Qui, presentiamo una semplice tecnica per valutare la resistenza antimicrobica ambientale (AMR) aumentando la proporzione di DNA extracellulare a basso peso molecolare. Il trattamento precedente con PEG al 20%-30% e NaCl 1,2 M consente di rilevare sia i geni genomici che quelli AMR trasferiti orizzontalmente. Il protocollo si presta a un processo senza kit con un'ulteriore ottimizzazione.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Estrazione avanzata di DNA a basso peso molecolare dalle acque reflue per una valutazione completa della resistenza agli antimicrobici
In questo articolo
Sommario
Abstract
La sorveglianza ambientale è riconosciuta come uno strumento importante per valutare la salute pubblica nell'era post-pandemica. L'acqua, in particolare le acque reflue, è emersa come fonte di scelta per campionare i carichi di agenti patogeni nell'ambiente. Le acque reflue provenienti da scarichi a cielo aperto e impianti di trattamento delle acque comunitarie sono un serbatoio di agenti patogeni e geni di resistenza antimicrobica (AMR) e spesso entrano in contatto con l'uomo. Sebbene esistano molti metodi per tracciare l'AMR dall'acqua, isolare DNA di buona qualità ad alte rese da campioni eterogenei rimane una sfida. Per compensare, i volumi di campione devono spesso essere elevati, creando vincoli pratici. Inoltre, il DNA ambientale è spesso frammentato e le fonti di AMR (plasmidi, fagi, DNA lineare) sono costituite da DNA a basso peso molecolare. Tuttavia, pochi processi di estrazione si sono concentrati su metodi per l'estrazione ad alto rendimento di DNA lineare e a basso peso molecolare. Qui, viene riportato un metodo semplice per l'estrazione lineare del DNA ad alto rendimento da piccoli volumi di acque reflue utilizzando le proprietà di precipitazione del polietilenglicole (PEG). Questo studio sostiene la necessità di aumentare la resa complessiva del DNA dai campioni d'acqua raccolti per le analisi metagenomiche, arricchendo la proporzione di DNA lineare. Inoltre, il miglioramento del DNA a basso peso molecolare supera l'attuale problema del sottocampionamento dell'AMR ambientale a causa di un'attenzione particolare al DNA intracellulare e ad alto peso molecolare. Si prevede che questo metodo sia particolarmente utile quando esiste DNA extracellulare ma a basse concentrazioni, come con gli effluenti degli impianti di trattamento. Dovrebbe anche migliorare il campionamento ambientale dei frammenti del gene AMR che si diffondono attraverso il trasferimento genico orizzontale.
Introduzione
Il SARS-CoV-2 e le sue conseguenze hanno sottolineato l'importanza della sorveglianza ambientale nel monitoraggio e nella previsione dei focolai di malattie infettive 1,2. Sebbene le pandemie virali siano evidenti, l'aumento della resistenza antimicrobica (AMR) è spesso descritto come una pandemia insidiosa e che costituisce una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica in tutto il mondo 3,4. Di conseguenza, vi è un urgente bisogno di strategie coordinate per comprendere l'evoluzione e la diffusione della resistenza antimicrobica. I corpi ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Campionamento delle acque reflue
- Immergere un becher di polipropilene da 500 mL nello scarico a cielo aperto o nel serbatoio dell'impianto di trattamento delle acque reflue (STP) e raccogliere ~300 mL di campione di acque reflue.
- Trasferire ~250 mL del campione in un flacone in polipropilene autoclavato da 250 mL.
- Avvitare il tappo della bottiglia e sigillarlo con una pellicola di plastica. Conservare il flacone in posizione verticale in un sacchetto chiuso.
- Trasportare il campione in posizione verticale in un contenitore chiuso a temperatura ambiente.
- Inattivare il campione a 70 °C in un forno ad a....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Istituzione di un protocollo per l'estrazione ad alto rendimento del DNA da campioni di acque reflue
Una versione modificata di protocolli precedentemente stabiliti è stata utilizzata per l'estrazione di DNA e RNA di alta qualità da campioni d'acqua17. I campioni provenivano da scarichi a cielo aperto e da impianti di trattamento delle acque reflue nella regione di Delhi-NCR, nel nord dell'India. Dopo la pre-elaborazione con PEG e NaCl (
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La resistenza antimicrobica è oggi una delle prime 10 minacce per la salute, come elencato dall'OMS, e la sorveglianza ambientale per la resistenza antimicrobica è riconosciuta come uno strumento importante in tutto il mondo. Come accennato nell'introduzione, una registrazione completa dell'AMR ambientale include il DNA a basso peso molecolare, frammentato ed extracellulare. Il protocollo di pre-processazione qui riportato utilizzando un'alta concentrazione di PEG combinato con sale (30% PEG e 1,2 M NaCl) raggiunge quest.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Riconosciamo il sostegno finanziario della Rockefeller Foundation (Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018) come parte del team APSI India (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Riconosciamo anche l'aiuto finanziario fornito da Axis Bank a sostegno di questa ricerca e dalla Trivedi School of Biosciences dell'Università di Ashoka per attrezzature e altro supporto.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microcentrifuga 24 posti | Eppendorf Centrifuge 5425 R | EP5406000046 | |
| Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Etanolo assoluto per analisi) | Supelco | 100983-0511 | |
| Agarosio | Invitrogen | 16500500 | |
| Centrifuga refrigerata da banco | Eppendorf Centrifuge 5920 R | EP5948000131 | |
| ChemiDoc Imaging System | BioRad | 12003153 | |
| DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47014 | |
| DNeasy PowerWater Pro Kit | Qiagen | 14900-100-NF | |
| dNTP (dNTP Mix 10mM ciascuno, 0,2 mL, R0191) | Thermo Fisher | R0191 | |
| DreamTaq DNA polimerasi, 5 U/µ L + 10x DreamTaq Buffer* | Thermofscientific | EP0702 | |
| E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder | Invitrogen | 10488091 | |
| Maxiamp Provette PCR 0,2 mL | Tarsons | 510051 | |
| Acqua di grado di biologia molecolare per PCR | HiMedia | ML065-1.5ML | |
| NanoDrop OneC Spettrofotometro UV-Vis a microvolume | Thermo Scientific | 13400519 | |
| Parafilm | Bemis | S37440 | |
| PEG-8000 | SRL | 54866 | |
| QIAquick PCR & Kit di pulizia del gel | Qiagen | 28506 | |
| Qubit 4 Fluorimetro (con WiFi) | Thermofisher | Q33238 | |
| Provette per saggi Qubit | Thermofisher | Q32856 | |
| Kit di reagenti Qubitt per ds DNA, ampia gamma | Thermo Scientific | Q32853 (500 saggi) | |
| Cloruro di sodio | HiMedia | TC046M-500G | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Termociclatore Invitrogen | S33102 | |
| T100 | BioRad | 1861096 | |
| Termociclatore (sistema PCR ProFlex 3 x 32 pozzetti) | Applied Biosystems | ||
| Wizard | Promega | A1125 |
Riferimenti
- Kirby, A. E., et al. Using wastewater surveillance data to support the COVID-19 response - United States, 2020-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 70 (36), 1242-1244 (2021).
- Amman, F., et al. Viral variant-resolve....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
