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Articolo di ricerca

Approfondimenti meccanicistici sulla protezione mitocondriale del salidroside tramite la via AMPK/SIRT1/HIF-1α nelle cellule HT22 ipossiche

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DOI:

10.3791/66923

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25 aprile 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Service Office, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan

In questo articolo

Sommario

Il presente studio ha identificato un meccanismo unico attraverso il quale il salidroside esercita effetti protettivi mitocondriali sulle cellule HT22 ipossiche, in parte attraverso la via AMPK/Sirt1/HIF-1α.

Abstract

È stato scoperto che Salidroside (Sal), un ingrediente attivo della Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba esercita effetti protettivi mitocondriali migliorando il metabolismo e migliorando l'apporto energetico delle cellule cerebrali in condizioni di ipossia. Tuttavia, il suo meccanismo d'azione non è stato completamente chiarito. Nel presente studio, la cromatografia liquida ad alte prestazioni è stata impiegata per la prima volta per analizzare gli effetti del Sal sui livelli di nucleotidi (ATP, ADP e AMP). Il saggio di spostamento termico cellulare (CETSA), un metodo di interazione molecolare ampiamente utilizzato per convalidare e quantificare l'impegno del bersaglio farmacologico in cellule e tessuti di diverse specie, è stato quindi scelto per confermare l'affinità di Sal per le proteine correlate alla via AMPK/Sirt1/HIF-1α. I risultati hanno rivelato che Sal ha aumentato i livelli di ATP e ADP nelle cellule HT22 ipossiche, riducendo i livelli di AMP. Inoltre, Sal ha mostrato un legame stabile con le proteine AMPKα, p-AMPKα, Sirt1 e HIF-1α. In conclusione, Sal può esercitare effetti protettivi mitocondriali modulando la via AMPK/Sirt1/HIF-1α per regolare il contenuto nucleotidico. Questo studio fornisce un riferimento metodologico per l'analisi del contenuto di nucleotidi in campioni cellulari e contribuisce all'identificazione e alla scoperta di bersagli per composti derivati dalla medicina tradizionale cinese.

Introduzione

Il cervello è altamente sensibile all'ossigeno a causa delle sue elevate richieste metaboliche, della limitata capacità glicolitica e della dipendenza dalla fosforilazione ossidativa. Di conseguenza, l'esposizione a un ambiente a basso contenuto di ossigeno ad alta quota può facilmente portare a lesioni cerebrali ipossiche ipobariche (HHBI)1,2. Studi epidemiologici indicano che quando gli individui non acclimatati ad alta quota salgono rapidamente verso regioni di alta quota, l'incidenza del mal di montagna acuto può raggiungere fino al 75%, con un tasso di mortalità di circa l'1% per i casi gravi. Inoltre, in assenza di cure mediche, i tassi di mortalità per edema cerebrale o polmonare d'alta quota possono raggiungere il 40%3,4.

L'HHBI si presenta con un ampio spettro di sintomi clinici. I casi da lievi a moderati possono includere mal di testa, vertigini e perdita di memoria5, mentre i casi gravi possono causare deterioramento cognitivo, alterazione della coscienza ed esiti potenzialmente fatali5. La prevenzione e il trattamento dell'HHBI nelle regioni d'alta quota sono diventati un obiettivo chiave della ricerca medica. Le strategie preventive coinvolgono principalmente l'allenamento adattivo in ambienti ad alta quota, tra cui un riposo adeguato, una dieta ben bilanciata, una corretta alimentazione e un adeguato esercizio fisico 6,7. Inoltre, gli interventi farmacologici volti a proteggere le cellule cerebrali e ad alleviare l'ipossia cerebrale rimangono centrali nell'attuale ricerca sull'HHBI.

I mitocondri fungono da centri primari di produzione di energia all'interno delle cellule, sintetizzando l'adenosina trifosfato (ATP) per soddisfare le richieste di energia cellulare. In condizioni di ipossia, la produzione di energia mitocondriale diminuisce, portando a una riduzione dei livelli di ATP e a una compromissione della funzione cellulare8. La lesione ipossica interrompe anche la regolazione mitocondriale del Ca2+ e l'omeostasi del pH, innescando apoptosi e necrosi 9,10. Esiste una relazione che si rafforza a vicenda tra la disfunzione mitocondriale e la lesione cerebrale ipossica. Da un lato, la compromissione mitocondriale indotta dall'ipossia aggrava la carenza di ossigeno riducendo ulteriormente il metabolismo energetico cellulare, creando un circolo vizioso. D'altra parte, la disfunzione mitocondriale eleva i livelli intracellulari di Ca2+, attivando cascate apoptotiche e portando alla morte cellulare11. Sebbene i meccanismi alla base della lesione cerebrale ipossica rimangano complessi e non completamente compresi, diversi studi hanno identificato il metabolismo energetico mitocondriale neuronale alterato come un fattore critico nella sua patogenesi12,13. Pertanto, un'ulteriore esplorazione della funzione mitocondriale può fornire preziose informazioni sui potenziali bersagli terapeutici per le lesioni cerebrali ipossiche.

Il salidroside (Sal) è un principio attivo estratto dalla pianta dell'altopiano Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba ed è ampiamente utilizzato in prodotti alimentari, sanitari e farmaceutici14. La formula molecolare del Sal è C14H20O7, ed è anche noto come 2-(4-idrossifenil)-etil β-D-glucopiranoside. Possiede diverse proprietà farmacologiche, tra cui anti-ipossia, antiossidante, anti-fatica, anti-tumorale, immunomodulante, antinfiammatorio ed effetti protettivi cardiovascolari e cerebrovascolari 15,16,17. Tra questi, il suo effetto anti-ipossia è uno dei più documentati. Studi recenti hanno sempre più evidenziato i significativi effetti protettivi mitocondriali del Sal come potenziale meccanismo per i suoi effetti preventivi e terapeutici sulle lesioni cerebrali indotte dal plateau nei topi14,18. Tuttavia, i precisi meccanismi molecolari con cui Sal influenza i livelli di ATP, ADP e AMP rimangono poco compresi.

La proteina chinasi attivata dall'AMP (AMPK) agisce come un sensore di energia chiave che aiuta a mantenere l'omeostasi energetica cellulare. L'attivazione dell'AMPK stimola la sirtuina 1 (Sirt1), portando ad un aumento dei livelli intracellulari di NAD+ 19. Gli studi hanno dimostrato che Sirt1 può regolare il fattore 1-alfa inducibile dall'ipossia (HIF-1α) per coordinare la risposta cellulare all'ipossia20. Ricerche precedenti hanno dimostrato che Sal inibisce l'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale neuronale, regola i processi energetici mitocondriali mediati da HIF-1α, attenua l'apoptosi neuronale e mantiene l'integrità della barriera emato-encefalica, proteggendo così i ratti dalle lesioni cerebrali indotte dal plateau14,21. Tuttavia, l'effetto del Sal sull'ATP e sui suoi metaboliti, ADP e AMP, rimane incerto.

Per indagare su questo aspetto, è stata prima impiegata la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per quantificare i livelli di questi tre nucleotidi. Inoltre, è stato utilizzato il saggio di spostamento termico cellulare (CETSA), una tecnica biofisica ampiamente utilizzata introdotta nel 2013 per studiare le interazioni ligando-proteina in cellule intatte22. Questo metodo è comunemente applicato per convalidare e quantificare l'impegno del bersaglio del farmaco nelle cellule e nei tessuti di diverse specie. In particolare, dopo la co-incubazione dei lisati delle cellule bersaglio con il farmaco a temperature variabili per un determinato periodo di tempo, la proteina legata al farmaco mostra una maggiore stabilità termica, rendendola meno incline alla denaturazione e alla precipitazione. Le proteine non legate precipitate vengono quindi rimosse mediante centrifugazione e le interazioni farmaco-bersaglio vengono successivamente identificate attraverso l'analisi western blot del surnatante22. Per identificare potenziali bersagli molecolari di Sal, CETSA è stato selezionato per valutare la sua affinità di legame con le proteine correlate alla via AMPK/Sirt1/HIF-1α.

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Protocollo

I dettagli commerciali dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione della soluzione

  1. Preparare il mezzo Eagle modificato di Dulbecco completo (DMEM) aggiungendo il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina.
  2. Preparare una soluzione di Sal da 20 mM sciogliendo 3 mg di Sal in 500 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)21.
  3. Filtrare 500 mL di acetonitrile cromatograficamente puro (fase mobile A) utilizzando una membrana organica da 0,45 μm.
  4. Preparare 1000 mL di fase B mobile aggiungendo 3,5 mL di reagente I a 1 L di acqua deionizzata. Regolare il pH a 6,15 con il reagente II, seguendo le istruzioni del kit di analisi del contenuto di nucleotidi (ATP, ADP e AMP) (vedere la Tabella dei materiali).
    NOTA: Il reagente I e il reagente II sono inclusi nel kit del saggio del contenuto di nucleotidi (ATP, ADP e AMP).
  5. Filtrare la fase mobile B utilizzando una membrana acquosa da 0,22 μm.
    NOTA: La fase B mobile deve essere utilizzata immediatamente dopo la preparazione. Le fasi mobili A e B devono essere sonicate per 30 minuti prima dell'uso per rimuovere le bolle d'aria.
  6. Diluire una soluzione madre standard ATP, ADP e AMP da 1 μM con acqua deionizzata per ottenere soluzioni standard delle serie ATP, ADP e AMP da 0,5 μM, 0,1 μM, 0,05 μM, 0,01 μM e 0,005 μM.
  7. Filtrare la serie di soluzioni standard utilizzando una membrana filtrante microporosa ad ago da 0,22 μm.
    NOTA: I flaconi marroni per iniezione devono essere utilizzati per conservare le soluzioni standard seriali. La serie preparata di soluzioni standard deve essere utilizzata il prima possibile.

2. Coltura cellulare

NOTA: La coltura cellulare HT22 e il modello di ipossia stimolata con CoCl2 sono stati stabiliti secondo un precedente rapporto21.

  1. Colture di cellule HT22 a 37 °C con il 5% di CO2 fino al raggiungimento dell'80% di confluenza nella capsula di Petri. Digerire le cellule con tripsina allo 0,25% per 1 minuto.
  2. Seminare 2 × 105 cellule dalla fase 2.1 in piastre a 6 pozzetti con DMEM completo (gruppo di controllo senza trattamento farmacologico) o DMEM completo contenente il farmaco (250 μM CoCl2, 250 μM CoCl2 + 10 μM Dor, 250 μM CoCl2 + 20 μM Sal e 250 μM CoCl2 + 10 μM Dor + 20 μM Sal). Incubare per 24 ore a 37 °C con CO2 al 5%.
    NOTA: In ogni gruppo sono stati preparati tre campioni paralleli.

3. Saggio del contenuto di nucleotidi (ATP, ADP e AMP)

  1. Aggiungere 1 mL di reagente di estrazione I a ciascun pozzetto delle piastre a 6 pozzetti del passaggio 2.2.
    NOTA: Il reagente di estrazione I è incluso nel kit del saggio del contenuto di nucleotidi (ATP, ADP e AMP) (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Lisi le cellule mediante sonicazione su un bagno di ghiaccio utilizzando un apparecchio di disgregazione cellulare ad ultrasuoni (potenza: 300 W, onde ultrasoniche per 3 s, intervallo di 7 s, tempo totale: 3 min).
  3. Centrifugare le celle lisate a 10,304 × g per 10 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga refrigerata ad alta velocità.
  4. Trasferire 0,75 mL di surnatante dal passaggio 3.3 in una provetta da 2,0 mL. Aggiungere 0,75 mL di reagente di estrazione II, agitare e mescolare con un miscelatore a vortice e centrifugare nuovamente a 10,304 × g per 10 minuti a 4 °C.
    NOTA: Il reagente di estrazione II è incluso nel kit del saggio del contenuto di nucleotidi (ATP, ADP e AMP).
  5. Pipettare il surnatante del passaggio 3.4 e filtrarlo utilizzando una membrana filtrante microporosa ad ago da 0,22 μm in una fiala marrone.
    NOTA: ATP, ADP e AMP nel campione estratto non sono stabili. Tutte le procedure sperimentali devono essere eseguite a basse temperature o su ghiaccio. I campioni devono essere elaborati e testati il prima possibile.
  6. Aprire il software cromatografico e impostare i seguenti parametri: volume di iniezione: 10 μL; temperatura della colonna: 27 °C; portata: 0,8 mL/min; lunghezza d'onda di rilevamento: 254 nm; Durata del rilevamento: 70 min. Impostare la procedura di eluizione del gradiente secondo la Tabella 1.
  7. Fare clic sul pulsante Esegui per iniettare automaticamente il campione e rilevare il contenuto di ATP, ADP e AMP nelle soluzioni standard seriali (passaggio 1.7) e nelle soluzioni campione (passaggio 3.5) in base al programma impostato nel passaggio 3.6.
    NOTA: Al termine dell'esperimento, lavare la colonna cromatografica con il 98% di fase B mobile per evitare l'intasamento.
  8. Traccia le curve standard di ATP, ADP e AMP utilizzando software di analisi grafica e statistica, con concentrazioni standard seriali sull'asse x e aree di picco sull'asse y.
  9. Calcola il contenuto di ATP, ADP e AMP nei campioni utilizzando l'equazione della curva standard del passaggio 3.8.

4. Saggio di spostamento termico cellulare (CETSA)

  1. Lisi le cellule HT22 normali per 20 minuti in una capsula di Petri utilizzando lisato contenente inibitore della proteasi (lisato: inibitore della proteasi = 100:1) pipettando ripetutamente le cellule.
    NOTA: Eseguire questo passaggio su un bagno di ghiaccio per prevenire la degradazione delle proteine.
  2. Raccogliere il lisato cellulare del passaggio 4.1 e sonicare su un bagno di ghiaccio utilizzando un apparecchio di disgregazione cellulare a ultrasuoni (potenza: 300 W, onde ultrasoniche per 3 s, intervallo 7 s, tempo totale: 3 min). Centrifugare a 10,304 × g, 4 °C per 20 min e raccogliere il surnatante.
    NOTA: Dividere il surnatante in 14 porzioni: 7 gruppi per la coincubazione con Sal e 7 gruppi per la coincubazione con PBS come controllo. Per il gruppo trattato con Sal, aggiungere 100 μL di surnatante e 0,1 μL di Sal da 20 μM per campione. Per il gruppo di controllo, aggiungere 100 μL di surnatante e 0,1 μL di PBS per campione.
  3. Incubare ogni campione a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi incubare ulteriormente a 37 °C, 42 °C, 47 °C, 52 °C, 57 °C, 62 °C e 67 °C per 3 minuti utilizzando uno strumento di controllo della temperatura di riscaldamento in metallo.
  4. Centrifugare i campioni dalla fase 4.3 a 10.304 × g per 20 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante utilizzando una pipetta.
  5. Misurare la concentrazione proteica totale del surnatante dal passaggio 4.4 utilizzando un kit per il dosaggio della concentrazione proteica BCA, seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali).
  6. Preparare il gel di separazione al 10% utilizzando un kit di preparazione rapida PAGE gel, seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei Materiali).
  7. Caricare 3 μL di marcatore proteico colorato precolorato e 14 μL di campioni nei pozzetti del gel di separazione (quantità proteica finale per pozzetto: 20 μg).
  8. Far funzionare il gel utilizzando il tampone per elettroforesi per 1 ora a 80-100 mV per ottenere proteine separate.
  9. Trasferire le proteine dal passaggio 4.8 su una membrana PVDF utilizzando una soluzione di trasferimento rapido della membrana e una struttura a sandwich (cotone-carta da filtro-membrana PVDF-gel proteico-carta da filtro-cotone) a 400 mA per 30 min.
  10. Bloccare le membrane in PVDF dal passaggio 4.9 con una soluzione di albumina sierica bovina (BSA) al 5% per 1-2 ore a temperatura ambiente.
    NOTA: Preparare una soluzione BSA al 5% sciogliendo 5 mg di polvere di BSA in 100 ml di soluzione TBST contenente 100 ml di tampone TBS e Tween 20 allo 0,05%.
  11. Incubare le membrane in PVDF dal passaggio 4.10 con 5 mL di anticorpo primario diluito a 4 °C per una notte.
    NOTA: Diluire l'anticorpo primario in soluzione BSA (rapporto 1:1000).
  12. Lavare le membrane in PVDF tre volte con TBST per 5 minuti ciascuna per rimuovere gli anticorpi primari non legati.
  13. Incubare le membrane della fase 4.12 con un anticorpo secondario accoppiato a perossidasi di rafano diluito (HRP) per 2 ore a temperatura ambiente su un agitatore di decolorazione.
    NOTA: Diluire l'anticorpo secondario accoppiato a HRP in soluzione BSA (rapporto 1:10.000).
  14. Lavare le membrane tre volte con TBST per 5 minuti ciascuna per rimuovere l'anticorpo secondario residuo.
  15. Coprire le membrane dal passaggio 4.14 con lo sviluppatore di chemiluminescenza ECL, quindi visualizzare il segnale della proteina bersaglio utilizzando un sistema di imaging.
    NOTA: Eseguire questo passaggio al buio per evitare l'estinzione della fluorescenza.
  16. Analizzare e quantificare il valore di grigio delle proteine target utilizzando il software ImageJ (vedi T able dei materiali).

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Risultati

Le curve standard per ATP, ADP e AMP rilevate dall'HPLC erano rispettivamente Y = 7006,5X - 222,99, Y = 5217,3X - 17,796 e Y = 9280,1X + 22,749 (Figura 1A-C). I contenuti nucleotidici misurati in ciascun gruppo mediante HPLC sono stati calcolati utilizzando le curve standard (Figura 1D-I). È stato riscontrato che il CoCl2 ha ridotto significativamente i livelli di ATP e ADP nelle cell...

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Discussione

I mitocondri sono organelli chiave coinvolti nella prevenzione terapeutica dell'HHBI 23,24,25. Precedenti studi del gruppo hanno confermato che Sal regola l'espressione delle proteine AMPK, Sirt1 e HIF-1α, migliorando la funzione mitocondriale neuronale e proteggendo da HHBI21,24. Tuttavia, l'effetto diretto del Sal sui nucleotidi nelle ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82274207 e 82474185), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia del Sichuan (2024NSFSC1845), dalla Science Foundation for Youths of Science & Technology Department della Provincia del Sichuan (2023NSFSC1776), dal Key Research and Development Program di Ningxia (2023BEG02012), dal Youth Talent Support Project della China Association of Chinese Medicine per il periodo 2024-2026 (2024-QNRC2-B07) e dallo Xinglin Scholar Research Progetto di promozione dell'Università di Chengdu di MTC (XKTD2022013 e QJJJ2024027).

CONTRIBUTO DELL'AUTORE:
Xiaobo Wang, Yating Zhang, Ya Hou, Rui Li e Xianli Meng hanno ideato questo progetto. Yating Zhang, Ya Hou e Tingting Kuang hanno eseguito gli esperimenti e analizzato i dati. Yating Zhang e Hong Jiang hanno scritto il manoscritto. Xiaobo Wang e Xianli Meng hanno rivisto il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AcetonitrileAladinoA104440
0,22 &; micro; membrana acquosaJintengJTMF0445
0,22 µ m membrana filtrante microporosa ad agoJintengJTSFM013001
0,45 &; m membrana organicaJintengJTMF0448
software Agilent OpenLab   Agilentversione 2.X
Anticorpo-AMPKαTecnologia di segnalazione cellulare#2532
Anticorpo-HIF-1αTecnologia di segnalazione cellulare#41560
Antibody-p-AMPKαTecnologia di segnalazione cellulare#50081
Anticorpo-Sirt1Tecnologia di segnalazione cellulare#2028
Anticorpo-β-actinaTecnologia di segnalazione cellulare#4970
Kit di analisi della concentrazione di proteine BCABoster Biological Technology17E17B46
Albumina sierica bovinaCywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW127-02
Inibitore della fosfatasi ad ampio spettro (100×)Boster Biological TechnologyAR1183
Colonna cromatograficaAgilentSB-C18
CoCl2Sigma15862
Agitatore di decolorazioneKylin-BellTS-2
DorsomorphinMedChemExpress (MCE)HY-13418A
Aquila modificata di Dulbecco medioGibco8121587
tampone per elettroforesiNCM Biotech20230801
Siero fetale bovinoGibco2166090RP
Capra Anti-coniglio IgG H& L (TRITC)ZenBioScience Co., Ltd.
software GraphPad PrismSoftware GraphPad, LLCVersione 9.0.0
Cromatografia liquida ad alte prestazioniAgilent1260 Infinity II Prime
Centrifuga refrigerata ad alta velocitàThermo Fisher Scientific LegendMicro 17R
HRP coniugato affinipure capra anti-coniglio IgG(H+L)Boster Biological Technology Co., Ltd.Celle BA1054
HT22Guangzhou Jennio Biotech Co., Ltd.JNO-02001
Kit di chemiluminescenza ECL ipersensibileNCM BiotechP10300
Immagine J softwareNational Institutes of Healthv1.8.0
Strumento di controllo della temperatura di riscaldamento in metalloBaiwan Electronictechnology Co., Ltd.Kit
Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.BC5114
PAGE kit di preparazione rapida in gelBiosharpPL566B-5
Penicillina-streptomicinaNCM BiotechC125C5
Soluzione salina tamponata con fosfato (1×)Gibco8120485
Marcatore proteico colorato precolorato (10-180 kDa)Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW176-02
Tampone di caricamento delle proteine (5x)Boster Biological TechnologyAR1112
PVDF (0,45 μ m)Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW120-01
Soluzione di trasferimento rapido della membranaCywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW171-02
Lisato di RIPABoster Biological Technology Co., Ltd.AR0105
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.Tampone RFS-H0400191102
TBSNCM Biotech23HA0102
Tampone transmembranaNCM Biotech23CA2000
Tripsina (0,25%, 1&volte;)HyCloneJ210045
Tween 20Shanghai Canspec Scientific Instruments Co., Ltd.
Apparecchio di disgregazione cellulare ad ultrasuoniNingbo Xinyi apparecchiature ad ultrasuoni Co., Ltd.JY92-IIDN
Sistema di imaging VisionworksAnalytik JenaUVP ChemStudio
Vortex mixerKylin-BellXW-80A
511202 di analisi del contenuto di metanolo Aladino M116118 nucleotidi (ATP, ADP e AMP) HG221-X3 PM12012

Riferimenti

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