Questo articolo descrive l'identificazione di cellule pirottiche mediante citometria a flusso dopo doppia colorazione con anticorpi contro il frammento N-terminale di GSDME di pollo (chGSDME-NT) e lo ioduro di propidio (PI).
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Articolo metodologico
Esame della piroptosi mediante citometria a flusso
In questo articolo
Sommario
Abstract
La piroptosi è un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata guidata prevalentemente dalla formazione di pori della membrana plasmatica da parte dell'N-terminale generato dalle proteine della famiglia Gasdermin (GSDM). L'esame del GSDM-NT attaccato alla membrana mediante Western Blot è il metodo più comunemente usato per valutare la piroptosi. Tuttavia, è difficile differenziare le cellule con piroptosi da altre forme di morte cellulare utilizzando questo metodo. In questo studio, le cellule DF-1 infettate dal virus della malattia infettiva della borsa (IBDV) sono state impiegate come modello per quantificare la percentuale di cellule sottoposte a piroptosi mediante citometria a flusso, utilizzando anticorpi specifici contro il frammento N-terminale del GSDME di pollo (chGSDME-NT) e la colorazione con ioduro di propidio (PI). Le cellule chGSDME-NT-positive erano facilmente rilevabili mediante citometria a flusso utilizzando gli anticorpi anti-chGSDME-NT marcati con Alexa Fluor 647. Inoltre, la percentuale di cellule double-positive chGSDME-NT/PI nelle cellule infettate da IBDV (circa il 33%) era significativamente maggiore rispetto ai controlli con mock-infected (P < 0,001). Questi risultati indicano che l'esame del chGSDME-NT legato alla membrana mediante citometria a flusso è un approccio efficace per determinare le cellule piroptotiche tra le cellule in fase di morte cellulare.
Introduzione
La piroptosi è un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata che dipende principalmente dalla formazione dei pori della membrana plasmatica da parte di Gasdermin (GSDM) D nei mammiferi 1,2,3. A causa del deficit genetico di GSDMD nei polli 4,5, il meccanismo della piroptosi nei polli rimane sfuggente. La famiglia Gasdermin comprende proteine conservate, tra cui GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME e DFNB59 3,6. Gli studi hanno riportato che il GSDME dei pe....
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Protocollo
I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Preparazione delle celle campione
- Coltura di cellule DF-1 (fibroblasti di embrioni di pollo immortali) in piastre a sei pozzetti (5 x 10,5 cellule per pozzetto) con Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in un incubatore al 5% di CO2 a 38 °C.
- Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, scartare il terreno di coltura cellulare contenente siero, lavare le cellule tre volte con soluzione salina tamp....
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Risultati
chGSDME-NT sulla membrana delle cellule DF-1 con infezione da IBDV potrebbe essere facilmente rilevato mediante citometria a flusso
Una delle caratteristiche più importanti delle cellule pirottotiche è la formazione di pori di membrana da parte di frammenti di GSDM-NT generati dalla scissione di Gasdermin. Pertanto, le cellule piroptotiche potrebbero teoricamente essere rilevate mediante citometria a flusso esaminando GSDM-NT sulle membrane cellulari utilizzando anticorp.......
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Discussione
Questo articolo descrive un metodo efficace per esaminare la piroptosi utilizzando la citometria a flusso, ottenuta attraverso la doppia colorazione delle cellule infette con Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT MCAB e PI. Questo approccio può essere applicato anche a vari tipi di cellule per differenziare la piroptosi da altri tipi di morte cellulare, come l'apoptosi e la necrosi.
La piroptosi, un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata che si basa principalmente sulla formazi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. Jue Liu per la sua gentile assistenza. Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del National Key Research and Development Program of China (n. 2022YFD1800300), della National Natural Science Foundation of China (n. 32130105) e dell'Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (n. CARS-40), Cina.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 ml (12 volte 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 kit di marcatura degli anticorpi | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT MCAB | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, Cina) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, Cina) | EU0227 | |
| Software CellQuest | BD Biosciences | ||
| CO2 incubatore | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Centrifuga criogenica per congelamento | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Citometro a flusso | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Citometria a flusso Tampone di colorazione | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Emocitometro | Qiu-jing Reagente biochimico e Azienda di strumenti (Shanghai, Cina) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx ceppo | IBDV Lx ceppo è stato gentilmente fornito dal Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Pechino, Cina | ||
| M& C Tecnologia genetica | CC017 | ||
| Ioduro di propidio (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Tripsina-EDTA, 0,25% | M & C Oscillatore | Gene Technology CC008 | |
| MIULAB | MIX-28+ |
Riferimenti
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Na....
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Ristampe e permessi
