Articolo metodologico

Chiarire le proprietà fisico-chimiche di #946;-1,3-glucanasi e perossidasi del meccanismo di difesa della parete cellulare del grano contro l'infestazione da Diuraphis noxia

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DOI:

10.3791/66903

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26 luglio 2024

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1Carbohydrates and Enzymology Laboratory (CHEM-LAB), Department of Plant Sciences, University of the Free State, 2Faculty of Natural and Agricultural Sciences, Department of Plant Science, Botany, Plant Biochemistry and Physiology, University of the Free State, 3Agricultural Research Council - Small Grain Institute

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive le procedure utilizzate per studiare e caratterizzare gli enzimi correlati alla parete cellulare, principalmente β-1,3-glucanasi e perossidasi, nelle piante di frumento. I loro livelli di attività aumentano durante l'interazione grano-RWA e sono coinvolti nella risposta di difesa delle piante attraverso il rinforzo della parete cellulare, che scoraggia l'alimentazione degli afidi.

Abstract

Le piante di grano infestate dagli afidi russi del grano (RWA) inducono una cascata di risposte di difesa, tra cui le risposte di ipersensibilità (HR) e l'induzione di proteine correlate alla patogenesi (PR), come la β-1,3-glucanasi e la perossidasi (POD). Questo studio mira a caratterizzare le proprietà fisico-chimiche della POD associata alla parete cellulare e della β-1,3-glucanasi e a determinare il loro sinergismo sulla modifica della parete cellulare durante l'interazione RWASA2-grano. Le cultivar Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 suscettibili, moderatamente resistenti sono state pregerminate e piantate in serra, fertilizzate 14 giorni dopo la semina e irrigate ogni 3 giorni. Le piante sono state infestate da 20 individui partenogenetici dello stesso clone RWASA2 allo stadio di 3 foglie e le foglie sono state raccolte da 1 a 14 giorni dopo l'infestazione. Il liquido di lavaggio intercellulare (IWF) è stato estratto mediante filtrazione sottovuoto e conservato a -20 °C. I residui fogliari sono stati frantumati in polvere e utilizzati per i componenti della parete cellulare. L'attività e la caratterizzazione del POD sono state determinate utilizzando 5 mM di substrato di guaiacolo e H2O2, monitorando la variazione dell'assorbanza a 470 nm. L'attività della β-1,3-glucanasi, il pH e le condizioni ottimali di temperatura sono stati dimostrati misurando gli zuccheri riducenti totali nell'idrolizzato con il reagente DNS utilizzando substrati di β-1,3-glucano e β-1,3-1,4-glucano, misurando l'assorbanza a 540 nm e utilizzando la curva standard del glucosio. Il pH ottimale è stato determinato tra pH 4 e 9, la temperatura ottimale tra 25 e 50 °C e la stabilità termica tra 30 °C e 70 °C. La specificità del substrato di β-1,3-glucanasi è stata determinata a 25 °C e 40 °C utilizzando substrati di cagliata e orzo β-1,3-1,4-glucano. Inoltre, la modalità d'azione della β-1,3-glucanasi è stata determinata utilizzando la laminaribiosio alla laminaripentasio. I modelli di prodotti dell'idrolisi degli oligosaccaridi sono stati analizzati qualitativamente con cromatografia su strato sottile (TLC) e analizzati quantitativamente con HPLC. Il metodo presentato in questo studio dimostra un approccio robusto per infestare il grano con RWA, estraendo la perossidasi e la β-1,3-glucanasi dalla regione della parete cellulare e la loro caratterizzazione biochimica completa.

Introduzione

Gli afidi russi del grano (RWA) infestano il grano e l'orzo, causando una significativa perdita di resa o una riduzione della qualità del grano. Il frumento risponde all'infestazione inducendo diverse risposte di difesa, tra cui l'aumento dei livelli di attività della β-1,3-glucanasi e della perossidasi nelle cultivar resistenti, mentre le cultivar sensibili riducono l'attività di questi enzimi nel periodo di infestazione precoce 1,2,3,4. Le funzioni chiave della β-1,3-glucanasi e della POD nella pianta di frumento includevano la regolazione dell'accumulo di callosio nella cultivar resistente e l'estinzione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) sulla parete cellulare e sulle regioni apoplastiche durante l'infestazione da RWA 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 hanno dimostrato che c'era una forte correlazione tra l'aumento dell'attività delle POD e l'aumento del contenuto di lignina nella cultivar di grano resistente in seguito a infestazioni da RWASA2. Inoltre, l'aumento del contenuto di lignina indicava che la parete cellulare della cultivar di grano resistente infestata era rinforzata, portando a una riduzione dell'alimentazione RWA.

La maggior parte dei gruppi di ricercatori ha estratto e studiato la β-1,3-glucanasi apoplastica e la POD durante l'interazione grano/orzo-RWA; inoltre, la maggior parte di questi studi ha affermato che questi enzimi influenzano la parete cellulare della pianta di grano infestata da RWA senza misurare la presenza dell'enzima nella regione della parete cellulare. Solo pochi studi hanno utilizzato tecniche microscopiche per dimostrare che i livelli di attività della β-1,3-glucanasi erano collegati alla regolazione del calcosio 7,8,9 o hanno estratto i principali componenti della parete cellulare per dimostrare la correlazione tra le attività del POD e la modifica della parete cellulare nel 6,10 resistente. La mancanza di sondare l'associazione β-1,3-glucanasi e POD alla parete cellulare indica la necessità di sviluppare metodi che consentano ai ricercatori di misurare direttamente gli enzimi legati alla parete cellulare.

Il metodo attuale propone che sia necessario rimuovere il fluido apoplastico dal tessuto fogliare prima di estrarre gli enzimi legati alla parete cellulare. La procedura di estrazione del liquido apoplastico deve essere eseguita due volte dal tessuto fogliare, che viene utilizzato per estrarre gli enzimi legati alla parete cellulare. Questo processo riduce la contaminazione e la confusione degli enzimi apoplastici con quelli che si trovano nelle regioni della parete cellulare. Pertanto, in questo studio, abbiamo estratto il POD legato alla parete cellulare, la β-1,3-glucanasi e la β-glucanasi specifica per MLG e abbiamo eseguito la loro caratterizzazione biochimica.

Protocollo

Lo studio è stato condotto con l'approvazione e il permesso del Comitato Etico per la Ricerca Ambientale e sulla Biosicurezza dell'Università del Free State (UFS-ESD2022/0131/22). I dettagli dei reagenti e dell'attrezzatura qui sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Condizioni di crescita delle piante

  1. Germinare 250 semi di ogni cultivar di grano, cioè Tugela suscettibile, Tugela-Dn1 moderatamente resistente e Tugela-Dn5 resistente, in piastre di Petri separate.
  2. Aggiungere 5 ml di acqua distillata in ciascuna capsula di Petri, sigillare con una pellicola di paraffina e incubare nella camera di germinazione impostata a 25 °C per 2 giorni.
  3. Trapiantare i semi germinati di ogni cultivar in vasi da 15 cm contenenti terriccio 1:1 e muschio di torba (15 piante per vaso) in condizioni di serra controllata.
  4. Impostare i regimi di temperatura rispettivamente a 18 °C e 24 °C di notte e di giorno.
  5. Irrigare le piante ogni 3 giorni con acqua di rubinetto e fornire loro 2 g/L di fertilizzante 14 giorni dopo la germinazione.
  6. Metti le piante in gabbie racchiuse in reti e lasciale crescere fino al terzo stadio fogliare 2,6 (con quattro repliche biologiche di ogni cultivar).

2. Infestazione da cultivar di grano con RWASA2

  1. Infestare le cultivar di grano Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 con RWASA2 secondo Jimoh et al.11 e Mohase e Taiwe12.
  2. Tieni le piante in due gruppi separati in gabbie; infestare un set con 20 individui partenogenetici dello stesso clone RWASA2 per pianta in ogni vaso nelle camere di crescita coperte con reti. Tenete un'altra serie di piante di grano in una stanza separata sotto la camera di crescita con reti pulite e trattatele come controlli.
    NOTA: Tenere i due trattamenti in locali separati e coprire le piante in gabbie racchiuse in reti. Inoltre, nel caso in cui in uno studio vengano utilizzati due diversi biotipi di RWA, tenere il più possibile le piante infestate da un biotipo di RWA da quelle infestate dal secondo biotipo o in stanze separate sotto camere di crescita coperte da reti per evitare ogni possibile contaminazione incrociata del RWASA2.
  3. Per la raccolta, selezionare la seconda e la terza foglia in due diversi regimi temporali, periodo di alimentazione a breve termine (1, 2 e 3 giorni) e periodo di alimentazione a lungo termine (7 e 14 giorni) e avvolgerle in tovaglioli di carta umidi.
  4. Trasferisci immediatamente le foglie raccolte in una scatola contenente ghiaccio per ridurre il metabolismo delle foglie prima dell'estrazione del liquido di lavaggio intercellulare (IWF).

3. Estrazione del liquido di lavaggio intercellulare (IWF) dall'apoplasto

  1. Tagliare le foglie raccolte di circa tre cultivar di grano in pezzi di 7 cm.
  2. Sciacquare due volte i pezzi di foglia in acqua distillata per rimuovere eventuali contaminazioni citosoliche dalle estremità tagliate 6,13.
  3. Inserire i pezzi di foglia in una provetta di vetro a pareti spesse e immergere i campioni nel tampone di estrazione (50 mM Tris-HCl, pH 7,8).
  4. Applicare l'infiltrazione sottovuoto per 5 minuti utilizzando una pompa a getto d'acqua per impregnare le foglie con il tampone di estrazione.
  5. Successivamente, rimuovere i pezzi di foglia dal tubo di vetro e asciugarli con un tovagliolo di carta.
  6. Inserire i pezzi di foglie essiccate verticalmente nelle provette da centrifuga preraffreddate dotate di dischi forati e centrifugare a 500 x g per 10 minuti a 4 °C.
  7. Utilizzare una pipetta da 100 μl per raccogliere il surnatante in provette per microcentrifuga da 1,5 mL pre-raffreddate.
  8. Ripetere l'intera procedura di estrazione con lo stesso materiale fogliare.
  9. Unire il surnatante raccolto e conservarlo a -20° C.
    NOTA: Le aliquote del surnatante sono trattate come fonte del contenuto di apoplast o IWF. L'IWF non è stato utilizzato nel presente studio, ma era importante rimuoverlo dai tessuti fogliari prima di estrarre la β-1,3-glucanasi e la perossidasi (POD) legate alla parete cellulare.

4. Estrazione della β-1,3-glucanasi associata alla parete cellulare e del POD

NOTA: I residui fogliari rimasti dopo l'estrazione IWF sono stati utilizzati per estrarre le proteine della parete cellulare totale.

  1. Schiacciare i residui fogliari in polvere fine con azoto liquido usando un mortaio e un pestello.
  2. Trasferire circa 200 mg di tessuto fogliare in polvere in un mortaio contenente 4 mL di tampone di estrazione (50 mM di fosfato di sodio con 1% (p/v) di polivinilpolipirrolidone (PVPP); pH 5,0) seguito da una macinazione con un pestello fino a ottenere una pasta liscia, che viene quindi trasferita in provette per microcentrifuga.
  3. Incubare la miscela nelle provette da microcentrifuga per 3 minuti con ghiaccio e poi centrifugare a 10.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
  4. Raccogliere il surnatante (estratti proteici totali) in provette da microcentrifuga (aliquote da 2 mL) e utilizzarlo come fonte di β-1,3-glucanasi e POD per l'intero studio.

5. Determinazione dello standard proteico

  1. Determinare la concentrazione proteica totale degli estratti seguendo il metodo Bradford14.
  2. Preparare le soluzioni di albumina sierica bovina (BSA) alle concentrazioni di 0,0 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL e 1,0 mg/mL disciolte in 50 mM di tampone fosfato di sodio per generare lo standard proteico.
  3. Preparare lo standard aggiungendo 10 μl di ciascuna soluzione BSA nella micropiastra a 96 pozzetti con 190 μl (0,25% v/v) di reagente Bradford (vedere la tabella dei materiali).
  4. Incubare a 25 °C per 20 minuti e misurare l'assorbanza a 595 nm utilizzando il lettore di micropiastre e utilizzare i valori di assorbanza per preparare la curva standard per quantificare la concentrazione proteica.
  5. Quantificare la concentrazione proteica
    1. Aggiungere 10 μl dell'enzima estratto (fase 4) in una micropiastra a 96 pozzetti con 190 μl (0,25% v/v) di reagente Bradford in triplicati.
    2. Incubare a temperatura ambiente (25 °C) per 20 min.
    3. Misurare l'assorbanza a 595 nm utilizzando lo spettrofotometro con lettore di micropiastre e utilizzare i valori di assorbanza per determinare la concentrazione proteica utilizzando BSA come standard proteico (preparato al punto 5.4).

6. Preparare lo standard glicemico per l'attività della β-1,3-glucanasi

  1. Preparare le soluzioni standard con concentrazioni comprese tra 0,00 mg/mL e 1,0 mg/mL (0,0 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1,0 mg/mL) con glucosio disciolto in acqua distillata.
  2. Aggiungere 300 μl di ciascuna soluzione di glucosio e 600 μl di reagente dell'acido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) in un rapporto 1:2 in provette da microcentrifuga da 1,5 mL e incubare le reazioni a 100 °C per 5 minuti (vedere la tabella dei materiali per i reagenti DNS) (Miller et al.15).
  3. Lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente prima di misurare l'assorbanza a 540 nm utilizzando lo spettrofotometro.
  4. Utilizzare i valori medi di assorbanza per sviluppare la curva standard per determinare l'attività dell'enzima β-1,3-glucanasi.

7. Determinazione del saggio di attività della β-1,3-glucanasi

NOTA: L'attività enzimatica della β-1,3-glucanasi legata alla parete cellulare estratta da Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 è stata determinata dalla quantità di zuccheri riducenti totali rilasciati dall'idrolisi di substrati misti di β-1,3-1,4-glucano (MLG) e 0,4% (p/v) β-1,3-glucano utilizzando un metodo modificato come descritto da Miller et al.15. Conservare sempre i tubi con le aliquote proteiche sul ghiaccio. Se i campioni sono stati congelati, scongelarli con ghiaccio e procedere immediatamente dopo lo scongelamento.

  1. Aggiungere 200 μl dell'estratto enzimatico (mantenere la concentrazione proteica compresa tra 20 μg/mL e 90 μg/mL in tutte le reazioni, salvo diversa indicazione) e 300 μl del substrato disciolto in 50 mM di tampone citrato di sodio (pH 5,0) nelle provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
    NOTA: Eseguire una reazione parallela in bianco senza l'estratto enzimatico per tutti i substrati (primo bianco) e il bianco enzimatico è costituito da estratto enzimatico senza substrato (secondo bianco). Sia il substrato che l'estratto enzimatico sono stati sostituiti con il tampone rispettivamente nel primo e nel secondo nero.
  2. Incubare le reazioni a 37 °C per 24 ore e terminare la reazione riscaldando a 100 °C per 5 minuti, quindi centrifugare a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
  3. Miscelare 300 μl di surnatante con 600 μl di reagente DNS (rapporto 1:2) in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 mL e far bollire a 100 °C per 5 min.
  4. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e misurare l'assorbanza a 540 nm utilizzando lo spettrofotometro.
    NOTA: Se la concentrazione di zuccheri riducenti totali è elevata nella miscela, si otterrà una soluzione marrone scuro, difficile da leggere utilizzando lo spettrofotometro. Pertanto, è necessaria un'ulteriore diluizione dei campioni prima di leggere l'assorbanza.
  5. Utilizzare la curva standard del glucosio sviluppata al punto 6.4 per determinare l'attività enzimatica nelle unità SI della curva standard.
  6. Per convertire l'attività in un'attività specifica espressa in μmol glucosio/h/mg di proteina, utilizzare l'equazione seguente:
    Attività specifica = [(attività enzimatica/180.16)*1000]/tempo/concentrazione proteica
    NOTA: Converte l'attività enzimatica in mg/mL in g/mL; 180,16 g/mol è il peso molecolare del glucosio, 1000 è un fattore che converte M in micromoli, il tempo è il periodo di reazione e la concentrazione dell'estratto proteico è rappresentata in mg/mL. Un'unità di attività della β-1,3-glucanasi è definita come 1 μmol di glucosio rilasciato dal substrato entro un periodo di reazione di 1 ora.

8. Determinazione dell'attività della perossidasi (POD)

NOTA: L'attività della perossidasi legata alla parete cellulare delle cultivar di frumento Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 è stata determinata quantificando la formazione del tetra-guaiacolo prodotto per unità di tempo dal guaiacolo16.

  1. Aggiungere 30 μl di estratto enzimatico, 30 μl di 1% (v/v) H2O2 e 970 μl di 5 mM di guaiacolo nelle cuvette a 25 °C.
    NOTA: Eseguire la reazione in bianco senza l'estratto enzimatico (primo bianco) e un altro bianco per campioni enzimatici senza substrato (secondo bianco). I campioni di enzima o substrato sono stati sostituiti da 50 mM di tampone fosfato di sodio rispettivamente nel primo e nel secondo bianco.
  2. Utilizzare la modalità cinetica dello spettrofotometro per monitorare la variazione dell'assorbanza a 470 nm.
  3. Determinare la pendenza in cui il grafico era lineare e utilizzarla come valore di assorbanza.
  4. Calcola l'assorbanza media e usala nel calcolo dell'attività POD.
  5. Calcolare l'attività della perossidasi utilizzando il coefficiente di estinzione molare del guaiacolo (26,6 mM-1 cm-1) ed esprimere l'attività in μmol tetra-guaiacolo/min/mg di proteina.
  6. Calcola l'attività del POD usando l'equazione utilizzata da Mafa et al.6:
    ATTIVITÀ DEL POD = [(ΔABS × DF) ÷ Concentrazione proteica] × 26,6 mM-1 cm-1 × 1 cm
    NOTA: Dove ΔABS = assorbanza media; DF = fattore di diluizione; 26,6 mM-1 cm-1 = coefficiente di estinzione del guaiacolo.

9. Caratterizzazione POD

NOTA: I saggi di caratterizzazione POD sono stati condotti utilizzando estratti enzimatici di Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 a 3 giorni dopo l'infestazione, seguendo metodi simili descritti nella fase 8, con lievi variazioni dei tamponi di reazione e delle temperature. I campioni di enzimi sono stati sempre tenuti in ghiaccio durante gli esperimenti. Esegui le reazioni in quadruplicate con una reazione in bianco parallela.

  1. Per ottenere saggi di pH ottimali, eseguire i seguenti passaggi.
    1. Sciogliere il substrato di guaiacolo in tamponi da 50 mM (citrato di sodio, pH 4 e 5), fosfato di sodio (pH 6 e 7) e Tris-HCl (pH 8 e 9) (vedere la Tabella dei materiali).
    2. Eseguire le reazioni a 25 °C come descritto al punto 8.
  2. Per saggi di temperatura ottimali, eseguire i seguenti passaggi.
    1. Eseguire le reazioni rispettivamente a 25 °C, 30 °C, 40 °C e 50 °C.
    2. Utilizzare il substrato di guaiacolo disciolto nel tampone pH 5 (pH ottimale) ed eseguire le reazioni come descritto al punto 8.
  3. Per i test di termostabilità, eseguire i seguenti passaggi.
    1. Prima di iniziare le reazioni, incubare l'enzima a 37 °C, 50 °C e 70 °C per 30 minuti.
    2. Eseguire le reazioni secondo i metodi descritti al punto 8 utilizzando 50 mM di tampone citrato di sodio (pH 5) e a 40 °C (temperatura ottimale).

10. Caratterizzazione della β-1,3-glucanasi

NOTA: Condurre i saggi di caratterizzazione seguendo il metodo descritto nella fase 7 utilizzando estratti enzimatici da 3 dpi, con alcune modifiche ai tamponi di reazione e alle temperature. Eseguire le reazioni in quadruplicati, con una reazione parallela in bianco per ogni substrato.

  1. Per saggi di pH ottimali, procedere come segue:
    1. Sciogliere i substrati MLG e β-1,3-glucano in tamponi da 50 mM (citrato di sodio, pH 4 e 5), fosfato di sodio (pH 6 e 7) e Tris-HCl (pH 8 e 9).
    2. Eseguire la reazione come descritto nel passaggio 7.
  2. Per saggi di temperatura ottimali, procedere come segue:
    1. Eseguire le reazioni rispettivamente a 25 °C, 30 °C, 40 °C e 50 °C.
    2. Utilizzare substrati MLG e β-1,3-glucano disciolti nel tampone citrato di sodio 50 mM (pH 5) con pH ottimale (ottenuto al punto 10.1) ed eseguire le reazioni come descritto al punto 7.
  3. Per i saggi di termostabilità, procedere come segue:
    1. Prima di iniziare le reazioni, incubare l'enzima a 37 °C, 50 °C e 70 °C per 30 minuti.
    2. Eseguire le reazioni utilizzando substrati disciolti in 50 mM di tampone citrato di sodio (pH 5) e incubare a 25 °C e 40 °C per 24 ore.

11. Valutazione del meccanismo d'azione della β-1,3-glucanasi su diversi substrati di glucano

NOTA: I substrati del glucano contengono lo stesso residuo di glucosio nella loro spina dorsale, ma i legami glicosidici tra le unità di glucopiranosio sono diversi e possono assumere l'orientamento α o β17. I legami glicosidici possono formarsi tra diversi atomi di carbonio di molecole di glucosio, definendo la loro struttura chimica, ad esempio β-1,3-glucano, β-1,4-glucano e β-1,3-1,4-glucano legato misto (MLG)18,19,20. Il meccanismo d'azione della β-1,3-glucanasi è stato determinato utilizzando campioni di Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn 5 infestati da RWASA2 (fonti enzimatiche) e i seguenti substrati β-1,3-glucano (CM-curdlan), MLG (da orzo) e β-1,4-glucano (AZO-CM-Cellulosa). Il meccanismo d'azione viene determinato in condizioni ottimali di saggio (25 °C e 40 °C, pH 5,0), utilizzando substrati MLG allo 0,1% (p/v) di β-1,4-glucano, 0,4% (p/v) β-1,3-glucano o 0,5% (p/v).

  1. Sciogliere i substrati in 50 mM di tampone citrato di sodio (pH 5).
  2. Aggiungere 200 μl dell'estratto enzimatico e 300 μl del substrato nelle provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
  3. Incubare le reazioni a due temperature separate, 25 °C e 40 °C per 8 ore.
  4. Terminazione delle reazioni mediante riscaldamento a 100 °C.
  5. Centrifugare la miscela di reazione di β-1,3-glucano e MLG a 10,000 x g per 10 minuti a 4 °C e procedere come descritto al punto 7.3.
  6. Per il β-1,4-glucano, dopo aver terminato la reazione a 100 °C, diluire la miscela con 800 μL di etanolo assoluto e centrifugare a 4 °C per 10 min a 10,000 x g.
  7. Trasferire il surnatante nelle curve, misurare l'assorbanza a 590 nm con lo spettrofotometro e calcolare l'attività della β-1,3-glucanasi sulla β-1,4-glucano utilizzando la procedura del produttore (vedi Tabella dei materiali) ed esprimere l'attività in Unità/mg di proteine.

12. Determinazione del meccanismo d'azione della β-1,3-glucanasi

NOTA: La modalità d'azione della β Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 indotta da RWASA2-infestate da Tugela-Dn5 è stata analizzata con laminarin-oligosaccaridi (LAM) con un grado di polimerizzazione (DP) compreso tra 5 e 2. Utilizzare il kit per cromatografia su strato sottile (TLC), cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) e glucosio ossidasi perossidasi (GOPOD) per determinare la DP necessaria alla β-1,3-glucanasi per idrolizzare il substrato. Il TLC è stato utilizzato per l'analisi qualitativa e l'LC-MS è stato utilizzato per l'analisi quantitativa, che ha determinato la concentrazione degli oligosaccaridi nell'idrolizzato dopo la reazione21.

  1. Preparare le reazioni della modalità d'azione della β-1,3-glucanasi
    NOTA: Preparare l'estratto proteico concentrato con un filtro a membrana concentrante per centrifuga da 10 kDa, e quindi avere estratti proteici concentrati e non concentrati infestati da RWASA2 per l'esperimento.
    1. Per concentrare gli enzimi estratti da ciascuna cultivar, trasferire 5 mL di estratti nei filtri a membrana concentratori centrifughi da 10 kDa.
    2. Centrifugare le provette filtranti a membrana contenenti estratto a 15.000 x g per 30 minuti a 4 °C.
    3. Sciogliere la laminaripentaosio (LAM5), la laminaritetraosio (LAM4), la laminaritriosio (LAM3) e la laminaribiosio (LAM2) (vedere la tabella dei materiali) in 50 mM di citrato di sodio (pH 5) per ottenere 10 mg/mL.
    4. Per avviare la reazione, aggiungere 20 μl di estratto proteico e 40 μl di laminaripentaosio (LAM5), laminaritetraosio (LAM4), laminaritriosio (LAM3) e laminaribiosio (LAM2).
    5. Incubare la reazione a 40 °C per 16 ore e terminare con ebollizione a 100 °C per 5 minuti.
  2. Eseguire la cromatografia su strato sottile (TLC)
    1. Tagliare 4 lastre di silice in2 pezzi da 10 cm e tracciare una linea sulla superficie della piastra, lasciando uno spazio di 1 cm dal fondo di un bordo.
    2. Segna i punti sopra la linea e segnali in base alle diverse cultivar e DP dei laminarin-oligosaccaridi, a 1 cm di distanza e. Prendi 2 piastre di silice per l'estratto proteico concentrato e le altre 2 per gli estratti non concentrati.
    3. Aggiungere 3 μl delle miscele di reazione da 3 a 5 volte sui punti contrassegnati corrispondenti sulla piastra di silice e lasciare asciugare completamente i punti sulla piastra prima di ripetere il processo.
    4. Mettere delicatamente le piastre di silice nel serbatoio TLC contenente la fase mobile di n-butanolo: acido acetico: acqua (2:1:1 v/v/v) con il lato contenente le macchie dei campioni sul fondo.
    5. Lasciare che la fase mobile si sposti dal basso verso l'alto della piastra.
      NOTA: Questo passaggio può richiedere circa 2 ore. Non spostare o disturbare il serbatoio durante la separazione dei campioni.
    6. Togliete le piastre dalla fase mobile e lasciatele asciugare a temperatura ambiente.
    7. Aggiungere la soluzione colorante nel piccolo contenitore, immergere delicatamente la lastra di silice nella soluzione colorante di naftolo allo 0,3% (p/v) in etanolo al 95% (v/v) utilizzando acido solforico al 5% (v/v) per 5 s, rimuoverla e lasciarla asciugare a temperatura ambiente.
      NOTA: A questo punto, accendere il blocco riscaldante/forno e impostare la temperatura a 100 °C.
    8. Mettere le piastre di silice essiccate sul blocco riscaldante e scaldare a 100 °C per 7-10 minuti o fino a quando non compaiono le macchie blu-violacee. Scatta foto delle lastre di silice che mostrano le macchie blu-viola e documentale.
  3. Quantificare la concentrazione di idrolizzati laminarin-oligosaccaridi
    NOTA: La concentrazione degli idrolizzati LAM sarà quantificata sia per gli estratti proteici concentrati che per quelli non concentrati21.
    1. Aggiungere 20 μl di ciascun campione su una colonna C18 (carboidrati 4,6 × 250 mm) e lasciare separare a una velocità di flusso di 500 μl/min utilizzando un gradiente di acqua (solvente A) e acetonitrile (solvente B) dal 100% B al 60% B in 10 minuti, seguito da fasi di riequilibrio della colonna con un tempo di esecuzione totale di 20 minuti per consentire il riequilibrio della colonna.
    2. Ionizzare gli analiti a rilascio in modalità elettrospray negativo nella sorgente ionica per spettrometria di massa con una temperatura di riscaldamento di 400 °C per far evaporare il solvente in eccesso, 30 psi di gas di nebulizzazione, 30 psi di gas di riscaldamento e 20 psi di gas di cortina.
    3. Impostare il potenziale di declustering a 350 V.
    4. Analizzare gli analiti eluiti sullo spettrometro di massa in una modalità di scansione Q1 che va da 150 Da a 1000 Da con un tempo di permanenza di 3 s.
    5. Registrare le concentrazioni degli analiti sul foglio di calcolo.
  4. Quantificare la concentrazione di glucosio
    1. Analizzare la concentrazione di glucosio prodotta dall'idrolisi della laminarina utilizzando il reagente GOPOD seguendo le istruzioni del produttore22,23.
    2. Misurare l'assorbanza a 510 nm in modalità fissa dello spettrofotometro.

13. Raccolta e analisi dei dati

  1. Randomizzare tutti gli esperimenti per evitare distorsioni durante l'infestazione o la raccolta del campione e condurre l'analisi in quadruplicati.
  2. Salvo diversa indicazione, utilizzare i mezzi ± deviazione standard per rappresentare i valori nei grafici e nelle tabelle generati dai dati sperimentali raccolti.
  3. Utilizzare Microsoft Excel per analizzare tutti i dati e generare grafici.
  4. Esegui analisi statistiche con software compatibile.
    NOTA: eseguire l'analisi multifattoriale della varianza (ANOVA) per verificare la significatività tra i trattamenti e l'LSD di Fisher per verificare la presenza di gruppi omogenei a un valore alfa di 0,05.

Risultati

Quattro repliche biologiche di cultivar di frumento (Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5) sono state infestate da RWASA2 nella fase di crescita a 3 foglie. Dopo l'infestazione, le foglie sono state raccolte a 1, 2, 3, 7 e 14 dpi. I trattamenti di controllo non sono stati infestati con RWASA2 per rendere i risultati dell'esperimento paragonabili a quelli delle piante di grano non esposte a stress. Gli esperimenti sono stati condotti in quadruplicati e i risultati sono stati presentati come valori medi.

Le concentrazioni proteiche sia degli estratti infestati da RWASA2 che di quelli di controllo sono state quantificate utilizzando BSA come standard proteico. Ciò è stato utile per determinare l'attività enzimatica della β-1,3-glucanasi e della POD e per garantire che le concentrazioni proteiche utilizzate in ogni reazione fossero note per ogni campione; Le differenze erano trascurabili. I dati possono essere presentati in formato grafico o tabellare. Il primo formato di grafico è stato utilizzato per esprimere le attività enzima-specifiche (asse y) tracciate rispetto ai giorni successivi all'infestazione (asse x) sia per l'attività enzimatica che per i risultati del test di caratterizzazione. L'aumento dell'attività specifica della β-1,3-glucanasi, della β-glucanasi MLG-specifica e della POD in campioni di Tugela-Dn5 resistenti infestati da RWASA2 ha dimostrato che gli enzimi hanno svolto un ruolo nella risposta di difesa (Figura 1 e Figura 2). Inoltre, entrambi gli enzimi hanno perso significativamente attività nel tempo nel suscettibile Tugela infestato da RWASA2.

La caratterizzazione biochimica della β-1,3-glucanasi e della POD associate alla parete cellulare è stata determinata esprimendo l'attività in percentuali di attività relativa o di attività enzimatica specifica, rappresentate rispettivamente da grafici a linee e a barre (Figura 3). Il risultato ha mostrato che sia la β-1,3-glucanasi che la POD avevano condizioni ottimali di pH simili (pH 5) corrispondenti alle condizioni della parete cellulare acida (Figura 3). È importante notare che la β-glucanasi MLG-specifica ha mostrato anche un'attività specifica a pH 5. Tuttavia, era più stabile alle condizioni di base rispetto alla β-1,3-glucanasi, che ha perso fino all'80% di attività relativa nella stessa condizione. I risultati hanno confermato che due enzimi che catalizzano i substrati MLG e β-1,3-glucano sono stati estratti con successo dalla regione della parete cellulare in base al pH ottimale. Questa affermazione è stata convalidata dai risultati dei test di termostabilità (Figura 4), che hanno confermato che la β-1,3-glucanasi poteva tollerare solo temperature fino a 50 °C e perdeva oltre l'80% di attività relativa a 70 °C (POD aveva gli stessi profili). Al contrario, l'enzima β-glucanasi specifico per MLG ha mostrato l'attività più alta a 25 °C seguita da un'attività gradualmente diminuita, ma questo enzima ha mantenuto oltre il 50% di attività relativa a 50 °C e 70 °C. Le osservazioni hanno confermato che la β-glucanasi MLG-specifica ha mostrato proprietà biochimiche uniche rispetto alla β-1,3-glucanasi e alla POD estratta da Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5.

La modalità d'azione della β-1,3-glucanasi è stata dimostrata con laminarin-oligosaccaridi con un DP compreso tra 5 e 2 (indicato come LAM5 a LAM2). I risultati della TLC hanno mostrato che Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 infestati avevano un enzima β-1,3-glucanasi che idrolizzava principalmente oligosaccaridi più lunghi (LAM5 e LAM4) rispetto a quelli più corti (LAM3). L'intensità delle macchie blu-viola visualizzate sulla lastra TLC ha mostrato che LAM5 e LAM4 avevano bande meno intense, seguite da LAM3 nelle cultivar resistenti e moderatamente resistenti (Figura 5). La cultivar suscettibile di Tugela ha dimostrato che la β-1,3-glucanasi idrolizza il LAM5 meglio di altri oligosaccaridi (LAM4-LAM2), che hanno mostrato bande intense più elevate. La modalità d'azione è anche espressa come le concentrazioni degli idrolizzati, presentate in una tabella con una mappa di calore che mostra un'efficiente idrolisi degli oligosaccaridi laminarinici con DP più elevata e un'attività moderata durante l'idrolisi degli oligosaccaridi più corti (LAM3 e LAM2) (Tabella 1).

figure-results-1
Figura 1: L'attività specifica della perossidasi estratta da Tugela (A), Tugela-Dn1 (B) e Tugela-Dn5 (C) infestati da RWASA2 14 giorni dopo l'infestazione. Gli esperimenti sono stati eseguiti in quadruplicati; i valori e le barre di errore rappresentano rispettivamente le medie ± SD. L'U nella proteina U/mg rappresenta il μmol di tetra-guaiacolo/min. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

figure-results-2
Figura 2: L'attività specifica della β-1,3-glucanasi misurata nelle cultivar Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 infestate da RWASA2. L'attività enzimatica è stata condotta utilizzando due substrati di glucano chimicamente distinti, cioè β-1,3-1,4-glucano (A-C) e cagliano (D-F) legati in modo misto. Gli esperimenti sono stati eseguiti in quadruplicati; i valori e le barre di errore rappresentano rispettivamente le medie ± SD. La proteina U in U/mg rappresenta μmol/h. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

figure-results-3
Figura 3: I saggi del pH ottimale dell'enzima β-1,3-glucanasi estratto da Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 infestati da RWASA2 a 3 giorni dall'infestazione. Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando substrati misti di linkage-β-1,3-1,4-glucano (A-C) e cagliata (D-F). Gli esperimenti sono stati eseguiti in quadruplicati; i valori e le barre di errore rappresentano rispettivamente le medie ± SD. La proteina U in U/mg rappresenta μmol/h. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

figure-results-4
Figura 4: Saggio di termostabilità. I saggi di termostabilità della β-1,3-glucanasi provenienti da Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 infestati da RWASA2 3 giorni dopo l'infestazione, studiati su β-1,3-1,4-glucano (A-C) e β-1,3-glucano (D-F). Gli esperimenti sono stati eseguiti in quadruplicati; i valori e le barre di errore rappresentano rispettivamente le medie ± SD. La proteina U in U/mg rappresenta μmol/h. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

figure-results-5
Figura 5: Analisi del meccanismo d'azione della β-1,3-glucanasi su oligosaccaridi laminarini. Gli oligosaccaridi laminarinici erano rappresentati da L5, L4, L3 e L2, equivalenti rispettivamente a laminaripentaosio (LAM5), laminaritetraosio (LAM4), laminaritriosio (LAM3) e laminaribiosio (LAM2). La freccia rossa mostra il glucosio (GLU) e la freccia blu mostra i profili dell'enzima senza gli oligosaccaridi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Laminarin-oligosaccaridi prodotti con concentrato di β-1,3-glucanasi estratta da cultivar di frumento infestate da RWASA2 per 3 giorni. Le concentrazioni degli oligosaccaridi nell'idrolizzato sono state determinate con LC-MS. LAM5, LAM4, LAM3, LAM2 e GLU rappresentano rispettivamente laminaripentasio, laminaritetraosio, laminaritriosio, laminaribiosio e glucosio. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Il grano e l'orzo sono colture cerealicole frequentemente infestate da specie di afidi, tra cui gli afidi russi del grano (Diuraphis noxia)7,24. Le piante di grano resistenti inducono l'upregolazione delle attività della POD e della β-1,3-glucanasi come risposte di difesa durante il periodo di infestazione per modificare la parete cellulare regolando l'accumulo di calclosio e lignina 6,25,26,27. È importante notare che la maggior parte degli studi ha estratto il POD e gli enzimi β-1,3-glucanasi dall'apoplasto 3,12,28, rendendo le loro funzioni di parete cellulare altamente speculative. L'attuale studio ha sviluppato un metodo che estrae la β-1,3-glucanasi legata alla parete cellulare, la β-glucanasi specifica per MLG e la POD come parte della proteina totale. Questi enzimi erano altamente attivi nelle cultivar di frumento resistenti rispetto al controllo, mentre la loro attività era ritardata nelle cultivar sensibili. L'uso dei controlli negli esperimenti ha aiutato a comprendere gli effetti dell'infestazione sui livelli di attività degli enzimi legati alla parete. Il campionamento dei tessuti della terza e della seconda foglia per campioni infestati o di controllo è importante perché garantisce coerenza. Inoltre, campionare l'infestato e il controllo con lo stesso periodo perché l'attività del POD, della β-1,3-glucanasi e della β-glucanasi specifica per MLG aumentano la crescita delle piantine di grano.

Il substrato di cagliata utilizzato in questo studio ha una struttura chimica simile a quella del callosio, un polimero depositato nella regione della parete cellulare durante l'interazione grano-RWA 7,24. Il substrato MLG dell'orzo rappresenta la parte della parete cellulare dell'emicellulosa presente in bassa proporzione rispetto allo xilano nella maggior parte delle monocotiledoni. I substrati sono stati disciolti in tampone di sodio citrato pH 5 per imitare la condizione acida della regione29 della parete cellulare della pianta. Se la β-1,3-glucanasi e la β-glucanasi MLG-specifica venissero rimosse con l'IWF, la proteina totale estratta dal tessuto fogliare rimanente non avrebbe attività sui substrati MLG e cagliata. Inoltre, se gli estratti proteici provenissero dalla regione citoplasmatica, mostrerebbero attività nell'intervallo di pH neutro. È interessante notare che entrambi gli enzimi erano presenti nell'estratto proteico totale perché idrolizzavano con successo i substrati MLG e cagliata. L'idrolisi del MLG e della cagliata da parte dei rispettivi enzimi ha prodotto gli zuccheri riducenti, che sono stati rilevati dal reagente DNS seguendo un metodo modificato da Mafa et al.6. Quando i campioni hanno una concentrazione di zuccheri riducenti totali più elevata, il colore del reagente DNS cambia da giallo a marrone scuro o cambia colore da giallo a marrone chiaro (sembra arancione scuro) quando la concentrazione di zuccheri riducenti è bassa.

Il substrato di guaiacolo è stato utilizzato per misurare l'attività del POD. A causa dell'elevata efficienza catalitica del POD, abbiamo misurato la sua attività utilizzando la modalità cinetica dello spettrofotometro. La POD viene attivata dalla bassa concentrazione di H2O2 in presenza del substrato (Guaiacolo). L'attività di questo enzima converte il guaiacolo in tetra-guaiacolo, che è un composto di colore marrone-arancio. La produzione del tetra-guaiacolo conferma che il POD lega i composti fenolici per produrre oligomeri o incorpora composti fenolici nella lignina. Il POD ha mostrato livelli di attività più elevati nel Tugela-Dn5 resistente infestato da RWASA2, seguito da Tugela-Dn1 moderatamente resistente rispetto ai controlli. Tuttavia, i livelli di attività delle POD sono stati significativamente ridotti nel tempo nel Tugela suscettibile infestato. I risultati di questo studio sono stati supportati dall'affermazione che le cultivar di grano resistenti infestate da RWASA2 utilizzano il POD per rafforzare la loro parete cellulare reticolando le connessioni lignina o lignina-emicellulosa6. Il POD richiedeva H2O2 per funzionare, il che indica che riduceva l'ossidazione o lo sbiancamento dei carboidrati strutturali della parete cellulare regolando i livelli di H2O2 nella regione della parete cellulare.

Sono state utilizzate diverse condizioni di pH e temperatura per determinare le condizioni biochimiche ottimali per questi enzimi legati alla parete cellulare. Le condizioni ottimali hanno mostrato che gli enzimi hanno attività ottimali a pH acido (pH 5), il che suggerisce che erano associati alla regione della parete cellulare. La temperatura ottimale per la β-1,3-glucanasi è stata ottenuta a 25 °C e 40 °C durante l'idrolisi di substrati di β-1,3-1,4-glucano e β-1,3-glucano, rispettivamente. Questa osservazione ha confermato che le β-1,3-glucanasi e la β-glucanasi MLG-specifica erano due diversi enzimi indotti nella regione della parete cellulare di cultivar di frumento resistenti durante l'infestazione da RWASA2. Anche se la caratterizzazione biochimica è un metodo promettente per scoprire o identificare diversi enzimi con substrati simili, si consiglia comunque di utilizzare altri metodi laboriosi ma accurati, tra cui il western blotting e i saggi di zimogramma. Infine, non siamo riusciti a quantificare la modalità di attività enzimatica per la β-glucanasi MLG-specifica a causa della mancanza di oligosaccaridi MLG. Tuttavia, le β-1,3-glucanasi estratte da Tugela-Dn5 e Tugela-Dn1 infestate da RWASA2 hanno mostrato un'attività più elevata su LAM5, LAM4 e LAM3, mentre quella proveniente da Tugela suscettibile ha mostrato un'attività più elevata su LAM5 e LAM4. Ciò conferma che lo studio della modalità di attività enzimatica può anche rilevare sottili differenze tra le β-1,3-glucanasi indotte nelle cultivar resistenti e suscettibili infestate da RWA.

Il presente studio fornisce una procedura dettagliata per l'estrazione degli enzimi legati alla parete cellulare dal tessuto fogliare di grano. Dopo l'estrazione, abbiamo identificato tre enzimi legati alla parete cellulare, vale a dire la β-1,3-glucanasi, la β-glucanasi specifica per MLG e il POD. I livelli di attività di questi enzimi erano significativamente più alti nelle cultivar Tugela-Dn1 moderatamente resistenti e Tugela-Dn5 infestate da RWASA2 rispetto ai controlli. Questi hanno confermato che gli enzimi legati alla parete cellulare hanno contribuito alla risposta di difesa nelle cultivar resistenti. I risultati della caratterizzazione danno un'idea che la POD della parete cellulare e la β-1,3-glucanasi funzionano nelle stesse condizioni, suggerendo che rinforzano sinergicamente la parete cellulare durante l'interazione grano-RWASA2.

Sono state identificate alcune limitazioni che interferiscono con gli attuali protocolli discussi. La carenza di piante di grano può limitare il materiale fogliare disponibile per estrarre i campioni di enzimi. Se l'IWF dall'apoplast non viene estratto con successo dai campioni di foglie prima di estrarre gli enzimi della parete cellulare, può portare alla combinazione di apoplast ed enzimi della parete cellulare. La combinazione dell'IWF e degli enzimi della regione della parete cellulare rende difficile lo studio degli enzimi legati alla parete cellulare che sono legati nella parete cellulare. Non sono state identificate altre limitazioni nell'attuale protocollo.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi coinvolto in questo lavoro.

Ringraziamenti

M. Mafa ha ricevuto finanziamenti dalla NRF-Thuthuka (numero di riferimento: TTK2204102938). S.N. Zondo ha ricevuto la borsa di studio post-laurea della National Research Foundation per il suo diploma di laurea magistrale. Gli autori sono grati all'Agricultural Research Council - Small Grain Institute (ARC-SG) per aver fornito i semi utilizzati in questo studio. Tutte le opinioni, i risultati e le raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e, pertanto, i finanziatori non si assumono alcuna responsabilità al riguardo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dispositivo a membrana di concentrazione centrifuga da 10 kDaSigma-AldrichR1NB84206Solo per uso di ricerca. Non per l'uso nelle procedure diagnostiche. Per la concentrazione e la purificazione di soluzioni biologiche.
2 g LaminaribioseMegazyme (Wicklow, Irlanda)O-LAM2Laminaribiosio ad alta purezza per l'uso nella ricerca, nei saggi enzimatici biochimici e nell'analisi diagnostica in vitro.
3 g LaminaritriosioMegazyme (Wicklow, Irlanda)O-LAM3Laminaritriosio ad alta purezza per l'uso nella ricerca, nei saggi enzimatici biochimici e nell'analisi diagnostica in vitro.
3,5 Acido salicilico dianitroSigma-AldrichD0550Utilizzato nella determinazione colorimetrica degli zuccheri riducenti
4 g Laminaritetraose Megazyme (Wicklow, Irlanda)O-LAM4Laminaritetraosio ad alta purezza per l'uso nella ricerca, nei saggi enzimatici biochimici e nell'analisi diagnostica in vitro.
5 g LaminaripentaoseMegazyme (Wicklow, Irlanda)O-LAM5Laminaripentaosio ad alta purezza per l'uso nella ricerca, nei saggi enzimatici biochimici e nell'analisi diagnostica in vitro.
95% Etanolo assolutoSigma-Aldrich107017Etanolo assoluto per analisi
acido aceticoSigma-AldrichB00063Acido acetc glaciale 100% per analisi (contiene acido acetico)
Azo-CM-CellulosaMegazima (Wicklow, Irlanda)S-ACMCIl polisaccaride è colorato con Remazolbrilliant Blue R in una misura di circa una molecola di colorante ogni 20 residui di zucchero.
Beta glucano (orzo) Megazyme (Wicklow, Irlanda)G6513Un substrato in polvere, meno solubile in acqua. Utilizzato per determinare l'attività della β-1,3-glucanasi.
dosaggio delle proteine Bio-Rad Bio-RadLaboratories, Sudafrica500-0006Colorante per test colorimetrico, concentrato, per l'uso con i kit per il dosaggio delle proteine Bio-Rad I e II 
Albumina sierica bovina (BSA)Gibco Europe810-1018Solo per uso di laboratorio
Acido citratoSigma-AldrichC0759Solo per la ricerca nelle scienze della vita. Non per l'uso in procedure diagnostiche.
CM-cagliata Megazyme (Wicklow, Ireland)P-CMCURSubstrato in polvere per la determinazione dell'attività della β-1,3-glucanasi. Insolubile in acqua.
D-GlucosioSigma-AldrichG8270Solo per la ricerca nelle scienze della vita. Non per l'uso in procedure diagnostiche.
GuaiacoloSigma-AldrichG5502Indicatore di ossidazione. Utilizzato per determinare l'attività della perossidasi.
Perossido di idrogenoBDH Laboratory Supplies, Inghilterra10366Potente agente ossidante.
Mikskaar Professional SubstarteMikskaar (Estonia)Substrato perpiantine a base di muschio di torba NI.
Fertilizzante Multifeed (5.2.4 (43))Multifeed ClassicB1908248Un fertilizzante idrosolubile per giovani piante in via di sviluppo e piantine con un elevato fabbisogno di fosforo (P) per garantire uno sviluppo ottimale delle radici.
NaphtholMerck, GermaniaN2780Subisce idrogenazioni in presenza di un catalizzatore.
FenoloSigma-Aldrich33517Sensibile alla luce. Per R& D Utilizzare solo. Non per uso farmacologico, domestico o di altro tipo. SDS disponibile
Tartrato di potassio e sodio tetraidrato (sale di Rochelle)Sigma-AldrichS2377utilizzato nella preparazione della soluzione di acido 3,5-dinitrosalicilico utilizzato nella determinazione dello zucchero riducente.
Piastra di silice (TLC Gel di silice 60 F254)Sigma-Aldrich60778-25EAMatrice di gel di silice, con indicatore fluorescente 254 nm
Idrossido di sodioSigma-AldrichS8045Per R& D Utilizzare solo. Non per uso farmacologico, domestico o di altro tipo.
Metabisolfito di sodioSigma-Aldrich31448Aggiunto come antiossidante durante la preparazione di soluzioni di acido 3,5-dinitrosalicilico.
Sodio fosfato bibasico eptaidratoSigma-AldrichS9390Utilizzato come soluzione tampone nella ricerca biologica per mantenere costante il pH.
Fosfato di sodio eptaidrato monobasicoSigma-Aldrich71500Un composto inorganico, solubile in acqua. Utilizzato come reagente nello sviluppo di malte a base di silicati.
Software di analisi statisticaTIBCO Statisticaversione 13.1
Acido solforicoMerck, Darmstadt, Germania30743Acido solforico 95-97% per l'analisi di Hg, reagente ACS.
Tris-HClSigma-Aldrich 10812846001Agente tampone nelle miscele di incubazione. È stato anche utilizzato come componente della lisi e del tampone TE (Tris-EDTA). Solo per la ricerca nel campo delle scienze della vita. Non per l'uso in procedure diagnostiche.
UV– Spettrofotometro visibileGENESYS 120 
  NI = non identificato.
Colorante per il

Riferimenti

  1. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
  2. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
  3. Moloi, M. J., Vander Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
  4. Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
  5. Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
  6. Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
  7. Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects - A review. J Plant Physiol. 269, 153582(2022).
  8. Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
  9. Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
  10. Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
  11. Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
  12. Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
  13. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
  16. Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
  17. Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
  18. Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
  19. Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , Sodertorn University College. Stockholm. (2008).
  20. Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94(2011).
  21. Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
  22. Megazyme. GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
  23. Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under draught stress. Plants. 11 (3), 394(2022).
  24. Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
  25. Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
  26. Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358(2014).
  27. Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747(2021).
  28. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
  29. Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).

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