Il presente protocollo descrive le procedure utilizzate per studiare e caratterizzare gli enzimi correlati alla parete cellulare, principalmente β-1,3-glucanasi e perossidasi, nelle piante di frumento. I loro livelli di attività aumentano durante l'interazione grano-RWA e sono coinvolti nella risposta di difesa delle piante attraverso il rinforzo della parete cellulare, che scoraggia l'alimentazione degli afidi.
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Articolo metodologico
Chiarire le proprietà fisico-chimiche di #946;-1,3-glucanasi e perossidasi del meccanismo di difesa della parete cellulare del grano contro l'infestazione da Diuraphis noxia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le piante di grano infestate dagli afidi russi del grano (RWA) inducono una cascata di risposte di difesa, tra cui le risposte di ipersensibilità (HR) e l'induzione di proteine correlate alla patogenesi (PR), come la β-1,3-glucanasi e la perossidasi (POD). Questo studio mira a caratterizzare le proprietà fisico-chimiche della POD associata alla parete cellulare e della β-1,3-glucanasi e a determinare il loro sinergismo sulla modifica della parete cellulare durante l'interazione RWASA2-grano. Le cultivar Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 suscettibili, moderatamente resistenti sono state pregerminate e piantate in serra, fertilizzate 14 giorni dopo la semina e irrigate ogni 3 giorni. Le piante sono state infestate da 20 individui partenogenetici dello stesso clone RWASA2 allo stadio di 3 foglie e le foglie sono state raccolte da 1 a 14 giorni dopo l'infestazione. Il liquido di lavaggio intercellulare (IWF) è stato estratto mediante filtrazione sottovuoto e conservato a -20 °C. I residui fogliari sono stati frantumati in polvere e utilizzati per i componenti della parete cellulare. L'attività e la caratterizzazione del POD sono state determinate utilizzando 5 mM di substrato di guaiacolo e H2O2, monitorando la variazione dell'assorbanza a 470 nm. L'attività della β-1,3-glucanasi, il pH e le condizioni ottimali di temperatura sono stati dimostrati misurando gli zuccheri riducenti totali nell'idrolizzato con il reagente DNS utilizzando substrati di β-1,3-glucano e β-1,3-1,4-glucano, misurando l'assorbanza a 540 nm e utilizzando la curva standard del glucosio. Il pH ottimale è stato determinato tra pH 4 e 9, la temperatura ottimale tra 25 e 50 °C e la stabilità termica tra 30 °C e 70 °C. La specificità del substrato di β-1,3-glucanasi è stata determinata a 25 °C e 40 °C utilizzando substrati di cagliata e orzo β-1,3-1,4-glucano. Inoltre, la modalità d'azione della β-1,3-glucanasi è stata determinata utilizzando la laminaribiosio alla laminaripentasio. I modelli di prodotti dell'idrolisi degli oligosaccaridi sono stati analizzati qualitativamente con cromatografia su strato sottile (TLC) e analizzati quantitativamente con HPLC. Il metodo presentato in questo studio dimostra un approccio robusto per infestare il grano con RWA, estraendo la perossidasi e la β-1,3-glucanasi dalla regione della parete cellulare e la loro caratterizzazione biochimica completa.
Introduzione
Gli afidi russi del grano (RWA) infestano il grano e l'orzo, causando una significativa perdita di resa o una riduzione della qualità del grano. Il frumento risponde all'infestazione inducendo diverse risposte di difesa, tra cui l'aumento dei livelli di attività della β-1,3-glucanasi e della perossidasi nelle cultivar resistenti, mentre le cultivar sensibili riducono l'attività di questi enzimi nel periodo di infestazione precoce 1,2,3,4. Le funzioni chiave della β-1,3-glucanasi e della POD nella pianta di frumento includevano la regolazione....
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Protocollo
Lo studio è stato condotto con l'approvazione e il permesso del Comitato Etico per la Ricerca Ambientale e sulla Biosicurezza dell'Università del Free State (UFS-ESD2022/0131/22). I dettagli dei reagenti e dell'attrezzatura qui sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Condizioni di crescita delle piante
- Germinare 250 semi di ogni cultivar di grano, cioè Tugela suscettibile, Tugela-Dn1 moderatamente resistente e Tugela-Dn5 resistente, in piastre di Petri separate.
- Aggiungere 5 ml di acqua distillata in ciascuna capsula di Petri, sigillare con una pellicola di paraff....
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Risultati
Quattro repliche biologiche di cultivar di frumento (Tugela, Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5) sono state infestate da RWASA2 nella fase di crescita a 3 foglie. Dopo l'infestazione, le foglie sono state raccolte a 1, 2, 3, 7 e 14 dpi. I trattamenti di controllo non sono stati infestati con RWASA2 per rendere i risultati dell'esperimento paragonabili a quelli delle piante di grano non esposte a stress. Gli esperimenti sono stati condotti in quadruplicati e i risultati sono stati presentati come valori medi.
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Discussione
Il grano e l'orzo sono colture cerealicole frequentemente infestate da specie di afidi, tra cui gli afidi russi del grano (Diuraphis noxia)7,24. Le piante di grano resistenti inducono l'upregolazione delle attività della POD e della β-1,3-glucanasi come risposte di difesa durante il periodo di infestazione per modificare la parete cellulare regolando l'accumulo di calclosio e lignina 6,25,26,27.<.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi coinvolto in questo lavoro.
Ringraziamenti
M. Mafa ha ricevuto finanziamenti dalla NRF-Thuthuka (numero di riferimento: TTK2204102938). S.N. Zondo ha ricevuto la borsa di studio post-laurea della National Research Foundation per il suo diploma di laurea magistrale. Gli autori sono grati all'Agricultural Research Council - Small Grain Institute (ARC-SG) per aver fornito i semi utilizzati in questo studio. Tutte le opinioni, i risultati e le raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e, pertanto, i finanziatori non si assumono alcuna responsabilità al riguardo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dispositivo a membrana di concentrazione centrifuga da 10 kDa | Sigma-Aldrich | R1NB84206 | Solo per uso di ricerca. Non per l'uso nelle procedure diagnostiche. Per la concentrazione e la purificazione di soluzioni biologiche. |
| 2 g Laminaribiose | Megazyme (Wicklow, Irlanda) | O-LAM2 | Laminaribiosio ad alta purezza per l'uso nella ricerca, nei saggi enzimatici biochimici e nell'analisi diagnostica in vitro. |
| 3 g Laminaritriosio | Megazyme (Wicklow, Irlanda) | O-LAM3 | Laminaritriosio ad alta purezza per l'uso nella ricerca, nei saggi enzimatici biochimici e nell'analisi diagnostica in vitro. |
| 3,5 Acido salicilico dianitro | Sigma-Aldrich | D0550 | Utilizzato nella determinazione colorimetrica degli zuccheri riducenti |
| 4 g Laminaritetraose | Megazyme (Wicklow, Irlanda) | O-LAM4 | Laminaritetraosio ad alta purezza per l'uso nella ricerca, nei saggi enzimatici biochimici e nell'analisi diagnostica in vitro. |
| 5 g Laminaripentaose | Megazyme (Wicklow, Irlanda) | O-LAM5 | Laminaripentaosio ad alta purezza per l'uso nella ricerca, nei saggi enzimatici biochimici e nell'analisi diagnostica in vitro. |
| 95% Etanolo assoluto | Sigma-Aldrich | 107017 | Etanolo assoluto per analisi |
| acido acetico | Sigma-Aldrich | B00063 | Acido acetc glaciale 100% per analisi (contiene acido acetico) |
| Azo-CM-Cellulosa | Megazima (Wicklow, Irlanda) | S-ACMC | Il polisaccaride è colorato con Remazolbrilliant Blue R in una misura di circa una molecola di colorante ogni 20 residui di zucchero. |
| Beta glucano (orzo) | Megazyme (Wicklow, Irlanda) | G6513 | Un substrato in polvere, meno solubile in acqua. Utilizzato per determinare l'attività della β-1,3-glucanasi. |
| dosaggio delle proteine Bio-Rad Bio-Rad | Laboratories, Sudafrica | 500-0006 | Colorante per test colorimetrico, concentrato, per l'uso con i kit per il dosaggio delle proteine Bio-Rad I e II |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Gibco Europe | 810-1018 | Solo per uso di laboratorio |
| Acido citrato | Sigma-Aldrich | C0759 | Solo per la ricerca nelle scienze della vita. Non per l'uso in procedure diagnostiche. |
| CM-cagliata | Megazyme (Wicklow, Ireland) | P-CMCUR | Substrato in polvere per la determinazione dell'attività della β-1,3-glucanasi. Insolubile in acqua. |
| D-Glucosio | Sigma-Aldrich | G8270 | Solo per la ricerca nelle scienze della vita. Non per l'uso in procedure diagnostiche. |
| Guaiacolo | Sigma-Aldrich | G5502 | Indicatore di ossidazione. Utilizzato per determinare l'attività della perossidasi. |
| Perossido di idrogeno | BDH Laboratory Supplies, Inghilterra | 10366 | Potente agente ossidante. |
| Mikskaar Professional Substarte | Mikskaar (Estonia) | Substrato per | piantine a base di muschio di torba NI. |
| Fertilizzante Multifeed (5.2.4 (43)) | Multifeed Classic | B1908248 | Un fertilizzante idrosolubile per giovani piante in via di sviluppo e piantine con un elevato fabbisogno di fosforo (P) per garantire uno sviluppo ottimale delle radici. |
| Naphthol | Merck, Germania | N2780 | Subisce idrogenazioni in presenza di un catalizzatore. |
| Fenolo | Sigma-Aldrich | 33517 | Sensibile alla luce. Per R& D Utilizzare solo. Non per uso farmacologico, domestico o di altro tipo. SDS disponibile |
| Tartrato di potassio e sodio tetraidrato (sale di Rochelle) | Sigma-Aldrich | S2377 | utilizzato nella preparazione della soluzione di acido 3,5-dinitrosalicilico utilizzato nella determinazione dello zucchero riducente. |
| Piastra di silice (TLC Gel di silice 60 F254) | Sigma-Aldrich | 60778-25EA | Matrice di gel di silice, con indicatore fluorescente 254 nm |
| Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | S8045 | Per R& D Utilizzare solo. Non per uso farmacologico, domestico o di altro tipo. |
| Metabisolfito di sodio | Sigma-Aldrich | 31448 | Aggiunto come antiossidante durante la preparazione di soluzioni di acido 3,5-dinitrosalicilico. |
| Sodio fosfato bibasico eptaidrato | Sigma-Aldrich | S9390 | Utilizzato come soluzione tampone nella ricerca biologica per mantenere costante il pH. |
| Fosfato di sodio eptaidrato monobasico | Sigma-Aldrich | 71500 | Un composto inorganico, solubile in acqua. Utilizzato come reagente nello sviluppo di malte a base di silicati. |
| Software di analisi statistica | TIBCO Statistica | versione 13.1 | |
| Acido solforico | Merck, Darmstadt, Germania | 30743 | Acido solforico 95-97% per l'analisi di Hg, reagente ACS. |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich 10812846001 | Agente tampone nelle miscele di incubazione. È stato anche utilizzato come componente della lisi e del tampone TE (Tris-EDTA). Solo per la ricerca nel campo delle scienze della vita. Non per l'uso in procedure diagnostiche. | |
| UV– Spettrofotometro visibile | GENESYS 120 | ||
| NI = non identificato. |
Riferimenti
- Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
- Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Glycoproteins fr....
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Ristampe e permessi
