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Articolo metodologico

Un modello di danno polmonare acuto a seguito di ischemia-riperfusione viscerale mediante clampaggio della croce aortica sopraceliaca nei ratti

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DOI:

10.3791/66896

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15 agosto 2025

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1Department of Vascular Surgery, Rouen University Hospital, 2INSERM U1096, FHU REMOD-VHF, Rouen University Hospital

In questo articolo

Sommario

Questo studio descrive un modello di danno polmonare acuto a seguito di ischemia-riperfusione viscerale durante il cross-clampaggio aortico sopraceliaco tramite laparotomia nei ratti. Consente di studiare gli effetti clinici e biologici del clampaggio aortico, nonché l'impatto dell'ischemia-riperfusione sugli organi sottostanti e sulle lesioni polmonari remote.

Abstract

La chirurgia a cielo aperto per gli aneurismi dell'aorta addominale richiede un'interruzione transitoria della circolazione sanguigna, causando ischemia-riperfusione degli organi a valle. Possono essere coinvolte le arterie renali, mesenteriche e splancniche. Nessuna terapia si è dimostrata efficace nel prevenire il danno polmonare remoto causato da ischemia-riperfusione dopo clampaggio aortico sopraceliaco. Per studiare le vie fisiopatologiche del danno polmonare acuto e i trattamenti farmacologici, è stato sviluppato un modello sperimentale di clampaggio aortico nei ratti.

Prima della procedura viene somministrata analgesia sottocutanea con buprenorfina (0,05 mg/kg). L'anestesia generale con ventilazione spontanea viene indotta utilizzando gas alogeno (isoflurano 2,5%) tramite una maschera. Una laparotomia xifo-pubica viene eseguita su un tavolo riscaldato (temperatura monitorata per via intrarettale). Il blocco gastro-splenico e l'intestino vengono retratti sul fianco destro e il fegato viene mobilizzato nella parte superiore dell'addome. Il diaframma e i suoi pilastri sono identificati per consentire il rilascio graduale dell'aorta sopraceliaca dal suo passaggio intradiaframmatico. La dissezione viene eseguita delicatamente per ottenere il controllo circonferenziale dell'aorta tra i pilastri del diaframma. Il tronco celiaco sottostante e l'arteria mesenterica superiore sono accuratamente identificati. Un clamp microvascolare può essere utilizzato per l'occlusione aortica sopra le arterie viscerali. Il corretto clampaggio è verificato dall'assenza di pulsatilità aortica, associata a pallore dell'intestino tenue. Il ratto rimane anestetizzato per tutta la durata dell'ischemia. Al termine della durata dell'ischemia, il microclamp viene rimosso e viene controllata la pulsatilità aortica, così come la ricolorazione intestinale. La parete addominale viene chiusa con una sutura, seguita dalla chiusura della pelle del ratto. Al termine del periodo di riperfusione, l'animale viene anestetizzato allo stesso modo. Viene soppresso mediante dissanguamento durante il prelievo di sangue e il polmone può quindi essere raccolto. Il danno polmonare può essere valutato attraverso l'emogasanalisi, la gravimetria polmonare e l'esame istologico. I campioni polmonari possono essere utilizzati anche per analisi RT-PCR e Western blot.

Introduzione

Un aneurisma aortico è una dilatazione focale e permanente dell'aorta1. L'evoluzione di un aneurisma tende alla rottura, associata a un'emorragia massiva, che comporta una mortalità significativa2. Pertanto, l'obiettivo del trattamento risiede nella prevenzione di questa drammatica complicanza. Gli aneurismi aortici sono il più delle volte infrarenali e possono essere trattati con endoprotesi aortica. Un endotrapianto aorto-bi-iliaco è uno stent biforcato coperto che viene introdotto in modo minimamente invasivo attraverso le arterie femorali utilizzando un approccio percutaneo. Questa tecnica non richiede il clampaggio aortico ed evita di causare ischemia viscerale. Può essere eseguito in anestesia locale. Al contrario, gli aneurismi aortici più estesi, come gli aneurismi toracoaddominali e gli aneurismi dell'aorta addominale complessi, sono più difficili da trattare con tecniche endovascolari. Ciò è dovuto al coinvolgimento delle arterie renali, dell'arteria mesenterica superiore e del tronco celiaco all'interno del segmento aneurismatico (Figura 1). Queste principali arterie viscerali devono essere ricostruite in aggiunta all'aorta stessa. L'approccio endovascolare, mini-invasivo, richiede quindi una procedura più complessa che prevede l'utilizzo di endoinnesti fenestrati e/o ramificati per la ricostruzione dell'arteria viscerale. Il limite principale di questi endotrapianti è il lungo tempo di produzione, spesso diversi mesi, che li rende inadatti per il trattamento di emergenza. In questi casi, la riparazione chirurgica convenzionale a cielo aperto rimane un'opzione fattibile e affidabile.

Il trattamento mediante riparazione a cielo aperto richiede laparotomia e clampaggio sopra-viscerale, cioè ischemia viscerale temporanea. Il tasso di complicanze è elevato durante il trattamento di questi aneurismi toracoaddominali. La mortalità varia dal 5 al 15%3. Le complicanze polmonari si verificano nel 60% e le complicanze renali nel 40%4. Queste complicanze, associate a una risposta infiammatoria sistemica, possono progredire fino all'insufficienza multiviscerale5. Questa morbi-mortalità è multifattoriale e coinvolge l'aggressione chirurgica, l'anestesia, l'analgesia, le variazioni emodinamiche, lo shock emorragico e i fenomeni di ischemia-riperfusione. L'aggressione chirurgica contribuisce alla manifestazione delle complicanze, sia che l'approccio includa toracotomia, frenotomia, lombotomia o laparotomia, modificando la meccanica ventilatoria, con in particolare una compromissione della funzione diaframmatica6.

La riperfusione temporanea dell'ischemia viscerale colpisce gli organi a valle, tra cui il tratto digestivo, il sistema splancnico, i reni e gli arti inferiori7. Le complicanze polmonari sono gli eventi avversi più frequenti a seguito di chirurgia dell'aorta toracoaddominale. La loro origine è multifattoriale. Il clampaggio aortico sopraceliaco non causa direttamente ischemia-riperfusione polmonare. Tuttavia, l'ischemia-riperfusione degli organi viscerali a valle innesca un'importante risposta infiammatoria sistemica. L'ipotesi di un nesso causale tra ischemia-riperfusione viscerale e l'insorgenza di lesioni a distanza, in particolare danni polmonari, è ben supportata. La disfunzione endoteliale polmonare, un componente critico della membrana alveolo-capillare, sembra essere centrale nello sviluppo del danno polmonare acuto (ALI). Una massiccia risposta infiammatoria sistemica e l'attivazione dei neutrofili giocano un ruolo fondamentale in questo processo.

L'ALI è spesso definita in base a criteri istologici piuttosto che alla presentazione clinica. L'ALI si riferisce a una malattia infiammatoria acuta caratterizzata dalla rottura delle barriere endoteliali ed epiteliali polmonari. La membrana alveolo-capillare, l'unità funzionale del polmone, è costituita da tre componenti: l'endotelio microvascolare, lo spazio interstiziale e l'epitelio alveolare.

Un segno distintivo dell'ALI è l'aumento della permeabilità di questa barriera, guidato dall'infiltrazione dei neutrofili e dal rilascio di mediatori pro-infiammatori citotossici. Il danno epiteliale alveolare coinvolge sia gli pneumociti di tipo I che quelli di tipo II. Le cellule di tipo I, che coprono il 95% della superficie alveolare, sono altamente suscettibili alle lesioni e svolgono un ruolo chiave nello scambio gassoso. Le cellule di tipo II, più numerose ma che coprono un'area più piccola, sono essenziali per la produzione di tensioattivi, la riparazione epiteliale e il trasporto di ioni. A seguito di lesioni, le cellule di tipo II contribuiscono al ripristino dell'integrità alveolare attraverso la loro capacità rigenerativa e la differenziazione in cellule di tipo I.

Molteplici vie di morte cellulare sono state implicate nel danno epiteliale durante l'ALI, con le cellule di tipo I particolarmente vulnerabili. L'ALI viene comunemente valutata valutando l'edema polmonare, con o senza misure di permeabilità microvascolare per riflettere la disfunzione endoteliale.

L'obiettivo di questo modello è quello di indagare il legame tra ischemia-riperfusione viscerale e lo sviluppo di danno polmonare remoto, sia a livello metabolico che meccanicistico, come illustrato nella Figura 2. Questa specifica connessione rimane solo parzialmente compresa. Il nostro modello di clampaggio aortico rappresenta uno scenario di ischemia-riperfusione viscerale su un'aorta sana, senza la presenza di un aneurisma dell'aorta addominale nel ratto. Al di sopra del tronco celiaco, non ci sono rami importanti né nell'uomo né nei ratti. L'aorta al di sopra di questo livello corrisponde all'aorta sopraceliaca, che dà origine solo a piccoli rami parietali che alimentano la parete toracica. Pertanto, non vi è alcuna differenza significativa nell'anatomia vascolare dei principali vasi a questo livello tra esseri umani e ratti.

L'uso di questo modello consente un'esplorazione estesa. Aiuterà a identificare i biomarcatori precoci nello sviluppo di lesioni tissutali remote. Inoltre, questo modello consente lo studio di potenziali inibitori, inclusi gli inibitori dei mediatori circolanti o gli inibitori di specifiche lesioni degli organi remoti.

Altri modelli di ischemia-riperfusione vengono utilizzati per studiare le lesioni a distanza. I modelli di ischemia-riperfusione cerebrale, intestinale e renale sono fortemente rappresentati 8,9,10. Sono in corso ricerche approfondite sul danno polmonare dopo ischemia-riperfusione intestinale dovuta all'occlusione transitoria dell'arteria mesenterica superiore (SMA)11,12,13. La durata dell'ischemia e della riperfusione è estremamente variabile, va da minuti a diverse ore14,15. Il razionale per la durata dell'ischemia è quello di indurre un'aggressività sufficiente a innescare una risposta significativa che porti al verificarsi di lesioni a distanza. Una durata troppo breve dell'ischemia potrebbe non causare un'alterazione significativa della via metabolica studiata. Per quanto riguarda la durata della riperfusione, il razionale risiede nell'insorgenza precoce di lesioni remote e nella natura potenzialmente transitoria dei cambiamenti fisiopatologici. Una durata ideale della riperfusione non dovrebbe essere troppo precoce o troppo tardiva per caratterizzare adeguatamente la compromissione metabolica.

I modelli sono principalmente nei roditori. I vantaggi dei roditori includono le loro piccole dimensioni, la facilità di manutenzione, il breve ciclo di vita e le abbondanti risorse genetiche16. L'uso di animali di grossa taglia come maiali, cani o primati non sembra giustificato in assenza di benefici aggiuntivi, il che si allinea con le regole etiche della sperimentazione animale per quanto riguarda la raffinazione. Inoltre, a causa della loro somiglianza anatomica, fisiologica e genetica con l'uomo, i roditori consentono studi traslazionali16.

Uno dei principali limiti dei modelli di clampaggio della SMA è che, nella pratica clinica, l'inizio del periodo di ischemia intestinale non è identificabile. Ciò rende più incerta l'estrapolazione alle situazioni cliniche umane. Al contrario, durante la chirurgia aortica complessa, i periodi di ischemia e riperfusione dei diversi organi sono chiaramente identificati. Inoltre, durante il clampaggio aortico sopraceliaco, tutti i visceri sottostanti sono in periodo ischemico (apparato digerente, fegato, milza, reni, organi pelvici e arti inferiori). Tutti questi organi vanno incontro al fenomeno dell'ischemia-riperfusione. Al contrario, sono meno studiati i modelli di ischemia-riperfusione focalizzati su un organo specifico (intestino, rene, fegato, ecc.), i modelli di clampaggio aortico e quindi di ischemia-riperfusione di più organi con fisiopatologia metabolica. Allo stesso modo, le lesioni remote come le lesioni polmonari dopo il clampaggio aortico sono scarsamente studiate in termini di metabolismo17,18.

I modelli di clampaggio aortico esistenti si concentrano principalmente sul bloccaggio dell'aorta addominale al di sotto delle arterie renali. Il limite di questo modello è che non induce ischemia-riperfusione viscerale. Pertanto, non consente la dimostrazione di un legame tra ischemia-riperfusione viscerale e potenziali lesioni a distanza18,19. Inoltre, non esiste un modello in vitro che consenta lo studio dell'ischemia-riperfusione attraverso il clamping aortico, motivo per cui l'analisi con modelli in vivo rimane necessaria.

Pertanto, questo modello sperimentale di clampaggio aortico sopraceliaco nei ratti facilita un'indagine completa sui meccanismi fisiopatologici e sugli interventi farmacologici mirati alle lesioni polmonari remote.

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Protocollo

La creazione di questo modello è conforme alle linee guida per la cura e la sperimentazione degli animali, nonché alla legislazione francese ed europea. Questo modello è stato convalidato in uno studio sperimentale su animali che è stato approvato dal Comitato Etico Universitario Regionale in Normandia, Rouen, Francia (n°APAFIS: #18974).

1. Modello animale e acclimatazione

  1. Periodo di adattamento al modello animale
    NOTA: Il modello aderisce ai principi di raffinatezza.
    1. Alloggiare gli animali in strutture non sovraffollate per una settimana per consentire l'adattamento prima dell'intervento chirurgico.
    2. Alloggiare i ratti due per gabbia con accesso ad libitum all'acqua e al cibo, che saranno controllati quotidianamente da personale esperto.
    3. Controllare quotidianamente la pulizia della biancheria da letto (strisce di carta) e cambiarla sistematicamente da personale esperto due volte a settimana o più, se necessario.
    4. Dopo un periodo di acclimatazione di una settimana, durante il quale avranno un contatto quotidiano con lo sperimentatore e l'esposizione a cicli di illuminazione di 12 ore, le procedure si svolgeranno in una stanza separata e tranquilla con lo stesso sperimentatore.
  2. Specie modello animale
    1. Utilizzare ratti maschi Wistar o Sprague Dawley per evitare influenze ormonali, come l'estradiolo, sull'analisi della fisiopatologia dell'ischemia-riperfusione viscerale da un allevamento accreditato e certificato11,20.
    2. Determinare in anticipo i gruppi sperimentali e il numero di animali per gruppo.
    3. Scegli l'età, si consigliano ratti di 6-10 settimane (350 g).

2. Anestesia e analgesia

  1. Analgesia
    1. Pesare ogni animale il giorno della procedura.
    2. Somministrare buprenorfina (0,05 mg/kg) per via sottocutanea a livello della pelle posteriore del ratto 1 ora prima della procedura a scopo analgesico con ago da 25 G e siringa da 2 ml.
    3. Applicare il gel di lidocaina cloridrato all'1% sulla pelle dell'addome a livello della futura incisione cutanea. Rivalutare il dolore regolarmente (almeno due volte al giorno) dopo l'intervento utilizzando una bilancia per valutare le espressioni facciali del dolore nel ratto21.
    4. Somministrare, durante le prime 24 ore, iniezioni sottocutanee sistematiche di buprenorfina (da 0,01 a 0,05 mg/kg) ogni 8 ore.
    5. Successivamente, somministrare iniezioni di buprenorfina (da 0,01 a 0,05 mg/kg) in base alla scala del dolore facciale del Centro nazionale per la sostituzione, il perfezionamento e la riduzione degli animali nella ricerca e ripetute ogni 8 ore se necessario21.
  2. Anestesia generale
    1. Utilizzare gas alogenati (isoflurano) per l'anestesia generale22.
    2. Utilizzare una camera ventilata con isoflurano (5 %) a una portata d'aria di 2 L/min per 2 minuti per la fase di induzione.
    3. Per il mantenimento dell'anestesia, passare il ratto a una maschera personalizzata per la ventilazione spontanea con isoflurano (2-2,5%) a una velocità del flusso d'aria di 2 L/min durante l'intervento.
    4. Liberare le vie aeree superiori spostando la lingua fuori dalla cavità orale per consentire la ventilazione attraverso la maschera.
    5. Monitorare continuamente la profondità dell'anestesia durante la procedura e regolare la concentrazione di isoflurano secondo necessità.

3. Posizionamento del ratto durante la procedura

  1. Posizionare il ratto in decubito dorsale con gli arti anteriori e posteriori immobilizzati utilizzando del nastro adesivo, rispettando i fisiologici range di movimento articolare del ratto.
  2. Posizionare il ratto su un tappetino riscaldante impostato a 37 °C con monitoraggio della temperatura rettale.
  3. Proteggere gli occhi applicando dacryogel. Radere il pelo addominale e disinfettare accuratamente l'addome con una soluzione di iodio povidone.

4. Procedura chirurgica

  1. Condizioni della procedura chirurgica
    1. Eseguire la procedura sotto una lente microchirurgica per facilitare le manovre delicate, anche se non è indispensabile.
  2. Incisione
    1. Dopo la palpazione del processo xifoideo al bordo superiore dell'incisione, incidere la pelle al centro dell'addome, rivelando la linea alba dei muscoli addominali.
    2. Incisione centrale del muscolo addominale sulla linea alba per evitare sanguinamento dai muscoli addominali.
  3. Esposizione intra-addominale
    1. Mantenere la parete addominale su entrambi i lati con divaricatori autotrattenibili.
    2. Assicurarsi dell'assenza di anomalie (tumori), mobilizzare i visceri, lo stomaco, la milza e il fegato sul lato destro dell'addome e quindi esporre l'aorta sopraceliaca.
    3. Mantenere tutti i visceri all'interno dell'addome il più possibile con un piccolo impacco piegato longitudinalmente e imbevuto di soluzione salina calda (37 °C).
    4. Coprire tutti i visceri con un impacco imbevuto di soluzione salina riscaldata a 37 °C, per prevenire l'ipotermia e la disidratazione.
  4. Identificazione dei principali vasi intra-addominali
    1. Identificare l'aorta sopraceliaca dalle sue pulsazioni e dalla sua posizione tra i pilastri diaframmatici.
    2. Controllo dell'aorta tra i pilastri diaframmatici con una dissezione delicata e attenta utilizzando applicatori con punta di cotone e pinze da dissezione per rilasciare l'aorta nel modo più atraumatico possibile.
    3. Circondare l'aorta sopraceliaca utilizzando una sutura monofilamento 5-0 con una pinza da dissezione e legatura.
    4. Verificare l'origine del tronco celiaco e dell'arteria mesenterica sottostante. La durata di questa procedura chirurgica è di 10-15 minuti per ratto.
    5. L'identificazione alla base della vena cava inferiore sottorenale è facile grazie alla trasparenza del retroperitoneo.
    6. Rilasciare la vena cava inferiore sottorenale solo sulla sua superficie anteriore, il che consente la somministrazione endovenosa diretta di qualsiasi agente farmacologico.
  5. Iniezione endovenosa
    1. A tale scopo, utilizzare un ago da 30 G per iniezione e posizionare alcuni millimetri di impacco emostatico per ottenere l'emostasi.
    2. Se si esegue il precondizionamento farmacologico, somministrare l'iniezione prima del clampaggio aortico. Per il trattamento post-condizionamento, somministrarlo durante o dopo il clampaggio aortico.
    3. Questo protocollo ha studiato il precondizionamento farmacologico, quindi somministrare 5 minuti prima del clampaggio aortico.
  6. Periodo ischemico
    1. Clamp l'aorta celiaca con un clamp microvascolare atraumatico per tutto il periodo ischemico di 40 minuti. Verificare l'efficacia del morsetto mediante la scomparsa delle pulsazioni aortiche sottostanti e lo scolorimento dei visceri e degli arti più volte durante il serraggio.
    2. Chiudere parzialmente l'addome con tre semplici suture riassorbibili intrecciate 5-0 per limitare la perdita di acqua e calore. Coprire l'incisione chirurgica con un impacco sterile imbevuto di soluzione salina calda per tutta la durata dell'ischemia.
  7. Periodo di riperfusione
    1. Al termine del periodo ischemico, riaprire l'addome ed esporre l'aorta nello stesso modo descritto in precedenza.
    2. Rimuovere il morsetto vascolare e verificare la ripresa della pulsatilità aortica sottostante e la ricolorazione dei visceri e degli arti. Il periodo di riperfusione inizia immediatamente dopo la rimozione del microclamp.
  8. Chiusura dell'addome
    1. Riportare i visceri nella loro posizione originale e chiudere l'addome con una sutura riassorbibile intrecciata 5-0 sulla linea alba e la pelle con una sutura riassorbibile monofilamento 5-0.
  9. Risveglio animale
    1. Posizionare il ratto in una posizione di decubito laterale sinistro per evitare di comprimere la vena cava inferiore dalla massa viscerale e dal contesto di ipovolemia. Metti il ratto in una gabbia individuale con una lampada termica per mantenere la temperatura fino al risveglio, circa 10 minuti dopo.
  10. Seconda anestesia generale
    1. Al termine del periodo di riperfusione di 180 minuti, anestetizzare il ratto utilizzando la stessa anestesia gassosa attraverso una camera ventilata con isoflurano (5%) ad una portata d'aria di 2 L/min per 2 min per la fase di induzione.
    2. Per il mantenimento dell'anestesia, passare il ratto a una maschera personalizzata per la ventilazione spontanea con isoflurano (2-2,5%) a una velocità del flusso d'aria di 2 L/min per tutto il periodo di raccolta dei tessuti.

5. Campionamento

  1. Campioni di sangue
    1. Raccogliere campioni di sangue utilizzando un ago da 23 G e una siringa da 5 ml mediante puntura diretta nella vena cava inferiore sotto le vene renali.
    2. Ottenere l'emostasi dopo la puntura applicando un piccolo pezzo di impacco emostatico.
    3. Utilizzare una piccola porzione (100 μl) del sangue totale per l'analisi dei gas e del sangue standard su un'unica scheda di test a temperatura ambiente.
    4. Raccogliere il sangue intero rimanente in una provetta da 4 mL di EDTA e centrifugarlo a 1.000 × g per 10 minuti a +4 °C.
    5. Congelare il plasma in crioprovette in azoto liquido e conservare a -80 °C fino all'analisi.
  2. Campioni di tessuto
    1. Prelievo di tessuti
      1. Raccogliere campioni di tessuto (polmone, intestino, rene, fegato e cuore) durante l'eutanasia dell'animale. Eseguire l'eutanasia mediante prelievo di sangue che porta al dissanguamento dopo l'anestesia generale con isoflurano secondo lo stesso protocollo precedentemente menzionato.
      2. Attraverso l'addome aperto, prelevare 50 mg di ciascun tessuto: il polo superiore del rene sinistro, il lobo epatico sinistro e l'intestino tenue distale 1 cm prima del cieco.
      3. Quindi, eseguire rapidamente una sternotomia mediana per identificare il cuore e i polmoni.
      4. Liberare il polmone sinistro dal legamento e rimuoverlo completamente per l'analisi istologica. Libera il polmone multilobo destro dai suoi legamenti. Separare il lobo anteriore per l'analisi degli acidi nucleici e delle proteine, conservare il resto in una tazza con siero fisiologico a 37 °C per alcuni minuti per eseguire successivamente la gravimetria.
      5. Estrarre il cuore nel suo insieme con sezioni dell'aorta, dell'arteria polmonare ed entrambe le vene cave. Prelevare un pezzo del ventricolo sinistro per l'analisi degli acidi nucleici e delle proteine, conservare il resto in una tazza con siero fisiologico a 37 °C per alcuni minuti per eseguire successivamente la gravimetria.
    2. Analisi degli acidi nucleici
      1. Per l'analisi degli acidi nucleici, prelevare immediatamente una porzione di tessuto da 50 g. Congelarlo in azoto liquido e conservarlo a -80 °C fino all'analisi.
      2. Estrarre l'RNA totale con un reagente pronto all'uso per l'isolamento di RNA totale di alta qualità secondo il protocollo del produttore.
      3. Determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA con uno spettrofotometro. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando 2 μL di campione, con 2 μL di acqua priva di RNasi come riferimento in bianco. Utilizzare l'assorbanza a 260 nm per determinare la concentrazione di RNA.
        NOTA: La purezza accettabile dell'RNA è stata definita come un rapporto di assorbanza 260/280 e 260/230 compreso tra 1,7 e 2,0.
      4. Utilizzare 1 μg di ciascun campione di RNA per la trascrizione inversa.
      5. Misurare i livelli di mRNA delle citochine pro-infiammatorie (IL-1beta, TNF-alfa, IL-6) e di un riferimento interno (beta2-microglobulina), mediante reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) in un ciclatore a blocchi termici rapido, basato su piastra, con capacità di rilevamento online integrate in tempo reale utilizzando una miscela di reazione di avvio a caldo pronta all'uso (i primer sono elencati nella Tabella 1).
      6. Calcolare il livello relativo di mRNA utilizzando il metodo 2-ΔΔCT.
    3. Analisi delle proteine
      1. Per l'analisi delle proteine, porre 50 mg di tessuto in una provetta di lisi da 2 mL contenente cinquanta perle di ceramica di ossido di zirconio da 2,8 mm. Questa provetta di lisi contiene 1 mL di tampone di lisi per saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) con una compressa di inibitore della proteasi e una compressa di inibitore della fosfatasi.
      2. Estrarre le proteine dai campioni mediante omogeneizzazione sul mulino a provette da laboratorio con 3 ripetizioni di controllo di 5 secondi, seguite da un periodo di riposo di 10 secondi.
      3. Centrifugare i campioni a 10.000 g a +4 °C per 10 minuti e conservare i surnatanti in provette criogeniche a -20 °C fino all'analisi.
      4. Determinare le concentrazioni proteiche con un metodo di analisi proteica basato su Bradford e conservare i campioni a -80 °C.
      5. Separare una quantità uguale di proteine da ciascun campione utilizzando SDS-PAGE.
      6. Trasferimento di proteine separate su membrane di nitrocellulosa da 0,2 μm.
      7. Incubare la membrana dopo il blocco con latte scremato in polvere TBS-Tween al 5% per 1 ora, con un anticorpo primario contro la proteina specifica di scelta. Ad esempio, per esplorare l'eparanasi, utilizzare un anticorpo primario policlonale di coniglio contro l'eparanasi umana (diluizione 1:2000) e una proteina di controllo come GAPDH, utilizzare un anticorpo primario monoclonale di capra contro GAPDH (diluizione 1:5000) durante la notte a 4 °C.
      8. Lavare le macchie tre volte con tampone TBST-Tween 0,1%.
      9. Incubare con un anticorpo secondario coniugato HRP diretto contro l'anticorpo primario a temperatura ambiente (RT) per 1 ora in soluzione bloccante. Ad esempio, per esplorare l'eparanasi, utilizzare l'anticorpo secondario capra contro coniglio (diluizione 1:5000) e per esplorare GAPDH, utilizzare l'anticorpo secondario coniglio contro capra (diluizione 1:10000).
      10. Rileva gli immunocomplessi utilizzando il sistema di rilevamento a chemiluminescenza avanzata (ECL).
      11. Analizzare le membrane utilizzando un software dedicato per determinare i valori densitometrici delle bande target, utilizzando GAPDH come controllo interno. Eseguire l'analisi densitometrica della banda corrispondente all'eparanasi (50 kDa) e normalizzarla nella banda proteica GAPDH (35 kDa) per determinare l'intensità relativa del segnale.
    4. Analisi istologica
      1. Per l'analisi istologica, prelevare il polmone uniobare sinistro in corrispondenza dell'ilo, quindi infondere attraverso il bronco principale sinistro con una soluzione di crioconservazione utilizzando un catetere da 16 G. Congelarlo in azoto liquido e conservarlo a -80 °C.
    5. Analisi gravimetrica
      1. Dopo i campioni per l'analisi degli acidi nucleici e delle proteine, analizzare la porzione rimanente del cuore e del polmone multilobulare destro mediante gravimetria, con essiccazione in forni a 70°C, consentendo al rapporto peso umido/secco di fornire una stima dell'edema tissutale.

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Risultati

Questo protocollo è risultato sicuro, con perdite animali minime (meno del 5%) durante l'anestesia e la chirurgia, ed efficace per l'induzione di danno polmonare acuto. L'anestesia con isoflurano era più sicura della ketamina combinata con l'anestesia con xilazina (perdita di circa il 15%), con un rapido risveglio e un migliore recupero nei ratti (dati non mostrati). Tutti gli animali anestetizzati sono stati in grado di sottoporsi a un clampaggio aortico sicuro ed efficace con questo metodo. Tutti gli animali (100%) con...

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Discussione

Questo modello chirurgico di cross-clamping aortico offre il vantaggio di consentire un'analisi completa, sia tissutale che plasmatica, del danno polmonare acuto a seguito di ischemia-riperfusione viscerale. Fornisce inoltre l'opportunità di testare molecole farmacologiche con somministrazione intraperitoneale, enterale o endovenosa in pre o post condizionamento.

Uno dei passaggi critici rimane il clampaggio aortico sopraceliaco durante l'intervento chirurgico...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,2 µ m membrane in nitrocellulosa Trans-Blot Turbo Transfert PackBio-Rad16201500,2 µ M Membrane in nitrocellulosa pretagliate
Siringa Luer Slip da 1 cc senza agoTerumoMDSS01SESiringa Luer Slip da 1 cc senza ago
Siringa Luer Slip da 2 cc senza agoBecton DinckinsonSiringa Luer Slip da 2 cc senza ago
Provetta EDTA da 4 mL BD K3 13 mm x75 mmBD VacutainerBD368860Provetta EDTA da 5 mL BD K3 13 mm x 75 mm
Sutura intrecciata 5-0 / Vicryl 5-0 (Ethicon) o Novosyn (B. Braun)Ethicon - Johnson e JohnsonV7970EVicryl 5-0 Ago conico 1/2 cerchio 13 mm Lunghezza 45 cm
Sutura assorbibile monofilamento 5-0 / Monocryil PoliglecaproneEthicon - Johnson e JohnsonY493GAgo 3/8 cerchi Lunghezza 18in
Siringa Luer Slip da 5 cc senza agoTerumoSS-05LE1Siringa Luer Slip da 5 cc senza ago
Pinza microvascolare atraumatica/Pinza per vasi monouso per venaAROSurgicoTKF-1-20gPinza microvascolare atraumatica per uso venoso al fine di bloccare l'aorta del ratto
BD Microlancia 3 23 G x 1 0,6 x 25 mmBD Vacutainer300800BD Microlancia 3 23 G x 1 0,6 x 25 mm
BD Microlancia 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mmBD Vacutainer300600BD Microlancia 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mm
BD Microlancia 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mmBD Vacutainer304000BD Microlancia 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mm
beta-actina InvitrogenCarlsbad, Stati Uniti15G5A11/E2
Saggio delle proteine con metodo BradfordBiorad, Marnes-la-Coquette, Francia5000201
BuprenorfinaBuprenorfina
Centrifugatore Sigma 3-30Sigma, Germania10375, 10376, 10377, 10378, 10379, 91276, 109014Centrifugatore per eppendorf
cOmplete MiniRoche11836153001Cocktail di inibitori della proteasi 25 compresse
Bastoncino cotonato
Dacryogel /  Gel oculare Lubrithal 10 gProdotti veterinari DechraCodice  ACL7376464Gel oculare Lubrithal 10 g
Bisturi monousoParamountPDSS11Lama per bisturi monouso n° 11
ElettrocauterizzazioneDentRMedEMB/87400Penna emostatica ad alta temperatura
Sistema di rilevamento ECL miglioratoBiorad, Hercules, California, Stati UnitiCodice 1705060S
Fisherbrand Mulino per perline 24Fisher scientifico15515799Usato per  macinazione, lisi e omogeneizzazione di campioni biologici prima dell'estrazione molecolare
Tamponi di garza Raffin.010106Tamponi di garza 
Software ImageLabTMBioradsu chiavetta USB o licenza
Isoflurano 5%Isoflurano 5%
Lidocaina Prilocaina gel 5% Aguettant, Lione, FranciaLidocaina Prilocaina gel 5% 
Strumento LightCycler 480Roche, Bâ le, Svizzera5015243001termociclatore
Gelatina Lubrificante Sterile K-Y 82 gRECKITT BENCKISERGelatina Lubrificante Sterile K-Y 82 g
NanoDrop 2000TermoScientific, Waltham, Massachusetts, Stati UnitiND-2000spettrofotometro
Peha Pince anatomicoHartmann991063Pinze anatomiche
PhosSTOPRoche4906837001inibitore della fosfatasi 20 compresse
Gesso/Nastro adesivoAnapore135320Nastro adesivo/cerotto chirurgico
Soluzione di iodio povione / Vé té Mangiare SoluzioneVé tochinoloSoluzione antisettica per uso esterno
Kit di lisi Precellys tubo Omogeneizzante per tessuti duri CK28, BertinCK28Kit di lisi Precellys tubo 
Prol' ne Sutura del prolipropileneEthicon - Johnson e Johnson7472HProl' ne 5-0 Ago conico taglio 3/8 cerchio 13 mm Lunghezza 75 cm
Provette Safe-Lock da 1,5 mLEppendorf.0030120086Provette Safe-Lock 1,5cc no colore 1000 provette per centrifugazione
Provette Safe-Lock 2 mLEppendorf.0030120094Provette Safe-Lock 2.0cc no color 1000 provette per centrifugazione
Provette Safe-Lock da 5 mLEppendorf.0030119401Provette Safe-Lock 5.0cc no color 200 provette per centrifugazione
Soluzione salina NaCl 0,9%Aguettant, Lione, Francia600502Soluzione salina 0,9% 500 mL
PAGINA SDSSigma-Alrich
Catetere IV Surflash 16 GTerumoSR*FF1651
ChirurgicoEthicon - Johnson e JohnsonTamponi emostatici riassorbibili
Set di sutura n° 12Hartmann4701762Set sterile per sutura con campione di adesina, cisor, pinze Adson, porta aghi
SYBR Verde KIT Light Cycler 480 SYBR Verde I MasternRoche4707516001SYBR Verde
TBST-Tween 0,1% buffer Sigma-Alrich
Test-Cards Epoc 24 schede 13 parametriSiemens-Healthineers
Tessuto TEKSakura FinetecSoluzione di crioconservazione 
Reagente TRIzol InvitrogenThermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, Stati Uniti15596026Reagente TRIzol

Riferimenti

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