Studiare il movimento ortodontico dei denti nei topi

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per lo studio del movimento ortodontico dei denti (OTM), che funge da modello adatto per studiare i meccanismi di adattamento osseo, riassorbimento radicolare e risposta delle cellule ossee agli stimoli meccanici. Questa guida completa fornisce informazioni dettagliate sul modello OTM, sull'acquisizione della microtomografia computerizzata e sulla successiva analisi.

Abstract

Il movimento ortodontico dei denti (OTM) rappresenta un processo dinamico in cui l'osso alveolare subisce un riassorbimento nei siti di compressione e una deposizione nei siti di tensione, orchestrati rispettivamente da osteoclasti e osteoblasti. Questo meccanismo funge da modello prezioso per lo studio di vari aspetti dell'adattamento osseo, tra cui il riassorbimento radicolare e la risposta cellulare agli stimoli della forza meccanica. Il protocollo qui descritto offre un approccio diretto per studiare l'OTM, stabilendo 0,35 N come forza ottimale in un modello murino che impiega una molla elicoidale in nichel-titanio (NiTi). Utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata, abbiamo quantificato l'OTM valutando la discrepanza nella distanza lineare alla giunzione cemento-smalto. La valutazione ha incluso anche un'analisi del riassorbimento radicolare infiammatorio indotto dall'ortodonzia, valutando parametri come la densità minerale radicolare e la percentuale di volume radicolare per volume totale. Questo protocollo completo contribuisce a far progredire la nostra comprensione dei processi di rimodellamento osseo e a migliorare la capacità di sviluppare strategie di trattamento ortodontico efficaci.

Introduzione

Il rimodellamento osseo è un processo continuo orchestrato da osteoclasti, osteoblasti, cellule di rivestimento osseo e osteociti, essenziale per mantenere l'integrità dello scheletro adulto ^1,2. Guidato principalmente dalla differenziazione e dall'attività di osteoclasti e osteoblasti, questo processo dinamico comporta il riassorbimento e la deposizione dell'osso, innescato da stress meccanico e carico ^3,4,5.

Gli esperimenti sugli animali svolgono un ruolo fondamentale nel chiarire gli intricati meccanismi biologici e cellulari alla base del movimento ortodontico dei denti (OTM)^6,7. Questo processo coinvolge una vasta gamma di tipi di cellule, come osteoblasti, osteoclasti, osteociti, fibroblasti e cellule immunitarie come macrofagi e cellule T, situate all'interno dell'osso mascellare e del legamento parodontale ^7,8. Queste cellule rispondono dinamicamente agli stimoli meccanici e ai cambiamenti nell'ambiente locale, influenzando la composizione e l'architettura dell'osso circostante ^7,8. Inoltre, innescano anche una risposta infiammatoria a livello cellulare, anche se non sono presenti agenti patogeni. Questa risposta infiammatoria svolge un ruolo nell'aumentare il turnover del tessuto osseo⁹.

Vari modelli animali, tra cui topi, ratti, conigli, cani e scimmie, sono stati utilizzati negli studi sperimentali di OTM ^7,8,10. Tra questi, i roditori, in particolare i topi, sono favoriti per studiare le fasi iniziali del movimento dei denti e del rimodellamento osseo⁶. Ricerche precedenti hanno sottolineato i vantaggi dell'utilizzo di modelli murini rispetto ai modelli di ratto, principalmente a causa dell'ampia disponibilità di ceppi geneticamente modificati, che consentono un'esplorazione dettagliata delle influenze genetiche in OTM ^7,11. Attualmente, due modelli principali sono impiegati per indurre il movimento dei denti nei topi. Il primo metodo prevede l'inserimento di una molla elicoidale in nichel-titanio (NiTi) tra il primo molare superiore e gli incisivi superiori ^4,12. Il secondo approccio prevede il posizionamento di una fascia elastica all'interno dello spazio interdentale tra il primo e il secondo molare superiore¹³. Gli esiti primari analizzati includono tipicamente l'entità del movimento dei denti e la microarchitettura ossea, preferibilmente valutati utilizzando la micro-tomografia computerizzata (micro-CT)¹⁴. Idealmente, valutare l'integrità delle radici dentali è importante per garantire che vengano impiegate forze adeguate per produrre OT^M4.

Sebbene la micro-CT sia ampiamente riconosciuta come il gold standard per la valutazione della microarchitettura dei tessuti mineralizzati¹⁴, l'assenza di metodologie e protocolli standardizzati per la scansione, l'analisi e la refertazione dei dati presenta spesso sfide nel discernere le procedure precise impiegate, nell'interpretare i risultati e nel facilitare il confronto tra diversi modelli OTM ^14,15.

Qui presentiamo una guida passo passo al modello murino OTM, che include l'acquisizione e l'analisi micro-CT di OTM, microstruttura ossea e radici dentali. Questo metodo comporta l'applicazione di una forza meccanica controllata al primo molare per indurre il movimento all'interno dell'osso mascellare. La scelta di questo metodo deriva da diversi fattori, tra cui la fattibilità, la pertinenza e la precisione. Tale approccio consente un'analisi quantitativa dettagliata, fornendo preziose informazioni sui processi biologici alla base del movimento ortodontico dei denti e facilitando lo sviluppo di migliori strategie di trattamento ortodontico in futuro.

Protocollo

Tutte le procedure hanno rispettato rigorosamente gli standard etici stabiliti dal Comitato Etico dell'Universidade Federal de Minas Gerais (n. 166/2022). Prima di ogni esperimento, è obbligatorio un calcolo della dimensione del campione. Utilizzare topi maschi di tipo selvatico C57BL6/J di 8-10 settimane del peso di circa 20-30 g. I topi devono essere alloggiati in una gabbia all'interno di una stanza mantenuta a 25 °C, rispettando un ciclo di 12 ore luce/12 ore buio. Dopo l'attacco della bobina, l'animale deve essere nutrito con una dieta morbida. Il monitoraggio quotidiano dovrebbe includere valutazioni del peso corporeo e della salute generale.

1. Rimodellamento osseo alveolare indotto meccanicamente

1. Utilizzando una pinza a taglio distale, tagliare la molla a spirale aperta NiTi da 0,25 x 0,76 pollici alle seguenti dimensioni di sei anelli e due estremità a forma di anello posizionate perpendicolarmente alla molla utilizzando pinze ortodontiche Weingart.
2. Modellare il filo rotondo di cromo-nichel (CrNi) da 0,20 mm di diametro nella configurazione desiderata con estremità a forma di anello utilizzando una pinzetta Mathieu e uno strumento di forma rotonda come riferimento dimensionale.
3. Unisci le estremità a forma di anello della bobina e il filo CrNi rotondo da 0,20 mm.
4. Anestetizzare l'animale con un'iniezione intraperitoneale di 0,2 mL di soluzione contenente xilazina (10 mg/Kg) e ketamina (100 mg/Kg). Prima di iniziare la procedura, valutare la profondità dell'anestesia utilizzando il riflesso del pedale. Pizzica con cura una delle dita dell'animale usando una pinzetta. L'assenza di un riflesso indica un adeguato piano di anestesia generale. Per evitare lesioni corneali e dolore post-operatorio, applicare un lubrificante oculare dopo che l'animale è stato anestetizzato.
5. Posizionare l'animale in decubito dorsale su un tavolo chirurgico, immobilizzando gli arti per limitare il movimento e consentire l'accesso intraorale.
6. Utilizza un apribocca, realizzato con un filo di 0,50 mm di diametro e fissato con un filo da 0,08 mm, per facilitare la visualizzazione completa impedendo il movimento della testa. Utilizzare il lato destro come lato sperimentale (lato OTM) e il lato sinistro come controllo senza bobina ortodontica (lato Control).
   NOTA: La visualizzazione avanzata delle strutture intraorali deve essere ottenuta utilizzando uno stereomicroscopio e un sistema di luce ottica.
7. Pulire e mordenzare le superfici del primo molare e dell'incisivo destro utilizzando rispettivamente acetone e un primer automordenzante. Il sistema è automordenzante, il che significa che non richiede un precedente condizionamento acido.
   1. Applicare il primer in un unico passaggio, che funziona anche contemporaneamente come acido e adesivo. Utilizzando un micropennello, prelevare una piccola quantità di primer automordenzante e applicarlo sulla superficie occlusale del primo molare superiore e degli incisivi. In questa fase è necessario prestare attenzione per garantire che il primer automordenzante non raggiunga la superficie prossimale tra il primo e il secondo molare, poiché ciò potrebbe causare l'adesione degli elementi dentali, impedendo il movimento dei denti. Fotopolimerizzare il primer sulla superficie occlusale dei molari e degli incisivi per 30 s.
8. Incollare l'estremità distale di una molla a spirale aperta in NiTi a sei anelli alla superficie occlusale del primo molare mascellare destro con resina fotopolimerizzabile e fotopolimerizzare per 30 s. Aggiungere un ulteriore incremento di resina sul bordo del filo per evitare danni ai topi e fotopolimerizzare per 30 s.
9. Attivare la bobina utilizzando un apparecchio appositamente progettato costituito da un binario e un meccanismo a manovella fissati al tavolo operatorio. Ciò consente al movimento longitudinale di scorrere avanti e indietro.
10. Collegare l'estremità libera a forma di anello del filo rotondo da 0,20 mm al gancio del misuratore di tensione.
11. All'attivazione della manovella, spostare il tavolo operatorio lungo la guida fino a quando il dinamometro registra una forza di 0,35 N.
12. Incollare il filo tondo da 0,20 mm a entrambi gli incisivi superiori per ancorare la bobina. Durante il periodo sperimentale non viene eseguita alcuna ulteriore riattivazione. Tagliare il filo per staccare l'animale dal dinamometro.  Aggiungi un altro incremento di resina in modo che il bordo metallico del dispositivo non sia esposto e non danneggi l'animale. Fotopolimerizzare per 30 s. Smonta l'animale dal tavolo.
13. Il primo molare superiore destro con un dispositivo che impone una forza di 0,35 N in direzione mesiale è costituito dal lato sperimentale. Utilizzare il lato sinistro della mascella (senza apparecchio ortodontico) come controllo ^4,16.
14. Mantenere questo dispositivo per un periodo di 12 giorni senza che sia necessaria alcuna attivazione. Non utilizzare alcun farmaco per il controllo del dolore. Il movimento ortodontico avviene attraverso un processo infiammatorio e i farmaci antidolorifici possono influenzare negativamente la cascata dell'acido arachidonico, influenzando il tasso di rimodellamento osseo e potenzialmente invalidando i risultati.
15. Dopo la fine dell'intervento, trattare gli animali con un'iniezione sottocutanea di soluzione salina per evitare la disidratazione durante il periodo di adattamento con il dispositivo. Tenere l'animale in una gabbia individuale con riscaldamento fino a quando non si sarà completamente ripreso e solo dopo questo periodo posizionare l'animale in gabbie collettive.
16. Eutanasia del topo il 12^° giorno eseguita mediante sedazione con iniezione intraperitoneale di una soluzione da 0,2 mL contenente xilazina (10 mg/Kg) e ketamina (100 mg/Kg) seguita da decapitazione con forbici affilate.

2. Misure Micro-CT

1. Prelevare l'osso mascellare con forbici affilate tagliando tutti i tessuti molli, l'osso zigomatico sul piano sagittale, la sutura frontonasale e la sincondrosi sfeno-occipitale sul piano coronale. Immergere l'osso mascellare in formalina tamponata neutra al 10% (pH=7,4) per un periodo di fissazione di 48 ore. Trascorso questo periodo, cambiare la soluzione di formaldeide al 70% di alcol.
2. Eseguire la scansione micro-CT dell'osso mascellare con i seguenti parametri per le scansioni ad alta risoluzione: dimensione isotropa del voxel da 9 a 18 μm, impostazioni dei raggi X di 50 kV, filtro in alluminio da 0,5 mm e angolo di rotazione di 0,5°. Durante la scansione microCT è possibile inserire più di una ganascia.
3. Ricostruire le immagini acquisite utilizzando il programma di ricostruzione microtomografica indicato dal produttore della microtomografia computerizzata (microCT) utilizzata¹⁷.
4. Posizionare le immagini ricostruite utilizzando il programma di Ispezione 3D indicato dal produttore della microtomografia utilizzata.
5. Quantificare l'OTM misurando la differenza di distanza lineare tra la giunzione cemento-smalto (CEJ) del primo e del secondo molare dell'emimascella destra (lato OTM) rispetto all'emimascella sinistra (lato di controllo). Utilizzare il software dell'analizzatore microCT appropriato con lo strumento di linea per questa misurazione 17,18,19,20.
6. Controllare i campioni per la presenza di riassorbimento radicolare infiammatorio indotto dall'ortodonzia (OIIRR). Selezionare la regione di interesse (ROI) della radice disto-vestibolare del primo molare mascellare utilizzando un metodo di contorno della regione di interesse irregolare e anatomica disegnata manualmente. Misurare i seguenti parametri: densità minerale radicale (RMD; g/cm³) e percentuale del volume radicale per volume totale (RV/TV; %). Utilizzare il software dell'analizzatore microCT appropriato con lo strumento volumetrico 3D per questa misurazione ^16,21.
7. Condurre la ricostruzione del primo molare mascellare utilizzando il software Mimics e analizzare i dati ottenuti per trarre conclusioni su OTM e OIIRR nel modello sperimentale^16,21.

Risultati

Questo protocollo consente lo studio di un modello murino OTM utilizzando una molla elicoidale in NiTi. Con una forza di 0,35 N applicata, la distanza CEJ media sul lato di controllo tra il primo e il secondo molare era di 243,69 μm (Figura 1A, linea A), mentre sul lato OTM è stata misurata a 284,66 μm (Figura 1A, linea B). La differenza tra l'OTM e il lato di controllo era di 40,97 μm (Figura 1B). La distanza lineare tra la CEJ tra il primo e il secondo molare dell'emimascella destra (lato OTM) e l'emimascella sinistra (lato di controllo) è stata misurata in almeno sei sezioni diverse con lo strumento di linea utilizzando l'apposito software di analisi microCT. Il valore medio delle sei misurazioni del lato OTM è stato sottratto dal valore medio del lato di controllo per generare il risultato OTM (Figura 1).

Per quanto riguarda l'OIIRR, i valori di RV/TV dentale e RMD sono stati dimostrati sia sul lato di controllo (71,02 ± 10,11% e 1,071 ± 0,1536 g/cm², rispettivamente) che sul lato OTM (73,38 ± 6,162% e 1,048 ± 0,2119 g/cm² μm, rispettivamente; Figura 2).

Figura 1: Movimento ortodontico dei denti (OTM). (A) Immagine rappresentativa dei lati di controllo e OTM. (B) Risultati della distanza CEJ dei lati di controllo e OTM e la differenza tra la distanza risultante nella distanza OTM. Una forza di 0,35 N è stata applicata nella direzione mesiale del primo molare superiore destro utilizzando una molla elicoidale in NiTi e il punto finale dello studio era il 12° giorno. Media ± deviazione standard dei risultati OTM generati da 10 topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagine rappresentativa della regione di interesse (ROI) selezionata. Viene mostrata la ROI della radice disto-vestibolare del primo molare mascellare, che è stata selezionata utilizzando una regione di interesse anatomica irregolare disegnata utilizzando il metodo del contorno manuale per analizzare la densità minerale della radice (RMD; g/cm³) e la percentuale del volume della radice per volume totale (RV/TV; %). I risultati della deviazione media ± standard sono stati generati da 10 topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui, descriviamo un protocollo standardizzato progettato per chiarire i meccanismi cellulari e molecolari alla base del rimodellamento osseo durante l'OTM. Una comprensione approfondita di questi meccanismi nei topi richiede un protocollo meticolosamente pianificato per garantire accuratezza e affidabilità ^7,11. Gli studi condotti dal nostro gruppo di ricerca hanno dimostrato che questo protocollo riduce efficacemente la variabilità dell'operatore incorporando un tensiometro e un apparato appositamente progettato, stabilendo 0,35 N come forza ottimale per l'OTM in un modello murino 4,16,17,18,19,20 . Per migliorare l'efficacia delle procedure sperimentali e massimizzare l'uso di campioni animali, i campioni utilizzati per l'analisi micro-CT possono anche essere sottoposti a trattamento per l'istologia di routine. Successivamente, l'OTM può essere valutato in sezioni di 5 μm, utilizzando la CEJ come punto di riferimento per le misure^16,19. La colorazione con ematossilina ed eosina, insieme a tecniche specializzate come la fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP) e la tricromina di Masson, fungono anche da metodi efficaci per valutare l'integrità delle radici e quantificare osteociti, osteoclasti e osteoblasti all'interno delle regioni di interesse ^4,5,16.

Le alterazioni dinamiche nella microstruttura dell'osso alveolare durante l'OTM nei roditori sono state studiate utilizzando sistemi di micro-CT. Queste valutazioni mirano a offrire preziose informazioni per il trattamento clinico ortodontico^14,15. La Micro-CT è una tecnica analitica in grado di catturare strutture interne con alta risoluzione e precisione a livello di micron. Questo metodo consente la ricostruzione di campioni su piccola scala in immagini 3D dettagliate, consentendo un'accurata analisi qualitativa e quantitativa dei campioni²². Coerentemente con studi precedenti, l'OTM è stato valutato quantificando la discrepanza lineare tra la CEJ del primo e del secondo molare dell'emi-mascella destra rispetto all'emi-mascella sinistra 17,18,19,20. Nell'ambito dell'imaging dentale, la micro-TC presenta diversi vantaggi. È in grado di identificare piccoli difetti sulle superfici radicolari, misurare con precisione i cambiamenti dentali lineari e valutare la morfologia dell'osso trabecolare e corticale^22,23. È interessante notare che l'attuale linea guida per la valutazione della microstruttura ossea nei roditori mediante micro-CT enfatizza l'insieme minimo di variabili raccomandate per descrivere la morfometria ossea trabecolare e corticale²³. Inoltre, è fondamentale analizzare l'insorgenza di OIIRR, una grave complicanza durante il trattamento ortodontico^16,21. I ricercatori dovrebbero valutare l'intensità del riassorbimento radicolare, poiché la presenza di OIIRR indica che la forza applicata può essere eccessiva, richiedendo aggiustamenti^16,21.

Attenersi alle fasi critiche della ricerca OTM su modelli animali è essenziale per ottenere risultati affidabili. Ciò include un'attenta selezione degli animali, considerando fattori come il ceppo, l'età, il metabolismo osseo, il tasso di crescita e il background genetico. La scelta di modelli animali influenza in modo significativo i risultati dello studio, poiché le variazioni di questi fattori influenzano la fisiologia ossea e la risposta alle forze ortodontiche⁶. Anche la tempistica dell'eutanasia degli animali è fondamentale perché cattura fasi specifiche del rimodellamento osseo in risposta alle forze ortodontiche. Ad esempio, Taddei et ^al.4 hanno condotto analisi molecolari a 0, 12 e 72 ore, con analisi istopatologiche a 6 giorni, consentendo la valutazione dei cambiamenti temporali nei marcatori di rimodellamento osseo durante l'OTM. Inoltre, sono state studiate le variazioni legate all'età nell'OTM, facendo luce su come l'invecchiamento influisce sui processi di rimodellamento osseo²³.

L'uso di una molla elicoidale in NiTi, sebbene efficace nell'indurre il movimento dei denti, presenta alcuni inconvenienti che possono influire sul benessere degli animali e sui risultati sperimentali. Si noti che l'inserimento di una molla elicoidale in NiTi richiede più tempo e tecnicamente impegnativo rispetto a metodi alternativi, come l'utilizzo di elastici⁷. Questa maggiore complessità può portare a un rischio più elevato di lesioni durante l'inserimento, che a sua volta può comportare effetti avversi come una maggiore perdita di peso corporeo dopo la procedura e un elevato tasso di mortalità tra gli animali⁷. Nella nostra esperienza, il monitoraggio quotidiano degli animali e l'attuazione di misure di supporto, come l'alimentazione ammorbidita, si sono dimostrati determinanti per ridurre al minimo gli effetti avversi associati all'uso di molle elicoidali in NiTi per OTM nei modelli animali. Queste misure non solo contribuiscono al benessere degli animali, ma migliorano anche l'affidabilità e la validità dei risultati sperimentali riducendo i fattori confondenti e garantendo la coerenza dei protocolli di ricerca 4,16,17,18,19,20.

L'impiego dell'OTM nei topi, combinato con l'analisi micro-CT, offre un modello adatto per sondare i meccanismi di adattamento osseo, riassorbimento delle radici e risposte cellulari agli stimoli della forza meccanica. Questo approccio integrato fornisce preziose informazioni sugli intricati processi alla base del trattamento ortodontico e facilita lo sviluppo di nuove strategie e interventi terapeutici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1
Pinza a taglio distale	Quinelato	QO.700.00
Dinamometro	SHIMPO	FGE-5XY
Illuminatore a fibre ottiche	Cole-Parmer	N/A
ketamina	Syntec	100477-72-3
NiTi molla a spirale aperta 0,25 x 0,76	Lancer Ortodonzia
Ø 0,20 mm tondo cromo-nichel (CrNi)	Morelli	55.01.208
Filo ortodontico elastico duro rotondo CrNi Ø 0.50 mm (.020 poll.)	Morelli	55.01.050
Filo per Fascette Rotonde CrNi & Oslash; 0.20 mm (.008 pollici)	Morelli	55.01.208
Stereomicroscopio	Quimis	Q7740SZ
Transbond Plus Primer automordenzante	3M	LE-Q100-1004-7
Pinza Weingart	Quinelato	QO.120.00
Xilazina	Syntec	23076-35-9
MicroCT Analisi
Skyscan 1174v2	Bruker	1174v2
Software
NRecon	Skyscan	N/A DataViewer
	Skyscan	N/A
CTAn	Skyscan	N/A
Mimics	Materialise	N/A