Articolo metodologico

Utilizzo di un modello di cuore di ratto funzionante isolato per testare le strategie di conservazione del cuore del donatore

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DOI:

10.3791/66910

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4 ottobre 2024

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1Cardiac Physiology and Transplantation, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent's Healthcare Clinical Campus, University of New South Wales, 3Heart and Lung Transplant Unit, St Vincent's Hospital, 4Faculty of Medicine, University of New South Wales

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un protocollo di funzionamento del cuore di ratto isolato ex vivo per testare le strategie di conservazione del cuore del donatore. Questo documento descrive il protocollo per l'uso nelle celle frigorifere statiche dei cuori dei donatori di roditori; Tuttavia, il protocollo può essere utilizzato anche per i cuori dei donatori ottenuti dopo la donazione dopo la morte circolatoria e la morte cerebrale.

Abstract

L'ottimizzazione delle soluzioni di conservazione del cuore del donatore ha svolto un ruolo chiave nella riduzione del danno da ischemia-riperfusione nei cuori dei donatori durante il prelievo, il trasporto e il trapianto di organi. Precedenti lavori del nostro laboratorio hanno dimostrato che l'aggiunta di gliceril trinitrato ed eritropoietina alle soluzioni di conservazione del cuore del donatore potrebbe migliorare significativamente il recupero funzionale cardiaco dopo una prolungata conservazione a freddo e nella donazione dopo la morte circolatoria dei cuori. Questo protocollo di integrazione è stato implementato nell'uso clinico nelle unità di trapianto in Australia, Belgio e Regno Unito. Qui, delineiamo un protocollo per testare le strategie di integrazione utilizzando un circuito di perfusione del cuore di ratto funzionante isolato (IWRH) ex vivo . Utilizzando questa metodologia, le strategie di integrazione possono essere testate nel contesto della conservazione statica a freddo prolungata, della donazione dopo la morte cerebrale e della donazione dopo la morte circolatoria della conservazione del cuore del donatore. Il recupero funzionale cardiaco, misurato dal flusso aortico, dal flusso coronarico, dalla gittata cardiaca, dalla pressione del polso e dalla frequenza cardiaca, può essere utilizzato per determinare se una particolare strategia di conservazione può ridurre al minimo il danno da ischemia-riperfusione del cuore del donatore.

Introduzione

Il successo di un trapianto di cuore può essere notevolmente influenzato dal metodo di conservazione utilizzato per il cuore del donatore. I cuori dei donatori sono soggetti a insulti ischemici durante il processo di prelievo, trasporto e trapianto degli organi. Il grado di danno ischemico all'organo del donatore può essere mitigato selezionando un'appropriata strategia di conservazione del cuore del donatore. La conservazione statica a freddo (CSS) rimane il metodo più fattibile e comune per la conservazione del cuore del donatore; tuttavia, la CSS potrebbe non essere necessariamente l'opzione migliore per tutti i percorsi di donazione del cuore. Ad esempio, i cuori prelevati tramite la via della donazione dopo la morte circolatoria (DCD) vengono mantenuti e valutati per la vitalità utilizzando la perfusione meccanica normotermica, mentre i cuori prelevati tramite la via della donazione dopo la morte cerebrale (DBD) possono essere preservati utilizzando la CSS o la perfusione meccanica ipotermica. Un altro fattore determinante per la strategia di conservazione utilizzata è la quantità di ischemia calda (per DCD) o di ischemia fredda (per DBD) a cui il cuore è sottoposto durante l'approvvigionamento e il trasporto degli organi.

Molti centri utilizzano un'integrazione farmacologica aggiuntiva della soluzione di conservazione del cuore per aumentare la tolleranza ischemica e migliorare la funzione cardiaca post-trapianto. Gli studi sui roditori del nostro laboratorio hanno dimostrato che l'integrazione della cardioplegia con eritropoietina e gliceril trinitrato è stata in grado di migliorare significativamente il recupero funzionale cardiaco dopo una prolungata conservazione a freddo del cuore del donatore 1,2. Questi studi sono poi passati a studi suini sulla conservazione del cuore del donatore e hanno fornito le basi precliniche che hanno portato all'incorporazione dell'eritropoietina e del gliceril trinitrato nella soluzione cardioplegica dei cuori prelevati tramite una via DCD utilizzando la perfusione meccanica normotermica 3,4,5. Attualmente, l'integrazione con eritropoietina e gliceril trinitrato è utilizzata anche nelle unità di trapianto australiane per i recuperi cardiaci clinici DBD che incorporano CSS. L'obiettivo generale del protocollo di perfusione del cuore di ratto funzionante isolato (IWRH) descritto di seguito è quello di testare le strategie di conservazione del cuore del donatore in un ambiente di laboratorio e testarne l'efficacia nel preservare la funzione cardiaca del donatore dopo la riperfusione. Il protocollo isolato funzionante del cuore di ratto descritto è stato utilizzato per oltre due decenni all'interno del nostro laboratorio e si è dimostrato estremamente utile nello screening di potenziali integratori e/o strategie che possono migliorare la conservazione del cuore del donatore 2,7,8,9.

Protocollo

Tutti gli animali hanno ricevuto cure umanitarie in conformità con le linee guida del National Health and Medical Research Council (Australia). Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico Animale del Garvan Institute of Medical Research (Sydney, Australia).

1. Preparazione del tampone Krebs-Henseleit (KH)

  1. Preparare 2 L di una soluzione madre 20x di tampone KH contenente 2,36 M NaCl, 0,094 M KCl, 0,024 M MgSO4, 0,024 M KH2PO4. Aliquotare in provette da 50 mL e conservare a -20 °C.
  2. Prima dell'esperimento, preparare due fiasche Erlenmyer da 2 L di 1x tampone KH contenente 1900 mL di acqua deionizzata, 100 mL di 20x tampone KH di riserva, 4,20 g di NaHCO3 (25 mM) e 3,96 g di glucosio (11 mM).
    1. Porre i palloni tampone in un bagno d'acqua a 37 °C e gasare la soluzione con carbogeno (95% di ossigeno, 5% di anidride carbonica, portata impostata a 2 L/min) tramite pietre porose (filtro di ingresso slip-on) per 5 minuti, quindi aggiungere 2,8 mL di 1 M CaCl2 (1,4 mM). Continuare a far bollire la soluzione per almeno 1 ora prima dell'inizio dell'esperimento. L'uso di una pietra porosa favorisce un'aerazione uniforme del tampone.
    2. Mettere un piccolo volume (~50 mL) di tampone in un piatto rotondo di metallo a -20 °C per raffreddare e formare uno strato di tampone ghiacciato.

2. Preparazione del circuito di perfusione

  1. Assicurarsi che tutti i tubi e la vetreria siano puliti e non presentino crescita/contaminazione visibile.
  2. Impostare le altezze delle camere di vetro in modo che corrispondano alle pressioni di perfusione richieste basate su 1 cm H2O equivalenti a 1,36 mmHg: Langendorff-cuore 100 cm (circa 75 mmHg), precarico di lavoro da lato a cuore 15 cm (circa 11 mmHg), cuore-camera di postcarico 100 cm (circa 75 mmHg).
  3. Iniziare la circolazione dell'acqua calda intorno al circuito almeno 10 minuti prima della perfusione cardiaca.
  4. Posizionare i filtri in microfibra (1,2 μm) nei portafiltri e fissarli saldamente.
  5. Adescare il circuito con tampone KH, assicurandosi che tutta l'aria venga rimossa, e utilizzare un morsetto per tubi di controllo del flusso per regolare il flusso sul lato Langendorff (Figura 1A, B) a ~50 mL/min. Il flusso più lento facilita l'incannulamento aortico e impedisce che il cuore si stacchi prima della legatura. Posizionare un termometro all'interno del circuito tramite un connettore per tubi a forma di T per monitorare la temperatura del tampone a ~37 °C.

3. Configurazione del software Lab Chart (analisi dei dati)

  1. Assicurarsi che Powerlab (sistema di acquisizione dati) e il flussometro siano accesi e collegati al computer prima di aprire il software di analisi dei dati.
  2. Apri un nuovo file.
  3. Imposta la raccolta dei dati selezionando il menu a discesa Impostazioni e selezionando Impostazioni canale. Selezionare Pressione aortica, Flusso aortico e Frequenza cardiaca (Figura 2A).
  4. Configurare ciascun canale con le impostazioni mostrate nella Figura 2B.

4. Preparazione dell'animale per l'isolamento del cuore di ratto

NOTA: La metodologia per l'isolamento e la perfusione del cuore di ratto per cuori non DBD e non DCD per la conservazione statica a freddo è descritta di seguito. I metodi per la strumentazione cardiaca sul circuito di perfusione sono relativamente simili, indipendentemente dal metodo di donazione utilizzato. Le differenze nel protocollo per la donazione di cuore di ratto DBD e DCD si verificano principalmente dal momento in cui l'anestesia animale ha avuto effetto fino a quando il cuore viene asportato dall'animale.

  1. Pesare l'animale, assicurandosi che il suo peso sia di >330 g. L'intervallo di peso ideale per i ratti maschi è di 330-420 g.
  2. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Garantire un adeguato piano chirurgico di anestesia basato sull'assenza di un riflesso del pedale (riflesso del pizzicamento delle dita) e del riflesso del battito delle palpebre.
  3. Posizionare l'animale in posizione supina, fissando gli arti con del nastro adesivo. Somministrare ossigeno all'animale attraverso un cono nasale.
  4. Avere il contenitore metallico per granita di ghiaccio tampone KH e un piccolo contenitore metallico con ghiaccio alla stazione di dissezione. Immergere una garza di 7,5 cm x 7,5 cm nel tampone KH e posizionarla sul contenitore con ghiaccio.
  5. Una volta confermato un adeguato piano chirurgico di anestesia, radere la pelle nel sito dell'incisione chirurgica e pulire la pelle con asettico come betadine o alcol al 70%. Praticare un'incisione laterale attraverso l'addome (laparotomia) e spostare lo stomaco e l'intestino lateralmente per consentire l'accesso alla vena renale sinistra. Iniettare 1500 UI di eparina e applicare pressione sul sito di iniezione fino a quando l'emorragia non si ferma. Attendere 1-2 minuti affinché l'eparina circoli prima di continuare con il recupero del cuore.
  6. Aprire la cavità toracica tagliando la gabbia toracica su entrambi i lati e tagliando il diaframma. Tenere e sollevare con cautela il blocco cuore-polmone mentre si taglia lungo l'aorta discendente, assicurandosi che l'arco aortico rimanga intatto. Ciò consentirà di mantenere una lunghezza sufficiente dell'aorta per l'incannulamento.
  7. Il ratto viene soppresso mediante la rimozione del cuore e dei polmoni mentre è sotto anestesia. Immergere il blocco cuore-polmone nella fanghiglia di ghiaccio tampone KH per consentire al cuore di arrestarsi.

5. Incannulare il cuore sul circuito di perfusione cardiaca funzionante isolato

  1. Trasferire il blocco cuore-polmone in una garza con ghiaccio. Sezionare il grasso in eccesso intorno all'aorta, tagliare l'aorta in modo da lasciare una lunghezza di 3-5 mm per l'incannulamento e praticare una piccola incisione di ~1-2 mm nell'arteria polmonare. Ciò consentirà un percorso per l'effluente coronarico.
  2. Posizionare il blocco cuore-polmone tagliato (mentre è ancora sul ghiaccio) direttamente sotto le cannule. Regolare il flusso dal lato di Langendorff utilizzando un morsetto per tubi di controllo del flusso per facilitare l'incannulamento aortico. Incannulare con cura l'aorta sulla cannula sinistra, tenerla con una pinza nera e legarla con una sutura di seta 2-0.
  3. Aumentare il flusso dalla perfusione di Langendorff aprendo completamente il morsetto del tubo di controllo del flusso. Aprire il morsetto di postcarico. Assicurarsi che ci sia un flusso continuo dalla camera Langendorff. Inizia a monitorare l'attività cardiaca con il software.
    NOTA: se il valore del flusso aortico sul display del flussometro è di <10 ml/min, assicurarsi che l'arteriotomia polmonare sia di dimensioni sufficienti. Un traccia/valore basso del flusso aortico potrebbe anche indicare che la cannula aortica è stata inserita troppo in profondità.
  4. Regolare il blocco cuore-polmone in modo che la superficie anteriore dei polmoni sia rivolta verso l'operatore. Legare il lobo polmonare sinistro con una sutura di seta 2-0 e tagliare il tessuto polmonare sinistro in eccesso. Legare i lobi polmonari rimanenti in una sola passata con una sutura di seta 2-0 e tagliare il tessuto. Ruota il cuore in modo che i polmoni legati siano rivolti verso la parte posteriore.
  5. Usando piccole forbici Vannas, tagliare un bordo di 2-3 mm dell'appendice atriale sinistra, assicurandosi di ottenere una piccola apertura negli atri. Incannulare con cura l'appendice atriale sinistra alla cannula sinistra, tenerla con una pinza nera e legarla con una sutura di seta 2-0. La Figura 3A mostra il posizionamento di entrambe le cannule.
  6. Regolare la camicia d'acqua della camera cardiaca in modo che il cuore si trovi al centro della camera.
  7. Aprire il trasduttore di pressione in aria e azzerare il trasduttore di pressione nel software selezionando il menu a discesa Pressione aortica > Bridge Amp > Zero. Fare clic su OK.
  8. Perfondere il cuore in modalità Langendorff per 10 min. Assicurarsi che il flusso aortico di Langendoff misuri tra 10 e 20 ml/min (ideale 20 ml/min).
  9. Prima di cambiare la modalità di lavoro, assicurarsi che la pietra porosa (filtro di ingresso slip-on) del serbatoio tampone Langendorff KH sia collocata nel serbatoio tampone KH funzionante.
  10. Passa il cuore in modalità di lavoro chiudendo il grande morsetto che porta alla cannula aortica e aprendo il flusso che porta all'appendice atriale sinistra. Aprire il rubinetto a tre direzioni che porta dal lavoro perfusare. Trasferire il tubo di ritorno comune (riportando il tampone KH al serbatoio) dal serbatoio di Langendorff al serbatoio di lavoro.
  11. Perfondere il cuore in modalità di lavoro per 15 min. I valori del flusso aortico devono idealmente essere di >30 mL/min al termine di 15 minuti di perfusione. Una volta che il cuore si è stabilizzato, inizia a registrare i dati nel software di analisi dei dati.
  12. Misurare l'effluente coronarico (flusso coronarico) a 1 min, 5 min, 10 min e 15 min.
    NOTA: I valori di flusso coronarico devono essere compresi tra 10 e 20 mL/min. Un flusso coronarico superiore a 22 mL/min indica generalmente una perdita originata da un vaso polmonare slegato. La frequenza cardiaca dovrebbe essere compresa tra 200 e 300 bpm. Gli effluenti coronarici possono essere raccolti per l'analisi a valle dei marcatori di lesione tissutale (ad esempio, troponina-I, rilascio di lattato deidrogenasi).

6. Somministrazione di cardioplegia per la conservazione statica fredda del cuore

  1. Riempire la camera cardioplegica (posizionata a un'altezza di 60 cm per produrre una pressione di perfusione di circa 40 mmHg) con 50 ml di soluzione di conservazione cardiaca designata (con o senza supplementazione).
  2. Abbassare la camicia d'acqua e chiudere il rubinetto a tre vie sul lato della modalità di lavoro.
  3. Arrestare il flusso verso la cannula atriale sinistra chiudendo il morsetto.
  4. Aprire il flusso alla cannula aortica.
  5. Chiudere la pinza dal lato Langendoff e sul postcarico.
  6. Aprire la pinza dalla linea di cardioplegia ed eliminare 15 ml di cardioplegia dalla linea di pressione. Chiudere il rubinetto in corrispondenza della linea di pressione.
  7. Consentire al cuore di essere lavato con la cardioplegia attraverso la cannula aortica e raccogliere l'effluente coronarico. Eseguire la cardioplegia per 3 minuti e registrare il volume di cardioplegia somministrata.
  8. Interrompere la registrazione dei dati nel software e salvare il file.
  9. Dopo 3 minuti, chiudere la pinza cardioplegica e la piccola pinza blu che porta alla cannula aortica.
  10. Posizionare un morsetto per bulldog sulla cannula aortica e un secondo morsetto per bulldog sulla cannula sinistra. Scollegare il blocco cuore-cannula dal circuito e posizionarlo in un becher contenente cardioplegia in una ghiacciaia (Figura 3B, C).
  11. Conservare il cuore in frigorifero per 6 ore (o il tempo di conservazione a freddo desiderato).

7. Riperfusione cardiaca dopo conservazione statica a freddo

  1. Preparare il tampone KH come indicato nella sezione 1.
  2. Adescare il circuito di perfusione come da sezione 2.
  3. Aprire il file salvato dalla perfusione basale.
  4. Rimuovere con cautela il blocco cuore-cannula dalla ghiacciaia e fissarlo al circuito di perfusione. Prima di ricollegare la cannula aortica, utilizzare una siringa smussata da 18 G riempita con tampone KH per rimuovere l'aria dalla cannula. Collegare prima la cannula aortica, aprire il tubo clamp sul lato Langendorff e assicurarsi che il tubo di postcarico clamp è aperto.
  5. Ricollegare la cannula atriale sinistra, assicurandosi che l'aria sia stata rimossa dalla cannula prima di collegarla al circuito di perfusione. Tenere il lato di lavoro clamp chiuso fino al momento di passare dalla modalità Langendorff alla modalità di lavoro.
  6. Perfondere il cuore in modalità Langendorff per 15 min. Assicurarsi di iniziare a registrare i dati all'inizio della riperfusione di Langendorff.
  7. Prima di passare alla modalità di lavoro, posizionare entrambe le pietre gorgoglianti nel tampone KH, aprire il rubinetto a 3 vie sul lato di lavoro e trasferire il tubo di ritorno comune nel serbatoio di lavoro.
  8. Chiudere il morsetto Langendorff bianco, aprire il morsetto laterale di lavoro bianco e perfondere il cuore per 30 minuti. Misurare e raccogliere gli effluenti coronarici in punti temporali designati per l'analisi a valle (ad esempio, marcatori di lesioni cardiache). Assicurati di interrompere-riavviare la registrazione del software per avviare un nuovo segmento (o in alternativa, aggiungi un commento).
  9. A circa 15 minuti di riperfusione in modalità di lavoro, chiudere il rubinetto a tre direzioni.
  10. Al termine della riperfusione, salvare il file di dati, interrompere il flusso attraverso il circuito e scollegare il blocco cardiaco. Raccogliere campioni del ventricolo sinistro per l'elaborazione istologica e/o il congelamento rapido per studi futuri (ad esempio, estrazione di proteine per studi di western blot).
  11. Rimuovere i filtri dai portafiltri, scaricare il tampone dal circuito e sciacquare due volte con 5 L di acqua distillata.
    NOTA: Sebbene non sia necessario, è utile preriscaldare l'acqua distillata in un grande contenitore all'interno del bagnomaria.

8. Analisi del recupero funzionale

  1. Apri il file LabChart.
  2. Evidenzia una regione di almeno 30 secondi di registrazione, quindi fai clic su Comando > Aggiungi selezione dati OPPURE Aggiungi più dati ai dati. Questo aggiungerà i parametri desiderati a un file DataPad all'interno del software.
  3. Seleziona il menu a discesa Finestra > DataPad.
  4. Evidenzia e copia i valori di recupero da DataPad in un foglio di calcolo per l'analisi funzionale del recupero. Calcolare il recupero funzionale come percentuale del rispettivo valore basale 1,6,7.

Risultati

I risultati della perfusione di base determineranno se l'esperimento iniziale (pre-conservazione) ha avuto successo. Il flusso aortico visualizzato durante la modalità Langendorff deve essere compreso tra 14 e 22 mL/min. Il flusso di Langendorff viene visualizzato come valore negativo sul flussometro a causa della perfusione retrograda dell'aorta. Un esempio di una traccia di Langendorff accettabile è mostrato nella Figura 4A.

Una volta passato alla modalità di lavoro, il flusso aortico dovrebbe essere di almeno 30 ml/min una volta che il cuore si è stabilizzato. È normale che il flusso inizialmente salga a circa 50 ml/min, quindi diminuisca a circa 25 ml/min prima di aumentare di nuovo a un flusso aortico basale stabile. Una volta che i parametri basali sono soddisfacenti (AF > 30 mL/min, CF 10-20 mL/min, HR 200-300 bpm), il cuore può essere conservato. Un esempio di una buona traccia di base è mostrato nella Figura 4B.

A seconda della soluzione di conservazione testata, alcuni cuori non produrranno un buon recupero dopo una prolungata conservazione statica a freddo, nonostante abbiano un'eccellente linea di base. Un esempio di traccia che indica uno scarso recupero in modalità di lavoro è mostrato nella Figura 4C.

Il recupero funzionale finale per il flusso aortico può essere calcolato in base alla lettura finale del flusso aortico come percentuale del valore basale. Ad esempio, se la FA basale del cuore era di 40 ml/min e la FA alla fine della riperfusione dopo la conservazione statica a freddo era di 20 ml/min, il recupero della FA per questo cuore era del 50%. Un esempio di questa rappresentazione dei dati è mostrato nella Figura 5.

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Figura 1: Circuito di perfusione cardiaca funzionante. (A) Foto del circuito di perfusione cardiaca di ratto funzionante isolato. La casella rossa indica dove è posizionato il cuore isolato. (B) Schema del circuito di perfusione del cuore di lavoro isolato che indica la direzione del flusso del tampone KH attraverso il circuito per la perfusione di Langendorff (linea tratteggiata) e la modalità di lavoro (linea continua). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Configurazione del software LabChart. (A) Impostazione delle impostazioni del canale per la pressione aortica, il flusso aortico e la frequenza cardiaca. (B) Esempio di modello LabChart impostato con tre canali. Le finestre a destra mostrano ogni singolo canale configurato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Incannulamento e cardioplegia. (A) Incannulamento cardiaco prima del posizionamento all'interno della camera della camicia d'acqua. La cannula sinistra viene inserita nell'aorta e la cannula destra viene inserita nel ventricolo sinistro attraverso l'appendice atriale sinistra. I vasi polmonari sono stati legati e il tessuto polmonare sezionato. (B) Dopo che la cardioplegia è stata somministrata, il cuore viene posto in un becher contenente la soluzione per cardioplegia. Le cannule sono state fissate con clip bulldog prima di essere scollegate dal rig. (C) Esempio di cuori posti all'interno di una ghiacciaia per una conservazione a freddo prolungata. Qui, due cuori sono stati conservati per la riperfusione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Esempi di tracce LabChart. Tracce di pressione (grafico rosso), flusso aortico (grafico blu) e frequenza cardiaca (grafico verde) per un cuore con (A) Buona traccia di Langendorff, (B) Buon recupero durante la riperfusione in modalità di lavoro, (C) Scarso recupero durante la riperfusione in modalità di lavoro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Grafici rappresentativi del recupero funzionale. (A) flusso aortico, (B) flusso coronarico, (C) gittata cardiaca e (D) frequenza cardiaca. Questa figura è stata riutilizzata con il permesso di Gao et al.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Data la natura sensibile della funzione basale del cuore, è necessario prestare attenzione a mantenere il rig di perfusione pulito e con componenti compatibili. Ad esempio, è necessario utilizzare il tubo in PVC corretto. Alcuni materiali per tubi, come il silicone, possono contribuire a ridurre il flusso aortico e la contrattilità, che possono essere dovute alla perdita di ossigeno attraverso il tubo. Sebbene siano disponibili in commercio circuiti di perfusione cardiaca di ratto isolati funzionanti, la maggior parte di questi viene utilizzata principalmente solo per la perfusione di Langendorff. Generalmente, le misurazioni funzionali possono essere ottenute in un modello di perfusione di Langendoff tramite l'inserimento di un catetere a palloncino nel ventricolo sinistro per ottenere misurazioni della pressione diastolica ventricolare sinistra (LVDP). Tuttavia, la capacità di misurare le misurazioni del flusso aortico grezzo e della gittata cardiaca in un sistema di perfusione di Langendoff non è possibile. Uno dei principali vantaggi del protocollo IWRH è la capacità di ottenere misurazioni funzionali del flusso aortico e della gittata cardiaca senza la necessità di ulteriori interventi del cuore (ad esempio, catetere a palloncino). Esistono opzioni commerciali per un sistema di perfusione cardiaca di ratto funzionante e, sebbene queste possano essere personalizzabili in base alle esigenze di studio individuali, questi sistemi possono essere costosi.

Ci sono passaggi critici nel protocollo per garantire una funzione di base ottimale del cuore del roditore durante la perfusione. La preparazione delle soluzioni tampone KHB non deve essere più vecchia di 4 settimane. Il circuito di perfusione deve essere privo di bolle d'aria durante l'adescamento. È necessario prestare attenzione quando si incannula l'appendice atriale sinistra. Un'eccessiva manipolazione del tessuto può aumentare il rischio di lacerazione e può anche aumentare l'irritabilità funzionale del cuore.

La qualità delle prestazioni del circuito di perfusione IWRH può essere generalmente determinata dalle letture di base ottenute nei cuori (AF > 30 mL/min, CF ~20 mL/min). Ulteriori test di controllo qualità in un modello CSS possono essere eseguiti arrestando e conservando il cuore in una soluzione di conservazione Celsior integrata con 1 μmol/L di zoniporide più 0,1 mg/mL di gliceril trinitrato. Hearts arrested con Celsior addizionato con gliceril trinitrato più zoniporide garantisce un immediato recupero della riperfusione di Langendorff e un recupero funzionale finale tra il 40 e il 60% dopo 6 ore di conservazione a freddo. In caso di dubbi sul fatto che il carro stia funzionando bene, questa integrazione di controllo qualità è utile da testare.

I metodi per l'utilizzo di cuori di roditori ottenuti tramite donazione dopo la morte circolatoria sono stati precedentemente descritti10,11. In breve, i ratti vengono anestetizzati, l'arteria carotide incannulata e si ottengono letture della pressione. L'eparina (500 UI) viene iniettata attraverso la cannula dell'arteria carotide. La trachea è legata per avviare la sospensione del supporto vitale. Una volta raggiunto il tempo ischemico caldo richiesto, il cuore può essere asportato e incannulato sul circuito di perfusione. Per la somministrazione della soluzione di conservazione nel cuore DCD, 60 mL di soluzione di conservazione vengono lavati attraverso l'aorta (~20 mL/min) attraverso la linea di pressione sul circuito. I vasi polmonari vengono legati, i polmoni sezionati, la cannula sinistra viene inserita e quindi 40 mL di soluzione di conservazione vengono lavati attraverso la linea di pressione. Il cuore viene quindi perfuso secondo il protocollo di cui sopra. Il recupero funzionale è preso come valore grezzo dell'emodinamica funzionale e l'analisi statistica viene eseguita confrontando i valori con quei cuori che sono stati operati in modo fittizio (nessun DCD, tuttavia, lavato sul rig).

I metodi per l'utilizzo di cuori di roditori procurati dopo la morte cerebrale sono stati precedentemente descritti12. In breve, gli animali vengono anestetizzati, intubati e ventilati, con monitoraggio emodinamico secondo il protocollo DCD per roditori. Viene eseguito un foro di fresatura nel cranio temporoparietale e un catetere per embolectomia 3F viene posizionato sub-durale. I controlli fittizi hanno fori di bava ma non l'inserimento del catetere. Il palloncino viene gonfiato con 0,3 ml di acqua per 2 minuti e mantenuto gonfiato per 1 ora. Dopo 1 ora di osservazione emodinamica, i cuori vengono espiantati e inseriti nel circuito di perfusione cardiaca funzionante isolato, vengono registrate le misurazioni di base, viene somministrata la cardioplegia e i cuori vengono conservati al freddo come descritto sopra.

Il principale limite dell'utilizzo del circuito di perfusione IWRH è l'impossibilità di utilizzare un tampone di perfusione a base di sangue per circolare attraverso il sistema. Sarebbe impossibile procurarsi abbastanza sangue di roditore da aggiungere al perfusare; pertanto, la perfusione ematica non è fattibile. Modelli alternativi, come il trapianto di cuore eterotopico di roditori o studi di trapianto di cuore ortotopico su animali di grandi dimensioni, dovrebbero probabilmente essere eseguiti per testare l'impatto della perfusione ematica. Tuttavia, questi metodi alternativi richiedono competenze in abilità microchirurgiche e/o strutture chirurgiche per animali di grandi dimensioni e anestesisti, perfusionisti e chirurghi cardiotoracici esperti.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Gli studi qui descritti sono stati finanziati da sovvenzioni assegnate a P.S. Macdonald dal National Health and Medical Research Council Australia, dalla St Vincent's Clinic Foundation e dal NSW Health Cardiovascular Research Capacity Senior Investigator Grant.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,5 mL incolore Provetta Eppendorff, 1000 per scatolaBio Strategy Pty Ltd0030.125.150
15 mL cent/provette (S) Sleeve/25 PP ctn/500Sigma-aldrich Pty LtdCLS430791-500ea
BP Kit trasduttore/cavoADInstrumentsMLT1199Data Acquisition
BridgeADInstrumentsFE221Acquisizione dati
Carbogen 555G2BOCBOC002
Checktemp1 termometroHanna InstrumentsHI98509Rig Costruzione
Morsetto Pinch 1/4-7/16 PK 12Thomas Scientific2848Y40Rig
Costruzione Morsetto con stelo di prolunga Med.Thomas Scientific8847T08Morsetto per costruzione rig
con stelo di prolunga mq.Thomas Scientific8847T02Clip per la costruzione del rig
, recipiente, 60 g Coerente di pressioneScientific14121apparecchiature chirurgiche
Thomas Scientific8847E25Costruzione del rig
Covidien Sofsilk 2-0 pretagliato nero Scatola da 45 cm da 24forniture mediche specialisticheS195Materiali di consumo chirurgici
su misura 250 ml Degasatore incamiciatoVetreria soffiata personalizzata Pty LtdN/ACostruzione di impianti di perforazione Serbatoio
da 750 ml su misuraVetreria soffiata personalizzata Pty LtdCostruzione diimpianti di perforazione
D-(+)-glucosio anidro SigmaUltraSigma-aldrich Pty LtdG7528-1KgPer realizzare Krebs Buffer
Dual Channel ConsoleADInstrumentsTS402Acquisizione dati
Palloni Erlenmyer 2 L 
Filtro Microfibra tipo GF/C fibra di vetro 47 mm, 100Bio-strategy Pty Ltd1822047
Pinze, 15 cm, 0,3 mm, CRVDCoherent Scientific14114Attrezzatura chirurgica
Morsetti a quattro punte con braccio lungo 9 mm x 115 mm per contenere oggetti di diametro 2-70 mm. CircolatoreMet-App Australia Pty Ltd1352rivestito
vinile. Controllo digitale a stato solido. (1020 Watt/240 Volt)Thermoline ScientificTU3Rig Construction
Eparina 5000 U/5 mL scatola 50 Pfizer 02112115Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd1258693Farmaci
Ilio Xilazil, 20 Inj 50 mLCenvet Australia Pty LtdX5010Anestetico
Johns Hopkins Bulldog ClampCoerente, Scientifico CS-WPI-14117
Ketamina 100 mg/50 mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1Anestetico
Solfato di magnesio eptaidrato AR 500 g ChemsupplyBio Strategy Pty LtdMA048-500gPer realizzare Krebs Buffer
Adattatore incernierato maschio/femminaThomas Scientific8847V08Rig Construction
Masterflex L/S Testa Easy-Load per tubi di precisione, PPS, rotoreCRSJohn Morris1015164Rig Construction
Forbici Metzenbaum, curve da 11,5 cmCoherent ScientificWPI-501748per attrezzature chirurgiche
, 14,5 cm diritteCoherent ScientificWPI-501252per apparecchiature chirurgiche
F/2-HEADS SSJohn Morris1014414Viti di montaggio per teste della pompa
Connettore apertoThomas Scientific8847E05Costruzione di impianti di perforazione
ParaformadeideSigma-AldrichP6148-500GElaborazione dei campioni
Cloruro di potassio (AnalaR NORMAPUR) 500 gVWR Chemicals 26764.26Per fare il tampone Krebs
fosfato di potassio monobasico Sigma-Aldrich Pty LtdP5379-500gPer realizzare Krebs Buffer
Powerlab 2/26, registratore a 2 canali + software LabchartADInstrumentsML826Computer Hardware e Software
Sensore di flusso in linea XN di precisione, 3,2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XFADInstrumentsME4PXNRig Construction
Bisturi con manico monouso #11 pkt/10BSN Medical (Aust) Pty Ltd73252-36
Guarnizione in silicone per Swinnex 47 mm 5/PKMerck MilliporeSX0004701Rig Costruzione
O-Ring in silicone 5-329 10/PKMerck MilliporeXX1104707Rig
Costruzione Morsetto per buretta singolaThomas Scientific8847T32Costruzione
Rig Ingresso slip-on Dimensione dei pori del filtro 10 & micro; m (gorgogliatore)Sigma-aldrich59277Costruzione Rig Sm
. 360 Connettore di rotazioneThomas Scientific8847E35Costruzione Rig
Bicarbonato di sodioSigma-Aldrich Pty LtdS6297 - 250gPer fare Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mmMerck MilliporeSX0004700Rig Costruzione
siringhe 1 mL scatola/100Becton Dickinson Pty Ltd302100
Morsetti a tre punte con braccio lungo 9 mm di diametro x 125 mm e vite gemella per il supporto di 5-80 mmMet-App Australia Pty Ltd1356la costruzione di rig
TS410ADInstrumentsTS410Tubi di acquisizione dati
PVC 6,35 mm ID x 9,52 mm OD 50 piedi Rotolo 15,24 m, trasparente, DEHP senza ftalati, per uso alimentare soddisfa REACThermo FisherNAL 8701-0600Costruzione dell'impianto di perforazione
Tubo PVC 7,94 mm ID x 11,1 mm OD 50 piedi Rotolo 15,24 m, trasparente, DEHP senza ftalati, commestibile conforme a REACThermo FisherNAL 8701-0900Rig Construction Tubi
PVC 9,52 mm ID x 12,7 mm OD 100ft Roll ThermoFisherNAL 8701-4120Rig Construction
Forbici Vannas, 8,5 cm, dritte, lame da 7 mmAttrezzatura
chirurgica coerente scientifica WPI-500-086Bagno d'acqua 30 litri con vassoio sospesoThermoline ScientificTLWB-30Rig Construction
Connettore chiuso per riscaldante in , , , , Forbici Metzenbaum Hardware di montaggio Modulo misuratore di portata per tubi per

Riferimenti

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