Dimostrazione del trasporto di membrana dell'istidina utilizzando sacche intestinali invertite di capra: uno strumento pedagogico esperienziale per studenti universitari

Sommario

Qui, riportiamo un metodo economico e riproducibile che dimostra il trasporto di membrana dell'istidina nell'intestino di una capra. Questo processo avviene attraverso il co-trasporto di istidina e ioni sodio abilitati dal gradiente di sodio attraverso la membrana degli enterociti. Questo metodo sfrutta la pedagogia dell'apprendimento esperienziale per comprendere meglio il movimento dei soluti attraverso le membrane biologiche.

Abstract

L'istidina è un aminoacido essenziale che è anche un precursore dei metaboliti implicati nel sistema immunitario, nella ventilazione polmonare e nella circolazione vascolare. L'assorbimento dell'istidina alimentare si basa in gran parte sul trasporto di aminoacidi neutri accoppiati al sodio da parte del trasportatore di aminoacidi neutri Broad (B⁰AT) presente sulla membrana apicale dell'enterocita. Qui, dimostriamo l'assorbimento dell'istidina da parte degli enterociti dei villi intestinali dal lume utilizzando le sacche invertite digiunali di capra. Le sacche digiunali esposte a concentrazioni variabili di sodio e istidina sono state analizzate per determinare la concentrazione di istidina all'interno delle sacche in funzione del tempo. I risultati mostrano un assorbimento attivo dell'istidina. L'aumento della concentrazione di sale ha comportato un maggiore assorbimento dell'istidina, suggerendo un simportone dell'assorbimento di sodio e istidina nelle sacche intestinali invertite di capra. Questo protocollo può essere applicato per visualizzare la mobilità intestinale di aminoacidi o altri metaboliti con le opportune modifiche. Proponiamo questo esperimento come strumento pedagogico esperienziale che può aiutare gli studenti universitari a comprendere il concetto di trasporto a membrana.

Introduzione

Le cellule biologiche sono circondate da un doppio strato lipidico di membrana che separa il citosol intracellulare dal contenuto extracellulare. La membrana funge da barriera semipermeabile che regola il movimento dei soluti¹. Il trasporto attraverso le membrane biologiche è influenzato dal coefficiente di permeabilità di un soluto, che dipende da diversi fattori, tra cui la concentrazione e la carica del soluto. In generale, i soluti si muovono attraverso la membrana utilizzando tre meccanismi (Figura 1): diffusione passiva, diffusione facilitata e trasporto attivo². La diffusione semplice è il processo mediante il quale soluti solubili, non caricati e non polari passano lungo il loro gradiente di concentrazione attraverso una membrana semipermeabile (Figura 1A). Le proteine di membrana non aiutano in questo processo poiché comporta il movimento dei soluti da una regione di concentrazione più alta a una regione di concentrazione più bassa. Il tasso di diffusione si basa sulla legge di Fick³. D'altra parte, la diffusione facilitata è un trasporto proteino-dipendente in cui la membrana consente solo ai soluti selettivi di passare lungo un gradiente di concentrazione senza il dispendio di energia (Figura 1B). Questo tipo di trasporto è specifico e differisce dalla semplice diffusione nell'esibire una cinetica di saturazione.

Il trasporto attivo è un trasporto proteino-dipendente di molecole rispetto al loro gradiente di concentrazione, cioè dalla regione di concentrazione più bassa a una regione di concentrazione più alta con l'uso di gradienti di ATP o ioni (Figura 1C). Quando il trasportatore idrolizza l'ATP, il trasporto è definito trasporto attivo primario (Figura 1C; pannello di sinistra). Un'altra forma di trasporto attivo è il trasporto attivo secondario (Figura 1C; pannello di destra). Nel trasporto attivo secondario, i soluti vengono spostati in base a un gradiente elettrochimico. Si verifica quando una proteina trasportatrice accoppia il movimento di uno ione (tipicamente Na⁺) lungo il suo gradiente di concentrazione con il movimento di un'altra molecola o di uno ione contro il suo gradiente di concentrazione. Questo tipo di movimento del soluto può essere un co-trasporto (Symport) in cui sia il soluto che lo ione si muovono nella stessa direzione o uno scambio (Antiport), nel qual caso il soluto e lo ione si muovono in direzioni opposte.

Gli aminoacidi alimentari e i monosaccaridi provenienti da fonti alimentari vengono assorbiti nell'intestino tenue. L'intestino tenue può essere diviso funzionalmente in tre segmenti: duodeno, digiuno e ileo (Figura 2). L'assorbimento del soluto avviene in tutto l'intestino tenue, con il massimo assorbimento che si verifica al digiuno e all'estremità prossimale dell'ileo. Gli enterociti intestinali sono cellule polarizzate e le giunzioni strette che collegano due cellule adiacenti creano due siti di membrana distinti: il sito della membrana basolaterale e quello apicale (Figura 2). L'assorbimento dei soluti luminali generati dalla digestione avviene sul sito⁴ della membrana apicale.

Il trasporto dell'istidina negli enterociti intestinali alla membrana apicale è un esempio di un simporto attivo secondario che è sodio-dipendente. All'estremità basolaterale, l'istidina che entra nell'enterocita si sposta lungo il gradiente di concentrazione nella circolazione portale epatica. Le concentrazioni intracellulari di sodio all'interno dell'enterocita sono mantenute a 12 mmoli/L¹, che è inferiore alle concentrazioni extracellulari/luminali, a causa del pompaggio attivo di sodio fuori dalla cellula da parte della Na⁺ K⁺ATPasi situata sulla membrana basolaterale (Figura 3). A livello della membrana apicale degli enterociti, l'AT B⁰e il trasportatore di amminoacidi neutri di sodio (SNAT) 5 sono i principali trasportatori che trasportano non solo l'istidina ma anche gli aminoacidi come l'asparagina e la glutammina in un cotrasporto sodio-dipendente ^5,6. Un'altra proteina di trasporto chiamata Large Amino Acid Transporter (LAT)1 presente sulla membrana basolaterale degli enterociti trasporta grandi amminoacidi neutri come leucina, triptofano, tirosina e fenilalanina attraverso la membrana⁷.

Con l'obiettivo di insegnare il concetto di trasporto a membrana integrato con tecniche come la spettrofotometria e i saggi biochimici di routine attraverso la pedagogia dell'apprendimento esperienziale, è imperativo sviluppare metodologie che possano non solo dimostrare il concetto in termini di facile comprensione, ma anche consentire l'apprendimento partecipativo per gli studenti universitari. Attualmente, ci sono risorse limitate a disposizione degli studenti per l'impegno pratico nell'apprendimento di tali concetti di biochimica. Qui, riportiamo un semplice protocollo per dimostrare il trasporto dell'istidina attraverso la membrana intestinale della capra che è facile da riprodurre nei laboratori universitari e può essere adattato per valutare il trasporto anche di altri metaboliti. Ancora più importante, il metodo utilizza materiali poco costosi in un laboratorio universitario, consentendo così l'apprendimento esperienziale anche nel più semplice dei laboratori.

Protocollo

L'intero protocollo con tutti i passaggi è rappresentato come un diagramma schematico nella Figura 4. Il metodo è adattato da uno studio precedente che utilizzava intestini di ratto⁸. L'esperimento è stato eseguito nel rispetto delle linee guida istituzionali. I campioni utilizzati in questo studio sono stati acquistati da un fornitore commerciale.

ATTENZIONE: Indossare i guanti durante questo esperimento.

1. Preparazione delle sacche di digiuno invertite

1. Pretrattare e pulire il digiuno di capra.
   1. Procurati le interiora di una capra sana appena sacrificata da un venditore autorizzato.
   2. Metti le interiora in una quantità sufficiente di soluzione salina tampone fosfato (PBS) in modo che siano completamente immerse per la pulizia.
   3. Separa l'intestino tenue dall'intestino crasso e assicurati che il tessuto connettivo esterno venga rimosso usando le forbici.
   4. Sciacquare delicatamente l'intestino tenue con 1x PBS utilizzando una siringa da 10 ml, assicurando la rimozione del materiale alimentare non digerito per ottenere una sacca cava di intestino tenue. Ripetere questo processo almeno tre volte per una pulizia efficace.
      NOTA: Evitare di usare una forza eccessiva o aghi durante il lavaggio. L'uso della forza può provocare la perforazione delle pareti intestinali e quindi danneggiare gli enterociti intestinali.
   5. Misurare l'intera lunghezza dell'intestino tenue usando un righello per ottenere le tre parti: Duodeno (1/^{4 dell'intestino} tenue) e il resto diviso uniformemente in digiuno e ileo.
   6. Procedi con l'esperimento utilizzando la parte Jejunum.
2. Prepara il digiuno invertito.
   1. Pulire la parte digiuno rimuovendo tutto il tessuto connettivo con una lama.
   2. Tagliare il digiuno in porzioni lunghe 12-15 cm, lavarlo con 1x PBS e metterlo in una capsula di Petri contenente PBS.
   3. Capovolgere le porzioni di digiuno usando una bacchetta di vetro per consentire l'esposizione della parte dei villi all'esterno.
      ATTENZIONE: Evitare l'uso di un'asta di vetro con spigoli vivi. Inoltre, il diametro dell'asta di vetro non deve essere maggiore del diametro della sacca.
      NOTA: A questo punto, è possibile visualizzare i villi al microscopio ottico (Figura 4).
   4. Sciacquare delicatamente le parti invertite del digiuno con 1x PBS.
   5. Verificare la presenza di eventuali perdite dai lati del digiuno rovesciato.
   6. Tagliare le parti invertite del digiuno in sacche lunghe 5 cm.
   7. Legare un'estremità con lo spago e ricontrollare la presenza di perdite visive all'estremità legata riempiendo le sacche con PBS.
   8. Legare l'altra estremità in modo da creare una sacca rovesciata vuota con villi sulla superficie esterna.
   9. Ricontrollare la presenza di perdite esterne picchiettando la sacca rovesciata sulla carta da filtro.
3. Equilibra le sacche invertite in 1x PBS.
   1. Procedere con l'esperimento lo stesso giorno o conservare le sacche per una notte in 1x PBS a 4 °C.

2. Configurazione sperimentale per il trasporto dell'istidina

1. Assemblare due set di tre provette da 50 mL in base alle diverse concentrazioni di cloruro di sodio, come indicato nella Tabella 1.
2. Immergere le sacche intestinali preparate nelle provette specificate per 30 minuti e 60 minuti per ciascuna delle serie.
3. Trascorso il tempo stabilito, svuotare la soluzione all'interno della sacca in una provetta da microcentrifuga separata da 1,5 ml e determinare il volume.
4. Aspirare il liquido all'interno della sacca utilizzando una siringa da 2 mL. In alternativa, slegare un'estremità del sacco e raccogliere il contenuto in una provetta fresca da 1,5 ml.
5. Analizzare 0,1 mL dei campioni raccolti per la stima dell'istidina e calcolare la concentrazione utilizzando il grafico standard.

3. Stima dell'istidina utilizzando la reazione di Pauly

1. Preparare una curva standard per l'istidina.
   1. Preparare soluzioni con concentrazioni variabili di istidina come indicato nella Tabella 2 utilizzando soluzioni madre di istidina (5 mM) e acqua.
   2. Aggiungere acido sulfanilico (0,5 mL) e nitrato di sodio (0,5 mL) a ciascuna provetta.
   3. Incubare le provette per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere 1 mL di carbonato di sodio ed etanolo a ciascuna provetta.
   4. Incubare le provette per 20 minuti a temperatura ambiente (~20 °C) e notare l'assorbanza alla lunghezza d'onda di 490 nm.
   5. Tracciare una curva standard dell'assorbanza rispetto alla concentrazione di istidina.
      NOTA: Questo test per l'istidina si basa sulla proprietà dell'istidina di formare un composto diazoico (Figura 5).

Risultati

Il flusso di lavoro sperimentale per dimostrare la mobilità intestinale dell'istidina attraverso l'assorbimento dell'istidina da parte dei villi intestinali nel lume delle sacche invertite è illustrato nella Figura 4, Tabella 1 e Tabella 2. Sono state eseguite tre configurazioni sperimentali indipendenti e i dati rappresentativi sono presentati nella Figura 6.

Nelle condizioni sperimentali date, la stima dell'istidina utilizzando la reazione di Pauly ha seguito la legge di Lambert Beer fino a 300 μM (Figura 6A). Questo test per l'istidina si basa sull'accoppiamento tra gli amminoacidi e lo ione diazonio nel reagente. Il reagente di Pauly contiene acido sulfanilico disciolto in acido cloridrico concentrato. Questo acido subisce diazotizzazione in presenza di nitrato di sodio e HCl. Il sale di diazonio p-fenildiazosolfonato reagisce con le molecole di istidina in condizioni alcaline per formare un complesso di colore rosso/arancio scuro a giallo, che può essere letto spettrofotometricamente a 490 nm (Figura 5)⁹. Si può notare che questo test è dato dall'istidina e dalla tirosina. Il test utilizzato in questo studio è una versione leggermente modificata della reazione originale in modo tale che il nitrato di sodio venga utilizzato direttamente a temperatura ambiente (~20 °C) piuttosto che utilizzare il nitrito di sodio in condizioni refrigerate⁹.

La reazione positiva di Pauly osservata con il campione recuperato dall'interno delle sacche invertite illustra l'assorbimento dell'istidina attraverso i villi intestinali. La Figura 6B mostra una correlazione tra l'assorbimento dell'istidina e le concentrazioni di sodio negli enterociti digiunali. Un aumento dell'assorbimento dell'istidina all'aumentare del tempo di incubazione da 30 a 60 minuti è indicativo di un trasporto attivo secondario.

Figura 1: Diversi tipi di trasporto a membrana. Schema che mostra i vari tipi di sistemi di trasporto a membrana. (A) Diffusione passiva. (B) Diffusione facilitata. (C) Trasporto attivo primario (a sinistra) e trasporto attivo secondario (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Organizzazione degli enterociti nei villi intestinali. Questa figura si concentra sull'intestino tenue e illustra le tre parti distinte, ovvero Duodeno, Digiuno e Ileo. L'intestino tenue ha inoltre alcune sporgenze simili a dita chiamate villi, che aumentano la superficie per l'assorbimento del cibo ingerito. I microvilli hanno cellule chiamate enterociti che contengono i trasportatori specifici per l'assorbimento degli aminoacidi. Le giunzioni strette impediscono il movimento dei soluti tra le cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Un enterocita con trasportatori di aminoacidi. Il cartone rappresenta un enterocita che mostra le estremità apicale e basolaterale. L'estremità apicale ha trasportatori come le proteine B⁰AT e SNAT5, e la membrana basolaterale contiene il trasportatore LAT1. Insieme, queste proteine sono responsabili dell'assorbimento dell'istidina dal lume intestinale alla circolazione portale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Rappresentazione schematica del protocollo che dimostra il trasporto di membrana dell'istidina utilizzando le sacche invertite dell'intestino di capra. Gli intestini di capra sono stati procurati, pretrattati e puliti come descritto. In breve, il digiuno è stato asportato e sono state preparate le sacche rovesciate. Queste sacche sono state utilizzate per impostare l'esperimento per quantificare l'assorbimento di istidina in varie concentrazioni di sale. I villi sono stati osservati con un ingrandimento di 400x utilizzando un microscopio ottico. La procedura dettagliata è fornita nel testo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Reazione per il metodo di Pauly. Il test di Pauly prevede la formazione di ioni diazonio in un reagente contenente acido sulfanilico in acido cloridrico concentrato. In condizioni alcaline, l'istidina reagisce con il sale di diazonio, determinando la formazione di un composto di colore rosso la cui assorbanza può essere misurata a 490 nm utilizzando uno spettrofotometro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Stima dell'istidina con il metodo di Pauly. (A) Curva standard per l'istidina. Concentrazioni variabili di istidina comprese tra 0 e 300 μM sono state sottoposte alla reazione di Pauly e il complesso formato è stato misurato alla lunghezza d'onda di 490 nm. (B) Il trasporto dell'istidina nelle sacche intestinali è stato seguito per 30 minuti e 60 minuti in presenza di 150 mM (nero solido) e 200 mM di soluzione salina di NaCl (grigio solido). La concentrazione di istidina all'interno delle sacche invertite è stata stimata utilizzando la curva standard (Figura 6A). I valori sono riportati rispetto al controllo (0 mM NaCl). Sono state eseguite tre repliche tecniche e sono stati presentati dati rappresentativi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Configurazione sperimentale per la mobilità intestinale dell'istidina. Questa tabella mostra l'incubazione delle sacche intestinali in diverse concentrazioni di cloruro di sodio in due punti temporali. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Preparazione della curva standard per l'istidina. Questa tabella mostra le diverse fasi e componenti della reazione di Pauly con concentrazioni note di istidina comprese tra 0 e 300 μM. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Il trasporto a membrana è uno dei concetti fondamentali insegnati agli studenti universitari di tutte le principali discipline delle scienze biologiche, di base o applicate. Tradizionalmente, il movimento attraverso le membrane è stato visualizzato utilizzando metaboliti marcati con isotopi radioattivi. Tuttavia, questi metodi sono estremamente pericolosi e non fattibili per l'insegnamento o l'apprendimento. Sebbene l'apprendimento esperienziale sia la migliore tecnica pedagogica per comprendere concetti così complessi, è una sfida che è ulteriormente aggravata dalla mancanza di infrastrutture, dai costosi coloranti/metaboliti a base di fluorescenza e, soprattutto, dal divieto di esperimenti di dissezione animale. Pertanto, è necessario sviluppare strumenti e metodi alternativi che non siano solo sicuri, ma anche economici e fattibili in un ambiente di laboratorio universitario. Qui, è stato sviluppato un nuovo metodo per l'insegnamento del trasporto a membrana per gli studenti universitari. Il protocollo riportato, un adattamento di Agar et al. 1954⁸, dimostra il trasporto attivo unidirezionale di membrana dell'istidina attraverso le cellule intestinali di capra. Questo studio è stato intrapreso per dimostrare l'uso di un test basato sulla colorimetria per visualizzare l'assorbimento dell'istidina attraverso le membrane intestinali. È semplice, riproducibile e comprensibile per gli studenti e può essere svolto in qualsiasi ambiente di laboratorio.

Il modello del sacco intestinale invertito è stato sviluppato per la prima volta da Wilson e Wiseman¹⁰, che è stato successivamente migliorato per aumentare la vitalità dei tessuti. I meccanismi e la cinetica dell'assorbimento dei farmaci sono stati chiariti utilizzando le sacche intestinali invertite¹¹. I vantaggi di questo modello includono un'ampia area per l'assorbimento; Tuttavia, la vitalità dei tessuti è uno dei parametri limitanti. È stato riportato che il tessuto intestinale rimane vitale e metabolicamente attivo in condizioni fisiologiche per ~2 ore^{e 11}. Un altro potenziale avvertimento di questo approccio che deve essere preso in considerazione è l'incapacità di rimuovere la mucosa muscolare e la sierosa dai preparati a sacco invertito. Il legame di alcuni composti allo strato muscolare può limitare o sottostimare il trasporto di questi composti. Sebbene il modello del sacco intestinale invertito sia sensibile che specifico, una varietà di fattori potrebbe influire sui risultati. Alcuni di questi fattori includono l'età, il sesso, la specie, la dieta e lo stato di malattia dell'animale, nonché il segmento dell'intestino utilizzato per l'analisi (ileo, digiuno, duodeno e colon). Anche fattori ambientali come il pH, l'aerazione e la temperatura influenzerebbero i risultati¹².

È stato dimostrato che il ritardo nel prelievo dell'intestino e dello stato animale (vivo/morto) influisce sul trasporto attivo nei segmenti duodenali dell'intestino di ratto. La raccolta da animali anestetizzati garantisce un ritardo minimo, evitando il deterioramento del trasportatore¹³. Tuttavia, alla luce del divieto di dissezione animale nelle università, nella nostra configurazione sperimentale sono stati utilizzati intestini di animali appena sacrificati. Sebbene questo protocollo possa essere utilizzato con successo per stabilire un assorbimento qualitativo di un metabolita attraverso gli enterociti, il suo utilizzo in studi che coinvolgono la cinetica di trasporto di membrana è limitante. La fase più critica di questo protocollo è la preparazione di sacche intestinali invertite a prova di perdite con enterociti vitali. La natura delicata e la vitalità dei villi e degli enterociti rappresentano una sfida, che può essere superata con la pratica. Inoltre, dato che il materiale di partenza non proviene da alcuna popolazione animale consanguinea e singenica, la variabilità dei risultati tra gli esperimenti è uno svantaggio significativo. Questo può essere superato con l'uso di più repliche dello stesso animale. Tenendo presenti queste considerazioni, il metodo presentato in questo studio deve essere rigorosamente utilizzato come strumento pedagogico nella formazione pratica universitaria.

Il protocollo delineato è stato utilizzato con successo per dimostrare il trasporto dell'istidina. L'assorbimento unidirezionale sia del sodio che dell'istidina nelle sacche invertite indica un tipo di trasporto attivo secondario simport. L'assorbimento intestinale degli amminoacidi neutri segue una cinetica vettoriale che dipende dal gradiente di concentrazione impostato dalla Na+ K+ ATPasi. Una configurazione simile mantiene un potenziale di membrana negativo intracellulare e una concentrazione di sodio extracellulare di 150 mM. Entrambi guidano il trasporto attivo di amminoacidi neutri da parte di B⁰AT all'estremità apicale e il successivo movimento fuori dall'enterocita all'estremità basolaterale da parte di LAT1. È interessante notare che, a concentrazioni di sale più elevate (200 mM), non c'era alcuna differenza significativa nell'assorbimento in funzione del tempo. A questo punto, non possiamo commentare il motivo di tale osservazione; tuttavia, la stessa configurazione sperimentale può essere ampliata per includere più concentrazioni di sodio con punti temporali variabili e controlli con 150 mM di cloruro di colina per mostrare il trasporto sodio-dipendente e il possibile contributo dovuto alla saturazione.

In linea di principio, le sacche di digiuno rovesciate di capra/maiale/ratto/topo possono essere utilizzate per dimostrare l'assorbimento intestinale di una varietà di metaboliti alimentari, a condizione che vi sia un test biochimico per la stima. Inoltre, è possibile analizzare l'effetto di altri componenti che potrebbero potenzialmente interferire con l'assorbimento intestinale o gli inibitori del trasporto di membrana. Le sacche invertite sono state utilizzate in modo efficiente come strumento nella ricerca farmaceutica per studiare l'assorbimento dei farmaci in vitro , il metabolismo intestinale dei farmaci e il ruolo del trasportatore nell'assorbimento dei farmaci. Infine, questa tecnica è un esempio di dimostrazione ex vivo del trasporto di membrana e non si basa su un estratto privo di cellule (in vitro) ma su un campione di tessuto. Tuttavia, questo vantaggio è compensato dalla disponibilità di intestini di capra/suino/ratto non infetti, che possono essere un fattore limitante.

Tra i molti strumenti pedagogici a disposizione di un insegnante per migliorare il processo di apprendimento, l'apprendimento esperienziale o "learning by doing" è una filosofia e una metodologia di insegnamento che è il metodo di istruzione più progressivo ed efficace che offre agli studenti l'opportunità di ottenere una comprensione olistica degli argomenti delle lezioni. L'apprendimento esperienziale garantisce il coinvolgimento pratico degli studenti e dell'istruttore, che fornisce supporto e tutoraggio durante questo processo di apprendimento attivo¹⁴. Serve come un'eccellente alternativa all'istruzione teorica tradizionale in classe, in particolare in alcuni concetti pesanti e integrativi come il trasporto a membrana che gli studenti spesso trovano difficile da immaginare. Tali esercizi incoraggerebbero anche l'apprendimento interattivo e collaborativo sia da parte dei pari che dei mentori. La presente iniziativa è un passo avanti nella direzione di creare e consentire un'esperienza di apprendimento che non sia solo informativa ma anche memorabile e possa essere trasformativa per uno studente, con un impatto significativo sull'esperienza di apprendimento complessiva.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
microcentrifuga da 1,5 mL	TARSONS	500020
Provette da 10 mL	BOROSIL	9800U04
Provette Falcon sterili da 50 mL	TARSONS	546041
Becher da 500 mL	BOROSIL	10044977
Pallone conico da 500 mL	BOROSIL	691467
D-Glucose	SRL	42738
Spettrofotometro digitale	SYSTRONICS	2710
Etanolo	EMSURE	1009831000
Pipette a pinna	THERMOFISHER 4642090
Agitatore in vetro	BOROSIL	9850107
L-Istidina	SRL	17849
NaCl	SRL	41721
Guanti in nitrile	KIMTECH	112-4847
Piastra di Petri	TARSONS	460090
Soluzione salina tamponata con fosfato (ph 7.4)	SRL	95131
Puntali per pipette	ABDOS	P10102
Carbonato di sodio	SRL	89382
Nitrato di sodio	SRL	44618
Fosfato di sodio bibasico (anidro)	SRL	53046
Fosfato di sodio monobasico (anidro)	SRL	22249
Acido sulfanilico	SRL	15354