Articolo metodologico

Esame della piroptosi mediante citometria a flusso

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DOI:

10.3791/66912

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31 maggio 2024

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1National Key Laboratory of Veterinary Public Health Security, 2Animal Epidemiology of the Ministry of Agriculture, 3College of Veterinary Medicine, China Agricultural University

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive l'identificazione di cellule pirottiche mediante citometria a flusso dopo doppia colorazione con anticorpi contro il frammento N-terminale di GSDME di pollo (chGSDME-NT) e lo ioduro di propidio (PI).

Abstract

La piroptosi è un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata guidata prevalentemente dalla formazione di pori della membrana plasmatica da parte dell'N-terminale generato dalle proteine della famiglia Gasdermin (GSDM). L'esame del GSDM-NT attaccato alla membrana mediante Western Blot è il metodo più comunemente usato per valutare la piroptosi. Tuttavia, è difficile differenziare le cellule con piroptosi da altre forme di morte cellulare utilizzando questo metodo. In questo studio, le cellule DF-1 infettate dal virus della malattia infettiva della borsa (IBDV) sono state impiegate come modello per quantificare la percentuale di cellule sottoposte a piroptosi mediante citometria a flusso, utilizzando anticorpi specifici contro il frammento N-terminale del GSDME di pollo (chGSDME-NT) e la colorazione con ioduro di propidio (PI). Le cellule chGSDME-NT-positive erano facilmente rilevabili mediante citometria a flusso utilizzando gli anticorpi anti-chGSDME-NT marcati con Alexa Fluor 647. Inoltre, la percentuale di cellule double-positive chGSDME-NT/PI nelle cellule infettate da IBDV (circa il 33%) era significativamente maggiore rispetto ai controlli con mock-infected (P < 0,001). Questi risultati indicano che l'esame del chGSDME-NT legato alla membrana mediante citometria a flusso è un approccio efficace per determinare le cellule piroptotiche tra le cellule in fase di morte cellulare.

Introduzione

La piroptosi è un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata che dipende principalmente dalla formazione dei pori della membrana plasmatica da parte di Gasdermin (GSDM) D nei mammiferi 1,2,3. A causa del deficit genetico di GSDMD nei polli 4,5, il meccanismo della piroptosi nei polli rimane sfuggente. La famiglia Gasdermin comprende proteine conservate, tra cui GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME e DFNB59 3,6. Gli studi hanno riportato che il GSDME dei pesci teleostei e delle anatre viene scisso dalla caspasi-1/3/7 o dalla caspasi-3/7 per indurre la morte cellulare piroptotica 7,8. Tuttavia, il ruolo della piroptosi mediata da GSDME nella risposta dell'ospite alle infezioni patogene nei polli rimane da chiarire.

La malattia infettiva delle borse (IBD) è una malattia acuta, altamente contagiosa e immunosoppressiva del pollame causata da IBDV9. IBDV, un virus a RNA a doppio filamento (ds) bisegmentato senza involucro, appartiene al genere Avibirnavirus della famiglia Birnaviridae10. Precedenti studi condotti da altri e dal nostro laboratorio hanno dimostrato che l'infezione da IBDV induce la morte cellulare nelle cellule ospiti attraverso diversi percorsi 11,12,13,14. Risultati precedenti hanno dimostrato che l'infezione da IBDV innesca il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH), un indicatore di morte delle cellule litiche 6,15, suggerendo che l'infezione da IBDV induce la morte delle cellule litiche nelle cellule ospiti. Inoltre, i dati mostrano che le cellule infettate da IBDV mostrano caratteristiche morfologiche di morte cellulare pirottotica, tra cui gonfiore cellulare con grandi bolle che soffiano dalla membrana plasmatica e colorazione positiva allo ioduro di propidio (PI), suggerendo che l'infezione da IBDV induce piroptosi nelle cellule.

Considerando che la formazione di pori di membrana nelle cellule pirottotiche da parte del frammento N-terminale di GSDM scisso (GSDM-NT) è un segno distintivo della piroptosi, teoricamente, le cellule pirottotiche potrebbero essere rilevate mediante citometria a flusso esaminando GSDM-NT sulla membrana cellulare utilizzando anticorpi specifici. Nelle cellule pirottotiche aviarie, il frammento N-terminale del Gasdermin E di pollo (chGSDME-NT) forma pori di membrana, consentendo allo ioduro di propidio (PI) di passare attraverso e legare il DNA. Pertanto, la proporzione di cellule pirottotiche può essere rilevata utilizzando la citometria a flusso, distinguendo così la piroptosi da altre forme di morte cellulare, come l'apoptosi e la necrosi. Tuttavia, il metodo per l'esame delle cellule pirottotiche mediante citometria a flusso non è stato riportato. In questo studio, le cellule DF-1 sono state infettate con IBDV ed è stata condotta una citometria a flusso per esaminare le cellule piroptotiche utilizzando anticorpi monoclonali (MCAB) contro il frammento chGSDME-NT (legato alla membrana) e la colorazione PI. Sorprendentemente, le cellule pirottotiche sono state efficacemente rilevate mediante citometria a flusso. Inoltre, è stato possibile quantificare la proporzione di celle pirottotiche. Questi risultati forniscono un mezzo potente ed efficace per determinare la piroptosi.

Questo articolo descrive un metodo per esaminare la piroptosi nelle cellule infette da IBDV mediante citometria a flusso utilizzando la colorazione anti-chGSDME-NT McAb e PI. Questo metodo può essere esteso anche ad altre cellule infettate da agenti patogeni e applicato per esaminare vari tipi di cellule con piroptosi, distinguendole da altre forme di morte cellulare.

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione delle celle campione

  1. Coltura di cellule DF-1 (fibroblasti di embrioni di pollo immortali) in piastre a sei pozzetti (5 x 10,5 cellule per pozzetto) con Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in un incubatore al 5% di CO2 a 38 °C.
  2. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, scartare il terreno di coltura cellulare contenente siero, lavare le cellule tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e quindi aggiungere 2 mL di terreno di coltura cellulare privo di siero a ciascun pozzetto.
  3. Aggiungere la soluzione del virus IBDV (contenente il MOI calcolato) a ciascun pozzetto e impostare un controllo dell'infezione simulata aggiungendo il volume di DMEM uguale a quello della soluzione del virus.
  4. Dopo 1 ora di adsorbimento del virus, scartare il terreno di coltura, lavare le cellule con PBS tre volte, aggiungere 2 mL di DMEM integrato con FBS al 2% in ciascun pozzetto e continuare le colture cellulari per 24 ore.
  5. 24 ore dopo l'infezione da IBDV, eseguire il trattamento con tripsina (500 μL per pozzetto) per 1 minuto e successivamente neutralizzare con DMEM integrato con FBS al 10% (2 mL per pozzetto). Successivamente, le cellule devono essere raccolte per preparare sospensioni a cellula singola per la citometria a flusso.
  6. Centrifugare le celle a 400 x g per 5 minuti a 2-8 °C. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.
  7. Risospendere il pellet di cella in PBS e agitare delicatamente i tubi per 3 s.
  8. Centrifugare le celle come descritto al punto 1.6 (400 x g per 5 minuti a 2-8 °C).
  9. Ripetere il lavaggio delle celle come descritto nei passaggi 1.7 e 1.8.
  10. Eseguire il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro al microscopio. Quindi, risospendere le cellule in un volume appropriato di tampone di colorazione per citometria a flusso (in modo che la concentrazione finale delle cellule sia 1 x 107 cellule/mL). Agitare delicatamente le sospensioni.

2. Colorazione cellulare per citometria a flusso

  1. Aggiungere 100 μl di sospensioni a cella singola dal passaggio 1.10 in provette di polistirene a fondo tondo da 5 mL (12 mm × 75 mm). Preparare cellule infettate da mock e IBDV per la colorazione anticorpale anti-chGSDME-NT/CT e utilizzare le normali IgG di topo come controllo dell'isotipo. Nel frattempo, preparare provette di controllo in bianco e singole colorate con cellule infette da IBDV.
  2. Aggiungere 1 μg di McAb anti-chGSDME-NT, MCAB anti-chGSDME-CT marcato con Alexa Fluor 647 o IgG di topo normale (come controllo dell'isotipo) rispettivamente alle provette infettate da IBDV e al mock-control. Successivamente, agitare delicatamente i tubi per 3 s.
  3. Incubare le cellule colorate a 2-8 °C o su ghiaccio per 30 minuti al buio. Agitare delicatamente i tubi ogni 10 minuti.
  4. Lavare le cellule con 1 mL di tampone di colorazione per citometria a flusso mediante centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 2-8 °C. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.
  5. Ripetere il lavaggio delle celle come descritto al punto 2.4.
  6. Risospendere il pellet in 100 μL di tampone di colorazione per citometria a flusso.
  7. Colorare le cellule del gruppo infettato da IBDV e del gruppo infetto da simulazione, nonché le provette colorate singolarmente con PI, con 10 μg/mL di PI per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere 400 μL di tampone di colorazione per citometria a flusso per il test di citometria a flusso.

3. Esecuzione del test di citometria a flusso

  1. Accendere il citometro a flusso per inizializzare lo strumento e avviare il software.
  2. Iniziare con l'esecuzione del tubo di controllo vuoto, seguito dai singoli tubi colorati per regolare la tensione e i parametri di compensazione del citometro a flusso. Utilizza i canali di fluorescenza FL3 e FL4, che emettono a 635 nm, per rilevare rispettivamente i fluorofori PI e Alexa Fluor 647.
  3. Dopo aver configurato tutti i parametri, eseguire tutti gli esempi in sequenza.

4. Analisi dei dati di citometria a flusso

  1. Analizza la colorazione Alexa Fluor 647 di ciascun campione nell'istogramma del canale FL4.
  2. Per valutare la proporzione di cellule doppie positive in ciascun campione, utilizzare il grafico a punti a quattro quadranti di FL3/FL4.
  3. Impostare soglie positive in base a campioni di controllo isotipometrico IgG/PI a doppia colorazione, assicurando che la percentuale di cellule doppiamente positive rimanga inferiore all'1%. Questo approccio facilita la misurazione della proporzione di cellule doppie positive in tutti i campioni.

Risultati

chGSDME-NT sulla membrana delle cellule DF-1 con infezione da IBDV potrebbe essere facilmente rilevato mediante citometria a flusso
Una delle caratteristiche più importanti delle cellule pirottotiche è la formazione di pori di membrana da parte di frammenti di GSDM-NT generati dalla scissione di Gasdermin. Pertanto, le cellule piroptotiche potrebbero teoricamente essere rilevate mediante citometria a flusso esaminando GSDM-NT sulle membrane cellulari utilizzando anticorpi specifici. Pertanto, le cellule DF-1 sono state infettate con IBDV e le cellule pirottotiche sono state esaminate mediante citometria a flusso utilizzando Alexa Fluor 647 marcato con McAb anti-chGSDME-NT e colorazione PI. Un numero considerevole di cellule chGSDME-NT positive è stato rilevato mediante citometria a flusso dopo l'infezione da IBDV (Figura 1). Al contrario, i controlli finti o le cellule colorate con IgG di controllo dell'isotipo hanno mostrato un numero minimo di cellule Alexa Fluor 647-positive. Questi risultati dimostrano l'efficace e specifica rilevazione del chGSDME-NT legato alla membrana mediante citometria a flusso. Da notare che, poiché i frammenti C-terminali di chGSDME clivato (chGSDME-CT) erano trattenuti all'interno del citoplasma piuttosto che traslocati sulla membrana plasmatica come chGSDME-NT, i frammenti di chGSDME-CT erano a malapena rilevabili dalla citometria a flusso utilizzando la colorazione dell'antigene sulla superficie della membrana, che era in accordo con il fatto che la piroptosi era associata a frammenti di chGSDME-NT legati alla membrana.

La piroptosi nelle cellule DF-1 può essere determinata mediante citometria a flusso utilizzando la doppia colorazione delle cellule con MCAB e PI anti-chGSDME-NT marcati con fluoresceina
Quando le cellule sono state doppiamente colorate con Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT MCAB e PI, seguite da analisi di citometria a flusso nei canali di fluorescenza FL3 e FL4, le cellule piroptotiche potevano essere determinate da chGSDME-NT e PI essendo positive. Come mostrato nella Figura 2A, B, un numero considerevole di cellule chGSDME-NT positive con infezione da IBDV sono state rilevate mediante saggi di citometria a flusso, e la percentuale di cellule chGSDME-NT/PI doppiamente positive nelle cellule infettate da IBDV (circa il 33%) era significativamente maggiore di quella dei controlli mock-infected (P < 0,001), suggerendo che la formazione di pori di membrana da parte del chGSDME-NT era sincrono con la rottura delle membrane cellulari, causando così la morte cellulare piroptotica di queste cellule infettate da IBDV. Questi dati mostrano chiaramente che l'infezione da IBDV induce la piroptosi mediata da chGSDME nelle cellule ospiti. Mentre le cellule PI single-positive possono rappresentare altre forme di morte cellulare indotta dall'infezione da IBDV. Pertanto, l'esame del chGSDME-NT che forma i pori mediante citometria a flusso fornisce un metodo prezioso per distinguere le cellule piroptotiche da quelle sottoposte ad altre forme di morte cellulare.

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Figura 1: Esame delle cellule legate a chGSDME-NT mediante citometria a flusso. Le cellule DF-1 sono state infettate con finta o infettate con IBDV con un MOI di 1. 24 ore dopo l'infezione, le cellule sono state raccolte e colorate con Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT / anti-chGSDME-CT MCAB o IgG di controllo isotipo, e analizzate con citometria a flusso. La colorazione positiva di chGSDME-NT nel test di citometria a flusso ha dimostrato che le cellule chGSDME-NT legate alla membrana con piroptosi indotta da IBDV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Esame della piroptosi mediante citometria a flusso utilizzando la doppia colorazione con chGSDME-NT e PI. (A) Analisi dot-plot di cellule pirottotiche mediante citometria a flusso. Le cellule DF-1 sono state infettate con IBDV con un MOI di 1. 24 ore dopo l'infezione, le cellule sono state raccolte, colorate con Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT / anti-chGSDME-CT MCAB e PI e analizzate con citometria a flusso. (B) La percentuale di cellule pirottotiche in ciascun gruppo in (A) è stata tracciata e analizzata statisticamente. L'ANOVA bidirezionale è stata impiegata per analizzare la significatività statistica. I dati rappresentavano tre esperimenti indipendenti e sono stati presentati come medie ± SD. ***P < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo articolo descrive un metodo efficace per esaminare la piroptosi utilizzando la citometria a flusso, ottenuta attraverso la doppia colorazione delle cellule infette con Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT MCAB e PI. Questo approccio può essere applicato anche a vari tipi di cellule per differenziare la piroptosi da altri tipi di morte cellulare, come l'apoptosi e la necrosi.

La piroptosi, un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata che si basa principalmente sulla formazione dei pori della membrana plasmatica indotta da Gasdermin (GSDM) D nei mammiferi 1,2,3, è stata tradizionalmente valutata attraverso metodi come il rilascio di LDH 6,15, le caratteristiche morfologiche16 e il rilevamento di frammenti GSDM-NT/GSDM-CT tramite Western Blot o saggi IFA17. Tuttavia, nessuno di questi metodi quantifica accuratamente la percentuale di celle pirottotiche. Questo studio sfrutta i caratteristici pori della membrana plasmatica nelle cellule pirottotiche formate da frammenti di GSDM-NT per sviluppare una strategia basata sulla citometria a flusso per la loro determinazione.

Quando le cellule sono state colorate con chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 e PI e successivamente analizzate tramite citometria a flusso nei canali di fluorescenza FL3 e FL4, la piroptosi era distinguibile attraverso due parametri contemporaneamente: la colorazione chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 che indicava la formazione di pori della membrana plasmatica da parte del frammento N-terminale di chGSDME scisso e la colorazione PI che indicava la rottura della membrana plasmatica. I dati dimostrano che la percentuale di cellule double-positive chGSDME-NT/PI nelle cellule infettate da IBDV (circa il 33%) era significativamente più alta rispetto ai controlli con mock-infected (P < 0,001).

Il metodo sperimentale richiede diverse considerazioni per garantire l'accuratezza e l'affidabilità. In primo luogo, ogni provetta del campione utilizzata per l'analisi del flusso deve contenere non meno di 1 x 106 celle per mantenere la precisione dell'analisi del flusso. Date le molteplici fasi di lavaggio del protocollo, si consiglia di aumentare di conseguenza il numero iniziale di cellule in ciascuna provetta al passaggio 2.1, ad esempio a 2 x 106 cellule. È fondamentale gestire il lavaggio e il trasferimento delle cellule con estrema cautela per evitare interruzioni involontarie dell'integrità delle cellule. Inoltre, tieni presente che la densità cellulare, la concentrazione di anticorpi e la durata dell'operazione possono influenzare le impostazioni ottimali dei parametri. Pertanto, è necessario regolare i parametri e le impostazioni del citometro a flusso in base alle specifiche condizioni sperimentali. In questo studio, i parametri utilizzati sono stati i seguenti: FSC AmpGain è stato impostato su 1,40 e la tensione SSC è stata impostata su 490 V. Il gate nel grafico FSC/SSC è stato impostato in modo da coprire tutte le popolazioni cellulari per la successiva analisi FL3/4 canali. Le tensioni di fluorescenza sono state impostate a 600 V per il canale FL3 (PI) e a 600 V per il canale FL4 (Alexa Fluor 647). La compensazione è stata fissata al 38,0% tra i canali FL4 e FL3. La portata è stata impostata su 200 eventi/s, con una soglia di eventi fissata a 10.000.

Aiutata dal nuovo approccio, questa comprensione del ruolo della piroptosi mediata da GSDME nella risposta dell'ospite alle infezioni patogene nei polli e dei meccanismi sottostanti è progredita in modo significativo. Attraverso l'uso di anticorpi specifici, siamo stati in grado di esaminare il chGSDME-NT che forma i pori tramite citometria a flusso, distinguendo le cellule pirottiche dalle altre e facilitando la determinazione della proporzione di cellule sottoposte a piroptosi. Di conseguenza, questo metodo offre un netto vantaggio rispetto ai saggi Western Blot o IFA nella rilevazione delle cellule pirottotiche.

Tuttavia, il limite di questo protocollo risiede nell'utilizzo del frammento N-terminale di GSDME di pollo in cellule infettate da IBDV come modello sperimentale per lo studio della piroptosi. Tuttavia, questo studio segna il primo utilizzo di successo della citometria a flusso per determinare la piroptosi.

In sintesi, il metodo di citometria a flusso qui descritto per esaminare la piroptosi ha un grande potenziale per far progredire la nostra comprensione dei meccanismi alla base della piroptosi sia nei mammiferi che negli uccelli. Questo metodo si pone come uno strumento efficace che contribuisce alla ricerca sulla morte cellulare nelle scienze della vita.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dott. Jue Liu per la sua gentile assistenza. Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del National Key Research and Development Program of China (n. 2022YFD1800300), della National Natural Science Foundation of China (n. 32130105) e dell'Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (n. CARS-40), Cina.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 ml (12 volte 75 mm)Corning Falcon352052
Piastra per colture cellulari a 6 pozzettiCorning3516
Alexa Fluor 647 kit di marcatura degli anticorpiThermo Fisher ScientificA20186
Anti-chGSDME-CT MCABSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, Cina)EU0228
Anti-chGSDME-NT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, Cina)EU0227
Software CellQuestBD Biosciences
CO2 incubatoreThermo Fisher Scientific3100
Centrifuga criogenica per congelamentoEppendorf5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco by Life TechnologiesC11995500BT
Siero fetale bovino (FBS)Sigma-AldrichF0193-500ML
Citometro a flussoBD BiosciencesFACSCalibur
Citometria a flusso Tampone di colorazioneThermo Fisher Scientific00-4222-26
EmocitometroQiu-jing Reagente biochimico e Azienda di strumenti (Shanghai, Cina)YX-JSB52
IBDV Lx ceppoIBDV Lx ceppo è stato gentilmente fornito dal Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Pechino, Cina
M& C  Tecnologia geneticaCC017
Ioduro di propidio (PI)Sigma-AldrichP4170
Tripsina-EDTA, 0,25%M & C  OscillatoreGene Technology CC008
MIULABMIX-28+
Microscopio invertito Chongqing Photoelectric Instrument Company XDS-1B Normal Mouse IgG Santa Cruz Biotechnology sc-2025 Phosphate Buffer Saline (PBS) a vortice

Riferimenti

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