Hellgrammite come biomonitor non convenzionale per la valutazione delle acque superficiali e della salute ambientale

Sommario

Questo protocollo descrive l'uso di biomarcatori per l'individuazione precoce di impatti deleteri negli ecosistemi acquatici. I biomarcatori sono strettamente correlati ai tratti sentinella e i loro cambiamenti aiutano a rilevare i danni precoci.

Abstract

Le larve di dobsonflies del genere Corydalus, comunemente note come Hellgrammites, sono caratterizzate da dimensioni notevoli, ampia gamma di occorrenza e prolungato periodo di immaturità, che può durare fino a un anno. Le Hellgrammiti sono chiaramente note per mostrare sensibilità all'inquinamento e agli impatti sulla struttura dell'habitat. Date queste caratteristiche uniche, l'utilizzo di larve di Corydalus texanus è altamente adatto come agenti di biomonitoraggio affidabili per valutare l'integrità ecologica degli ecosistemi acquatici. Questo protocollo mira a fornire gli strumenti necessari per la valutazione di C. texanus e a dimostrarne l'efficacia attraverso un caso di studio. I risultati della ricerca hanno implicazioni pratiche, indicando che le larve di C. texanus mostrano risposte di allerta precoce all'inquinamento minerario, bioaccumulando elevate quantità di metalli pesanti come Zn, Fe e Al. La presenza o l'assenza di popolazioni di C. texanus può fungere da indicatore utile per identificare potenziali problemi legati alla salute dell'ecosistema. L'approccio non convenzionale ha dimostrato di essere allarmo precoce dell'inquinamento nei siti colpiti dalle attività minerarie, evidenziando la necessità di un'azione tempestiva per proteggere l'ambiente. Date le loro caratteristiche uniche, l'uso di larve di C. texanus è altamente raccomandato come bioindicatore non convenzionale affidabile.

Introduzione

Le Hellgramites sono larve di insetti dell'ordine Megaloptera (Latreille, 1802), chiamate dobsonflies o fishflies nella loro fase adulta. Una bassa diversità ma diffusa caratterizza questo gruppo di larve di insetti predatori provenienti dagli ecosistemi acquatici¹. Le specie di Hellgramite si trovano in regioni biogeografiche ben definite; Pertanto, è relativamente facile identificare le specie senza un'elevata conoscenza tassonomica. In particolare, le larve di Corydalidae possiedono le specie più importanti dell'ordine dei Megaloptera (20-90 mm di lunghezza del corpo)², rendendo l'hellgramite visibile ad occhio nudo.

Gli Hellgrammites svolgono un ruolo cruciale negli ecosistemi acquatici come predatori, con una presenza potente dovuta a grandi masticatori che denotano la loro impressionante forma predatoria. Un corpo appiattito dorsoventralmente si unisce anche con 7-8 paia di branchie filamentose lungo il corpo, e una capsula della testa con sei stemmi per lato rende le hellgrammites organismi affascinanti per entomologi e appassionati³. Gli adulti di Corydalidae sorprendono e creano un'immagine d'impressione per le persone grazie alle loro dimensioni prominenti; Tuttavia, sono del tutto innocui. È interessante notare che le hellgrammites hanno la capacità di persistere negli ambienti acquatici nel loro stadio larvale per una durata significativa.

Le caratteristiche fenotipiche delle hellgrammites consentono una particolare possibilità di evidenziare il loro ruolo negli ecosistemi acquatici; Tuttavia, il loro potenziale indicatore è la caratteristica più ricercata dagli ecologi acquatici. La vasta conoscenza del loro potenziale bioindicatore è evidenziata negli ecosistemi acquatici perché la loro presenza è correlata a buone condizioni di salute nei loro habitat a causa della loro intolleranza all'inquinamento organico nelle acque superficiali 4,5,6,7,8.

La maggior parte dei Corydalidae megalopteri vive in acque correnti ad alta velocità come rivoli e substrati predominati da ciottoli e ciottoli, ma le hellgrammites si trovano anche in corsi d'acqua a basso gradiente con strappi e substrati sabbiosi, così come in habitat lentici come i laghi ^3,9,10. La loro vasta gamma di occorrenze rispecchia i tratti critici di un predatore superiore e la loro capacità di colonizzare diversi habitat mirati dalle loro efficaci strategie di storia della vita¹¹. Gli Hellgramiti collegavano i loro tratti con le dinamiche degli ecosistemi acquatici; quindi, strategie come l'adattamento alla respirazione aerea da parte degli spiracoli (oltre ai loro ciuffi ventrali di branchie tracheali) sono proprie delle strategie dei Corydalidae¹⁰.

Gli Hellgrammiti abitano particolari ecosistemi e mostrano risposte rapide alle deviazioni dai modelli stabiliti, fungendo così da sistema di allerta precoce⁷. Le reazioni di questi organismi selvatici possono essere utilizzate come strumento prezioso per valutare l'impatto dell'inquinamento sugli ecosistemi acquatici, in particolare nel caso di miscele di inquinanti non bersaglio. Alcuni effetti deleteri sugli organismi viventi sono stati riconosciuti negli ecosistemi a causa della tossicità individuale delle sostanze chimiche, ma l'effetto delle miscele di inquinanti deve essere identificato. Le risposte di allerta precoce degli hellgrammites possono rendere possibile l'identificazione degli effetti deleteri fornendo un riferimento agli impatti di una miscela di inquinanti o anche quando i singoli effetti degli inquinanti riconoscono la concentrazione di nessun effetto osservabile (NOEC)¹².

Diversi organismi modello sono stati utilizzati per test sperimentali acuti e cronici; tuttavia, vengono allevati e mantenuti in condizioni controllate¹³. Le condizioni controllate li rendono incapaci di identificare gli effetti non bersaglio di diversi inquinanti a cui sono esposti. Inoltre, la NOEC è spesso riconosciuta a causa della complessità della miscela dell'inquinante. Per questo motivo, negli ultimi decenni, le specie autoctone non modello con effetti non bersaglio sono state riconosciute per lo screening dei sistemi, che sono essenziali per condurre ricerche ecotossicologiche¹⁴. Di conseguenza, gli hellgrammiti sembrano in grado di valutare gli effetti deleteri dell'inquinamento negli ecosistemi acquatici. Tratti come la loro biologia, genetica e fisiologia, tra gli altri, rendono gli organismi non modello adatti alla valutazione dell'impatto negli ecosistemi¹⁴.

Questo protocollo mira a stabilire un nuovo strumento di biomonitoraggio utilizzando un organismo non modello in grado di rilevare segnali di allarme precoce in risposta a miscele di inquinamento non bersaglio. Per ottenere i migliori risultati, i caratteri esibiti dalle larve della specie modello, C. texanus, sono stati considerati in modo completo e integrati nell'analisi¹⁵.

Protocollo

Figura 1: Guida rapida passo passo su come utilizzare il biomonitor non convenzionale Corydalus texanus per l'implementazione negli ecosistemi acquatici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Lavoro sul campo

1. Identificare i siti di studio situati a monte e a valle della fonte di inquinamento dove vengono riconosciuti impatti sospetti o evidenti (i.e., emissioni puntuali o diffuse).
   NOTA: Il presente protocollo comprendeva 15 siti di studio in quattro fiumi principali: 1) Fiume Extoraz (siti PB, EZ, RQ, BC); 2) Fiume Escanela-Jalpan (ES, EN, AH, JL, PI, PA); 3) Fiume Ayutla (AY); e 4) Fiume Santa María (SM, AT).
2. Ricercare e localizzare almeno un sito di riferimento (un luogo con impatti minori o privi di impatti) e definirlo come sito di studio.
   NOTA: Per gli attuali siti di studio BC, ES, SM, AY e AT sono stati considerati come siti di riferimento.
3. Riconoscere alcuni attributi degli habitat che aumentano la probabilità di trovare individui di C. texanus. Questi includono substrato ghiaioso, habitat rocciosi con pendenze più ripide, flussi ad alta velocità, acque ben ossigenate, alta densità di chioma e habitat in altopiani e pianure.
4. Racchiudere un tratto di 100 m del torrente per identificare gli habitat appropriati per il biomonitoraggio¹⁶.
5. Entra nel flusso per raccogliere campioni.
6. Campiona almeno sei individui di C. texanus in habitat come riffles, ciottoli, acque limpide e detriti utilizzando una rete a calcio con una dimensione delle maglie di 500 μm.
7. Rimuovere le rocce nella direzione del flusso d'acqua e trasferire le larve nella rete.
8. Maneggiare la rete con le larve campionate e trasferirle in bottiglie designate per la sistemazione temporanea. Maneggiare la rete con cautela e piegare i bordi verso l'interno per evitare la perdita di larve.
9. Misurare la larghezza della testa delle larve campionate utilizzando un calibro per identificare gli stadi da IX a XI (nell'intervallo da 6 mm a 10 mm).
10. Spurgare le larve immergendole in una bottiglia contenente acqua di ruscello per 30 minuti.
11. Collocare i campioni in bottiglie di plastica con un'etichettatura chiara e quindi sopprimerli mediante immersione in azoto liquido (-75 °C) in un serbatoio criogenico.
12. Trasportare e conservare i campioni in modo sicuro a -45 °C nell'ultracongelatore del laboratorio.
13. Utilizzando una bottiglia di polietilene, prelevare un campione di acqua di flusso di 200 ml, aggiungere 1 ml di acido nitrico e conservare il campione a 4 °C per la successiva quantificazione dei metalli pesanti in laboratorio.

2. Dissezione delle larve campionate e separazione dei tessuti

1. Mettere la vaschetta di dissezione in plastica sul ghiaccio e attendere che raggiunga i 4 °C, utilizzando un termometro per controllare.
2. Prelevare i campioni dall'ultracongelatore e metterli sul vassoio di dissezione per iniziare la dissezione.
3. Seleziona i tessuti bersaglio: muscolo, rami, tubo neurale ed esoscheletro.
4. Usa un coltello di ceramica per rimuovere la testa e separare accuratamente i tessuti. Aprire il corpo longitudinalmente e rimuovere le branchie su ciascun lato.
5. Separare gli esoscheletri con un coltello di ceramica più piccolo e pulire il tessuto in eccesso. Mettere gli esoscheletri in forno e asciugarli a 80 °C per 48 h.
6. Trascorso il tempo, conservare gli esoscheletri asciutti per ulteriori analisi.
7. Continuare a pulire i tessuti molli in condizioni di freddo per ulteriori analisi mediante microdosaggi.
8. Usa un piccolo coltello di ceramica per estrarre i tessuti molli dal grasso. Separare e raggruppare ogni tessuto target da individui provenienti dallo stesso punto di campionamento.
9. Conservare ogni tipo di tessuto in una microprovetta da 2 mL, mantenendo le condizioni di freddo durante tutto il processo.
10. Per preparare ciascun tessuto bersaglio, pesare 100 mg di tessuto e aggiungere 1 mL di soluzione di PBS con un pH di 7,4. Utilizzare uno strappo di tessuto con una sola mano per omogeneizzare ogni tessuto. In genere, i tessuti molli richiedono tre cicli di 10 s ciascuno.
11. Centrifugare il campione a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una microprovetta da 1 mL.
12. Esegui saggi di micromarcatori biomarcatori.

3. Quantificazione dei metalli pesanti

1. Pesare 250 mg di esoscheletri essiccati da almeno sei campioni nello stadio di sviluppo specificato utilizzando una bilancia analitica.
2. Macinare gli esoscheletri in un mortaio di vetro fino a quando non diventano finemente polverizzati. Aggiungere 250 mL di acido nitrico ultrapuro ai recipienti di reazione della polvere.
3. Per digerire i campioni, trasferirli in un forno a microonde per digestione a 180 °C per 30-45 minuti.
   NOTA: Utilizzare il contenitore adatto al microonde adatto alla marca del microonde per riscaldare i campioni in modo sicuro ed efficace. Il tempo di digestione per i campioni di tessuto varia a seconda della marca del microonde, impiegando 30-45 minuti. Alcuni marchi offrono metodi standardizzati.
4. Eseguire un metodo di digestione a microonde per campioni d'acqua seguendo il metodo EPA3015A, utilizzando 45 mL del campione d'acqua e aggiungendo 5 mL di acido nitrico.
5. Misura di metalli pesanti e metalloidi in campioni digeriti (acqua e tessuti) utilizzando la spettroscopia di emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES), tra cui Hg, Cu, Pb, Zn, Fe, Cr, Cd, Mn, Ba e As.
   NOTA: Utilizzare argon di grado 5 e soluzioni standard di ciascun metallo e metalloide per costruire una curva di calibrazione.

4. Microsaggi per la valutazione dello stress ossidativo e biomarcatori

1. Preparazione dei reagenti
   1. Mescolare 6 g di NaH₂PO₄ con 1000 mL di acqua ultrapura per ottenere un tampone fosfato monobasico da 50 mM. Conservare in un matraccio a 2-8 °C a tempo indeterminato.
   2. Per ottenere l'8,1% di SDS, sciogliere 450 mg di sodio dodecil solfato (SDS) in 5 ml di acqua ultrapura. Preparare poco prima dell'uso.
   3. Diluire 2 mL di acido tricloroetanoico (TCA) in 8 mL di acqua ultrapura (preparare un reagente fresco quando necessario).
   4. Sciogliere 100 mg di tetrabutilammonio (TBA) in 10 ml di acqua ultrapura (preparare un reagente fresco quando necessario).
   5. Per ottenere 50 mM di PBS pH 7,8, sciogliere 97 mg di Na₂HPO₄ e 59 mg di NaH₂PO₄ in 10 mL di acqua ultrapura. Quindi, regolare il pH a 7,8 utilizzando NaOH per aumentare o HCl per diminuire.
   6. Preparare una soluzione di 200 μg/mL di catalasi bovina sciogliendo 8 mg di catalasi in 40 μL di acqua ultrapura (preparare un reagente fresco quando necessario).
   7. Per preparare una soluzione di acido etilendiamminicominacetico (EDTA) da 50 mM TRIS/5 mM, aggiungere 6,05 g di tris (idrossimetil)amminometano (TRIS) e 0,073 g di EDTA a 45 mL di acqua ultrapura. Regolare il pH a 7,6 con HCl e conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
   8. Per 0,1 M di glutatione ridotto (GSH) (per 45 campioni duplicati), pesare 0,0184 g di GSH e scioglierlo in 600 μL di 10 mM di HCl.
   9. Per preparare 10 mM di HCl, aggiungere 0,5 μL di HCl concentrato a 599,5 μL di acqua ultrapura.
   10. Aggiungere 28,5 μL di glutatione reduttasi a 1,4 mL di 0,1 M TRIS/HCl 0,5 mM EDTA pH 8,0.
   11. Miscelare 1,211 g di TRIS e 0,0146 g di EDTA con 90 mL di acqua ultrapura per preparare una soluzione di TRIS/HCl 0,1 M e EDTA 0,5 mM a pH 8,0. Aggiungere HCl per regolare il pH, se necessario. La soluzione può essere conservata indefinitamente a 2-8 °C.
   12. Pesare 0,075 g di NADPH e aggiungerlo a 2,25 mL di NaHCO₃ 1 mM EDTA all'1%.
   13. Mescolare 1 g di NaHCO₃ e 0,0282 g di EDTA in 100 mL di acqua ultrapura per preparare una soluzione di NaHCO3 all'1% e 1 mM di EDTA. Conservare la soluzione a 4-8 °C per un tempo indeterminato.
   14. Mescolare 2 μL di t-butilidroossido con 2 mL di acqua ultrapura per ottenere una soluzione da 7 mM. Mescolare immediatamente prima dell'uso.
   15. Mescolare 1 g di albumina sierica bovina (BSA) con 1 mL di acqua ultrapura per creare una soluzione madre da 1 μg/μL.
2. Sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS) (perossidazione lipidica, LPO)¹⁷
   1. Aggiungere 5 μL di surnatante tissutale in una microprovetta da 1 mL. Aggiungere 45 μl di 50 mM di PBS (soluzione fresca e madre).
   2. Aggiungere 12,5 μl di SDS all'8,1% (appena preparato). Aggiungere 93,5 μl di TCA al 20% pH 3,5 (preparato al momento).
   3. Aggiungere 93,5 μl di TBA all'1% (preparato al momento). Completare il volume aggiungendo 50,5 μl di acqua ultrapura. Chiudere il coperchio del tubo e agitarlo per 30 s.
   4. Forare il coperchio della microprovetta con un ago e incubare in acqua bollente per 10 minuti.
   5. Raffreddare la provetta a temperatura ambiente (RT), quindi centrifugarla a 1000 x g per 10 minuti.
   6. Aggiungere 150 μl di surnatante a un pozzetto in una micropiastra a 96 pozzetti e misurare l'assorbanza a 530 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre.
   7. Per quantificare i perossidi lipidici, creare una curva di calibrazione TBARS a 8 punti (0-160 μM) utilizzando malondialdeide bis (dimetilacetale) come descritto nella Tabella 1. Regolare la curva della malondialdeide (MDA) in base al tipo di tessuto o al livello di danno sospetto.
   8. Esprimere i risultati come nmol MDA eq·mg⁻¹ proteina.
3. Dosaggio enzimatico antiossidante (SOD) con superossido ^dismutasi18
   1. Utilizzare una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 147 μl di 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8 in due pozzetti come spazi vuoti. Aggiungere 144 μL di 1 M TRIS/5 mM HCl EDTA pH 8 in altri pozzetti per duplicato.
   2. Prelevare 3 μl dal surnatante e aggiungerlo ai pozzetti del campione. Mescolare delicatamente il contenuto sul piatto più volte.
   3. Aggiungere 3 μL di acido pirogallico 10 mM a ciascun pozzetto entro 30 s. Mescolare delicatamente e subito.
   4. Misurare l'assorbanza a T0 (tempo = 0 s) e T10 (tempo = 10 s), a 420 nm e 25 °C.
   5. Determinare la SOD calcolando la percentuale di inibizione del pirogallolo nel campione utilizzando la seguente equazione:
      
      Dove
      x% = percentuale di ossidazione del pirogallolo da parte della SOD nel campione; Pertanto, l'ossidazione del pirogallolo è pari al 100 - x%
      NOTA: Calcolo dell'attività SOD considerando 1 UI è il volume che inibisce il 50% dell'ossidazione del pirogallolo come descritto di seguito:
      
      Dove
      y = volume del campione in millilitro (inibisce il 50% del pirogallone)
      50% = percentuale di inibizione del pirogallolo uguale a 1U di SOD
      0,003 = volume in millilitri del campione
      100 - x% = inibizione del pirogallolo in percentuale da parte del campione
   6. Infine, determinare l'attività SOD con l'equazione:
      
      SOD = attività della SOD in unità internazionali per microgrammo di proteina
      Y = volume del campione in quanto inibisce il 50% del pirogallolo
      100 = fattore di conversione da decilitro a millilitro.
      proteina = la concentrazione proteica ottenuta dalla quantificazione di Bradford è espressa in microgrammi per millilitro; È necessario dividere per 10 per convertire in grammi per decilitro
4. Dosaggio dell'enzima antiossidante catalasi (CAT)^19,20
   1. Utilizzare una micropiastra a 96 pozzetti. Aggiungere 20 μl di surnatante del campione nei pozzetti (in duplicato).
   2. Aggiungere 20 μL di catalasi fresca (200 μg/mL) nei pozzetti come standard (in duplicato). Aggiungere 100 μl di 50 mM PBS pH 7.8 al campione e ai pozzetti bianchi.
   3. Aggiungere 100 μL di 90 mM (30%) H₂O₂ nei pozzetti per avviare la reazione. Dopo aver aggiunto H₂O₂, leggere l'assorbanza ogni 15 s per 2,5 min a 240 nm.
   4. Calcola l'attività usando l'equazione:
      
      
      
      
      
5. Dosaggio dell'enzima glutatione perossidasi (GPx)²¹
   1. Utilizzare una micropiastra a 96 pozzetti.
   2. Miscelare 240 μl di soluzione 0,1 M GSH, 1 200 μl di soluzione 10 U/mL di GSH-Rd e 1 200 μl di 4 mM NADPH. Mantenere la soluzione in ghiaccio.
   3. Aggiungere nei pozzetti 100 μl di 50 mM TRIS/HCl 5 mM EDTA pH 7,6. Aggiungere 1 μL di campione surnatante in duplicato. Picchiettare la micropiastra e mescolare delicatamente.
   4. Aggiungere 50 μl della soluzione di miscelazione (passaggio 4.5.2) e mescolare delicatamente.
   5. Aggiungere 20 μl della soluzione di t-butilidroossido da 7 mM nei pozzetti per avviare la reazione (sono necessari circa 15 s per avviare la reazione in 16 campioni duplicati). Mescolare rapidamente la micropiastra.
   6. Monitorare l'assorbanza a intervalli di 1 minuto per 5 minuti a 25 °C a 340 nm.
   7. Calcola l'attività GPx con l'equazione:
      
      Dove
      GPx = attività in millimolari al minuto per microgrammo di proteina
      ΔAbs_340/min= Assorbanza media in delta
      10³ = conversione da molare a millimolare
6. mg prot = concentrazione proteica dalla determinazione di Bradford espressa in microgrammi per microlitro
   1. Quantificazione delle proteine mediante analisi di Bradford²²
   2. Eseguire una curva standard da soluzioni di albumina sierica bovina (BSA), impostate dalla soluzione madre di 1 μg/μL come mostrato nella Tabella 2.
   3. Utilizzare una micropiastra a 96 pozzetti. Aggiungere 190 μl di reagente Bradford nel campione e nei pozzetti standard.
   4. Aggiungere 10 μL di BSA in pozzetti standard per duplicato. Aggiungere 10 μl di surnatante nei pozzetti del campione per duplicato.
   5. Mescolare delicatamente con il puntale della pipetta.
   6. Leggere l'assorbanza a 595 nm. Quantificare la concentrazione proteica con la curva standard.

Risultati

I risultati dello studio rivelano che i metalli pesanti, in particolare l'alluminio (Al), il ferro (Fe) e lo zinco (Zn), hanno un impatto dannoso sull'ambiente, come evidenziato dalla Figura 2. Il rilevamento di alti livelli di metalli pesanti nei campioni di tessuto e acqua raccolti da tutti i siti ha portato a un risultato sfavorevole. Sono stati rilevati valori anomali, con un fattore di bioaccumulo (BAF) di 600, in particolare nelle aree ad alta intensità mineraria come il fiume Extoraz (siti PB, EP, RQ e BC mostrati nella Figura 3). Sorprendentemente, in alcuni siti di studio in cui le concentrazioni di zinco nell'acqua erano anormalmente alte (PB), non è stato possibile trovare esemplari di C. texanus. Ciò indica che la soglia di bioaccumulo è stata probabilmente superata.

Figura 2: Boxplot del fattore di bioaccumulo (BAF) valutato in individui di Corydalus texanus campionati lungo 15 siti di studio. Il fattore di bioaccumulo (BAF) è stato calcolato per i metalli Al, Fe e Zn in base all'analisi di campioni d'acqua ed esoscheletri di individui di C. texanus . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Poiché SGBR è un'area naturale protetta, è essenziale garantire che non si verifichino cambiamenti ambientali che potrebbero avere un impatto sull'organismo sentinella. Tuttavia, sono stati osservati gradienti nelle risposte dei biomarcatori dello stress ossidativo (Figura 3). Secondo la valutazione, i siti con i livelli più bassi di danno alla membrana cellulare, come evidenziato dai livelli di LPO, erano EN, SM e CN. Questi stessi siti hanno mostrato un basso livello di attività SOD, che funge da enzima primario nella difesa del corpo contro lo stress ossidativo. Ciò suggerisce che lo stress ossidativo che si verifica in queste posizioni è minimo e, pertanto, potrebbero essere presi in considerazione interventi che non influenzano gli organismi sentinella. Al contrario, è stato osservato che l'attività di GPx è significativamente più bassa in vari siti, vale a dire EP, RQ, BC ed ES, dove sono stati registrati alti livelli di LPO. Questa osservazione suggerisce che l'organismo sta rispondendo alle condizioni di stress causate principalmente dall'estrazione mineraria. Dopo aver valutato i marcatori di allerta precoce all'interno di questo particolare organismo, è stato scoperto che alcuni siti hanno livelli di impatto bassi e alti. Questi risultati mostrano efficacemente l'utilità di utilizzare questa specie come sentinella non convenzionale.

Figura 3: Boxplot delle risposte dei biomarcatori valutate in campioni di Corydalus texanus in 15 siti di campionamento in tre fiumi principali che sfociano in un bacino in Messico (Riserva della Biosfera della Sierra Gorda) durante le stagioni secca e umida. Le risposte sono state misurate utilizzando tre biomarcatori: (A) livello di perossidazione lipidica (LPO) che riflette il danno precoce cellulare, (B) risposta antiossidante della superossido dismutasi (SOD) di prima linea della difesa cellulare e (C) risposta antiossidante della difesa cellulare da parte della glutatione perossidasi (GPx). Le frecce rosse indicano l'assenza di individui biomonitor o un numero molto limitato di campioni, che si è verificato una sola volta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tubo	200 μM di MDA bis (μL)	Acqua ultrapura (μL)	Concentrazione di MDA bis (μM)
1	0	1000	0
2	12.5	987.5	2.5
3	25	975	5
4	50	950	10
5	100	900	20
6	200	800	40
7	400	600	80
8	800	200	160

Tabella 1: Concentrazione di MDA necessaria per costruire la curva di concentrazione di MDA.

Concentrazione (μg/μL)	Soluzione madre (μL)	Acqua ultrapura (μL)
0	0	50
0.1	5	45
0.2	10	40
0.4	20	30
0.8	40	10
1	50	0

Tabella 2: Concentrazione di BSA per la curva di quantificazione delle proteine.

Discussione

Sebbene l'uso di C. texanus sia ottimale per la valutazione, è necessario considerare diversi aspetti del suo uso e della sua raccolta. I siti di studio scelti si rivelano impegnativi, a causa di diversi fattori come condizioni meteorologiche sfavorevoli, inaccessibilità geografica, alti livelli di aridità o protocolli di sicurezza insufficienti in regioni selezionate. I vincoli e le limitazioni dichiarati possono spesso rappresentare una sfida quando si conduce il lavoro sul campo. Quando si valutano regioni specifiche, in particolare quelle dei corsi d'acqua tropicali, ottenere campioni può essere difficile. Sebbene le linee guida Barbour²³ siano state rispettate a questo scopo, potrebbero esserci ostacoli all'adattamento dei protocolli in alcuni ecosistemi a causa delle loro caratteristiche particolari. Come affermato in precedenza, la raccolta di campioni in ambienti lotici tropicali presenta una serie di sfide a causa di fattori regionali e locali. Questi fattori comprendono gli alti livelli di eterogeneità ambientale, i substrati con elevata variazione, il bacino idrografico, l'ampiezza, la profondità, il flusso, la vegetazione ripariale e l'ampia gamma di condizioni fisico-chimiche²⁴. Di conseguenza, ottenere una dimensione uniforme per gli esemplari può rivelarsi difficile, poiché sono naturalmente influenzati da un determinato intervallo di fattori, in particolare in risposta ai cambiamenti stagionali. Di conseguenza, standardizzare le loro dimensioni può essere un'impresa complessa. Una volta completato con successo il lavoro sul campo, le successive procedure di laboratorio vengono facilitate, consentendo ulteriori analisi.

L'attuazione di una valutazione di allerta precoce in C. texanus ha dimostrato la sua fattibilità nel rispecchiare gli impatti nel contesto degli ecosistemi acquatici. A questo proposito, l'identificazione dei macroinvertebrati acquatici come indicatori affidabili dell'impatto umano si è dimostrata un approccio pratico^25,26. L'attuale ricerca ha dimostrato che C. texanus funge da modello non tradizionale altamente efficace per valutare rapidamente le condizioni ambientali. Nel caso del presente studio, è stato dimostrato che C. texanus ha mostrato variazioni nelle risposte per affrontare l'inquinamento da metalli pesanti derivato dall'estrazione mineraria. Gli effetti aggiuntivi delle alterazioni dell'habitat consentono il riconoscimento di un alto grado di sensibilità in C. texanus. Mentre le prove dell'attività mineraria erano presenti nell'area, gli indicatori di inquinamento tradizionali, come l'indice di diversità calcolato in Rico-Sanchez et ^al.27, non sono riusciti a riconoscere l'impatto dell'inquinamento da metalli pesanti nelle zone centrali o nei siti di conservazione. Tuttavia, sono stati osservati cambiamenti in aree come BC o SM, che si trovano nelle zone centrali. Sebbene le aree naturali protette siano efficaci per la conservazione, i risultati relativi a C. texanus indicano che i primi segnali di allarme dei danni si stanno già verificando inosservati. L'inclusione della fauna non convenzionale e indigena deve essere sostenuta nei protocolli di ricerca e nelle normative future all'interno delle rispettive nazioni, in particolare nelle regioni tropicali dove gli ecosistemi fluviali differiscono in modo significativo da quelli delle aree temperate²⁸. L'uso di un biomonitor non convenzionale come il C. texanus può contribuire a migliorare l'accuratezza e la pertinenza dei risultati della ricerca e a migliorare gli sforzi di conservazione di queste importanti specie e del loro habitat.

L'uso di Corydalus sp. ha mostrato, inoltre, un'elevata sensibilità ai diversi impatti delle attività umane (ad esempio, impatti sull'agricoltura come il cambiamento dell'uso del suolo e l'uso di prodotti agrochimici), come osservato nel fiume Filobobos (un luogo verso il bacino del Golfo del Messico)⁷. Lo studio in questione evidenzia il ruolo significativo del calcio nell'indurre stress su Corydalus sp. a causa dell'aumento accresciuto dei livelli di LPO in acque anormalmente indurite nel fiume Filobobos. Questi risultati, insieme a quelli attuali, hanno evidenziato l'utilità del genere Corydalus nella valutazione degli ecosistemi acquatici a latitudini intertropicali. Tuttavia, prima di valutare uno specifico ecosistema acquatico, è necessario avere una conoscenza preliminare dell'area di studio. Conducendo un'analisi approfondita, è necessario determinare i luoghi di ricerca ottimali per raccogliere i dati più estesi e completi.

L'efficacia del lavoro di laboratorio dipende fortemente dall'uso di tecniche di raccolta appropriate. La raccolta di campioni più grandi può rivelarsi utile durante l'esecuzione della dissezione, a causa della maggiore quantità di tessuti molli ed esoscheletro disponibili per l'analisi. Tuttavia, è importante notare che le variazioni stagionali possono influenzare l'accumulo di tessuto adiposo, rendendo difficile separare i tessuti molli e gli esoscheletri durante gli studi temporali. In questi casi, può essere consigliabile concentrarsi sulle branchie e sui muscoli disponibili di ciascun individuo. Ottenere un numero significativo di individui può rappresentare una sfida critica. A causa delle variazioni precedentemente indicate, ottenere abbastanza tessuto per valutare il contenuto di metalli pesanti e la risposta dei biomarcatori potrebbe essere più difficile. Il presente studio ha mostrato un esempio di questo caso perché non è stato possibile valutare la catalasi in campioni dell'SGBR. Prima dell'attuale protocollo, la valutazione della catalasi richiedeva un'elevata quantità di tessuto; Tuttavia, l'attuale proposta per la determinazione della catalasi offre una quantità minima di tessuto per la loro valutazione.

L'attuale proposta di protocollo offre un'adeguata possibilità di adottare un'approssimazione fattibile dell'integrità ecologica utilizzando le comuni hellgrammites negli ecosistemi acquatici. Fornisce informazioni cruciali per identificare l'inquinamento puntuale o gli effetti deleteri indiretti degli impatti umani, consentendo informazioni tempestive alle parti interessate, agli ecologi e agli scienziati acquatici. Sebbene il costo dell'attuale protocollo sia stato notevolmente ridotto, rimane ancora relativamente costoso a causa della necessità di diversi reagenti e dell'uso di attrezzature specializzate. Inoltre, la necessità di attrezzature specializzate limita il numero di posizioni in cui è possibile eseguire il test completo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bilancia analitica da 220 g	Ohaus	PR224/E	Questa bilancia è utile per pesare il tessuto estratto dai campioni.
Trampolieri pettorali	LaCrosse	700152M	Si consiglia di utilizzare trampolieri per la raccolta dei campioni. In alternativa, puoi anche utilizzare stivali con stivali di gomma per il campionamento.
Tagliere	True	TRUE915121	Si consiglia di utilizzare tavole bianche e di plastica.
Pinza	DR Instruments	112	Si consiglia di utilizzare una pinza da 12 pul in acciaio inossidabile.
Sistema di spettroscopia di emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente	Perkin Elmer	7300 DV	Un dispositivo per la quantificazione dei metalli pesanti mediante spettroscopia.
Rete da calcio	LaMotte	0021-P	Un metodo alternativo per realizzare una rete da calcio prevede la lavorazione manuale di una rete con uno spessore di 500 micrometri.
Azoto liquido		statico NA	NA
Liquid Nitrogen Dewar	BestEquip	DF0504	Si consiglia di utilizzare un serbatoio in alluminio con contenitori.
Set di mortaio e pestello	Cole-Parmer	EW-63100-54	Si tratta di un mortaio e pestello in porcellana utilizzato per macinare i tessuti secchi.
Multiwave GO Plus	Anton Paar	C93IP001EN-E	Multiwave è uno strumento utile per digerire più campioni.
Forno per essiccazione	Fisher scientific	506G	Un forno incubatore, noto anche come forno per tessuti secchi, è indispensabile per essiccare i tessuti a temperature di almeno 80 gradi.
Bisturi di precisione	Xcelite di Weller	037103-48768	Si consiglia di utilizzare un bisturi in alluminio.
Omogeneizzatore di tessuti (tearer)	Kopro	K110000	Si consiglia di utilizzare uno stearer di tessuti con una base. Alcune aziende offrono laceratori a ultrasuoni, che possono essere la scelta ottimale.
Congelatore a pozzetto a bassissima temperatura	REVCO	CA89200-384	Molte aziende forniscono congelatori, ma si consiglia di sceglierne uno con una temperatura di conservazione di almeno -40 °C.
Bottiglie di plastica a bocca larga	United Scientific	81900	Si consiglia vivamente di utilizzare bottiglie in polipropilene con tappi e bocche larghe.