalis Zanzare della ceppa KNWR allevate come precedentemente descritto27.
    2. Mantenere femmine adulte di zanzare, di età compresa tra 5 e 17 giorni dalla schiusa, a digiuno per 8-12 ore per aumentare i tassi di probing, consentendo però l'accesso all'acqua per evitare mortalità.
    3. Preparare una colla d'argento fresca26,27,28,29,30:
      1. Aggiungere 510 mg di 4-8 µm aggiungere la lamina d'argento a un becher da 20 mL. Azzerare la bilancia e aggiungere 1.100 mg di colla non tossica per uso scolastico al becher sopra la lamina d'argento.
      2. Azzerare la bilancia, aggiungere 510 mg di 8-10 µm aggiungere la lamella d'argento al becher sopra la colla, quindi aggiungere 1,000 µL di acqua utilizzando una pipetta.
      3. Aggiungere delicatamente una barretta magnetica al becher e posizionarlo sulla piastra magnetica. Iniziare a mescolare lentamente, aumentare gradualmente fino all'impostazione "rapida" e continuare a mescolare per 4 minuti. Assicurarsi che tutti i componenti siano completamente incorporati.
      4. Utilizzare una pipetta di trasferimento (con la punta tagliata) per trasferire la colla argentata in provette microcentrifuga da 1,5 mL.
      5. Avvolgere le estremità dei tubi di colla argentata con Parafilm e conservare sul banco di lavoro fino all'uso.
        NOTA: La colla argentata mantiene la consistenza corretta per un massimo di 2 giorni, ma si raccomanda di preparare la colla fresca la sera precedente l'uso30.
  2. Preparare gli elettrodi di registrazione26,27,29,30:
    1. Vortexare energicamente la colla d'argento prima dell'uso.
    2. Avvolgere un blocco di poliuretano con pellicola trasparente fresca per contenere i supporti preparati con insetti e le zanzare cablate.
      NOTA: La schiuma deve essere sufficientemente grande da permettere alle zanzare filate di appoggiarsi sulla superficie senza toccarsi tra loro, ma abbastanza piccola da poter essere contenuta all'interno di una scatola di conservazione. PRECAUZIONE: Le goccioline escretorie rilasciate dopo il pasto ematico potrebbero contenere agenti patogeni. Smaltire adeguatamente la pellicola di plastica/il blocco di schiuma dopo l'uso.
    3. Rimuovere l'ossidazione (e la vecchia colla di argento, se si riutilizzano le basette per insetti) dalla punta del filo di rame raschiando con una lametta i primi 1 cm del filo di rame finché non risulti brillante su tutti i lati. Preparare una basetta per insetto per ogni zanzara, più alcune in aggiunta.
    4. Tagliare il filo d'oro di diametro 0,025 mm in pezzi lunghi 4-5 cm. Tenere sempre il filo con pinzette autocludenti ricoperte di nastro adesivo per evitare ammaccature.
      NOTA: Il filo d'oro è molto più visibile su uno sfondo nero.
    5. Posizionare l'estremità del filo d'oro sulla punta pulita del filo di rame del supporto per insetti e avvolgere delicatamente il filo d'oro 3 volte attorno al filo di rame.
    6. Utilizzare una sonda da dissezione per applicare una colla argentata al fine di fissare il filo d'oro. Assicurarsi che non vi siano code o estremità libere. Posizionare il supporto dell'insetto sulla schiuma fino a quando la colla non si sarà asciugata.
    7. Accarezzare delicatamente il filo d'oro collegato al supporto dell'insetto per livellarlo e modellarlo in un arco lungo e morbido (Figura 2F). Tagliare il filo alla lunghezza desiderata (~2,5-3 cm).
    8. Lavorando sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette a punta fine per formare un'ansa d'oro all'estremità del filo d'oro e piegare l'ansa a un angolo di 90° angolo come descritto di seguito (passaggi 2.2.8.1-2.2.8.4; Figura 2E, F). Assicurarsi che il cappio d'oro sia completamente chiuso. Riposizionare il supporto dell'insetto nel blocco di schiuma.
      1. Utilizzando la mano non dominante, tenere il supporto dell'insetto per il chiodo di ottone, in modo che la punta del filo d'oro tocchi la piastra del microscopio. Con la mano dominante, afferrare l'estremità del filo d'oro con pinzette a punta fine.
      2. Utilizzando pinzette a punta fine, incrociare la punta del filo d'oro sul filo di rame del supporto per insetti in prossimità del punto in cui il filo d'oro è incollato. Appoggiare la punta delle pinzette a punta fine e del filo d'oro sulla piastra del microscopio.
      3. Tirare delicatamente sull'appendice dell'insetto finché il filo d'oro non formi un piccolo anello intorno alla punta della pinzetta a punta fine (non tirare troppo forte). Rilasciare il filo d'oro e rimuovere con attenzione la pinzetta.
      4. Mantenendo ancora fermo il supporto dell'insetto nella mano non dominante, afferrare il cappio d'oro con pinzette a punta fine in modo che le pinzette formino un angolo perpendicolare rispetto al collo del filo e la punta delle pinzette attraversi il centro del cappio d'oro, afferrando così entrambi i lati del cappio. Tirare delicatamente il supporto dell'insetto mentre si ruotano leggermente le pinzette allontanandole dal supporto fino a quando il cappio non risulta piegato a un angolo di 90° angolo rispetto al collo del filo (Figura 2G).
  3. Applicare elettrodi di registrazione alle zanzare26,27,29,30 (la mattina della PEG):
    1. Anestetizzare le zanzare a digiuno con CO2 gas fino a quando tutti i movimenti cessano. Posizionare le zanzare supine sul tappetino anestetico, con gli addomi rivolti verso il ricercatore.
    2. Posizionare un pezzo di nastro adesivo da laboratorio di circa 2 cm sotto un microscopio stereoscopico, con il lato adesivo rivolto verso il basso. Applicare una goccia di 0,5 cm (circa 10 µL) di colla d'argento sul nastro.
    3. Aspirare l'addome di una zanzara anestetizzata nella pipetta di Pasteur modificata, utilizzando l'aspirazione solo per il tempo necessario a posizionare correttamente l'addome. Tenere la zanzara sotto la lente stereoscopica sopra la colla argentata utilizzando l'aspiratore.
      NOTA: Le ali possono trovarsi all'interno o all'esterno della punta della pipetta di Pasteur modificata, ma posizionarle all'interno aiuta a impedire che la zanzara cada. Evitare di piegare o danneggiare le ali.
    4. Lavorando rapidamente, immergere un ago minutien nella colla argentata e applicare uno strato sottile sul pronoto della zanzara (ovvero sulla superficie dorsale del torace). Procedere immediatamente al passaggio successivo, se possibile (oppure ri-anestetizzare la zanzara se necessario).
      NOTA: Si raccomanda di rimuovere le squame sul pronoto strofinando il perno avanti e indietro per favorire la penetrazione della colla nei pori della cuticola. Evitare di mettere colla su altre parti della zanzara.
    5. Immergere rapidamente l'anello d'oro all'estremità dell'elettrodo di registrazione nella colla argentata e posizionarlo sulla goccia di colla argentata sul pronoto della zanzara. Muovere l'anello avanti e indietro per assicurarsi che aderisca perfettamente al pronoto. Tenere fermo il filo fino a quando la colla non si asciuga (~20-25 s).
    6. Sostituire il supporto per insetti nella schiuma con un angolo che permetta alla zanzara cablata di stare in posizione comoda quando si risveglia. Procedere con il cablaggio della zanzara successiva.
      NOTA: È consigliabile prendere appunti sulla qualità di ogni intervento di cablaggio.
    7. Una volta collegato il numero desiderato di zanzare, posizionare il blocco di schiuma in una scatola di conservazione. Mantenere le zanzare in condizioni normali di allevamento fino al momento dell'uso.

3. Configurazione e preparazione dell'EPG (la mattina prima dell'EPG)

  1. Accendere il monitor AC-DC EPG (azionando l'interruttore sull'alimentatore) almeno 30 minuti prima della registrazione per consentire l'equilibrazione dello strumento e qualsiasi intervento di risoluzione dei problemi.
    NOTA: I canali in uso sulla scatola di controllo e sulla scatola dell'interfaccia di commutazione possono rimanere accesi.
  2. Accendere il computer e aprire il software di gestione dell'hardware.
    NOTA: Se i segnali non appaiono come linee sottili e piatte, è necessario effettuare la risoluzione dei problemi (vedere la sezione di discussione).
  3. Eseguire il test del contatto27,30 per verificare il funzionamento dell'apparecchiatura:
    1. Mantenendosi a massa (cioè toccando la gabbia di Faraday con la pelle nuda), ruotare la manopola dell'amplificatore di testa su 106 Ω e inserire l'asta di un supporto per insetto nella porta.
      ​NOTA: Eseguire il test del contatto a un livello più elevato di resistenza di ingresso (Ri) potrebbe danneggiare l'amplificatore di testa.
    2. Mantenendosi a massa, accendere l'amplificatore di testa e afferrare saldamente il filo di rame del supporto per insetto tra pollice e indice per tre volte. Se l'EPG funziona correttamente, sullo schermo appariranno tre picchi elevati sia nei segnali pre che post. In caso contrario, è necessario effettuare la risoluzione dei problemi (vedere la sezione di discussione).
  4. Regolare le impostazioni dello strumento a 150 mV di corrente alternata (AC) con un Ri di 107 Ω, un guadagno hardware di 20-40x, un offset negativo, una linea di base nativa e un guadagno software di 8-16x27,30, come descritto di seguito (passaggi 3.4.1-3.4.3).
    1. Impostare tensione, tipo di corrente, guadagno hardware (intervallo, guadagno e moltiplicatore), offset e linea di base (zero) utilizzando gli interruttori e le manopole del canale 1 della scatola di controllo.
      NOTA: L'impostazione appropriata del guadagno hardware dipende dalla qualità del cablaggio e della colla argentata; pertanto, si prevedono variazioni nell'impostazione ottimale del guadagno da zanzara a zanzara e da giorno a giorno. Il guadagno hardware potrebbe dover essere regolato durante la registrazione se i picchi del segnale sono troppo elevati (definiti nella Tabella 2 e mostrati nella Figura 3A,C) o troppo piccoli per essere visualizzati. Eventuali modifiche al guadagno hardware influenzeranno in modo permanente la registrazione (mostrato nella Figura 3A,C).
    2. Impostare il livello di Ri utilizzando la manopola sull'amplificatore di testa.
    3. Impostare e regolare il guadagno software utilizzando il software di gestione dell'hardware (ad esempio, selezionare il segnale pre o post e fare clic con il tasto sinistro per aumentare il guadagno software o con il tasto destro per ridurlo).
      NOTA: Le modifiche al guadagno effettuate nel software NON influenzeranno in modo permanente la registrazione.
  5. Configurare una nuova registrazione nel software di gestione dell'hardware, ma non avviare la registrazione fino al passaggio 4.3 della sezione successiva.

4. EPG su mani umane26,27 :

  1. Dopo aver ottenuto il consenso informato (come specificato dal comitato etico dell'istituzione di appartenenza), far sedere l'ospite accanto alla gabbia di Faraday con un braccio all'interno, afferrando la sonda del voltaggio del substrato e tenendola al di sotto dell'amplificatore della testa.
    NOTA: Il braccio deve riposare comodamente su materiale in polietilene espanso o su un substrato non conduttivo simile. La mano e la sonda del voltaggio del substrato non devono entrare in contatto con la gabbia di Faraday o con l'amplificatore della testa durante la registrazione. Per evitare danni, è fondamentale che il volontario non tocchi l'amplificatore della testa una volta che è acceso. Se l'amplificatore della testa viene toccato accidentalmente, eseguire il test del contatto descritto in precedenza per valutarne il funzionamento.
  2. Una volta che l'ospite è in posizione, ruotare l'amplificatore della testa lateralmente. Prelevare una zanzara cablata dalla scatola di conservazione e collegarla allo strumento inserendo il perno in ottone del supporto dell'insetto nella porta dell'amplificatore della testa. Lasciare la zanzara penzoloni.
    NOTA: Tenere a portata di mano un flacone spray contenente etanolo al 70% per controllare eventuali zanzare che si staccano dal filo.
  3. Avviare la registrazione utilizzando il software di gestione hardware. Posizionare l'amplificatore della testa sopra la mano in modo che la zanzara possa stare comodamente in piedi e iniziare la perforazione.
  4. Accendere l'amplificatore della testa mentre si è a massa. Avviare un timer di 10 minuti. Regolare la posizione della mano dell'ospite secondo necessità per facilitare il successo della perforazione.
    NOTA: Quando si utilizzano zanzare inclini a perforare immediatamente, accendere l'amplificatore della testa prima di posizionare la zanzara sulla mano. Un bastoncino di legno sottile o l'impugnatura di un pennello non conduttivo possono essere utilizzati per piegare il filo di rame del supporto dell'insetto e regolare ulteriormente la posizione della zanzara. Una lente d'ingrandimento o un microscopio digitale su un braccio flessibile possono aiutare nell'osservazione della zanzara durante l'EPG, specialmente negli studi di correlazione comportamentale.
  5. Utilizzare il software di gestione hardware per effettuare osservazioni con timestamp (ad esempio, marcatori di evento) durante la registrazione riguardo alle risposte dell'ospite, ai comportamenti della zanzara, ai cambiamenti di guadagno, ecc. Regolare la posizione dei segnali sullo schermo e il guadagno del software secondo necessità per mantenere entrambi i segnali chiaramente visibili sullo schermo. Regolare il guadagno hardware se i segnali raggiungono il picco (Figura 3A,C e Tabella 2) o se le onde appaiono troppo piccole quando il guadagno del software è al massimo. Regolare l'offset se si osserva un ripiegamento del raddrizzatore (Figura 3C,C' e Tabella 2). Fare riferimento al manuale del software31 e alle risorse online30 per istruzioni dettagliate su come effettuare queste regolazioni.
    1. Per regolare la posizione dei segnali sullo schermo, selezionare il segnale pre o post (ad esempio, cliccando su
      1 = 1       o 2 = 3) e quindi trascinare il segnale nella posizione desiderata sullo schermo (idealmente vicino al centro dello schermo ma senza sovrapposizioni).
    2. Per regolare il guadagno del software, utilizzare il software di gestione hardware descritto al punto 3.4.3.
    3. Per regolare il guadagno hardware, iniziare ruotando il selettore del guadagno del canale 1 a destra o a sinistra per aumentare o ridurre il guadagno, rispettivamente. Se questa regolazione non è sufficiente per eliminare il picco (guadagno troppo alto; Figura 3A,C) o per permettere di visualizzare chiaramente i dettagli del segnale (guadagno troppo basso), commutare gli interruttori di intervallo e moltiplicatore del canale 1 per regolare ulteriormente il guadagno.
      NOTA: Si raccomanda di utilizzare marcatori di evento per registrare quando è stato modificato il guadagno hardware, al fine di facilitare l'interpretazione dei dati delle forme d'onda.
    4. Per regolare l'offset, commutare l'interruttore di offset del canale 1 sulla scatola di controllo su neg, quindi ruotare la manopola di offset del canale 1 finché i picchi nei segnali pre e post non si verificano nella stessa direzione sullo schermo del computer. Se la manopola di offset viene ruotata troppo, il segnale post si capovolgerà nuovamente.
  6. Se la zanzara non perfora entro 10 minuti (o un altro punto temporale definito), spegnere l'amplificatore della testa. Se la zanzara è nel mezzo della perforazione al momento stabilito, permetterle di completare la perforazione prima di spegnere l'amplificatore della testa. Chiedere all'ospite di rimuovere con attenzione la propria mano, quindi rimuovere la zanzara con il supporto dell'insetto collegato. Riporre la zanzara nella scatola di conservazione.
  7. Interrompere/chiudere la registrazione utilizzando il software di gestione hardware. Procedere con l'EPG sulla zanzara successiva (Passaggio 4.2).
    NOTA: Ricordarsi di modificare il nome del file dopo ogni zanzara.
  8. Spegnere l'amplificatore della testa e la fonte di alimentazione al termine della sessione e chiudere il software.
  9. Rivedere con il volontario la Dichiarazione di Debriefing del Partecipante o un documento simile, come specificato dal comitato etico approvato.
  10. Smaltire le zanzare secondo i requisiti del protocollo. Rimuovere la pellicola di plastica dal blocco di poliuretano espanso e smaltirla correttamente.
  11. Al termine della raccolta di tutti i dati, rivedere e misurare le forme d'onda e analizzare i dati come descritto in precedenza24,25,26,27,29,30. Fare riferimento alle risorse online30 per tutorial passo dopo passo sull'utilizzo del software di revisione delle forme d'onda, sulla creazione di figure che rappresentano le forme d'onda, sulla misurazione delle forme d'onda, sull'esportazione dei dati per l'analisi, sull'esecuzione dell'analisi statistica e su una spiegazione dettagliata delle variabili comuni di risposta delle forme d'onda.

Grafico di dati elettrofisiologici che illustra variazioni transitorie dell'ampiezza del segnale nel tempo.
Figura 3: Esempi di registrazioni subottimali dovute a saturazione del segnale, variazioni del guadagno del box di controllo, cambi di tensione poco chiari causati da cablaggi difettosi, piegamento del segnale da raddrizzatore e rumore. Forme d'onda ottenute da zanzare Culex tarsalis mentre si nutrivano fino alla sazietà da mani umane, distorte da (A) saturazione del segnale (freccia orizzontale blu) e successive variazioni del guadagno del box di controllo da 100x a 80x a 40x a 60x a 40x a 20x (frecce verticali arancioni), (B) cambi di tensione poco chiari e (C) piegamento del segnale da raddrizzatore nel segnale post- (nero) rispetto al segnale pre- (rosso) (vedere forma d'onda J, ingrandimento mostrato nel pannello C'), rumore di linea (onda sinusoidale a 11 Hz visibile solo nel segnale pre-raddrizzamento (rosso), ingrandimento mostrato nel pannello C'), saturazione del segnale (freccia orizzontale blu) e variazione del guadagno del box di controllo da 500x a 200x (freccia verticale arancione). I nomi delle forme d'onda sono indicati nella parte superiore di ciascun pannello. Le frecce viola nell'angolo in basso a destra del pannello C indicano quando l'amplificatore di testa è stato spento dopo il completamento della prova e forniscono un ulteriore esempio di piegamento del segnale da raddrizzatore. Le linee orizzontali rosse associate al segnale pre-raddrizzamento nel pannello C indicano quando sono stati utilizzati i marcatori di evento per registrare note con timestamp. I livelli di Ri, i segnali applicati, le scale temporali e i guadagni software sono: (A) 107 Ω, 150 mV DC, 13,2 s/div, 8x; (B) 107 Ω, 150 mV DC, 4,4 s/div, 128x; e (C) 107 Ω, 150 mV AC, 7,4 s/div, 2x; (C') 0,2 s/div, 8x. Abbreviazioni: AC = corrente alternata, DC = corrente continua, Ri = resistenza di ingresso, mV = millivolt, Ω = Ohm, s/div = secondi per divisione. Questa figura è stata preparata utilizzando dati di Cooper et al.27. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati

Le registrazioni EPG AC-DC della alimentazione ematica di zanzare Cx. tarsalis su mani umane (Figura 4) hanno generato forme d'onda interpretabili, adatte all'analisi e alla pubblicazione27. Le forme d'onda interpretabili presentavano schemi ripetuti distinti e distinguibili, classificabili in famiglie (Tabella 1 e Figura 4), tipi e sottotipi, una volta regolati la compressione (definita nella Tabella 2) e il guadagno del software nel programma di revisione delle forme d'onda27,31. Tutte le famiglie di forme d'onda (J, K, L, M, N) e i tipi (L1, L2, M1, M2) precedentemente descritti in Ae. aegypti durante l'alimentazione su mani umane26 sono stati identificati anche nelle forme d'onda prodotte da Cx. tarsalis che si nutrono su mani umane, confermando la validità dei metodi qui descritti. Inoltre, sono stati identificati tre nuovi tipi di forme d'onda (M3, N1, N2) e numerosi sottotipi di L1, L2, M1 e M227. In aggiunta, la caduta di tensione al valore di base al ritiro delle parti boccali dall'ospite è stata denominata famiglia di forme d'onda W27.

La variazione sistematica delle impostazioni dello strumento (tipo di corrente e livelli di Ri) seguendo le procedure descritte qui ha permesso di determinare le impostazioni ottimali per la registrazione dell'alimentazione di Cx. tarsalis su mani umane, le origini elettriche di ciascun tracciato, la durata media in secondi delle punture complete e incomplete per zanzara e il confronto statistico della durata del tracciato in secondi per insetto (WDI), del numero di eventi di tracciato per insetto (NWEI) e della durata del tracciato in secondi per evento per insetto (WDEI) tra le diverse impostazioni27. Le zanzare sono state inoltre interrotte durante diversi tracciati ed esaminate mediante dissezione per determinare quale tracciato fosse correlato all'ingestione di sangue27. Un'indagine simile è stata condotta per Ae. aegypti utilizzando una metodologia comparabile26.

A causa della natura sensibile e complessa dell'EPG, non tutte le registrazioni erano altrettanto nitide rispetto a quelle mostrate in Figura 4. Picchi (Figura 3A,C), variazioni del guadagno hardware (Figura 3A,C), collegamenti elettrici scadenti (Figura 3B), inversione del raddrizzatore nella forma d'onda J (Figura 3C,C') e rumore elettrico (Figura 3C,C') hanno occasionalmente distorto e mascherato le forme d'onda, rendendole inadatte per figure di qualità pubblicabile e complicando la valutazione e l'analisi. Pertanto, si raccomanda un impegno iniziale per perfezionare le tecniche di cablaggio, ottimizzare le impostazioni di guadagno e tensione, regolare l'offset e controllare il rumore elettrico. Curiosamente, l'inversione del raddrizzatore è stata osservata soltanto nella famiglia di forme d'onda J per Cx. tarsalis (Figura 3C,C') e non si è più verificata una volta regolato inizialmente l'offset, anche quando sono state utilizzate altre specie di zanzare (Ae. aegypti e Culex quinquefasciatus) (dati non mostrati). Inoltre, il controllo diagnostico ha rivelato che il rumore elettrico incontrollato mostrato in Figura 3 (pannelli C e C') era dovuto a una gabbia di Faraday difettosa. Le registrazioni effettuate nella gabbia di Faraday difettosa erano comunque utilizzabili, ma i problemi di rumore sono stati risolti costruendo una gabbia di Faraday migliorata (Figura 1B).

Anche quando sono state adottate tutte le precauzioni e le ottimizzazioni iniziali, lievi variazioni nella qualità dell'attacco dell'elettrodo al morso e altri fattori sconosciuti che alteravano il segnale e modificavano periodicamente il rapporto segnale-rumore rendevano necessario regolare il guadagno hardware durante la registrazione, al fine di mantenere il segnale entro un intervallo visibile e garantire una risoluzione sufficiente dei picchi in ogni forma d'onda per l'identificazione e la caratterizzazione. Purtroppo, regolare il guadagno hardware durante la registrazione può causare bruschi spostamenti di tensione (Figura 3A, C), rendendo le forme d'onda poco adatte per la pubblicazione, ma comunque utilizzabili (totalmente o parzialmente) per misurazioni e analisi.

Diagrammi di equilibrio statico che mostrano l'analisi delle forze; i grafici evidenziano le equazioni ΣFx=0, ΣFy=0.
Figura 4: Forme d'onda rappresentative registrate da una sonda di Culex tarsalis su una mano umana, utilizzando un Ri di 107 Ω e un segnale applicato di 250 mV AC. I nomi delle forme d'onda a livello familiare (NP, J, K, L, M, W) sono indicati nella parte superiore di ciascun pannello. I pannelli inferiori mostrano ingrandimenti di alcune regioni del pannello A. I pannelli inseriti mostrano ingrandimenti delle regioni indicate. Le scale temporali e i guadagni del software sono: (A) 7,0 s/div, 16x; (B) 1,0 s/div, 64x; (B') 0,2 s/div, 64x; (C) 1,0 s/div, 64x; (C') 0,2 s/div, 32x; (D) 1,0 s/div, 64x; (D') 0,2 s/div, 64x. Abbreviazioni: AC = corrente alternata, Ri = resistenza di ingresso, mV = millivolt, Ω = Ohm, s/div = secondi per divisione. Questa figura è stata preparata utilizzando dati di Cooper et al.27. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Quando si utilizza l'EPG AC-DC, è fondamentale avere una conoscenza di base del funzionamento hardware e software30 e seguire attentamente i protocolli qui descritti per evitare di danneggiare l'apparecchiatura. In particolare, evitare di toccare l'head amp quando è acceso a meno che non sia collegato a terra sulla gabbia di Faraday. Si consiglia di registrare il più indietro possibile nella gabbia di Faraday30. Le porte della gabbia non devono necessariamente essere chiuse per ottenere forme d'onda interpretabili, a meno che non si registri in un ambiente con rumore elettrico ambientale eccessivo. Nulla di motorizzato può essere nella gabbia di Faraday. È importante notare che la gabbia di Faraday stessa deve essere collegata a terra elettricamente esclusivamente attraverso l'head amp affinché funzioni correttamente. Ciò si ottiene collegando l'head amp a un supporto da laboratorio in metallo con la vernice levigata da un piede del supporto per consentire un percorso conduttivo per l'elettricità catturata dalla gabbia di Faraday per fluire verso il supporto da laboratorio, nell'involucro metallico dell'head amp, lungo il cavo fino alla scatola di controllo, attraverso l'alimentatore in una presa a muro adeguatamente messa a terra e nella terra attraverso il terreno dell'edificio30. Un multimetro può essere utilizzato per verificare la qualità della connessione tra i componenti all'interno della gabbia misurando la resistività (che è l'inverso della conducibilità) tra i vari punti. Una radio AM wireless può anche essere posizionata all'interno della gabbia di Faraday per verificare che il suono sia significativamente ridotto (o idealmente eliminato) quando le porte sono chiuse, confermando che la gabbia di Faraday stia catturando adeguatamente i segnali elettrici presenti nell'aria (E. Backus per. Comm.).

La preparazione corretta e standardizzata della colla d'argento e l'attaccamento degli elettrodi di registrazione agli insetti sono fondamentali per ottenere registrazioni utilizzabili. La cuticola dell'insetto è un isolante e funge da condensatore se la colla d'argento non penetra adeguatamente nei pori della cuticola per creare un percorso per l'elettricità che viaggia dall'interno dell'insetto al filo d'oro sulla superficie del pronoto30. Preparare la colla d'argento contemporaneamente prima di ogni sessione EPG, lavorare con colla d'argento fresca dal tubo e sostituirla frequentemente con colla d'argento a vortice vigoroso durante la procedura di cablaggio. Assicurati che l'anello d'oro sia posizionato contro il torace in modo che l'intero anello sia a contatto con la cuticola e non inclinato da un lato o separato da uno spesso strato di colla d'argento e squame per aiutare a formare una forte connessione elettrica e prevenire il distacco e la fuga della zanzara dal filo.

I protocolli qui descritti devono essere ottimizzati quando si lavora con diverse specie di zanzare. Le impostazioni EPG ottimali (livello Ri, tensione, tipo di corrente e guadagno hardware) per la registrazione su un determinato artropode devono essere determinate sperimentalmente12,30. Tuttavia, una volta regolato l'offset, non sarà necessario regolarlo nuovamente quando si lavora con zanzare simili. Sono state determinate le impostazioni ottimali per l'EPG AC-DC con Ae. aegypti26 e Cx. tarsalis27. Le librerie di forme d'onda (definite nella Tabella 2) per altre specie faciliteranno l'adozione dell'EPG per le zanzare. È inoltre necessario ottimizzare l'anestesia per la zanzara di interesse, poiché il comportamento di alimentazione del sangue può essere influenzato in modo differenziale in base alle specie di zanzara e alla scelta dell'anestesia. Ad esempio, Cx. tarsalis richiede un periodo di recupero di 4 ore dopo 15 minuti di anestesia con CO2, mentre per Ae. aegypti, un periodo di recupero di 15 minuti è sufficiente dopo un periodo di anestesia di 15 minuti con ghiaccio. I culex tarsalis, tuttavia, sono difficili da abbattere con l'esposizione al freddo, quindi la CO2 viene utilizzata prevalentemente nonostante il lungo periodo di recupero.

Sebbene il monitor EPG AC-DC sia semplice da usare dopo aver esaminato le risorse online30,31 o la formazione con un utente esperto, è necessaria una risoluzione dei problemi. Inizialmente, le registrazioni EPG dell'autore delle sonde di zanzara avevano un'onda inaspettata di 11 Hz nel pre-segnale che non era stata osservata o riportata da Wayadande e colleghi26. La consultazione con E. Backus ha indicato che la gabbia di Faraday era probabilmente il problema a causa dell'interferenza dei loop di terra. Una nuova gabbia di Faraday costruita con uno schermo di rame altamente conduttivo collegato a un telaio in alluminio imbullonato a una grande piastra di alluminio sostenuta da piedini in gomma per isolarla dalla tabella sottostante (Figura 1B), ha risolto il segnale di rumore a 11 Hz (Figura 3C,C'). Inoltre, occasionalmente, quando l'alimentatore EPG veniva acceso per la prima volta, i segnali pre e post-rettifica apparivano come linee spesse e sfocate invece che linee rette, lisce e sottili. Questo problema veniva solitamente risolto spegnendo lo strumento e controllando tutti i collegamenti dei cavi. In caso di errore, di solito è stato utile scollegare lo strumento per 1-3 minuti. Molto raramente, i segnali pre e post diventano spessi e sfocati durante il funzionamento, il che è stato risolto spegnendo lo strumento e collegandolo a una presa diversa o utilizzando un regolatore di tensione e un condizionatore di alimentazione per collegare l'EPG prima di collegarlo alla parete. Idealmente, una linea dedicata per il monitor EPG eliminerebbe il rumore di linea proveniente da frigoriferi e altre apparecchiature collegate allo stesso circuito elettrico dell'EPG30.

Attualmente, ci sono due limitazioni principali all'uso dell'EPG per studiare le zanzare. In primo luogo, sono stati eseguiti pochi studi di correlazione per verificare quali comportamenti di sondaggio corrispondono alle forme d'onda. Mentre ci sono forti ipotesi su ciò che sta accadendo durante ciascuna famiglia di forme d'onda (Tabella 1) e alcuni dei tipi di forme d'onda (M1 e M2), poche di queste ipotesi sono state confermate sperimentalmente, tranne che l'ingestione di sangue è correlata con la famiglia di forme d'onda M26,27. Ancora più importante, le forme d'onda corrispondenti agli eventi di salivazione devono essere identificate perché molti agenti patogeni vengono trasmessi nella saliva. La correlazione delle forme d'onda EPG con le attività biologiche nelle zanzare sarà necessaria per interpretare in modo significativo le differenze significative nella durata e nel conteggio delle forme d'onda tra i gruppi di trattamento. In secondo luogo, i tassi di sondaggio e di ingestione durante l'EPG possono essere molto più bassi del previsto27. Legare individualmente le zanzare a fili corti e posizionarle direttamente sull'ospite potrebbe prevenire comportamenti di ricerca dell'ospite e di alimentazione sociale a lunga distanza, che possono influenzare i comportamenti di sondaggio e ingestione. Gli insetti correttamente cablati possono camminare e volare normalmente. Tuttavia, le zanzare spesso tirano contro i fili e talvolta si aggrovigliano o si tengono ad angoli innaturali, indicando che essere cablate influisce in una certa misura sul loro comportamento. Gli autori hanno testato molte strategie per migliorare i tassi di sondaggio durante l'EPG e il digiuno delle zanzare durante la notte, utilizzando individui più anziani, esponendoli al respiro umano immediatamente prima di metterli sulla mano e applicando saliva umana alla mano sono stati i più efficaci, oltre a utilizzare ospiti che hanno costantemente apportato regolazioni su larga scala alla posizione della loro mano per garantire che la zanzara fosse nella posizione ideale per sondare27.

Nonostante queste limitazioni, l'EPG AC-DC presenta numerosi vantaggi rispetto ad altri approcci per lo studio dei comportamenti di sondaggio e ingestione. Sistemi come il BiteOScope11, il flyPAD15 e l'Automated Biomaterial Platform14, progettati per quantificare i comportamenti di sondaggio e ingestione e le secrezioni salivari durante l'alimentazione del sangue, utilizzano substrati artificiali trasparenti e diete liquide prive dei normali sistemi tissutali dell'ospite e dei segnali dell'ospite. Sebbene queste piattaforme sintetiche siano utili per molti scopi sperimentali, un chiaro vantaggio dell'EPG AC-DC è la capacità di studiare questi comportamenti degli artropodi e le variabili di interesse all'interno dei sistemi ospiti naturali. Inoltre, l'adattabilità definita dall'utente del sistema EPG AC-DC offre un ulteriore vantaggio rispetto ad altri strumenti EPG22,33 e dispositivi di monitoraggio elettronico simili all'EPG 16,21, che non hanno livelli di Ri regolabili, tipi di corrente e livelli di tensione necessari per ottenere forme d'onda con la massima quantità di informazioni e ridurre al minimo gli effetti negativi su un'ampia gamma di ospiti e artropodi22, 23. Le tecniche di elettromiografia (EMG) vengono utilizzate anche per studiare l'alimentazione del sangue. Tuttavia, il circuito elettrico di solito include solo l'artropode e vengono registrati solo i potenziali muscolari più vicini all'elettrodo di registrazione, quindi le forme d'onda non forniscono informazioni sulle attività dettagliate che si verificano all'interfaccia ospite-insetto come rotture cellulari, posizioni e attività dello stiletto e potenziali di flusso attraverso l'apparato boccale28,34. Le tecniche di microscopia intravitale possono essere utilizzate per visualizzare direttamente i movimenti dettagliati dell'apparato boccale e le attività nei tessuti ospiti viventi, ma queste tecniche comportano procedure invasive su modelli animali vivi9. Solo il monitor EPG AC-DC è in grado di fornire informazioni altamente dettagliate in tempo reale sui comportamenti di sondaggio, ingestione e salivazione che si verificano nei tessuti ospiti opachi viventi senza la necessità di procedure invasive ed è adattabile per l'uso in un'ampia varietà di artropodi 10,12.

Questa è la prima procedura dettagliata passo dopo passo per il cablaggio delle zanzare, la costruzione di un aspiratore di insetti e l'esecuzione di EPG su ospiti umani. Si prevede che questi protocolli faciliteranno l'adozione dell'EPG AC-DC sulle zanzare che si nutrono di ospiti umani. Esempi di futuri sforzi di ricerca che impiegano l'EPG AC-DC possono includere studi sui meccanismi fondamentali dell'alimentazione del sangue e del danno tissutaledell'ospite 10, tra cui l'identificazione di sequenze stereotipate di comportamenti di sondaggio che precedono l'ingestione di sangue, lo studio del flusso sanguigno attraverso l'apparato boccale e il confronto della plasticità dell'alimentazione all'interno e tra le specie di artropodi/gli stadi di sviluppo26. L'EPG può anche essere utilizzato per quantificare gli effetti di insetticidi, antifeedant e repellenti12. Le procedure qui presentate per l'utilizzo dell'EPG AC-DC per studiare le zanzare sulle mani umane accelereranno questi studi e consentiranno nuove intuizioni sulla biologia dell'alimentatore di sangue delle zanzare.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare. La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione ha il solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica una raccomandazione o un'approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. Le conclusioni di questo rapporto sono quelle degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni dell'USDA.

Ringraziamenti

Siamo grati al Prof. Astri Wayadande dell'Oklahoma State University per aver aperto la strada alla procedura di cablaggio per le zanzare, e al Dr. Elaine Backus dell'USDA-ARS di Parlier, CA, e al Sig. Andrew Dowell della EPG Technologies Inc. di Gainesville, FL, per l'assistenza nella risoluzione dei problemi dell'apparecchiatura EPG. Ringraziamo anche il Dr. Dustin Swanson e il Sig. William Yarnell dell'USDA-ARS Insectary di Manhattan, KS, per aver fornito le zanzare, e la signorina Miriam Ruhinda della Kansas State University di Manhattan, KS per la sua assistenza nelle riprese dei video procedurali. Questo lavoro è stato reso possibile dall'accesso all'Integrated Molecular Entomology Core (IEMC) presso la Kansas State University. Questa ricerca è stata supportata dall'USDA Research, Education, and Economics Workforce Development Agreement (#58-3022-0-002) e dall'Hatch Multistate Project (NE1943). Questo manoscritto è il contributo n. 24-194-J della Kansas Agricultural Experiment Station, Kansas State University, Manhattan, KS, USA.

Materiali

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Strumentazione
Elettropenetrografo a 4 canali AC-DCEPG Technologies, Inc.Per l'EPG, include l'alimentatore, la scatola di controllo, la scatola di interfaccia dell'interruttore, quattro amplificatori dello stadio principale, quattro sonde di tensione del substrato e i relativi cavi I
cuscini d'ariaAmazon.comconsentire all'ospite umano di appoggiare la mano/il braccio durante l'EPG
DI-710 Hardware di acquisizione dati (AD Board)DATAQ Instruments Inc.per digitalizzare i segnali EPG analogici in modo che possano essere visualizzati su un computer
Lampada d'ingrandimento a LED dimmerabile, grande lente d'ingrandimento a mani libere 5X con luce e supporto per la lettura Hobby Artigianato Cucito Banco da lavoroper l'osservazione comportamentale durante l'EPG; utilizzare solo scollegato durante l'EPG o potrebbero verificarsi rumori
per l'osservazione comportamentale durante l'EPG
Dino-Lite Flex-arm Desktop StandDino-LiteMS22Bper tenere e manipolare la telecamera
Eisco Steel Retort Base Stand and Rod SetFisher ScientificS41740per tenere l'amplificatore dello stadio principale e mettere a terra la gabbia di Faraday (deve essere in metallo)
EPG Online WorkshopUF IFAS Extensionhttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022AKA, "risorse online" per l'apprendimento dell'EPG (configurazione dello strumento, raccolta e analisi dei dati, costruzione di Faraday, preparazione della colla d'argento, costruzione di tronchi di insetti, ecc.)
Furman P-1800 AR Regolatore di potenza/Condizionatore di potenzaAmazon.comper ridurre il rumore di linea
Amazon.comdi imbottitura a bolled'aria da utilizzare come barriera tra l'ospite e la gabbia di Faraday
Troemner Talboys Labjaws Regular Clamp HolderFisher Scientific02-217-121per contenere l'amplificatore dello stadio principale e mettere a terra la gabbia di Faraday (deve essere in metallo e non rivestita in plastica)
Computer WindowsBest Buyper EPG e analisi statistiche
Software
Backus 2.0 Programma SAS per l'analisi dei dati UF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/per l'analisi statistica dei dati delle forme d'onda
Ebert 1.0 File Manipulator e Error Checker Programmi SASUF IFAS Extension https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/per la preparazione di file per l'analisi statistica dei dati delle forme d'onda
SAS versione 9.4SAS Institute Inc.per l'analisi statistica dei dati delle forme d'onda
WinDaq Lite Strumenti DATAQ Inc.per la registrazione e la revisione dei dati EPG. Include il software WinDaq Hardware Manager (AKA, "software di gestione hardware") e il software WinDaq Waveform Browser (AKA, "software di revisione delle forme d'onda"). Per l'uso solo su computer Windows.
gabbia di Faraday
telaio dello schermo in alluminioHome DepotMSCF5167per le pareti della gabbia di Faraday
Foglio di alluminio, 0,125 (1/8) spessore 3003-H14Deposito metalliS318per la base della gabbia di Faraday
Bretelle angolari, 1" Home Depot339547per  le pareti della gabbia di Faraday
Viti a macchina Phillips a testa piatta, #6-32 x 1"Home Depot459999per la costruzione della gabbia di Faraday
Rondelle piatte, #6 Home Depot638977per la costruzione di gabbie di Faraday
Multimetro digitale Fluke 15B+, per applicazioni elettriche, misura misure di tensione e corrente CA/CC fino a 1000 V e 10 A, insieme a capacità di resistenza, continuità, diodo e capacitàAmazon.comper testare la gabbia
di FaradayRadio portatile AM FM, radio a transistor Goodes con altoparlante, jack per cuffie, radio a batteria 2AA per la ricezione a lungo raggio, radio tascabile per uso interno, esterno e di emergenzaAmazon.comdella gabbia di Faraday
, maglia 16 x 16 con diametro del filo 0,11, 36 "x 12'MetroScreenworksper le pareti della gabbia di Faraday
Viti a macchina combinate a testa tonda, #6-32 x 3/4 "Home Depot528466per la costruzione della gabbia di Faraday
Carta vetrata, 1/2" per 1", 150 GritHome Depot19036-20-CCper la rimozione della vernice dal fondo del supporto da laboratorio Angoli del
telaio dello schermo, 5/16" Home DepotWCORN516per le pareti della gabbia di Faraday
Scanalatura dello schermo, 0,14"Home Depot3034719per le pareti della gabbia di Faraday
Insect Stubs
Brass Escutcheon Pins HomeDepot801294 per la costruzione di stub di insetti...  
Filo di rame, 20 AWGAmazon.comper la costruzione di tronconi di insetti  
Influenza idrosolubile di HarrisHome Depot355398per aiutare a saldare, rivestire il filo di fusto degli insetti e formare una forte connessione
Pinze ad agoHome Depotper piegare il filo durante la costruzione di tronchetti di insetti Kit
Pro 900-015 Helping Hands Aiuto per la saldaturaAmazon.comper tenere i perni della rosetta durante la saldatura
Saldatura (con nucleo di colofonia)Home Depot296497per la costruzione di stub di insetti   
Home Depotper spelare e tagliare il filo di rame durante la costruzione di tronconi di insetti
YIHUA 928D-III, saldatore ad alta potenza da 110 W,Amazon.comper la costruzione di tronconi di insetti; viene fornito con un supporto, una spugna e lana d'acciaio per la pulizia
Aspiratore di insetti
AccurisV0020per l'applicazione dell'aspirazione all'aspiratore per insetti; include il controller del vuoto portatile, l'adattatore in acciaio inossidabile a punta fine (40 mm) e l'adattatore per puntali per pipette
Pipette Chemglass Life Sciences Pasteur, lunghe 5 3/4Fisher ScientificNC0230004per l'uso come aspiratore di insetti durante il cablaggio delle zanzare
Nastro isolante in vinile colorato elettrico commercialeHome Depotper il fissaggio della pipetta Pasteur modificata alla linea del vuoto
Tessuto multiuso per zanzariere, 10 x 10 cm quadratiJoann Fabrics16651622per evitare che le zanzare vengano aspirate nella pompa del vuoto
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914per passare in modo rapido e semplice tra diverse pipette Pasteur modificate
Thermo Scientific Nalgene HDPE Sganciatine rapide (da 3/8 a 7/16 in. I.D.)Fisher Scientific15-315Bper passare rapidamente e facilmente da una pipetta Pasteur all'altra
Silver Glue 
Elmer's Glue-All Multi Purpose White GlueAmazon.comper la preparazione della colla d'argento
Silver Flake 99,9% puro,  4-8 &; mThermoFisher786.09per la preparazione della colla d'argento
Fiocco d'argento puro al 99,95%, 8-10 µ mInframat Advanced Materials47MR-12Fper la preparazione della colla d'argento
Insect Anesthesia
/sub> bubbler kit, 1000 mL, #9 Tappo in gommaFlyStuff59-181per prevenire l'essiccazione degli insetti durante l'utilizzo del
flypad Flypad  telaio, misura standardFlyStuff59-118per evitare che le zanzare cadano dal flypad
Flystation BrushFlyStuff59-205per ridurre l'elettricità statica quando si lavora su un fly pad
Flystuff  Flypad  dimensioni standardFlyStuff59-114AKA "tappetino per anestesia" per l'anestesia delle zanzare
Imbuto (diametro 4 pollici)Amazon.comper gassare le tazze di zanzare prima del trasferimento sul flypad
Vetro plexi o un coperchio piatto in plastica (tagliato a misura)Home DepotMC-27per coprire il flypad se le zanzare iniziano a svegliarsi
Chiusura dei tubi in plastica Fascette stringitubo Posizione singola e apertura regolabile (varietà da 1/8" a 1/2")Amazon.comper deviare il gas tra il flypad e l'imbuto
Regolatore CO2monostadio FlyStuff59-142per la regolazione del flusso di gas dal serbatoio CO2
" T” Raccordo per tubo ID da 1/8FlyStuff59-123per collegare sia il flypad che l'imbuto al serbatoio CO2
Tubo, trasparente FlyStuff59-124Cper il collegamento dell'imbuto e del flypad al regolatore sul serbatoio CO2
Insect Wiring
Cartoncino nero, (65Lb, 176 g/m2) 8.5" x 11"s Michael's Stores Inc.327826per rendere il filo d'oro più facile da visualizzare
da costruzione nera quadrata 3,5 "x 4,0"Graffette956221per rendere il filo d'oro più facile da visualizzare
Batuffoli di cotoneAmazon.comper le zanzare a digiuno
Schiuma artigianale # 12 blocco (3,1 cm x 17,2 cm x 30,2 cm)Joann Fabric and Craft Store1941079per tenere le zanzare cablate
Nastro deflesso Dispenser,Amazon.comper la conservazione del filo d'oro
Pinze per entomologia FeatherweightFisher ScientificS72110per la manipolazione degli insetti
Pinze fini (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)Fine Science Tools91150-20per creare un anello d'oro durante il cablaggio delle zanzare
Pennello a punta fineAmazon.comper manipolare le zanzare durante il cablaggio e l'EPG; deve avere un manico in plastica o legno se utilizzato per EPG
Pipette di trasferimento standard a punta fine, strette, 5,8 mLThomas Scientific7761D21per la preparazione della colla d'argento
Filo d'oro, puro al 99,99%, spessore 0,025 mmGoodfellowAU005121per il cablaggio delle zanzare
Spille minuziose, punta 0,2 mm, 1 cmFisher ScientificNC9681411per applicare la colla alle zanzare Bicchieri
carta di carta rigidoper zanzare a digiuno     
Morsa a spilloFisher Scientific50-996-811per tenere il perno minuzioso durante il cablaggio degli insetti
Scatola di stoccaggio in plastica con coperchio (7 pollici x 9 pollici x 14 pollici)Amazon.comper il trasporto di zanzare cablate
Vetro plexi o un coperchio piatto in plastica (tagliato a misura)Home DepotMC-27per coprire il cuscinetto antimosche se le zanzare iniziano a svegliarsi
Pinze a chiusura automaticaFisher Scientific08-906per contenere e manipolare filo d'oro
Gas compresso
CO2 gas serbatoioGas Mathesonper anestetizzare le zanzare con un flypad
Common Lab Items
Sacchetti monouso per autoclave a rischio biologico, 8 1/2" x 11"Fisher Scientific03-410-591per lo smaltimento delle zanzare alimentate con sangue
Bruciatore Bunsen o torcia a propanoAmazon.comper la modifica delle pipette Pasteur
Nastro da laboratorio coloratoDaigger FornisceEF9763Rper l'etichettatura, la preparazione della colla d'argento e le pinze per mascheratura
Puntali per pipette monouso, 1000 e micro; LFisher Scientific per aliquotare l'acqua durante la produzione di colla d'argento
Microscopio di dissezioneLeica Microsystemsper il cablaggio delle zanzare Sonda
dissezioneFisher ScientificNC9109673per agitare e applicare la colla d'argento
Pallone di Erlenmeyer, 1000 mLFisher Scientific per prevenire l'essiccazione degli insetti durante l'utilizzo del flypad
Etanolo, 70% Fisher Scientific04-355-122per il recupero delle zanzare fuggite Piastre
Petri in vetroFisher Scientific08-747Bper l'anestetizzazione delle zanzare con ghiaccio
GuantiFisher Scientificper la protezione personale
Kimwipes Tergicristalli delicati per attività a marchio KimTech ScienceFisher Scientific06-666per schiacciare le zanzare
Camici da laboratorioFisher Scientificper la protezione personale
Flaconi spray LiBa, flaconi spray vuoti ricaricabili (sicuri per l'alcol denaturato)Amazon.comper il recupero delle zanzare fuggite
Barra di agitazione magnetica, lunga 2 cmFisher Scientific per la miscelazione della colla d'argento
Pipetta meccanica monocanale, 1000 &; LFisher Scientific 13-690-032per l'aliquotazione dell'acqua durante la produzione di colla d'argento
Provette per microcentrifuga, 1,5 mLFisher Scientific 780420per la conservazione della colla d'argento
Parafilm M Fisher Scientific50-998-944per sigillare provette di colla d'argento
Involucro di plasticaAmazon.comper coprire il blocco di schiuma
Pyrex 20 mL becherFisher Scientific 07-250-051per mescolare la colla d'argento
Semi-Micro BalanceFisher Scientific 10-919-370per pesare colla e scaglie d'argento
Penna pennarello,Amazon.comper l'etichettatura
Lama di rasoio a filo singoloMicroscopia elettronica Scienze71980per la pulizia di mozziconi di insetti
Pipette di trasferimento monouso standardFisher Scientific 133-711-7mLper il trasferimento di colla d'argento in una provetta di stoccaggio 
Piastra di agitazioneFisher Scientific per la miscelazione della colla d'argento
Timer/cronometroFisher Scientificper cronometrare per quanto tempo l'ospite è esposto a ciascun insetto
Acqua ultrapura (18 MΩ)Fisher Scientific per la preparazione della colla d'argento
Forbici multiusoFisher Scientific08-945per il taglio del filo d'oro
Miscelatore a vorticeFisher Scientific per la miscelazione di colla d'argento
Study Organisms
Culex tarsalis zanzareUSDA ARS Center for Grain and Animal Health Research a Manhattan KSper l'uso come soggetti di studio
Amazon.com Microscopio digitale Dino-Lite Edge (ingrandimento 250x)Dino-Lite AF4915ZT Piccolo per testare lo schermo in rame puro di saldatura completamente digitale Strumenti " CO" Carta trasparente di Tubo di di a punta fine

Riferimenti

  1. Becker, N., et al. Medical importance of mosquitoes in Mosquitoes and their control. , 2nd ed, Springer. Los Angeles, CA. 25-42 (2010).
  2. World Health Organization. Vector-borne diseases. , (2024).
  3. Woodstream Corporation, Inc. The economic cost of mosquito-borne diseases. AMosquito Magnet. , (2022).
  4. Bartlow, A. W., et al. Forecasting zoonotic infectious disease response to climate change: Mosquito vectors and a changing environment. Vet Sci. 6 (2), 40(2019).
  5. Naslund, J., et al. Emerging mosquito-borne viruses linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global status and preventive strategies. Vector Borne Zoonotic Dis. 21 (10), 731-746 (2021).
  6. Shaw, W. R., Catteruccia, F. Vector biology meets disease control: Using basic research to fight vector-borne diseases. Nat Microbiol. 4 (1), 20-34 (2019).
  7. Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Negl Trop Dis. 14 (1), e0007831(2020).
  8. Dusfour, I., et al. Management of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses: Advances and challenges. PLoS Negl Trop Dis. 13 (10), e0007615(2019).
  9. Choumet, V., et al. Visualizing non infectious and infectious Anopheles gambiae blood feedings in naïve and saliva-immunized mice. PLoS ONE. 7 (12), e50464(2012).
  10. Backus, E. A., Cervantes, F. A., Guedes, R. N. C., Li, A. Y., Wayadande, A. C. AC-DC electropenetrography for in-depth studies of feeding and oviposition behaviors. Ann Entomol Soc Am. 112 (3), 236-248 (2019).
  11. Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. Elife. 9, e56829(2020).
  12. Backus, E. A., Guedes, R. N., Reif, K. E. AC-DC electropenetrography: Fundamentals, controversies, and perspectives for arthropod pest management. Pest Manag Sci. 77 (3), 1132-1149 (2021).
  13. Gordon, R. M., Lumsden, W. H. R. A study of the behavior of the mouthparts of mosquitoes when taking up blood from living tissue; together with some observations on the ingestion of microfilariae. Ann Trop Med Parasitol. 33, 259-278 (1939).
  14. Janson, K. D., et al. Development of an automated biomaterial platform to study mosquito feeding behavior. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1103748(2023).
  15. Henriques-Santos, B. M., Xiong, C., Pietrantonio, P. V. Automated analysis of feeding behaviors of females of the mosquito Aedes aegypti using a modified flyPAD system. Sci Rep. 13, 20188(2023).
  16. Kashin, P., Wakeley, H. G. An insect 'Bitometer. Nature. 208 (5009), 462-464 (1965).
  17. Kashin, P. Electronic recording of the mosquito bite. J Insect Physiol. 12, 281-286 (1966).
  18. Kashin, P. Development of an orally effective insect repellent. IIT Research Institute. , (1967).
  19. Kashin, P., Arneson, B. E. An automated repellency assay system. II. a new electronic "Bitometer-timer.". J Econ Entomol. 62 (1), 200-205 (1969).
  20. Shieh, J. -N. Salivation and engorgement parameters of sucking insect vectors: Implications in pathogen transmission. , Oregon State University. (1994).
  21. Kimsey, R. B. Measuring and recording arthropod blood feeding. History, Development, and Applications of AC Electronic Insect Feeding Monitors. , Entomological Society of America. 122-128 (1994).
  22. Backus, E. A., Devaney, M. J., Bennett, W. H. Comparison of signal processing circuits among seven AC electronic monitoring systems for their effects on the emf and R components of aphid (Homoptera: Aphididae) waveforms. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  23. Backus, E. A., Bennett, W. H. The AC-DC correlation monitor: New EPG design with flexible input resistors to detect both R and emf components for any piercing-sucking hemipteran. J Insect Physiol. 55 (10), 869-884 (2009).
  24. Backus, E. A., Cline, A. R., Ellerseick, M. R., Serrano, M. S. Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding on cotton: New methods and parameters for analysis of nonsequential electrical penetration graph data. Annals of the Entomological Society of America. 100, 296-310 (2007).
  25. Ebert, T. A., Backus, E. A., Cid, M., Fereres, A., Rogers, M. E. A new SAS program for behavioral analysis of electrical penetration graph data. Comput Electron Agr. 116, 80-87 (2015).
  26. Wayadande, A. C., et al. Waveforms from stylet probing of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) measured by AC-DC electropenetrography. J Med Entomol. 57 (2), 353-368 (2020).
  27. Cooper, A. M. W., et al. An electropenetrography waveform library for the probing and ingestion behaviors of Culex tarsalis on human hands. Insect Sci. 31 (4), 1165-1186 (2024).
  28. Reif, K. E., Backus, E. A. AC-DC electropenetrography unmasks fine temporal details of feeding behaviors for two tick species on unsedated hosts. Sci Rep. 11 (1), 2040(2021).
  29. Vaughan, L. D., et al. Electropenetrography as a tool to quantify probing and injection behaviors of mosquitoes (Aedes aegypti) in mice under biocontainment housing. Comp Med. 73 (6), 25(2023).
  30. Backus, E. A., Shugart, H. Electropenetrography (EPG) Online Workshop. Hosted by L. Diepenbrock at the University of Florida. Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022 (2022).
  31. Dataq Instruments Inc. WinDaq recording and playback software. , (2024).
  32. Backus, E. A. Our own jabberwocky: clarifying the terminology of certain piercing-sucking behaviors of homopterans. Principles and applications of electronic monitoring and other techniques in the study of homopteran feeding. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  33. Tjallingii, W. F. Comparison of AC and DC systems for electronic monitoring of stylet penetration activities by homopterans. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America. 41-69 (2000).
  34. Mizrahi, J. Advances in Applied Electromyography. , IntechOpen. Rijeka, Croatia. (2011).

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