Articolo metodologico

Quantificazione del livello di 8-oxo-dG utilizzando il test ELISA per valutare il danno ossidativo al DNA nelle cellule MCF-7

DOI:

10.3791/66888

⸱

24 maggio 2024

 ,  ,  , 
1Suzhou Key Laboratory of Medical Biotechnology, Suzhou Vocational Health College, 2Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 3Department of Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People’s Hospital of Suzhou City

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per rilevare quantitativamente il danno ossidativo del DNA nelle cellule MCF-7 mediante tecnologia ELISA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La base 8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxo-dG) è la forma predominante di danno ossidativo del DNA comunemente osservato. La compromissione del DNA ha un profondo impatto sull'espressione genica e funge da fattore fondamentale nella stimolazione dei disturbi neurodegenerativi, del cancro e dell'invecchiamento. Pertanto, la quantificazione precisa dell'8-oxoG ha un significato clinico nello studio delle metodologie di rilevamento del danno al DNA. Tuttavia, al momento, gli approcci esistenti per il rilevamento dell'8-oxoG pongono sfide in termini di praticità, convenienza, convenienza e maggiore sensibilità. Abbiamo impiegato la tecnica ELISA (Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), un metodo colorimetrico altamente efficiente e rapido, per rilevare variazioni nel contenuto di 8-oxo-dG in campioni di cellule MCF-7 stimolati con diverse concentrazioni di perossido di idrogeno (H2O2). Abbiamo determinato la concentrazione di H2O2 che induce il danno ossidativo nelle cellule MCF-7 rilevando il suo valore IC50 nelle cellule MCF-7. Successivamente, abbiamo trattato le cellule MCF-7 con 0, 0,25 e 0,75 mM H2O2 per 12 ore e abbiamo estratto 8-oxo-dG dalle cellule. Infine, i campioni sono stati sottoposti a ELISA. Seguendo una serie di passaggi, tra cui la diffusione della piastra, il lavaggio, l'incubazione, lo sviluppo del colore, la terminazione della reazione e la raccolta dei dati, abbiamo rilevato con successo i cambiamenti nel contenuto di 8-oxo-dG nelle cellule MCF-7 indotte da H2O2. Attraverso tali sforzi, miriamo a stabilire un metodo per valutare il grado di danno ossidativo del DNA all'interno dei campioni cellulari e, così facendo, a far progredire lo sviluppo di approcci più convenienti e convenienti per il rilevamento del danno al DNA. Questo sforzo è pronto a dare un contributo significativo all'esplorazione delle analisi associative tra il danno ossidativo del DNA e vari domini, tra cui la ricerca clinica sulle malattie e l'individuazione di sostanze tossiche.

Introduzione

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Il danno ossidativo del DNA è una conseguenza di uno squilibrio tra la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il sistema di difesa antiossidante cellulare1. Coinvolge principalmente l'ossidazione delle basi di DNA, purina e pirimidina 2,3. Questa modificazione ossidativa delle basi del DNA non solo compromette l'integrità del genoma, ma comprende anche un'ampia gamma di problemi patologici, tra cui cancro, malattie neurodegenerative e malattie cardiovascolari 4,5. La base guanina nel DNA ha il più basso potenziale di riduzione ed è la più suscettibile all'ossidazione6. Pertanto, l'8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxo-dG) funge da marcatore primario per valutare l'entità del danno ossidativo del DNA 7,8. La quantificazione accurata dell'8-oxo-dG è diventata una questione critica nell'affrontare vari aspetti dell'insorgenza della malattia, della progressione e della valutazione del carico ossidativo multifattoriale9.

I metodi tradizionali per la rilevazione dell'8-oxo-dG, come la cromatografia liquida ad alte prestazioni con rivelazione elettrochimica (HPLC-ECD), la spettrometria di massa e le relative tecniche di sillabazione, mostrano un'elevata sensibilità e specificità 10,11,12. Tuttavia, queste tecniche hanno spesso requisiti operativi complessi e costi elevati, che ne ostacolano l'ampia applicabilità e la praticità nell'analisi di campioni ad alto rendimento. Con il continuo progresso della scienza e della tecnologia, è emersa una varietà di metodi nuovi, efficienti e accurati. L'applicazione di queste nuove tecnologie ci permette di quantificare il livello di 8-oxo-dG in modo più accurato e fornisce strumenti più potenti per uno studio approfondito dell'associazione tra stress ossidativo e malattia. Ad esempio, i ricercatori hanno applicato la tecnologia dei nanopori per rilevare e sequenziare quantitativamente il DNA13, identificare i tipi di danno al DNA utilizzando una strategia di sequenziamento del codice con un solo clic14, sviluppare metodi di sequenziamento ad alto rendimento e creare biosensori basati su 8-oxoG integrando la biotina-streptavidina con ELISA15. Tra queste, l'ELISA, con i suoi riconosciuti vantaggi in termini di specificità, screening ad alto rendimento e costi, è una delle soluzioni ideali per il rilevamento di 8-oxo-dG. Pertanto, è fondamentale sviluppare un metodo ad alto rendimento, altamente sensibile, conveniente e rapido per rilevare l'8-oxo-dG.

La tecnica ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), sviluppata nel 197116, è progredita rapidamente negli ultimi 50 anni ed è ora diventata uno dei metodi di rilevamento più comunemente utilizzati nei campi della biologia e della medicina 17,18,19. La tecnologia ELISA presenta un'elevata sensibilità e specificità, possiede un breve tempo di reazione ed è facile da usare, il che la rende una scelta ampiamente riconosciuta per l'analisi di campioni su larga scala e l'analisi ad alto rendimento20. Di conseguenza, l'ELISA è stato ampiamente utilizzato per l'analisi quantitativa o semiquantitativa di composti, proteine, anticorpi o molecole all'interno delle cellule 21,22,23. Ad esempio, è stato utilizzato nel rilevamento di biomarcatori associati a varie malattie, residui di farmaci e biomolecole24. Gli ELISA possono essere classificati in quattro tipi principali in base al disegno sperimentale e ai principi25. Questi metodi includono ELISA diretto, ELISA indiretto, ELISA a sandwich ed ELISAcompetitivo 26,27. Tra questi, per lo studio di questo articolo è stato scelto l'ELISA a sandwich, che utilizza due anticorpi specifici, uno per catturare la molecola bersaglio e l'altro per il rilevamento. Il principio sperimentale dell'ELISA a sandwich è il seguente: in primo luogo, un anticorpo specifico viene immobilizzato nei pozzetti di una micropiastra per catturare l'analita di interesse. Dopo l'aggiunta dello standard o del campione, l'analita target si lega all'anticorpo immobilizzato. Successivamente, viene aggiunto un anticorpo marcato che riconosce un epitopo diverso sull'antigene, formando una struttura a sandwich. Dopo la rimozione degli anticorpi non legati, viene aggiunto un substrato. Sotto l'azione catalitica dell'anticorpo secondario, si verifica una reazione cromatica e l'intensità del colore è correlata positivamente con la concentrazione dell'analita target nel campione. Infine, è stata misurata la densità ottica (OD) per determinare la concentrazione del campione. L'ELISA a sandwich presenta i vantaggi di una maggiore sensibilità e specificità per i campioni target, il che lo rende adatto per rilevare basse concentrazioni di analiti target e campioni complessi28. Inoltre, i risultati ottenuti possono essere quantificati per ulteriori analisi. Questi fattori rendono l'ELISA a sandwich un metodo di rilevamento comunemente utilizzato sia nella ricerca scientifica che nei laboratori clinici29.

Questo studio mirava a rilevare quantitativamente l'8-oxo-dG nelle cellule MCF-7 per determinare il grado di danno ossidativo del DNA nelle cellule. Questo studio si compone di due parti principali: la costruzione di un modello di danno ossidativo del DNA delle cellule MCF-7 e la rilevazione dell'8-oxo-dG mediante ELISA. In primo luogo, le cellule MCF-7 sono state coltivate in vitro e trattate con diverse concentrazioni di H2O2 per durate diverse. La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando un test CCK-8 per determinare la concentrazione inibitoria semimassimale (IC50) di H2O2 nelle cellule MCF-7. Sulla base dei valori IC50 , sono stati scelti un tempo di trattamento H2O2 appropriato e una concentrazione di induzione. Per estrarre campioni di cellule MCF-7 danneggiate dall'ossidazione, sono stati prelevati campioni cellulari e surnatanti e aggiunti a pozzetti legati agli enzimi precedentemente rivestiti con anticorpi 8-oxo-dG. L'8-oxo-dG presente nel campione si legherà agli anticorpi legati al vettore in fase solida. Quindi, sono stati aggiunti anticorpi 8-oxo-dG marcati con perossidasi di rafano. La miscela di reazione è stata incubata a temperatura costante per garantire il completo legame del campione e dell'anticorpo. L'enzima non legato è stato rimosso mediante lavaggio, quindi è stato aggiunto il substrato colorimetrico, che ha prodotto un colore blu. Sotto l'azione dell'acido, la soluzione è diventata gialla. Infine, il valore OD dei campioni del pozzo di reazione è stato misurato a 450 nm e la concentrazione di 8-oxo-dG nel campione era proporzionale al valore OD. Generando una curva standard, è possibile calcolare la concentrazione di 8-oxo-dG nel campione.

Protocollo

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1. Costruzione di un modello didanno ossidativo del DNA indotto da H2O2 in cellule MCF-7

  1. Recupero cellulare MCF-7
    1. Trasferire rapidamente la provetta criogenica per colture cellulari, che contiene 3,5 x 106 cellule MCF-7 e viene conservata in frigorifero a -80°C, in una scatola di schiuma contenente azoto liquido. Recuperare la provetta con una pinza e metterla in un bagno d'acqua a temperatura costante di 37 °C per circa 1 minuto per scongelare le cellule conservate.
      NOTA: Durante il processo di scongelamento a bagnomaria, agitare le cellule in modo intermittente per garantire un riscaldamento uniforme del crioviale.
    2. Mettere il crioviale in una centrifuga e centrifugare a temperatura ambiente a 150 x g per 5 minuti.
    3. Utilizzare una pipetta per scartare il surnatante dalla provetta criogenica e aggiungere 1 mL di terreno di coltura completo. Mescolare bene e trasferire in una piastra di coltura da 10 mm, integrare altri 7 mL di terreno di coltura completo.
    4. Agitare il piatto di coltura in modo incrociato per garantire una miscelazione uniforme e la coltura in un incubatore di CO2 a 37 °C con il 5% di CO2.
      NOTA: Il terreno di coltura completo è costituito da terreno di coltura DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina e streptomicina.
  2. Valutazione della vitalità cellulare
    1. Selezionare le cellule MCF-7 nella fase di crescita logaritmica con un buon stato cellulare per l'esperimento. Durante la fase di crescita logaritmica, le cellule mostrano tipicamente un ciclo di divisione più breve e un'alta frequenza di divisione cellulare.
      1. Osserva la morfologia e il tasso di crescita delle cellule MCF utilizzando un microscopio elettronico. Quando le cellule presentano una morfologia monostrato uniforme e densamente compatta e la proliferazione cellulare è evidente, si può determinare che le cellule sono essenzialmente nella fase di crescita logaritmica.
    2. Lavaggio delle cellule: utilizzare una pipetta per rimuovere il terreno di coltura dalla piastra di coltura, aggiungere 1 ml di tampone PBS per lavare le cellule, quindi scartare il PBS.
    3. Distacco cellulare: aggiungere 1 ml di tripsina per lavare le cellule, attendere circa 1 minuto affinché la tripsina si stacchi completamente dalle cellule dal piatto di coltura. Picchiettare delicatamente il piatto di coltura; Osservazione del movimento cellulare
      nei fogli indica un completo distacco delle cellule.
    4. Terminazione del distacco cellulare e conteggio delle cellule: aggiungere 8 mL di terreno di coltura completo per terminare il distacco, pipettare delicatamente le cellule e determinare la concentrazione della sospensione cellulare utilizzando un dispositivo di conteggio delle cellule.
      NOTA: Assicurarsi che la sospensione cellulare sia omogenea prima di contare pipettando delicatamente verso l'alto e verso il basso.
    5. Semina cellulare: regolare la sospensione cellulare diluita per ottenere una densità cellulare di 5.000 cellule per 100 μl. Inoculare la sospensione cellulare in 21 pozzetti di una piastra da 96 pozzetti utilizzando una pistola pipetta, erogando 100 μl in ciascun pozzetto. Aggiungere 100 μl di tampone PBS ai pozzetti circostanti dei pozzetti seminati per evitare un'eccessiva evaporazione del terreno di coltura.
    6. Preparazione del terreno contenente H2O2: scegliere 9 pozzetti sulla piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti e assegnare etichette in base al gradiente delle concentrazioni di H2O2 (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0 mM). Aggiungere 720 μl di terreno completo ai pozzetti etichettati come 2,0 mM e 1,5 mM e aggiungere 360 μl di terreno completo ai pozzetti rimanenti.
      1. Utilizzando una pipetta, erogare 1,63 μL e 1,22 μL di reagente al 3% H2O2 nei pozzetti etichettati rispettivamente come 2,0 mM e 1,5 mM. Mescolare accuratamente la soluzione. Utilizzando una pipetta, trasferire 360 μL di 2,0 mM H2O2 nel pozzetto marcato 1,0 mM e mescolare; quindi, trasferire 360 μL di 1,0 mM H2O2 nel pozzetto contrassegnato 0,5 mM e mescolare; e infine trasferire 360 μL di 0,5 mM H2O2 nel pozzetto contrassegnato 0,25 mM. Pipettare 360 μL di 1,5 mM H2O2 nel pozzetto marcato 0,75 mM per diluire e raggiungere la concentrazione desiderata. (Figura 1).
        NOTA: Assicurarsi che la soluzione madre H2O2 nella pipetta sia completamente trasferita nei pozzetti per evitare qualsiasi soluzione residua. Assicurarsi di miscelare accuratamente le soluzioni prima di procedere con la diluizione.
    7. Incubazione: Dopo circa 24 ore di semina cellulare, utilizzare una pipetta per rimuovere il terreno di coltura dalla piastra a 96 pozzetti una volta che le cellule hanno aderito alle superfici. In base al gradiente di concentrazione, aggiungere il rispettivo mezzo contenente H2O2 a ciascun pozzetto. Rimettere la piastra nell'incubatrice per 12 ore.
    8. Aggiunta del reagente CCK-8: dopo il periodo di trattamento di 12 ore designato, utilizzare una pipetta per rimuovere il terreno di coltura dalla piastra a 96 pozzetti, aggiungere 100 μL di terreno di coltura completo e 10 μL di reagente CCK-8 a ciascun pozzetto e includere tre pozzetti di controllo in bianco. Incubare la piastra a 37 °C per 2 ore.
      NOTA: Durante il processo di aggiunta dei campioni, evitare la formazione di bolle per evitare qualsiasi interferenza con la lettura del valore OD.
    9. Misurazione dell'assorbanza: estrarre la piastra a 96 pozzetti dall'incubatore, misurare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre e registrare i risultati.
    10. Secondo la formula di calcolo IC50 ,
      tasso di inibizione (%) = (OD del gruppo sperimentale del farmaco-OD medio del foro di controllo del farmaco)/ (OD medio del foro di controllo cellulare-OD medio del foro di controllo del farmaco) x 100%
      Calcola i risultati come percentuale di assorbanza nelle colture di controllo.
    11. Importare i dati sperimentali elaborati in un software di analisi statistica, selezionare il tipo di analisi Regressione non lineare, costruire il modello logistico a quattro parametri e procedere con il clic sul pulsante Adatta curva per l'adattamento della curva. Dopo il processo di adattamento, il software calcolerà automaticamente il valore IC50 .
  3. Esperimento di ossidazione cellulare MCF-7 indotta da H2O2
    1. Recuperare le cellule MCF-7 nella fase di crescita logaritmica con un buon stato cellulare per la sperimentazione.
    2. Lavare, eseguire il distacco delle cellule, terminare il distacco e contare le cellule (fare riferimento al passaggio 1.2 per i metodi specifici).
    3. Semina cellulare: Regolare la densità della sospensione cellulare a 1 x 106 cellule per piastra, con 4 ml di sospensione per piastra di 6 cm di diametro.
    4. Etichettare due provette per microcentrifuga da 5 mL come 0,25 mM e 0,75 mM 3% H2O2. Aggiungere 4 mL di terreno completo a ciascuna provetta, quindi aggiungere 1,13 μL e 3,40 μL di 3% H2O2, rispettivamente. Agitare delicatamente i tubi per garantire una miscelazione accurata. Sostituire il terreno di coltura nelle tre piastre con un terreno completo contenente concentrazioni di H2O2 di 0, 0,25 e 0,75 mM.
    5. Incubare le colture: Rimettere i piatti nell'incubatrice per 12 ore.

2. Preparazione di campioni cellulari e preparazione dei reagenti ELISA

  1. Raccolta di campioni di estratti cellulari
    1. Raccolta del campione: Scartare il surnatante della coltura cellulare MCF-7, risciacquare, eseguire il distacco delle cellule, terminare il distacco e raccogliere le cellule. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL.
    2. Centrifugazione: Centrifugare a 800 x g per 5 minuti per raccogliere il pellet della cella. Aggiungere 200 μl di PBS per risospendere ogni campione di cellule e disgregare le cellule mediante ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. Centrifugare il lisato cellulare a 1.500 x g per 10 minuti e utilizzare una pipetta per raccogliere il surnatante per l'analisi.
      NOTA: Quando la quantità di celle è bassa, ridurre il volume di PBS utilizzato per la risospensione. I campioni possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 1 settimana se l'analisi immediata non è possibile. Per la conservazione a lungo termine, aliquotare i campioni in base alle quantità monouso e conservarli a -80 °C per evitare ripetuti cicli di gelo-scongelamento.
  2. Preparazione dei reagenti ELISA
    1. Scongelamento dei reagenti: lasciare che i reagenti ELISA, comprese le pellicole di tenuta, le piastre prerivestite, gli standard, il diluente del campione, l'anticorpo-HRP di rilevamento, il substrato cromogeno, la soluzione di arresto, il tampone di lavaggio concentrato (20x) e i campioni di prova raggiungano la temperatura ambiente (18-25 °C) per 20 minuti prima di iniziare il saggio. Pre-aprire il lettore ELISA 15 minuti prima dell'uso.
    2. Preparazione del tampone di lavaggio: Calcolare il volume richiesto di tampone di lavaggio diluito, quindi diluire 20 volte il tampone di lavaggio concentrato con acqua distillata o deionizzata in 1 soluzione di lavoro. Rimettere il tampone di lavaggio concentrato non utilizzato nel frigorifero a 4 °C.
      NOTA: Il tampone di lavaggio deve essere preparato fresco prima dell'uso. Se sono presenti cristalli nel tampone di lavaggio concentrato conservato in frigorifero, lasciarlo raggiungere la temperatura ambiente e agitarlo delicatamente fino a quando i cristalli non si dissolvono completamente prima dell'uso.
    3. Preparazione della norma
      1. Preparare soluzioni di lavoro di campioni standard con concentrazioni rispettivamente di 1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 ng/mL. Per garantire l'accuratezza dei risultati sperimentali, mescolare accuratamente i campioni standard su e giù prima dell'uso per evitare la formazione di bolle durante il processo di dissoluzione.

3. Esperimento ELISA

  1. Rivestimento delle piastre: progettare in anticipo il numero totale di pozzetti per standard, campioni e bianco/controlli ed estrarre le strisce di piastre richieste. Aggiungere 50 μl di soluzione di lavoro standard e campioni di rilevamento con diverse concentrazioni ai pozzetti di reazione. Eseguire gli standard in triplice copia ed evitare di aggiungere campioni ai pozzetti del bianco/controllo25.
    NOTA: Le fasi sperimentali del test ELISA sono mostrate schematicamente nella Figura 2. Se la concentrazione del campione supera l'intervallo di rilevamento, il campione deve essere diluito con diluente prima del campionamento. Quando si aggiungono campioni, aggiungerli sul fondo della piastra, evitando di toccare le pareti del pozzetto, agitare delicatamente per mescolare ed evitare la formazione di bolle. Per garantire l'accuratezza dell'esperimento, ogni aggiunta di campione deve essere completata entro 10 minuti.
  2. Incubazione: ad eccezione dei pozzetti vuoti, aggiungere 100 μl di anticorpo di rilevamento coniugato con perossidasi di rafano (HRP) a ciascun pozzetto di reazione, sigillare i pozzetti con un sigillo a piastra e incubare a 37 °C per 60 minuti in un incubatore a temperatura costante.
  3. Lavaggio: Scartare il liquido, scrollarsi di dosso il liquido nei pozzetti della piastra, asciugare tamponando su carta assorbente, aggiungere 350 μL di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto di reazione, lasciarlo riposare per 1-2 minuti, quindi scartare il tampone di lavaggio. Ripetere il processo di lavaggio 5 volte.
    NOTA: Un lavaggio accurato è fondamentale perché influisce direttamente sull'accuratezza dei risultati sperimentali. Assicurarsi che il tampone di lavaggio sia completamente scosso dopo ogni lavaggio. Rimuovere accuratamente eventuali residui sul fondo della piastra dopo il lavaggio per evitare di influire sulla misurazione dell'assorbanza.
  4. Reazione cromatica: Aggiungere 50 μL di substrato A e 50 μL di substrato B a ciascun pozzetto di reazione, sigillare la piastra e incubare a 37 °C al buio per 15 minuti.
    NOTA: Dopo aver aggiunto il reagente colorante, osservare prontamente il cambiamento di colore nei pozzetti di reazione. Se il colore è troppo scuro, aggiungere la soluzione di arresto per terminare la reazione prima.
  5. Terminare la reazione e misurare l'assorbanza: aggiungere 50 μL di soluzione di arresto a ciascun pozzetto di reazione e misurare immediatamente il valore OD a una lunghezza d'onda di 450 nm con un lettore ELISA (entro 15 minuti).
  6. Analisi dei dati: Importa i dati sperimentali elaborati nel software di analisi statistica, seleziona il tipo di analisi Regressione lineare. Costruisci una curva di calibrazione tracciando la concentrazione degli standard sull'asse X rispetto ai valori di densità ottica (OD) sull'asse Y. Utilizzare la curva di calibrazione stabilita per accertare la concentrazione di 8-oxo-dG presente nei campioni. Costruisci un modello matematico logistico e procedi facendo clic sul pulsante Adatta curva per l'adattamento della curva. Dopo il processo di adattamento, il software calcola automaticamente la curva standard e il valore P.
    NOTA: La curva standard non può essere riutilizzata e deve essere determinata nuovamente per ogni esperimento.

Risultati

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Come illustrato nella Figura 3, l'asse X denota la concentrazione di H2O2 applicata alle cellule MCF-7, mentre l'asse Y indica la vitalità cellulare. Il trattamento con 0,75 mM per 12 ore ha ridotto la vitalità delle cellule MCF-7 al 67%. In concomitanza con l'aumento della concentrazione, c'è stata una significativa diminuzione della vitalità delle cellule MCF-7, in particolare a una concentrazione di 1,5 mM, dove la vitalità è diminuita al di sotto del 3% (Tabella 1). I risultati sperimentali hanno suggerito un IC50 di 0,7655 mM per le celle MCF-7.

In questa serie di esperimenti, abbiamo impiegato una tecnica ELISA potenziata per la quantificazione dei livelli di 8-oxo-dG. Attraverso l'analisi dei dati, l'equazione di regressione della curva standard è:

Y = 23,66 × X + 0,07038.

Come illustrato nella Figura 4A, la curva di calibrazione ha dimostrato un'elevata linearità (R²=0,978) e la Figura 4B mostra che le relazioni tra le concentrazioni misurate di 8-oxo-dG nei campioni e le corrispondenti quantità aggiunte erano fortemente correlate, indicando una buona precisione (il coefficiente di variazione era inferiore al 5%). Inoltre, la coerenza dei risultati ottenuti su più repliche indica l'affidabilità e la riproducibilità del metodo sperimentale.

In sintesi, i dati sperimentali indicano che il nostro metodo ELISA ottimizzato è in grado di rilevare con successo le fluttuazioni dei livelli di 8-oxo-dG in condizioni ben controllate. Ciò ha implicazioni significative per le future applicazioni di questa tecnica in una gamma più ampia di tipi di campioni per monitorare i danni al DNA causati dallo stress ossidativo. Nonostante alcune limitazioni, le prospettive di applicazione del metodo appaiono promettenti dopo l'ottimizzazione delle condizioni sperimentali.

figure-results-1
Figura 1: Preparazione delle diluizioni di H2O2 . Il diagramma schematico delinea il metodo per preparare le diluizioni di perossido di idrogeno (H2O2), che prevede la meticolosa combinazione di soluzioni e il trasferimento preciso di varie concentrazioni di H2O2 in provette etichettate come 1,0 mM, 0,5 mM e 0,25 mM rispettivamente. La concentrazione target viene raggiunta trasferendo 1,5 mM H2O2 nel tubo designato come 0,75 mM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la rilevazione dell'antigene. Questa illustrazione schematica illustra le fasi sequenziali di un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la rilevazione dell'antigene: Aggiunta del campione e preparazione del bianco; incubazione dell'antigene marcato con HRP; lavaggio e preparazione piatti; aggiunta e incubazione del substrato; Terminazione di reazione e misura della densità ottica (OD). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: H2O2 ha inibito la proliferazione delle cellule MCF-7. La vitalità cellulare è stata valutata mediante test CCK-8 trattato con varie concentrazioni di H2O2 (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5 o 2,0 mM) per 12 ore ed è stato calcolato IC50 per la condizione indicata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Analisi quantitativa dell'8-oxo-dG in cellule MCF-7 dopo trattamento con H2O2 . (A) Curva standard ELISA per 8-oxo-dG. Descrive la relazione tra le concentrazioni note di 8-oxo-dG (1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 ng/mL) e i rispettivi valori di assorbanza. L'equazione di regressione della curva standard è Y = 23,66 × X + 0,07038. (n=3, R2=0,978). (B) Concentrazione di 8-oxo-dG in cellule MCF-7 trattate con H2O2. Il grafico mostra i livelli di 8-oxo-dG nelle cellule MCF-7 sottoposte a diverse concentrazioni di H2O2 (0, 0,25 e 0,75 mM). Ogni punto dati rappresenta la media ± SE (errore standard) di tre esperimenti indipendenti (n=3), illustrando l'impatto dello stress ossidativo sul danno al DNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Parametro
Concentrazione di H2O2 , mM00.250.50.7512
Vitalità cellulare MCF-7, %10082.881.3761.0713.42.77

Tabella 1: Vitalità cellulare delle cellule MCF-7 trattate con H2O2.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo sviluppo di metodi ELISA riveste grande importanza sia per le metodologie di rilevamento del danno al DNA esistenti che per quelle nuove. Rispetto alle tradizionali tecniche di HPLC e spettrometria di massa, questo approccio non solo è facile da usare, ma mostra anche un'elevata sensibilità e soddisfa le esigenze dello screening ad alto rendimento30. Ciò consente il monitoraggio dell'8-oxo-dG in studi di screening della malattia su larga scala, facilitando una comprensione più profonda della correlazione tra questo biomarcatore e varie malattie.

Durante le procedure sperimentali, diversi passaggi critici sono essenziali per garantire l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati. Inizialmente, l'esperimento ha valutato in modo competente la sensibilità delle cellule MCF-7 a H2O2, con un valore IC50 di 0,7655 mM a 12 h, evidenziando il livello di tolleranza delle cellule MCF-7. Questo risultato è di grande significato scientifico per comprendere i meccanismi di difesa antiossidante delle cellule MCF-7 e la loro sopravvivenza sotto stress ossidativo, fornendo al contempo un importante indicatore di riferimento per il futuro screening di farmaci antiossidanti o meccanismi di trattamento correlati31. Inoltre, la selezione e l'accoppiamento degli anticorpi 8-oxo-dG è fondamentale per il rilevamento ELISA e influisce direttamente sulla specificità e sulla sensibilità del sistema di rilevamento ELISA. Inoltre, l'ottimizzazione della strategia di amplificazione del segnale e le fasi di elaborazione del campione sono fattori importanti che influenzano l'accuratezza del rilevamento. Abbiamo scoperto che l'utilizzo di un sistema di reazione stabile del substrato può ridurre gli errori di fondo e aumentare la gamma di sensibilità di rilevamento.

Durante il processo sperimentale, possono verificarsi problemi tecnici come anticorpi instabili, fluttuazioni del segnale e cross-reattività dei reagenti. Per affrontare questi problemi, abbiamo adottato un protocollo sperimentale più stabile, che includeva l'uso di solventi anticorpali stabili per migliorare la stabilità degli anticorpi e l'ottimizzazione e la regolazione delle condizioni sperimentali. Inoltre, per risolvere l'errore causato dalle fluttuazioni del segnale, abbiamo standardizzato l'esperimento utilizzando campioni standard 8-oxo-dG per garantire la coerenza dei risultati.

Per quanto riguarda i limiti del metodo sperimentale, sebbene l'ELISA fornisca un approccio ad alto rendimento, può ancora essere limitato dalla copertura anticorpale specifica e dall'inevitabile cross-reattività del substrato32. Pertanto, per i campioni complessi possono essere necessarie ulteriori fasi di purificazione o pre-trattamento del campione. Inoltre, la rilevazione di campioni con concentrazioni più basse può richiedere un'ulteriore ottimizzazione dell'attività anticorpale per soddisfare i requisiti della ricerca.

In conclusione, il metodo di rilevamento ELISA per l'8-oxo-dG ha importanti implicazioni per specifiche aree di ricerca. Ha un potenziale valore applicativo nel monitoraggio ambientale, nella valutazione del rischio di malattia e nella diagnosi precoce e fornisce un nuovo approccio di rilevamento per l'8-oxo-dG in agricoltura, sicurezza alimentare e screening dei farmaci33. Ad esempio, nel biomonitoraggio ambientale, l'individuazione dello stress da danno ossidativo del DNA causato da tossine ambientali negli organismi può aiutare a identificare i potenziali rischi in modo tempestivo34. In futuro, con l'ulteriore ottimizzazione della tecnologia di rilevamento e la sua applicazione in più discipline, si prevede che questo metodo svolgerà un ruolo più critico nella ricerca nelle scienze della vita.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal team di ricerca innovativa dell'istituto di istruzione superiore di Jiangsu per la scienza e la tecnologia (2021), dal programma del Jiangsu Vocational College Engineering Technology Research Center (2023), dal programma tecnologico chiave dei progetti tecnologici per il sostentamento del popolo di Suzhou (SKY2021029), dal progetto aperto della biobanca delle risorse cliniche del Jiangsu (TC2021B009), dal progetto del laboratorio chiave statale di medicina e protezione dalle radiazioni, Università di Soochow (GZK12023013), programmi del Suzhou Vocational Health College (SZWZYTD202201) e Progetto Qing-Lan della provincia di Jiangsu in Cina (2021, 2022).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% Tripsina-EDTA (1x)Gibco25200-072
Kit conteggio cellule-8DojindoCK04
Piastra contacelluleQiuJingXB-K-25
CO2 incubatoreThermo51032872
DMEM basic(1X)GibcoC11995500BT
FBSPANST30-3302
GraphPad Prism X9GraphPad Softwareanalisi statistica
centrifuga ad alta velocitàThermo  9AQ2861
Kit ELISA umano 8-oxo-dGZcibioZC-55410
L-1000XLS+ PipetteRainin17014382
L-20XLS+ PipetteRainin17014392
serbatoio di azoto liquidoMvecryogeYDS-175-216
MCF-7 CELLBNCCBNCC100137
Multiskan FC fotometro per micropiastreThermo1410101
PBSSolarbioP1020
Soluzione di penicillina-streptomicina, 100XBeyotimeC0222
Microscopio trinoculare per cellule viveMotic1.1001E+12
Congelatore a bassissima temperaturaHaireV118574
software di

Riferimenti

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