Risonanza magnetica polmonare iperpolarizzata 129Xe e spettroscopia in topi ventilati meccanicamente

Sommario

La risonanza magnetica allo xeno iperpolarizzata può quantificare la microstruttura polmonare regionale (dimensioni dello spazio aereo) e la fisiologia (ventilazione e scambio di gas) nella ricerca traslazionale e nell'assistenza clinica. Sebbene impegnativo, può fornire informazioni polmonari comparabili negli studi preclinici. Questo protocollo descrive l'infrastruttura e le procedure necessarie per eseguire la risonanza magnetica polmonare allo xeno di routine nei topi.

Abstract

Lo xenon-129 iperpolarizzato (HP) (¹²⁹Xe) è un agente di contrasto per risonanza magnetica (MRI) inalato con proprietà spettrali e fisiche uniche che possono essere sfruttate per quantificare la fisiologia polmonare, tra cui la ventilazione, la diffusione limitata (dimensione dello spazio alveolare-aereo) e lo scambio gassoso. Nell'uomo, è stato utilizzato per valutare la gravità e la progressione della malattia in una varietà di disturbi polmonari ed è approvato per l'uso clinico negli Stati Uniti e nel Regno Unito. Al di là delle sue applicazioni cliniche, la capacità della risonanza magnetica ¹²⁹Xe di valutare in modo non invasivo la fisiopatologia polmonare e fornire informazioni spazialmente risolte è preziosa per la ricerca preclinica. Tra i modelli animali, i topi sono i più utilizzati a causa dell'accessibilità dei modelli di malattia geneticamente modificati. In questo caso, la risonanza magnetica ¹²⁹Xe è promettente come tecnica minimamente invasiva, priva di radiazioni e sensibile per monitorare longitudinalmente la progressione della malattia polmonare e la risposta alla terapia (ad esempio, nella scoperta di farmaci). Questa tecnica può estendersi alle applicazioni precliniche incorporando un apparecchio di respirazione libera attivato dalla risonanza magnetica o un ventilatore meccanico per erogare gas. Qui, descriviamo i passaggi e forniamo liste di controllo per garantire una solida raccolta e analisi dei dati, tra cui la creazione di un fantoccio di gas xeno polarizzato termicamente per il controllo di qualità, l'ottimizzazione della polarizzazione, la gestione degli animali (sedazione, intubazione, ventilazione e cura dei topi) e i protocolli per la ventilazione, la diffusione limitata e i dati di scambio gassoso. Mentre la risonanza magnetica preclinica ¹²⁹Xe può essere applicata in vari modelli animali (ad esempio, ratti, suini, pecore), questo protocollo si concentra sui topi a causa delle sfide poste dalla loro piccola anatomia, che sono bilanciate dalla loro convenienza e dalla disponibilità di molti modelli di malattia.

Introduzione

Sebbene i disturbi polmonari rimangano le principali cause di morbilità e mortalità a livello^globale1, nell'ultimo decennio si sono registrati notevoli miglioramenti negli esiti dei pazienti. Questi miglioramenti sono guidati in parte da due fattori. In primo luogo, gli studi clinici di Fase III ora danno priorità ai cambiamenti nella funzione polmonare come endpoint piuttosto che alla mortalità, accelerando gli studi farmacologici 2,3,4,5. In secondo luogo, i progressi nei modelli animali migliorati hanno fornito informazioni sui meccanismi della malattia e hanno aiutato lo sviluppo della terapia ^6,7. I modelli murini sono spesso preferiti per la ricerca traslazionale perché offrono parallelismi fisiologici con gli esseri umani, convenienza e rapido sviluppo della malattia. L'ingegneria genetica ha ampliato la gamma e la qualità dei modelli disponibili, con l'International Mouse Strain Resource che ora vanta oltre 32.000 ceppi di topo⁸, rispetto ai soli 4.218 ceppi di ratto (Rat Genome Database⁹). Questi modelli hanno aperto nuove strade per lo studio dei driver meccanicistici e delle risposte terapeutiche per una serie di malattie polmonari, tra cui la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO)¹⁰, la fibrosi cistica (FC)¹¹, la fibrosi polmonare^12,13, l'ipertensione polmonare^14,15 e l'asma¹⁶.

Sfortunatamente, la ricerca polmonare che coinvolge i topi è limitata dalle tecniche disponibili per quantificare il carico di malattia. Gli studi spesso si basano su procedure terminali che 1) forniscono informazioni sull'intero polmone (saggi biochimici) o informazioni localizzate (istologia) e 2) richiedono disegni trasversali e campioni di grandi dimensioni. Pertanto, non catturano né le dinamiche spaziali né temporali della malattia. Al contrario, l'imaging tridimensionale non invasivo può valutare la struttura, i processi molecolari e la funzione dei polmoni nel tempo.

La struttura polmonare (ad es. anomalie delle vie aeree e fibrosi interstiziale) può essere visualizzata con la risonanza magnetica a tempo di eco ultra-breve (UTE) e la tomografia microcomputerizzata (μCT) ad alta risoluzione. Le informazioni funzionali e meccanicistiche (ad esempio, ventilazione, perfusione, metabolismo tumorale e processi infiammatori) possono essere ottenute con agenti di contrasto esogeni (ad esempio, TC potenziata con xeno e UTE potenziata con ossigeno) e approcci di medicina nucleare ionizzante (ad esempio, tomografia a emissione di positroni [PET] e tomografia computerizzata a emissione di fotone singolo [SPECT]). Tuttavia, l'imaging funzionale è impegnativo a causa del modesto rapporto tra contrasto e rumore (in particolare per UTE potenziato con ossigeno alle elevate intensità del campo magnetico utilizzato per la risonanza magnetica preclinica, dove T₁ è allungato) disponibile senza impiegare modalità ionizzanti con livelli di radiazioni superiori al normale. Mentre l'imaging con queste modalità è ben tollerato nei modelli animali che utilizzano dosi convenzionali, la radiazione cumulativa può confondere i risultati negli studi su immunologia, infiammazione e cancro del polmone¹⁷. Tuttavia, la risonanza magnetica (MRI) allo xenon-129 (¹²⁹Xe) iperpolarizzata (HP) fornisce informazioni strutturali e funzionali minimamente invasive, non irradianti e altamente sensibili. Sebbene questa tecnica sia stata impiegata nella ricerca preclinica per caratterizzare condizioni tra cui enfisema^18,19, fibrosi²⁰, cancro del polmone²¹, BPCO²² e danno polmonare indotto da radiazioni²³ in uno o più punti temporali, rimane sottoutilizzata in ambito preclinico.

Per abilitare la risonanza magnetica ¹²⁹Xe preclinica di routine, sono necessari diversi prerequisiti, tra cui il supporto normativo istituzionale, un dispositivo di iperpolarizzazione, una bobina a radiofrequenza (RF) sintonizzata ^{con 129}Xe e uno scanner multinucleare. Sebbene le applicazioni avanzate 24,25,26,27,28,29,30,31,32,33 richiedano una programmazione a impulsi specifica del fornitore che non rientra nell'ambito di questo protocollo, le applicazioni di base possono essere ottenute con modeste modifiche software. Pertanto, ci concentriamo sul controllo di qualità, sulla gestione della magnetizzazione, sulla raccolta dei dati e sulle procedure di manipolazione degli animali, inclusa la ventilazione meccanica, che sono esclusive della risonanza magnetica preclinica ¹²⁹Xe (Figura 1).

Ad oggi, l'imaging ¹²⁹Xe per piccoli animali ha impiegato tre approcci di erogazione di gas sicuri per la risonanza magnetica, ciascuno con vantaggi e svantaggi: respirazione libera, azionamento a pistone e caduta di pressione. La respirazione libera consente l'inalazione spontanea senza il rischio di lesioni dovute all'intubazione o alla tracheostomia, ma consuma significativamente più gas HP e può introdurre artefatti di movimento^34,35. I dispositivi commerciali a pistone sono autocalibranti e facili da usare, ma possono essere proibitivi³⁶. L'approccio basato sulla caduta di pressione utilizzato qui è ben descritto in letteratura, modulare, personalizzabile ed eseguito da codice open source 37,38,39,40. Inoltre, è conveniente, in genere totalizza meno di $ 10k e alcune settimane di tempo di costruzione dedicato. Il ventilatore a caduta di pressione eroga ¹²⁹Xe da una sacca dosatrice all'interno di una bombola pressurizzata, monitorando al contempo la pressione delle vie aeree di un topo intubato.

Figura 1: Panoramica del protocollo per la raccolta di routine della risonanza magnetica (MRI) xenon-129 (¹²⁹Xe) nei topi. (A) Passaggi per la configurazione iniziale. (Nota: la programmazione dello scanner è univoca per ciascun fornitore e non è descritta in questo protocollo). (B) Passaggi per raccogliere dati giornalieri sulla garanzia della qualità (QA) e sugli animali. (C) Passaggi per la conclusione dell'esperimento e l'analisi dei dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Qui, raccogliamo e analizziamo le tre classi comuni di ^{dati 129}Xe MRI: ventilazione, imaging pesato in diffusione (dimensione dello spazio alveolare-aereo) e scambio gassoso. Le immagini di ventilazione mostrano la distribuzione del gas ¹²⁹Xe inalato. Le regioni dei polmoni con flusso d'aria ridotto appaiono scure nelle immagini del gas HP e la patologia è quantificata dal volume di ventilazione difettosa. Nell'uomo, la percentuale di difetto di ventilazione (VDP) ha mostrato una forte ripetibilità ^41,42 e un'elevata sensibilità all'ostruzione polmonare in malattie come la BPCO 43,44,45 e l'asma ^46,47.

La diffusione ristretta dei ¹²⁹atomi di Xe nello spazio aereo può essere misurata tramite il coefficiente di diffusione apparente (ADC) e funge da surrogato per le dimensioni dello spazio aereo. L'ADC viene calcolato acquisendo un'immagine basale (b₀) senza ponderazione della diffusione e una o più immagini acquisite in presenza di ponderazione della diffusione indotta da gradiente bipolare (b_N). Un ADC elevato riflette un aumento delle dimensioni dello spazio aereo dovuto all'invecchiamento o al rimodellamento enfisematoso^18,48. Inoltre, l'utilizzo di più immagini del valore b (≥4) consente di calcolare informazioni morfometriche più dettagliate (ad esempio, intercetta lineare media)^49,50.

Lo scambio gassoso può essere caratterizzato a causa 1) della solubilità di ¹²⁹Xe nel tessuto della membrana capillare, nel plasma e nei globuli rossi (globuli rossi) e 2) lo spostamento chimico di >200 ppm verso il basso di ¹²⁹Xe quando disciolto in questi compartimenti. Sia i dati spettroscopici che quelli di imaging forniscono informazioni sulle malattie cardiopolmonari (ad esempio, ipertensione polmonare e insufficienza cardiaca sinistra 51,52,53). Mentre molte specie (esseri umani, cani e ratti) mostrano picchi spettrali unici originati da ciascun compartimento, i topi mancano di un segnale RBC unico a causa delle differenze nelle interazioni del sito di legame emoglobina-xeno. Invece, tutti i componenti disciolti sono combinati in un unico segnale nei topi⁵⁴. Tuttavia, è possibile osservare una distinta risonanza dei globuli rossi nei topi transgenici che esprimono emoglobina umana, come quelli utilizzati nei modelli di anemia falciforme⁵⁴. Nel complesso, la spettroscopia Xe ¹²⁹disciolta e l'imaging forniscono informazioni uniche sulla fisiopatologia cardiopolmonare nei topi^55,56.

Prima di tentare questo protocollo, è necessario comprendere le informazioni di base sullo scanner MRI, la ventilazione meccanica e le tecniche di manipolazione del topo necessarie per gli studi sui topi. Prima di iniziare gli studi sugli animali, tutte le procedure devono essere approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC)⁵⁷. Poiché il momento magnetico totale disponibile nel polmone del topo è intrinsecamente basso (cioè il volume corrente ~ 250 μL), la dimensione del voxel deve essere 1000 volte più piccola rispetto all'uomo per ottenere una risoluzione anatomicamente equivalente. Anche la frequenza respiratoria murina è estremamente rapida (>100 respiri/minuto). Pertanto, le procedure di sospensione del respiro singolo tipicamente utilizzate per l'imaging umano non sono fattibili. Invece, solo poche eccitazioni RF possono essere applicate all'interno di ogni respiro, quindi ¹²⁹immagini Xe devono essere codificate su decine o centinaia di respiri. La programmazione degli impulsi può essere necessaria per consentire l'attivazione esterna delle acquisizioni e per eseguire correttamente il loop di slice, codifiche di fase e/o immagini pesate in diffusione, bilanciando il rapporto segnale/rumore (SNR), la risoluzione e la durata della scansione. In questo caso, il ventilatore emette un impulso logico transistor-transistor (TTL) una volta per respiro per attivare l'acquisizione dei dati (Figura 2).

Figura 2: Ventilazione meccanica rappresentativa e tempi di acquisizione dati. (A) La ventilazione controllata dall'utente può innescare l'acquisizione dei dati alla fine dell'inspirazione, durante l'apnea o alla fine dell'espirazione. (B) Per questa sequenza di ventilazione radiale 3D, l'utente definisce il numero totale di proiezioni acquisite e il numero di proiezioni per respiro. (C) Per un'immagine 2D ponderata in diffusione selettiva per le sezioni, l'utente definisce l'ordine delle sezioni, le immagini con valore b e le codifiche di fase. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per consentire una ventilazione affidabile e l'erogazione di ¹²⁹Xe, sono necessarie solide procedure di sedazione e intubazione. Per ogni studio, devono essere considerati gli effetti a valle di ciascun anestetico, comprese le variazioni della ventilazione al minuto, della frequenza cardiaca (HR) e della pressione sanguigna 58,59,60,61,62,63,64,65,66. Mentre una varietà di sedativi è stata utilizzata per la risonanza magnetica preclinica con gas HP, impieghiamo una miscela di ketamina, xilazina e acepromazina, grazie alla sua disponibilità, economicità, affidabilità e durata ^67,68. Una volta sedati, gli animali devono essere intubati per un'efficace ventilazione meccanica. L'intubazione dei topi è difficile a causa delle piccole dimensioni della loro anatomia e, quindi, è importante allenarsi a fondo in questa tecnica. Incoraggiamo gli investigatori a rivedere i protocolli video pubblicati^69,70. Poiché la maggior parte delle cannule per intubazione commerciali contiene acciaio inossidabile, introduciamo una tecnica per realizzare cannule a forma di cuneo prive di metallo (ad esempio, compatibili con risonanza magnetica e gas HP) che possono essere personalizzate in base al diametro delle vie aeree per creare una chiusura ermetica con la parete tracheale del topo.

Poiché ^{vengono raccolte 129}immagini Xe in molti respiri, le impostazioni del ventilatore sono fondamentali. Le strategie di ventilazione protettiva devono essere attentamente considerate per prevenire lesioni polmonari 71,72,73,74. In particolare, l'uso di un basso volume corrente (TV), di una moderata pressione positiva di fine espirazione (PEEP) e di manovre di reclutamento alveolare (RM) riducono il rischio di lesioni polmonari indotte dal ventilatore in pazienti umani e modelli animali 75,76,77,78,79,80,81. In questo caso, consigliamo una tecnica semplice compatibile con la ventilazione meccanica ¹²⁹Xe a caduta di pressione, che è protettiva e fornisce un sufficiente SNR dell'immagine ¹²⁹Xe. In particolare, applichiamo la PEEP aggiungendo una valvola PEEP commerciale alla linea di espirazione del ventilatore. Per eseguire le RM, la linea di espirazione deve essere chiusa in modo che l'animale riceva più inspirazioni senza espirazione fino al raggiungimento di una pressione e di una durata target.

In tutto, forniamo impostazioni generali di ventilazione, ma si consiglia di rivedere la letteratura per affrontare obiettivi di studio specifici^82,83. Oltre a monitorare il picco di pressione inspiratoria durante la ventilazione meccanica, è importante monitorare la temperatura dell'animale, che può essere eseguita utilizzando i metodi standard di monitoraggio della temperatura del topo. Sebbene non sia necessario per l'imaging, il monitoraggio della frequenza cardiaca tramite elettrocardiogramma (ECG) può essere vantaggioso; L'ECG può indicare se un animale si sta svegliando dalla sedazione, è in overdose o è angosciato, consentendo al ricercatore di intervenire.

Il protocollo che descriviamo è progettato per raccogliere dati di ventilazione radiale ^{3D 129}Xe⁶¹, dati pesati in diffusione GRE^{2D 76} e dati di scambio gassoso con spettroscopia di acquisizione dinamica degli impulsi. Questo protocollo mira a colmare il divario tra la ricerca preclinica in modelli di piccoli animali e il potenziale della risonanza magnetica ¹²⁹Xe per far progredire la nostra comprensione dei disturbi polmonari.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Cincinnati Children's Hospital Medical Center.

1. Preparazione iniziale del sito

1. Creare e testare un fantoccio di gas ¹²⁹Xe polarizzato termicamente (Figura 3).
   1. Procuratevi un recipiente in vetro borosilicato (~60 mL), una valvola a stantuffo con un O-ring a tenuta frontale e uno stelo in vetro borosilicato rettificato, tutti con una potenza nominale fino a 150 psig. Assicurarsi che non ci siano parti magnetiche. Fissare un raccordo a compressione allo stelo del bicchiere. Serrare per produrre una tenuta a tenuta di gas.
   2. Collegare il recipiente a una pompa per vuoto e al serbatoio di ossigeno secondo la Figura 3A. Recipiente a vuoto con pressione assoluta inferiore a 100 mTorr.
   3. Riempire il recipiente con ossigeno alla pressione di 1,5 atm per ridurre il ¹²⁹Xe T₁ da > 30 min a ~2 s (con un'intensità del campo magnetico di 7 T; Per uno scanner da 9,4 T, utilizzare 1,6 atm di ossigeno). Recipiente di tenuta.
      NOTA: Per intensità di campo più elevate, sarà necessaria una pressione parziale dell'ossigeno leggermente più alta per raggiungere T₁≤ 2 s⁸⁴.
   4. Riempire un serbatoio impermeabile ai gas con 400 mL di xeno arricchito isotopicamente (85% ¹²⁹Xe).
      NOTA: È possibile utilizzare anche lo xeno ad abbondanza naturale (26% ¹²⁹Xe), ma sarà necessario aumentare il taveraging del segnale per mitigare la riduzione di ~3 volte dell'SNR.
   5. Collegare l'imbarcazione al serbatoio di ¹²⁹Xe. Tubo a vuoto con pressione assoluta inferiore a 100 mTorr.
   6. Riempire un liquido da banco a bocca aperta N₂ Dewar a ~90%. Immergere il fondo del recipiente (~5 cm) in azoto liquido per condensare O₂ e creare il vuoto (Figura 3B). Mentre è immerso, aprire la valvola per consentire a ¹²⁹Xe dal serbatoio di fluire nel recipiente (Figura 3C).
   7. Sigillare la valvola dello stantuffo tirando lentamente lo stelo fino a quando il foro di afflusso nello stantuffo non viene tirato oltre l'O-ring. Immediatamente dopo che il foro ha superato l'O-ring, serrare a mano per sigillare il recipiente. Rimuovere il recipiente dall'azoto liquido e lasciarlo scongelare.
      NOTA: Una volta scongelato, il recipiente si pressurizzerà a ~4,5 atm (2 atm O₂ + 2,5 atm ¹²⁹Xe).
   8. Proteggere la vetreria (ad esempio, inserire il recipiente in un contenitore imbottito per tubi in cloruro di polivinile (PVC), Figura 3D).
      NOTA: Se sottoposto a una corretta manutenzione, il fantasma può mantenere la pressione per un decennio o più.
   9. Misurare il T₁ del fantoccio (ad esempio, utilizzando una sequenza di recupero dell'inversione spettroscopica). Verificare T₁ < 2 s per gli scanner 7 T. Traccia il segnale e T₁ nel tempo per la garanzia della qualità (QA).

Figura 3: Creazione di un fantoccio di gas ¹²⁹Xe polarizzato termicamente guidato dal protocollo descritto nel passaggio 1.1. Le pressioni parziali O₂ e ¹²⁹Xe possono essere modificate per personalizzare il T₁ per produrre ¹²⁹Xe T₁ volte e la potenza del segnale a una data intensità di campo⁸⁴. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Eseguire l'assicurazione della qualità con il phantom del gas polarizzato termicamente (Tabella 1 e Figura 4).
   1. Posizionare la bobina ¹²⁹Xe all'isocentro del magnete e centrare il fantasma del gas ¹²⁹Xe all'interno della bobina. In una singola sequenza di impulsi e acquisizioni ("impulso singolo"), impostare la frequenza di lavoro in modo che corrisponda alla frequenza del gas Xe di circa ¹²⁹nel phantom (~83,07 MHz a 7T).
   2. Centrare le frequenze di acquisizione ed eccitazione sulla frequenza ¹²⁹Xe Larmor e utilizzare questa frequenza per tutte le scansioni ¹²⁹Xe di calibrazione e controllo qualità dei fantocci. Vedere la Tabella 1 per i parametri sperimentali per tutte le scansioni QA. Verificare che il fantoccio sia centrato con un localizzatore fantasma (Figura 4A).
   3. Eseguire l'esperimento di nutazione per calibrare l'angolo di inversione: supponendo che l'SNR sia sufficiente, utilizzare singoli impulsi RF con spaziatura del tempo di ripetizione (TR) > 5 x T₁. Per ogni acquisizione, aumentare in modo incrementale la potenza RF fino a quando il segnale non si annulla e inizia a invertirsi. Lo standard utilizzato qui è: numero di impulsi = 65; TR = 10 s; durata dell'impulso = 125 μs; Potenza RF = 1-13,8 W, incrementata di 0,2 W
   4. Trasformata di Fourier e fase del primo spettro (cioè lo spettro acquisito con la più bassa potenza RF). Applicare la stessa fase per tutti gli spettri. Tracciare gli spettri reali in funzione della potenza dell'impulso RF (Figura 4B).
   5. La potenza che produce un picco nullo (cioè l'altezza minima del picco) corrisponde all'angolo di inversione di 180°. Raggiungi un angolo di rotazione di 90° utilizzando la stessa potenza a metà della lunghezza dell'impulso necessaria per produrre l'angolo di rotazione di 180°. Supponendo che il software dello scanner lo consenta, impostare questa potenza di riferimento di 90° e la lunghezza dell'impulso per la successiva scala dell'angolo di ribaltamento.
   6. Utilizzare un singolo impulso per spessorare riducendo al minimo l'intera larghezza a metà massimo dello spettro ¹²⁹Xe (TR ~ 1 s). Se necessario, ricentrare la frequenza dopo lo spessore. Registra la metà max.
   7. Eseguire la scansione ^{QA 129}Xe (Tabella 1 e Figura 4C). Registra i dati QA: SNR, segnale fantasma medio e deviazione standard del rumore.

Figura 4: Garanzia di qualità pre-scansione. (A) Un localizzatore di fantoccio coronale GRE 2D a bassa risoluzione assicura che il fantoccio sia centrato nel magnete. (B) Un esperimento di nutazione per impostare un impulso di 90° mostra un picco nullo all'impulso di 180°. (C) Dopo aver localizzato e calibrato l'angolo di capovolgimento, acquisire un'immagine 2D GRE QA a risoluzione più elevata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome abbreviato del protocollo	Descrizione della sequenza	TR (ms)	TE (ms)	Medie / Ripetizioni	Angolo di ribaltamento (°)	Dimensione matrice o Npunti	Campo visivo (mm2)	RF BW (kHz)	Spessore fetta / lastra (mm)	Durata della scansione
Impulso singolo	Acquisizione impulsi	1000		1 / 1	60	2048		10		1 s
Localizzatore fantasma	GRE 2D	200	3.7	20 / 1	48	60 × 32	120 × 48	3	60	2 minuti
Calibrazione dell'angolo di ribaltamento	Acquisizione impulsi	7000		1 / 65	20	2048		5.12		7,5 minuti
129Xe QA	GRE 2D	5000	3.3	8 / 1	90	322	322	3	40	21 minuti

Tabella 1: Parametri della sequenza di garanzia della qualità della calibrazione del fantoccio. TR = tempo di ripetizione, TE = tempo di eco, N_pts = numero di punti, FOV = campo visivo, BW = larghezza di banda. Clicca qui per scaricare questa tabella.

3. Polarizzazione piana (Figura 5A, B).
   1. Selezionare il volume polarizzato ¹²⁹Xe e il tempo di accumulo: 400 mL in 15 minuti è ottimale per questo protocollo (Figura 5), ma può essere facilmente regolato per altre applicazioni e apparecchiature.
   2. Supponendo un volume morto noto all'interno dell'iperpolarizzatore (ad esempio, V_{dead vol} = 80 mL), calcolare la portata (F_Xe in SLM) per un volume dispensato V_desiderato, ¹²⁹Xe frazione di gas f e tempo di accumulo t_acc:
      (1)
      NOTA: Sebbene tempi di produzione più lunghi producano in genere una polarizzazione più elevata, potrebbero non essere pratici per l'imaging in vivo. Utilizzare un modello appropriato per l'iperpolarizzatore 85,86,87,88 per determinare una portata che bilanci il tempo di produzione e la polarizzazione. Qui, è stato utilizzato il modello di J. W. Plummer et ^al.89 (Figura 5A). Questo vale per i polarizzatori a flusso continuo e non è applicabile agli iperpolarizzatori a flusso arrestato⁹⁰.
   3. Polarizzare il gas in base a questi parametri, misurare la polarizzazione con un dispositivo commerciale o autocostruito e confrontarla con la polarizzazione prevista per il QA.
   4. Misurare la perdita di polarizzazione durante il trasporto. Se la polarizzazione diminuisce di una quantità sufficientemente grande (ad esempio, >10%), costruire una custodia magnetica per proteggere la polarizzazione durante il trasporto. Vedere il file supplementare 1: Gestione della polarizzazione durante il trasporto e la Figura supplementare 1.

Figura 5: Gestione della polarizzazione. (A) La polarizzazione e il volume prodotto sono funzione del tempo di accumulo e della portata. Una sacca di gas da 400 mL fornisce un'elevata polarizzazione iniziale (~35%) in 20 minuti. Sebbene l'utilizzo di 1 L di gas possa sembrare attraente, avrà una polarizzazione iniziale inferiore (~20%). (B) Dopo ~15 minuti di ventilazione, un lotto da 1 litro di HP ¹²⁹Xe si esaurirebbe al <10% di polarizzazione, mentre 600 mL di gas ne rimarrebbero¹¹⁶. Pertanto, l'utilizzo di più sacche da 400 mL di ¹²⁹Xe mantiene una polarizzazione media erogata più elevata. C) Le posizioni in cui il campo primario e il campo di schermatura attivo si intersecano (riquadro rosso in posizione (N,N,N)) possono causare un rapido rilassamento di HP ¹²⁹Xe. La caratterizzazione del campo marginale del magnete aiuta a identificare le zone sicure in cui i serbatoi di HP ¹²⁹Xe possono essere posizionati senza un rapido rilassamento (riquadro verde in posizione (0,0,n)). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Gestione della polarizzazione durante il trasporto. Clicca qui per scaricare questo file.

4. Misurare il T₁ dipendente dalla posizione di HP ¹²⁹Xe all'interno del campo marginale (Figura 5C).
   1. Create punti di riferimento con distanze e posizioni note rispetto all'isocentro del magnete lungo le quote X, Y e Z. Etichettare l'isocentro ed etichettare le altre posizioni da n a N. Il numero di posizioni da indagare dipenderà dallo spazio disponibile.
   2. Iperpolarizzare un piccolo volume di ¹²⁹Xe (~250 mL) e trasportarlo alla sala di controllo della risonanza magnetica. Riempire una siringa grande (50-100 mL) con ¹²⁹Xe e posizionarla all'isocentro all'interno del magnete (Posizione 1 nella Figura 5C). Riproduci un impulso con angolo di inversione di ~1° per misurare il segnale.
   3. Lasciare la siringa in posizione per ~10 minuti, quindi acquisire un altro spettro. Rimisurare il segnale ogni 10 minuti fino a quando il segnale non è decaduto di almeno 1 T₁ (cioè, il segnale è decaduto a ~1/3 del suo valore iniziale).
   4. Iniziare un nuovo esperimento T₁ con una nuova siringa di ¹²⁹Xe ripetendo il passaggio 1.4.2.
   5. Spostare la siringa in una nuova posizione (ad es. Posizione n nella Figura 5C) e lasciarla lì per 10 minuti. Riposizionare la siringa sull'isocentro per acquisire un ulteriore spettro dell'angolo di ribaltamento di ~1°.
   6. Ripetere questo processo: spostare la siringa in posizione n, attendere 10 minuti, rimetterla all'isocentro e rimisurare il segnale fino a quando non è decaduto di almeno 1 T₁.
   7. Ripetere i passaggi da 1.4.4 a 1.4.6 per le restanti posizioni di riferimento che coprono le direzioni X, Y e Z.
   8. Il segnale iniziale (S₀) decadrà in modo monoesponenziale su n impulsi RF con un angolo di inversione θ . Inserire il segnale (S) in funzione del tempo (t) nel campo di frangia per calcolare il T₁ in ogni posizione:
      (2)
   9. Identificare una posizione con T₁ (>20 min) sufficiente per il posizionamento del serbatoio ¹²⁹Xe.
5. Creare cannule per intubazione prive di metallo (Figura 6).
   1. Procurarsi due cateteri venosi a permanenza in politetrafluoroetilene (PTFE) con connettori Luer. Gettare gli aghi in un contenitore per lo smaltimento di oggetti taglienti.
      NOTA: Per i topi di >25 g, utilizzare cateteri da 18 G e 20 G. Per gli animali più piccoli, utilizzare cateteri da 20 G e 22 G.
   2. Tagliare il connettore Luer dai cateteri. Inserire il catetere più piccolo nell'estremità superiore del catetere più grande per creare una cannula più affusolata e più lunga. Tagliare la cannula in composito a ~4,6 cm con un'estremità smussata, esclusa la base Luer (Figura 6A, B).
   3. Tagliare l'estremità più larga di un puntale per pipetta da 200 μl a una lunghezza di ~2,6 cm (Figura 6C).
   4. Rivestire l'interno del puntale della pipetta con un lubrificante generico per il rilascio dello stampo. Utilizzare un altro puntale della pipetta inserito all'interno per distribuire sottilmente il lubrificante. Riempire il puntale della pipetta con pasta vulcanizzante acetossisiliconica epossidica (Figura 6D, E).
   5. Collegare la cannula con un filo da 22 G che fuoriesce da entrambe le estremità. Inserire il tubo della cannula attraverso il silicone nel puntale della pipetta. Estendere la provetta di ~7 mm oltre l'estremità del puntale della pipetta (Figura 6F, G).
   6. Far scorrere il tubo della cannula sul lato più largo del puntale della pipetta attraverso un connettore Luer maschio in plastica, incollando i pezzi insieme alla resina epossidica. Tagliare il tubo che si estende oltre il connettore Luer (Figura 6H).
   7. Attendere che la resina epossidica si asciughi (>24 ore), quindi rimuovere con cautela la cannula di intubazione in silicone dallo stampo del puntale della pipetta. Rimuovere il filo dalla cannula, assicurandosi che il tubo non sia stato occluso (Figura 6I).
   8. Per creare una maniglia per una facile intubazione, collegare il tubo (1/16" o 1/8") a un connettore Luer femmina. Quando è pronto per l'intubazione, collegare questo connettore Luer femmina alla cannula di intubazione Luer maschio. Questo pezzo può essere facilmente staccato dopo l'intubazione (Figura 6J).
   9. Igienizzare prima di ogni utilizzo sugli animali: pulire l'esterno della cannula con alcool al 70%. Pulire il filo da 20 G con disinfettante, quindi far passare il filo attraverso la cannula per igienizzare l'interno e assicurarsi che non vi siano ostruzioni.

Figura 6: Creazione di cannule per intubazione per mouse compatibili con MRI e HP ¹²⁹Xe. Queste cannule sono costituite da cateteri venosi, puntali per pipette e sigillante siliconico, come descritto nel passaggio 1.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Raccolta giornaliera dei dati

NOTA: Vedere il file supplementare 2: Lista di controllo per il controllo qualità della scansione preclinica.

File supplementare 2: Lista di controllo per il controllo qualità della scansione preclinica. Clicca qui per scaricare questo file.

1. Completare il controllo di qualità giornaliero dello scanner e configurare il ventilatore (Figura 4).
   1. Con i fantocci, eseguire i protocolli QA sullo scanner (vedere la Tabella 1 per i parametri di scansione QA e il passaggio 1.2 per i passaggi giornalieri del controllo qualità).
   2. Calibrare il ventilatore secondo il metodo di J. Nouls et ^al.38. Vedere il file supplementare 3: Calibrazione del ventilatore, la Figura supplementare 2 e la Figura supplementare 3.
   3. Impostare le impostazioni del ventilatore per l'imaging al momento dell'inspirazione finale (Tabella 2). Posizionare la cuccia per animali sul rack dello scanner e il modulo di supporto vitale (cioè le parti del ventilatore meccanico) sul tavolo accanto allo scanner.
   4. Attivare il sistema di riscaldamento degli animali specifico per il sito. Impostare un riscaldatore a 35,5 - 40 °C, accendere la circolazione dell'aria e posizionare il tubo dell'aria entro ~5" dal punto in cui poggerà la testa dell'animale per preriscaldare il foro dello scanner.

Impostazione della ventilazione	Raccomandazione per la risonanza magnetica HP 129Xe	Note
Volume corrente (TV)	8-10 ml/kg di peso corporeo ideale	TV moderata; una TV bassa richiede un BR più elevato che può causare artefatti di movimento nelle immagini
Pressione positiva di fine espirazione (PEEP)	2–6 cmH2O
Frequenza respiratoria (BR)	80-120 br/min
Manovre di reclutamento (RM)	~35 cmH2O per 6 s ogni 5 min
Durata della ventilazione; Posizione	< 6 ore; supino	Supino per vedere meglio il movimento del torace
Frazione di ossigeno inspirato (FIO2)	0.3–0.5	Prevenire l'ipossia nei topi anestetizzati
Rapporto inspiratorio/espiratorio (I:E)	1:2–1:4
Inspiratorio alla durata totale del ciclo	0.2–0.4
Ventilazione minuziosa	≥0,57 mL·g-1·min-1
I nostri standard:
BR = 80 br/min, durata dell'inspirazione = 200 ms, FIO2 = 0,3
Imaging alla fine dell'inspirazione: apnea = 200 ms, ritardo di attivazione = 200 ms dopo l'inizio dell'inspirazione
Imaging durante l'apnea: apnea = 250 ms, ritardo di attivazione = 250 ms dopo l'inizio dell'inspirazione
Imaging alla fine dell'espirazione: apnea = 200 ms, ritardo di attivazione = 650 ms dopo l'inizio dell'inspirazione

Tabella 2: Impostazioni consigliate del ventilatore per l'imaging ¹²⁹Xe. I parametri possono essere messi a punto per obiettivi di studio specifici e condizioni sperimentali 117,118,119,120,121,122,123,124. Clicca qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 3: Calibrazione del ventilatore. Clicca qui per scaricare questo file.

2. Animale sedato e intubato.
   1. Accendere l'incubatrice a 27,7 °C e/o il termoforo elettrico a 37,7 °C. Misurare e registrare la massa corporea dell'animale. Calcola il dosaggio del sedativo in base alla massa. Vedere la Tabella 3 per un regime posologico tipico.
   2. Iniettare il sedativo per via intraperitoneale. Annotare il tempo di iniezione e impostare il timer per la dose successiva di sedativo.
      NOTA: Completare i passaggi rimanenti nella Sezione 2 (Raccolta giornaliera dei dati) il più rapidamente possibile per ridurre al minimo il tempo sotto sedazione e il rischio di sovradosaggio.
   3. Applicare un lubrificante per gli occhi sugli occhi dell'animale e posizionare l'animale in una gabbia sul termoforo o all'interno di un'incubatrice per prevenire l'ipotermia.
   4. Confermare che l'animale sia completamente sedato eseguendo un test di pizzicamento delle dita dei piedi 10-15 minuti dopo l'iniezione di sedativo⁶⁸. Intubare seguendo le procedure descritte in Das et ^al.69.
      NOTA: L'articolo di Das et ^al.69 è accompagnato da una dimostrazione video completa della tecnica. I passaggi sono i seguenti:
   5. Appendere l'animale supino per i denti su una tavola inclinata. Usa un abbassalingua per roditori per estrarre la lingua.
   6. Per garantire che le corde vocali siano visibili, fornire luce bianca tramite un cavo in fibra ottica all'interno della cannula di intubazione o una luce intensa posizionata all'esterno della gola. Inserire la cannula a meno di 5 mm dalle corde vocali.
   7. Assicurati che la cannula si trovi nella trachea, non nell'esofago, collegandola a un pezzo di tubo con una piccola goccia d'acqua all'interno. Se la goccia d'acqua si muove a tempo con i respiri dell'animale, è probabile che il posizionamento sia corretto.

Agente	Dose	Rotta	Durata	Commenti
Agenti per via inalatoria
Isoflurano	Induzione: 4%–5% Manutenzione: 1%– 3% o per effettuare	Inalato	Durante il flusso continuo	• Richiede l'uso di vaporizzatore calibrato
Agenti iniettabili
Consigliato: ketamina + xilazina + acepromazina	90 + 9 + 3 mg/kg	Intraperitoneale	20-60 minuti	• Crea suscettibilità all'ipotermia
				• Per dosaggi ripetuti, si consiglia di passare a una miscela di ketamina + xilazina per prevenire il sovradosaggio
				• Provoca tremori mentre svanisce. Per l'imaging, attenersi rigorosamente allo schema di dosaggio
				• Può causare bradicardia
Ketamina + xilazina	90 + 9 mg/kg	Intraperitoneale	20-40 minuti	• Vedi sopra (ketamina + xilazina + acepromazina)
Pentobarbital	50 - 70 mg/kg	Intraperitoneale	20-60 minuti	• Deprime la frequenza respiratoria e il movimento
				• La spesa può essere proibitiva dal punto di vista dei costi
				• Il grado farmaceutico potrebbe non essere disponibile
Disclaimer: queste sono linee guida generali. Consultare un veterinario per ulteriori informazioni prima dell'implementazione.

Tabella 3: Formulario anestetico comune per topi. Clicca qui per scaricare questa tabella.

3. Ventilare l'animale (Tabella 2).
   1. Collegare l'animale al ventilatore tramite il connettore Luer sulla cannula di intubazione. Monitorare il movimento diaframmatico e la pressione inspiratoria di picco (~10-12 cm H₂O per un volume corrente di 10 mL/kg di peso corporeo). Se la pressione o il movimento respiratorio sono anomali, regolare attentamente l'angolo del collo e la profondità della cannula secondo necessità.
   2. Assicurarsi che la cannula di intubazione sia ermetica eseguendo una manovra di reclutamento: impedire l'espirazione (ad esempio, con un dito, bloccare la porta di espirazione) in modo tale che l'animale inspiri più volte senza espirare.
      NOTA: Se la pressione delle vie aeree raggiunge una pressione inspiratoria di picco di 35 cmH₂O oltre ~6 s, la tenuta delle vie aeree è sufficientemente stretta. In caso contrario, vedere la discussione per la risoluzione dei problemi.
   3. Lasciare riprendere l'espirazione normale. Eseguire manovre di reclutamento tra le scansioni e ogni ~5 minuti quando non si esegue la scansione per mantenere la compliance polmonare e prevenire l'atelettasia. Collegare la valvola PEEP alla linea di espirazione. Impostare la PEEP su 4 cmH₂O. Osservare l'aumento della pressione inspiratoria di picco di tale quantità.
   4. Dopo aver eseguito correttamente l'intubazione, pianificare e inizializzare la produzione di HP ¹²⁹Xe in base al programma di ridosaggio del sedativo per evitare che l'animale si svegli durante una scansione. Monitorare la temperatura corporea durante l'esperimento.
4. Acquisizione dati: Raccogli immagini di ventilazione.
   NOTA: I passaggi di acquisizione dati 2.4, 2.5 e 2.6 possono essere eseguiti in qualsiasi ordine
   1. Impostare il ventilatore in base alla Tabella 2 per l'imaging al termine dell'inspirazione.
   2. Caricare i seguenti protocolli di configurazione: localizzatore di animali protonici, impulso singolo per centrare la frequenza del gas nei polmoni del topo e localizzatore di animali ¹²⁹Xe. Vedere la Tabella 4 per i parametri di scansione.
   3. Posizionare l'animale all'isocentro e confermare che la cavità toracica sia al centro del campo visivo con localizzazione protonica. Se si utilizzano bobine a frequenza singola, sostituire la bobina protonica con una bobina RF sintonizzata ¹²⁹Xe.
   4. Registra la polarizzazione ¹²⁹Xe e trasportali allo scanner MRI. Vedere il file supplementare 4: Lista di controllo QA per la polarizzazione allo xeno.
   5. Posizionare una sacca di ¹²⁹Xe all'interno della bombola del ventilatore e sigillare. Collegare il contenitore in linea con il ventilatore e lasciare che il contenitore si pressurizzi (3 - 6 psig).
   6. Avviare la ventilazione meccanica ¹²⁹Xe. Ogni volta che viene attivata la ventilazione ¹²⁹Xe, consentire all'animale di completare ~5 respiri prima di iniziare una scansione per invertire la capacità funzionale residua dei polmoni.
      NOTA: Passare alla miscela N₂/O₂ tra ¹²⁹scansioni Xe per conservare il gas iperpolarizzato.
   7. Utilizzando un singolo impulso, regolare la frequenza di lavoro in modo che corrisponda alla frequenza di risonanza in vivo del ¹²⁹Xe gassoso (~83,07 MHz a 7 T). Copiare la frequenza in tutte le successive scansioni ¹²⁹Xe in fase gassosa. Eseguire la localizzazione ¹²⁹Xe per confermare che i polmoni siano all'isocentro.
   8. Caricare ed eseguire la sequenza di ventilazione radiale ¹²⁹Xe. Monitorare il picco di pressione inspiratoria.
      NOTA: Se il gas ¹²⁹Xe si esaurisce prima del completamento del protocollo, la pressione inspiratoria di picco diminuirà rapidamente. Una sacca da 400 ml di ¹²⁹Xe può ventilare un mouse da 30 g per ~24 minuti se ventilata con il 70% ^{di 129}Xe a 80 respiri al minuto con un volume corrente di 10 mL/kg di peso corporeo ideale.
   9. Al termine della scansione, passare alla ventilazione con la miscela N₂/O₂ e rimuovere la sacca vuota di ¹²⁹Xe.
   10. Per l'imaging alla fine della scadenza, modificare la durata dell'apnea e il ritardo di attivazione in base alla Tabella 2 e ripetere i passaggi 2.4.2 - 2.4.9.
   11. Esporta i dati grezzi dallo scanner.

Nome abbreviato del protocollo	Descrizione della sequenza	Grilletto	TR (ms)	TE (ms)	Ripetizioni	Angolo di ribaltamento (°)	Dimensione matrice o Npunti	Campo visivo (mm2)	RF BW (kHz)	Spessore fetta/lastra (mm)	Durata della scansione
Impulso singolo	Acquisizione impulsi (fase gassosa)	Opzionale	1000		1	60	2048		10		1 s
Localizzatore di animali	GRE 2D	Sì	50	1.7	1	60	642	322	3	25	Anni '60
Ventilazione radiale	3D Multi-eco radiale	Sì	20	Vedi didascalia	1	30	613	223	32.05	30	16 minuti
Impulso singolo in fase disciolta	Acquisizione dell'impulso (fase disciolta)	No	80		1	90	512		10.35		80 ms
Spec. dinamica in fase disciolta.	Acquisizione dell'impulso (fase disciolta)	No	50		1000	90	512		10.5		Anni '50
Diffusione ponderata	GRE 2D	Sì	12.2	8.1	4	45	642	322	3	1.5	18 minuti

Tabella 4: Parametri di sequenza in vivo . La sequenza di ventilazione radiale multi-eco 3D descritta in precedenza³⁹ acquisisce immagini a 6 tempi di eco. I risultati sono mostrati per la prima immagine dell'eco (TE = 1,12 ms, Figura 7). Clicca qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 4: Lista di controllo QA per la polarizzazione allo xeno. Clicca qui per scaricare questo file.

5. Acquisizione dati: Esecuzione della spettroscopia dinamica in fase disciolta.
   1. Impostare il ventilatore secondo la Tabella 2 per l'imaging durante l'apnea. Impostare il BR a 100 respiri/min. Preparati per una nuova sacca da ¹²⁹Xe come nei passaggi 2.4.2 - 2.4.5.
   2. Avviare la ventilazione meccanica ¹²⁹Xe. Caricare ed eseguire un singolo impulso per regolare la frequenza di lavoro in modo che corrisponda alla frequenza disciolta (~83,084 MHz a 7 T). Copiare la frequenza di lavoro nella spettroscopia dinamica della fase disciolta.
      NOTA: Questo sarà un singolo picco nei topi con emoglobina^{wild-type 54}.
   3. Caricare ed eseguire la sequenza di spettroscopia dinamica centrata sulla frequenza disciolta nei polmoni degli animali. Al termine della scansione, passare alla ventilazione con la miscela N₂/O₂ e rimuovere la sacca vuota di ¹²⁹Xe. Esporta i dati grezzi dallo scanner.
6. Acquisizione dati: Raccogli immagini pesate in diffusione.
   1. Impostare il ventilatore secondo la Tabella 2 per l'imaging durante l'apnea. Preparati per una nuova sacca da ¹²⁹Xe come nei passaggi 2.4.2 - 2.4.7.
   2. Caricare ed eseguire la sequenza pesata in diffusione. Al termine della scansione, passare alla ventilazione con la miscela N₂/O₂ e rimuovere la sacca vuota di ¹²⁹Xe. Esporta i dati grezzi dallo scanner.

3. Conclusione dell'esperimento

1. Recupera l'animale.
   1. Estrarre la cannula per intubazione direttamente dalla bocca dell'animale. Se l'animale non inizia immediatamente a respirare spontaneamente, somministrare leggere compressioni toraciche. Se disponibile, somministrare un leggero flusso di ossigeno di grado medico vicino al muso dell'animale per favorire il recupero dalla sedazione.
   2. Una volta che l'animale respira costantemente da solo e se l'animale è stato sedato per >2 ore, somministrare 0,5 - 1 ml di soluzione fisiologica normale per via sottocutanea per prevenire la disidratazione.
   3. Rimetti l'animale in una gabbia da solo. Posiziona la gabbia in un'incubatrice o su un termoforo.
      NOTA: Gli animali sedati sono vulnerabili al cannibalismo e non possono essere messi in una gabbia con i compagni di gabbia fino a quando non si sono completamente ripresi (cioè, deambulando in modo indipendente). Gli animali sedati non possono regolare la loro temperatura corporea. Usa il dorso della mano per sentire la temperatura dell'animale ogni pochi minuti.
   4. Monitorare attentamente l'animale fino a quando il suo riflesso di raddrizzamento non è tornato (cioè, può passare autonomamente da una posizione supina a una prona).
   5. Rimuovere l'animale dal supporto termico una volta che può deambulare in modo indipendente. Riporta l'animale in una gabbia con i suoi compagni di gabbia.
      NOTA: se l'animale non ha compagni di gabbia, è più suscettibile all'ipotermia indotta dalla sedazione. Fornisci all'animale una lettiera extra e, se disponibile, lascia l'animale in un'incubatrice durante la notte.
   6. Registra il peso dell'animale una volta alla settimana per 2 settimane per monitorarne la salute.
      NOTA: Se l'animale ha subito una lesione alla bocca o all'esofago a causa dell'intubazione, potrebbe smettere di mangiare. Se l'animale perde >20% del suo peso corporeo iniziale, consultare un veterinario per l'eutanasia.
2. Analizzare le immagini di ventilazione (Figura 7).
   1. Carica i dati grezzi in una piattaforma di programmazione. Scarica il framework di ricostruzione open-source per immagini non cartesiane⁹¹.
   2. Ricostruisci le immagini secondo le istruzioni del framework open source. Normalizza il primo punto su ogni proiezione radiale³⁹.
   3. Segmentare il parenchima polmonare nelle immagini, compresi i voxel con segnale Xe ¹²⁹basso o assente. Non includere grandi vie aeree. Segmenta il rumore di fondo nell'immagine, escludendo polmoni, vie aeree e artefatti di imaging.
      NOTA: L'immagine del localizzatore di protoni può aiutare a determinare i confini parenchimali.
   4. Calcola l'SNR utilizzando la formula:
      (3)
   5. Quantificare la ventilazione difettosa.
      NOTA: Sono stati proposti vari metodi per quantificare la ventilazione compromessa in modelli di piccoli animali. I metodi di analisi rimangono un'area di indagine aperta, ma gli approcci facilmente implementabili includono: (i) Segmentazione manuale semiquantitativa⁹², (ii) Approccio istografico che utilizza il segnale dalla trachea per normalizzare il segnale parenchimale⁴⁷ e (iii) Segmentazione del volume polmonare totale (TLV) e definizione di una soglia del segnale (ad esempio, <60% dell'intera media polmonare) per dividere i polmoni in volume difettoso e volume polmonare ventilato (VV). Quantificare VDP^93,94 secondo:
      (4)
3. Analisi della spettroscopia dinamica in fase disciolta (Figura 8).
   1. Carica i dati grezzi in una piattaforma di programmazione. Eseguire una trasformata di Fourier veloce e mettere in fase gli spettri (per questa applicazione è sufficiente la fasatura manuale simultanea di ordine zero degli spettri).
   2. Calcola i dati standard di risonanza magnetica nucleare (NMR) ^95,96: SNR, metà larghezza massima, area integrata, spostamento chimico e fase di entrambi i picchi.
   3. Dai dati di magnitudo, dividere l'ampiezza del segnale dello spettro disciolto per quella dello spettro del gas per ogni ripetizione per trovare il rapporto disciolto/gas nel tempo.
4. Analizzare le immagini pesate in diffusione (Figura 9).
   1. Carica i dati grezzi in una piattaforma di programmazione. Segmentare il parenchima polmonare dell'immagine b₀ come al punto 3.2.3. Calcola l'SNR per ogni immagine con valore b.
   2. Calcola il rapporto valore-segnale/rumore, SVNR_0, dividendo il segnale in ogni voxel dell'immagine b₀ per la deviazione standard del rumore dell'immagine. Escludi i voxel con SVNR₀ < 2,5 volte il rumore dell'immagine⁹⁷.
      NOTA: La SVNR₀ è una metrica voxel individuale, mentre l'SNR parenchimale è una metrica dell'intero polmone.
   3. Calcolare l'ADC adattando il decadimento del segnale ai valori b (b_i) secondo l'equazione 5^98,99:
      (5)

Risultati

Immagini di ventilazione

Se le procedure di preparazione e ventilazione degli animali sono implementate correttamente, l'imaging radiale 3D può catturare con successo i modelli di ventilazione quando l'acquisizione dei dati viene eseguita all'inspirazione o all'espirazione (Figura 7). Sebbene queste immagini vengano raccolte nel corso di molti respiri, il metodo qui descritto è simile al metodo di imaging a respiro singolo utilizzato negli esseri umani. Questo perché tutte le linee dello spazio k sono raccolte in un momento specifico durante il ciclo del respiro (ad esempio, tutte alla fine dell'inspirazione), creando cumulativamente un'immagine rappresentativa di una singola inspirazione. In queste immagini, le principali vie aeree (trachea e bronchi) sono chiaramente visibili, non sono presenti artefatti evidenti dell'immagine e il parenchima polmonare appare completamente gonfiato con SNR elevato (~15 o superiore, a seconda della polarizzazione iniziale). Sebbene controintuitive, le immagini acquisite all'inspirazione (Figura 7A, SNR = 15) mostrano un SNR inferiore rispetto a quelle acquisite all'espirazione (Figura 7B, SNR = 27). Ciò è correlato alla modesta pressione di guida e al flusso lento utilizzati durante la ventilazione di questo mouse. Per le immagini di inspirazione, il gas HP non era ancora completamente penetrato nel parenchima dei polmoni, causando la concentrazione del ¹²⁹Xe (e quindi del segnale) nelle vie aeree più grandi. Questo effetto è visivamente esacerbato dal ridimensionamento dello spazio k durante la ricostruzione dell'immagine perché l'alto segnale delle vie aeree domina la gamma dinamica dei dati. Tuttavia, l'analisi dovrebbe essere semplice se il parenchima è segmentato in modo tale da omettere le grandi vie aeree.

Figura 7: Immagini rappresentative della ventilazione radiale 3D in un topo adulto C57BL/6J acquisite utilizzando metodi precedentemente pubblicati³⁹. Mentre entrambe le immagini hanno un SNR relativamente alto, le immagini all'inspirazione (A) hanno un SNR inferiore rispetto alle immagini all'espirazione (B), in gran parte perché il gas ¹²⁹Xe non aveva ancora avuto il tempo di lavarsi nei polmoni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

È importante distinguere tra ventilazione patologicamente ostruita e altre cause di basso SNR. Nella Figura 7A, non è prevista alcuna ostruzione della ventilazione (cioè bassa VDP) perché l'animale era un topo sano di tipo selvatico. Se la ventilazione fosse ostruita, i difetti apparirebbero tipicamente come regioni con segnale Xe ¹²⁹basso o nullo. Le cause non patologiche di segnale basso includono comunemente:

(i)  Bassa polarizzazione ¹²⁹Xe: provoca un basso SNR nel parenchima polmonare e nelle vie aeree senza artefatti di accompagnamento. La bassa polarizzazione può in genere essere attribuita a un seguito errato delle procedure di polarizzazione, alla depolarizzazione durante il trasporto o all'eccessivo contenuto di gas O₂ nel tubo di mandata HP ¹²⁹Xe (ad esempio, da un ventilatore tarato in modo errato).

(ii) Cannula per intubazione inserita troppo in profondità: se inserita troppo in profondità nella trachea, la cannula può deviare lungo il bronco sinistro o destro. Se alloggiato abbastanza strettamente, il volume corrente dell'intero polmone può essere confinato solo a pochi lobi e vie aeree, mentre il resto del polmone non ne riceve nessuno. Se ciò dovesse accadere, i lobi ipergonfiati potrebbero essere feriti e potrebbe essere necessario sopprimere l'animale. In alternativa, la punta della cannula può entrare in contatto diretto con il tessuto. In questo caso, ¹²⁹Xe sarà principalmente confinato all'interno della cannula, risultando in un segnale luminoso da un tubo visibilmente dritto e in un segnale minimo all'interno del parenchima. In questo caso, la posizione della cannula deve essere corretta tempestivamente e l'animale deve essere monitorato per rilevare eventuali segni di sofferenza (ad esempio, movimento toracico anormale, assente o asincrono rispetto al ventilatore).

(iii) Cannula per intubazione posizionata troppo superficialmente: quando un bolo di gas viene erogato troppo superficialmente nell'orofaringe, la resistenza a quel bolo che fluisce nei polmoni può essere più forte della resistenza a quel bolo che scorre intorno all'esterno della cannula e fuori dalla bocca. Ciò può comportare una scarsa inflazione polmonare. L'SNR tracheale può essere alto, mentre l'SNR parenchimale sarà basso. Possono essere presenti artefatti di movimento a causa del gas che scorre lungo la trachea durante l'acquisizione dei dati. Il carattere dell'artefatto varierà a seconda del tipo di sequenza (GRE, radiale, ecc.).

(iv) Tempi di acquisizione errati: se la pulsazione RF e l'acquisizione dei dati si sono verificati durante periodi di flusso di gas inspiratorio o espiratorio, di solito saranno presenti gravi artefatti di movimento, in particolare quando si utilizzano sequenze cartesiane, e l'SNR parenchimale sarà basso.

(v) Respirazione spontanea: se l'animale non è sufficientemente sedato durante l'acquisizione dei dati, il movimento respiratorio spontaneo sarà sovrapposto in modo asincrono al modello di ventilazione meccanica. Ciò si tradurrà in un'erogazione variabile di ¹²⁹Xe da respiro a respiro, artefatti da movimento da moderati a gravi e scarso SNR parenchimale. Un attento monitoraggio della dose e della tempistica dei sedativi è fondamentale.

(vi) Morte animale: in rari casi, i topi possono morire (ad esempio, a causa di una posizione errata della cannula, di un'erogazione insufficiente di O₂ , di sovradosaggio di sedativi o di una grave patologia sperimentale). Se ciò si verifica, il tessuto polmonare si irrigidisce rapidamente e il parenchima polmonare si gonfierà male. La trachea superiore può rimanere luminosa, ma il parenchima polmonare sarà molto basso nel segnale.

Spettroscopia di scambio gassoso

Nei soggetti umani, i parametri derivati dalla spettroscopia (ad esempio, intensità del segnale, larghezza spettrale, spostamento chimico e fase) offrono informazioni sulla dinamica cardiopolmonare e sullo stato della malattia^52,53. A differenza degli esseri umani⁸⁶, dei cani¹⁰⁰ e dei ratti^20.101, gli spettri dell'intero polmone dei topi ottenuti quando la magnetizzazione ¹²⁹Xe è confinata al parenchima polmonare mostrano una singola, ampia risonanza di fase disciolta corrispondente a ¹²⁹Xe disciolto nel tessuto della membrana capillare, nel plasma sanguigno e nei globuli rossi⁵⁴ (Figura 8A, 197 ppm). Quando viene trasportato dal flusso sanguigno ai tessuti più distali, ^{il 129}Xe produce frequenze di risonanza distinte da vari tessuti, tra cui il tessuto adiposo⁵⁴, il muscolo, la materia grigia e la sostanza bianca^102,103. Tuttavia, a causa dei tempi di transito relativamente lunghi (diversi secondi) e della modesta solubilità¹⁰⁴ (solubilità di Ostwald = 0,1 - 0,3), questi segnali sono tipicamente deboli e osservati solo durante esperimenti dedicati e attenti. L'eccezione è il ¹²⁹Xe disciolto nei tessuti adiposi (Figura 8A, 189 ppm). Da questi tessuti, un segnale ¹²⁹Xe può apparire entro pochi secondi (ad esempio, durante i primi respiri durante l'allestimento dell'animale). Inoltre, l'intensità del segnale può essere elevata, perché la solubilità di Ostwald di ¹²⁹Xe è quasi 20 volte maggiore nei tessuti adiposi che nel plasma sanguigno (cioè, 1,7 vs 0,094, rispettivamente, a 37 °C¹⁰⁴). Anche i tempi di rilassamento longitudinale dovrebbero essere relativamente lunghi (in vivo T₁ è ~20 s nei lipidi¹⁰⁵ rispetto a 3-8 s nel sangue¹⁰⁶). Di conseguenza, il segnale ¹²⁹Xe dal tessuto adiposo può essere relativamente alto rispetto ad altri tessuti.

A causa della diversa dinamica del segnale, gli esperimenti di spettroscopia ¹²⁹Xe possono essere personalizzati per interrogare il tessuto adiposo (ad esempio, per mirare alla termometria del tessuto adiposo bruno¹⁰⁷) o l'assorbimento di gas nei polmoni selezionando i parametri di acquisizione corretti. Quando si acquisiscono ¹²⁹spettri Xe dai polmoni con le impostazioni descritte nella Tabella 4 (cioè TR = 50 ms e un angolo di inversione di 90° centrato sul picco della fase disciolta), si osservano sia i picchi della fase gassosa che quelli della fase disciolta (Figura 8A, B). In particolare, il volume di gas nel polmone di topo è 2-3 volte superiore al volume del tessuto e la solubilità di ¹²⁹Xe in questo tessuto è solo ~^{104,108,109,110,111.} Nonostante ciò, l'ampiezza del segnale disciolto supera quella della fase gassosa di circa 2 volte perché l'eccitazione della fase gassosa è molto lontana dalla risonanza (~15 kHz a 7 T; Figura 8B, SNR = 102 vs. 43, rispettivamente). Pertanto, il pool di magnetizzazione da 20 a 30 volte maggiore nella fase gassosa può essere approssimato come un serbatoio stabile (cioè non esaurito) per il segnale della fase di dissoluzione durante le parti statiche del ciclo respiratorio.

Con un nuovo soffio di magnetizzazione ogni ~600 ms e un TR di 50 ms, l'intensità del segnale sia dalla fase gassosa che dalla fase disciolta ¹²⁹Xe oscilla. Per il segnale del gas, ciò è attribuibile alla variazione del volume totale del gas (cioè alto all'inspirazione e basso all'espirazione). La situazione è più complessa per il segnale disciolto perché la magnetizzazione del gas sorgente, il T₂* e il volume del sangue capillare possono fluttuare con lo stato di inflazione. Di conseguenza, il rapporto di ampiezza del segnale disciolto/gas oscilla anche rispetto al ciclo del respiro (Figura 8C, rapporto medio disciolto:gas = 1,9 ± 0,39).

Figura 8: Spettroscopia dinamica rappresentativa in un topo adulto C57BL/6J. (A) Un singolo spettro di impulsi mostra il segnale proveniente da ¹²⁹Xe in fase gassosa, disciolto nel tessuto adiposo (189 ppm) e disciolto sia nella membrana capillare che nei tessuti sanguigni (197 ppm). (B) Spettroscopia dinamica che mostra l'intensità del segnale variabile nel tempo sia del ¹²⁹Xe disciolto che di quello gassoso (tempo di ripetizione = 50 ms). Per facilitare la visualizzazione, vengono visualizzati solo cinque spettri. Le linee diagonali sull'asse del tempo rappresentano le interruzioni di scala. (C) Il rapporto tra l'ampiezza del segnale disciolto e quello del gas su un intervallo di 2 s (corrispondente alla rottura della scala rossa nel pannello B mostra una chiara variazione con il ciclo respiratorio (0,6 s per respiro). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Di seguito è riportato un elenco di fattori che potrebbero compromettere i risultati della spettroscopia di scambio gassoso ¹²⁹Xe. In ogni caso, il risultato probabile è un basso SNR, il che può rendere imprecisi l'adattamento spettrale e le metriche risultanti (ad esempio, il rapporto di ampiezza del segnale disciolto-gas, lo spostamento chimico, l'ampiezza spettrale e la fase).

(i) Frequenza di lavoro errata: a causa del volume di gas significativamente più elevato e della bassa solubilità dei tessuti, gli impulsi RF centrati sulla frequenza della fase gassosa non produrranno alcun segnale di fase disciolta. Gli impulsi RF devono essere centrati in corrispondenza o vicino alla frequenza della fase disciolta.

(ii) Larghezza di banda troppo ampia: la larghezza di banda di eccitazione dovrebbe essere sufficientemente ampia da eccitare una parte della fase gassosa ¹²⁹Xe per misurare il rapporto tra l'ampiezza del segnale disciolto e quello del gas. Ma se la larghezza di banda è troppo ampia, l'impulso di eccitazione distruggerà la magnetizzazione nella fase gassosa prima che si dissolva nel tessuto. Questo può essere visto come un segnale di gas molto alto e un segnale di fase disciolta basso o nullo, nonostante l'impulso sia centrato sulla frequenza della fase disciolta.

(iii) TR non ottimizzato: per interrogare la dinamica del segnale su un respiro, il teorema di campionamento di Nyquist-Shannon richiede che il segnale sia campionato a un minimo del doppio della sua frequenza (qui, sono stati campionati 100 respiri al minuto ogni 50 ms, o ~12x per respiro). A seconda delle condizioni sperimentali, è possibile un'ulteriore interrogazione della dinamica del segnale cardiopolmonare a una frequenza di campionamento più elevata. I risultati di questi esperimenti dipenderebbero da molti fattori, tra cui la larghezza di banda di eccitazione, la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca. Devono essere considerati anche il tempo di scambio dello xeno (cioè il tempo impiegato dallo xeno per dissolversi nel tessuto; ~56 ms⁵⁴) e il tempo di transito polmonare (cioè il tempo impiegato dal sangue per fluire dal ventricolo destro a quello sinistro; ~830 ms per una frequenza cardiaca di ~436 battiti/min¹¹²). Il campionamento troppo frequente comporterà la distruzione precoce della magnetizzazione e un segnale basso, ma ridurrà anche l'influenza del flusso sanguigno. Il campionamento meno frequente consentirà alla magnetizzazione di dissolversi ulteriormente e di accumulare più segnale, ma diventerà più dipendente dal flusso sanguigno e meno localizzata nelle regioni di scambio gassoso negli alveoli.

Immagini ponderate in base alla diffusione

Le immagini pesate in diffusione, utilizzate per quantificare le dimensioni dello spazio alveolare aereo, sono state rigorosamente convalidate in modelli di piccoli animali attraverso metodi di istomorfometria tradizionali ^98,113,114. In questo caso, abbiamo limitato la discussione all'imaging 2D selettivo per ridurre al minimo il tempo di scansione e l'utilizzo di gas, abbinando i protocolli⁹⁸ precedentemente convalidati. Un minimo di 2 immagini del valore b è sufficiente per calcolare l'ADC e 4 o più immagini del valore b sono necessarie per calcoli morfometrici avanzati (come l'intercetta lineare media). L'acquisizione di più immagini b-value offre un vantaggio significativo migliorando l'accuratezza dei calcoli. A differenza dell'imaging umano durante una singola apnea, l'imaging preclinico su molti respiri fornisce un segnale continuamente reintegrato. Per questo motivo, è possibile acquisire molte immagini con un valore b SNR elevato, limitate solo dal volume di gas HP disponibile e dalla durata della sedazione animale. Qui, abbiamo acquisito 7 immagini con valore b, ciascuna con SNR >15, utilizzando 400 mL di ^{gas 129}Xe in 18 minuti di scansione (Figura 9). Il segnale in ogni immagine decade con l'aumentare dell'intensità del gradiente di diffusione (valore b). Questo decadimento del segnale è proporzionale all'ADC del ¹²⁹Xe all'interno del polmone. Le grandi vie aeree possono essere distinte dal tessuto acinare confrontando le immagini b₀ e b₆. Nelle regioni che hanno una probabilità anatomica di contenere vie aeree, i pixel appariranno molto luminosi nell'immagine b₀ ma appariranno scuri nell'immagine b₆ (frecce rosse, Figura 9). Questi pixel dovrebbero essere esclusi dall'analisi del parenchima polmonare.

Figura 9: Immagini rappresentative pesate in diffusione in un topo adulto C57BL/6J. Le grandi vie aeree (frecce rosse), attraverso le quali ¹²⁹Xe si diffonde liberamente mentre viene diluito con ossigeno, mostrano una maggiore attenuazione del segnale rispetto al parenchima polmonare. Ciò si traduce in vie aeree luminose nell'immagine b₀ e vie aeree a basso segnale nell'immagine b₆ . Topi e ratti hanno valori di ADC altrettanto piccoli rispetto agli esseri umani, ma i valori dipenderanno da fattori biologici e sperimentali come l'età, il volume corrente, la pressione e i parametri di diffusione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'ADC di questo topo sano, adulto e wild-type segue il risultato atteso in base alla letteratura, alla sua età, SNR, parametri di acquisizione e altro ancora. I fattori che possono influire in modo deleterio sulla precisione e l'accuratezza dei risultati dell'ADC includono:

(i) SNR basso: è importante sottolineare che un SNR basso nelle immagini distorce il calcolo dell'ADC verso valori inferiori^{a 99.115}. Per questo motivo, escludiamo i voxel con SVNR₀ < 2,5 volte il rumore dell'immagine⁹⁷.

(ii) Segmentazione impropria: una segmentazione scadente (ad esempio, l'utilizzo della soglia del segnale senza ispezione visiva per il controllo di qualità) può distorcere i risultati. Se le immagini contengono artefatti (come quelli causati dal movimento), potrebbero superare la soglia ed essere erroneamente classificate come parenchima. Inoltre, è particolarmente importante escludere i pixel vicino a grandi vie aeree, poiché gli effetti di volume parziale possono influenzare il loro ADC verso valori più alti.

(iii) Ventilatore calibrato in modo errato: in generale, la diluizione di ¹²⁹Xe con gas più leggeri (ad esempio, O₂ o N₂) può spostare l'ADC verso valori più elevati, quindi la ventilazione con miscele di gas note è necessaria per i confronti quantitativi. Se si ventila con una miscela ¹²⁹Xe/O₂ , un aumento della concentrazione di ossigeno prima dell'erogazione aumenterà il rilassamento di T₁ e ridurrà la magnetizzazione ^{di 129}Xe nel tubo di erogazione del gas, diminuendo così l'SNR.

(iv) Dereclutamento polmonare: negli animali anestetizzati e ventilati meccanicamente, il collasso alveolare (atelettasia) può verificarsi nel tempo. Quando ciò avviene durante la ventilazione a volume costante, lo stesso volume corrente viene necessariamente ridistribuito agli alveoli che rimangono reclutati. Con lo sviluppo di atelettasia da moderata a grave, il resto del polmone può diventare ipergonfiato, causando lesioni e aumento dell'ADC in quelle regioni. Le manovre di reclutamento regolari e la PEEP prevengono il collasso alveolare, evitano una diminuzione della compliance polmonare e riducono al minimo il rischio di lesioni polmonari che possono distorcere i risultati dell'ADC.

(v) Scarso adattamento dei dati: il metodo di stima dell'ADC deve essere preso in considerazione. L'adattamento log-lineare è il più efficiente dal punto di vista computazionale, ma introduce distorsioni nelle immagini a basso SNR. Pertanto, è meglio applicarlo a immagini con SNR elevato (>20). Il metodo lineare ponderato riduce questa distorsione ed è appropriato nelle immagini con SNR > 15. La stima bayesiana può produrre stime di ADC con bassa incertezza anche con SNR <10, ma è computazionalmente costosa⁹⁹.

(vi) Tempo di diffusione non ottimale: il tempo di diffusione ottimale è influenzato dalla massima intensità del gradiente dello scanner MRI e dal raggio delle vie aeree acinose nei topi (raggio ~100 μm⁴⁹), che è circa tre volte più piccolo di quello nell'uomo. Per garantire condizioni ottimali, il tempo di diffusione è impostato in modo da raggiungere una lunghezza di diffusione maggiore del raggio alveolare medio ma inferiore alla lunghezza media dei dotti alveolari. Il tempo di diffusione ottimale per l'intensità massima del gradiente sito-specifica può essere determinato utilizzando i metodi delineati da Sukstanskii e Yablonskiy⁴⁹. L'utilizzo di un tempo di diffusione non ottimale può portare a diminuzioni non lineari dell'ADC ¹²⁹Xe, complicando l'interpretazione dei risultati.

(vii) Valori b non ottimali: esiste un compromesso tra la massimizzazione dell'SNR e la massimizzazione del rapporto contrasto/rumore (CNR) generato nelle immagini con valore b. Se il CNR viene sacrificato dall'uso solo di bassi valori b (cioè il decadimento del segnale diffusivo come se si acquisissero solo le prime 3 immagini del valore b nella Figura 9), allora la stima dell'ADC sarà imprecisa a causa dello scarso adattamento. Se la ponderazione della diffusione è troppo forte, l'SNR risultante sarà insufficiente e l'ADC sarà orientato verso valori più bassi.

Discussione

La risonanza magnetica iperpolarizzata ¹²⁹Xe sta emergendo come una tecnica sofisticata e potente per studiare la microstruttura e la funzione polmonare in piccoli modelli animali. Questo protocollo ha lo scopo di guidare la preparazione iniziale del sito e descrivere le procedure sperimentali necessarie per quantificare la ventilazione, la diffusione e lo scambio di gas nei polmoni di topo con HP ¹²⁹Xe. I prerequisiti chiave per gli esperimenti includono la creazione di un fantasma di gas ¹²⁹Xe e la garanzia che l'animale fornisca un'elevata polarizzazione del gas. Quest'ultimo richiede un'attenta pianificazione dei parametri di polarizzazione, mitigando le perdite di polarizzazione durante il trasporto del gas (ad esempio, costruendo una custodia magnetica per il trasporto) e caratterizzando (e idealmente evitando) il rilassamento T₁ all'interno del campo marginale del magnete MRI preclinico^116,125. Parallelamente allo sviluppo della necessaria infrastruttura HP ¹²⁹Xe, è imperativo stabilire solidi protocolli e procedure di gestione degli animali. Questi includono una sedazione efficace per consentire una robusta ventilazione meccanica, un'intubazione non dannosa per consentire studi longitudinali e strategie di ventilazione che bilanciano la necessità di fornire un'elevata magnetizzazione ¹²⁹Xe con condizioni di ventilazione sicure e fisiologicamente rilevanti.

In una certa misura, i metodi, le procedure e i risultati qui descritti dipendono dall'hardware specifico utilizzato (ad esempio, ventilatore, polarizzatore e tipo di scanner MRI). Se sono disponibili attrezzature alternative, le tecniche sperimentali possono essere modificate in modo relativamente semplice. Inoltre, le procedure quotidiane di garanzia della qualità possono essere ottimizzate (Passaggio 1.2, Figura 4 e Tabella 1). La registrazione meticolosa durante i ~30 minuti di QA è fondamentale durante la creazione di un nuovo sito. Consente il rilevamento precoce dei problemi hardware e la possibilità di escluderli durante la risoluzione dei problemi. Una volta che le variazioni quotidiane delle metriche QA sono ben caratterizzate, la calibrazione dell'angolo di ribaltamento e la scansione QA di ~21 minuti possono essere ridimensionate per garantire l'efficienza. Inoltre, l'approccio generale può essere esteso ad altre specie di piccoli animali comuni (ad esempio, ratti e conigli) regolando i dosaggi dell'anestetico, le impostazioni del ventilatore e i parametri di acquisizione. I protocolli di base possono essere utilizzati per esplorare la fisiologia dipendente dal ventilatore, come l'impatto della frequenza respiratoria, del volume e dei livelli di PEEP sullo scambio gassoso o sul reclutamento alveolare. Se non sono necessari dati longitudinali o se viene completato uno studio longitudinale, la cannula per intubazione consente il lavaggio broncoalveolare o la fissazione e il prelievo rapido dei polmoni per le analisi convenzionali (ad esempio, misurazioni istologiche o morfometriche). Inoltre, il potenziale di modifica di questo protocollo si estende alle sequenze e ai parametri della risonanza magnetica, rappresentando un aspetto dinamico della ricerca ¹²⁹Xe MRI.

Il posizionamento della cannula è fondamentale per la sicurezza degli animali e la qualità dell'immagine. Poiché la cannula per intubazione non è fissata rigidamente, ad esempio suturando intorno alla trachea, spostamenti relativamente piccoli (ad esempio, movimenti durante il collegamento di apparecchiature di monitoraggio fisiologico) possono rompere il sigillo ermetico con la trachea. Questa chiusura ermetica è necessaria per le manovre di reclutamento (~35 cm H₂O di pressione inspiratoria di picco), che sono fondamentali per mantenere la compliance polmonare e prevenire l'atelettasia. Se la manovra di reclutamento non raggiunge la pressione target, lo sperimentatore deve valutare le strategie correttive nel contesto degli obiettivi dello studio (ad esempio, imaging ponderato in diffusione vs. imaging di ventilazione; singolo punto temporale vs. longitudinale). Le strategie di mitigazione possono includere 1) la rimozione della cannula e la reintubazione, 2) la regolazione della posizione della cannula per aumentare il contatto con le pareti tracheali mentre è ancora inserita e 3) la prosecuzione dell'esperimento senza ottenere una tenuta stagna ai gas. Dal punto di vista della fedeltà dei dati, la reintubazione è l'opzione più robusta, ma può richiedere molto tempo e portare a un decadimento indesiderato della magnetizzazione ¹²⁹Xe. La regolazione della posizione della cannula è più rapida, ma deve essere eseguita con cautela, poiché comporta un rischio maggiore di lesioni. Continuare l'esperimento senza RM è meglio utilizzato quando il topo sarà ventilato per <20 minuti per evitare cambiamenti indotti dall'atelettasia nella dinamica polmonare¹¹⁷.

Al di là dell'ovvia necessità di una gestione sicura degli animali, la chiave per sviluppare un programma di risonanza magnetica del mouse HP ¹²⁹Xe robusto e affidabile e per risolvere le sue sfide è la meticolosa tenuta dei registri. Per la produzione di HP ¹²⁹Xe, si consiglia di monitorare la potenza del laser, il tempo di accumulo, la portata e la polarizzazione. Durante l'imaging e la spettroscopia phantom, è meglio registrare l'SNR dell'immagine, la posizione del picco, la larghezza della linea spettrale e la potenza RF necessaria per ottenere un impulso di 90°. Per l'imaging in vivo , è necessario registrare dati QA simili insieme a parametri di monitoraggio fisiologici (pressione inspiratoria di picco, temperatura corporea, ecc.) e una cronologia dettagliata degli eventi di manipolazione degli animali. Alcune apparecchiature chiave possono semplificare la risoluzione dei problemi del ventilatore. Questi includono un sensore O₂ , uno spirometro per piccoli animali e un manometro per calibrare la ventilazione e la pressione PEEP. Un oscilloscopio e un voltmetro possono aiutare a confermare che la temporizzazione del ventilatore è precisa e abbinata al gating dello scanner MRI. Infine, un gaussmetro portatile è indispensabile per confermare l'integrità di una custodia magnetica per il trasporto, se necessaria per il trasporto. Per quanto riguarda la risoluzione dei problemi della sequenza MRI, si consiglia di utilizzare sia il fantasma di gas descritto in questo protocollo che una siringa riempita con gas HP. L'uso di una siringa contenente gas HP ¹²⁹Xe è particolarmente vantaggioso per la risoluzione dei problemi delle sequenze pesate in diffusione, poiché l'accuratezza dei dati può essere valutata in base al fatto che riflettano una verità di base nota: il coefficiente di diffusione libero del ¹²⁹Xe puro all'interno della siringa.

Quando si applica questo protocollo, è necessario riconoscere diverse limitazioni. In primo luogo, dipende da attrezzature e competenze specializzate, il che riduce l'accessibilità per i nuovi siti. Tuttavia, con la recente approvazione normativa per l'uso clinico negli Stati Uniti, si prevede che il numero di siti dotati di ¹²⁹funzionalità di risonanza magnetica Xe aumenterà. La tecnica è anche limitata dalle limitazioni intrinseche del gas iperpolarizzato, tra cui una durata di polarizzazione relativamente breve e la necessità di una rapida acquisizione dei dati. L'uso di un ventilatore meccanico in genere migliora l'SNR dell'immagine ed evita intrinsecamente artefatti di movimento, ma maschera le dinamiche respiratorie naturali che potrebbero essere catturate utilizzando un dispositivo di erogazione del gas a respirazione libera. Inoltre, i risultati dei modelli di piccoli animali che utilizzano questo protocollo devono essere interpretati con cautela quando si estrapolano alla fisiologia umana, date le variazioni significative delle specie. Un'altra limitazione è la natura impegnativa dell'intubazione orale e della ventilazione meccanica, che sono difficili nei topi di peso inferiore a 25 g. Ciò può escludere i maschi di età inferiore a ~8 settimane e le femmine di età inferiore a ~20 settimane, a meno che non vengano utilizzate attrezzature e procedure dedicate. Il limite più evidente di questo protocollo è l'assenza di programmazione degli impulsi e di tecniche avanzate di ricostruzione delle immagini. L'inclusione di tali metodi in un protocollo generalizzato è impraticabile a causa dei loro intricati dettagli tecnici e delle conoscenze specialistiche. Infine, questo protocollo descrive metriche quantitative di base come SNR, VDP e ADC, ma non misure più avanzate come la ventilazione frazionata regionale, la morfometria di diffusione e l'imaging degli scambi gassosi. Queste metriche avanzate saranno implementate più facilmente una volta configurata l'infrastruttura di base qui descritta.

Sebbene la risonanza magnetica con gas HP ¹²⁹Xe di piccoli animali richieda molte risorse e sia stimolante dal punto di vista sperimentale, ha il potenziale per far progredire in modo significativo la ricerca polmonare preclinica. Offre un mezzo minimamente invasivo e sensibile per quantificare la ventilazione regionale, le dimensioni dello spazio alveolare aereo e le dinamiche di scambio gassoso. In quanto tale, può fornire un mezzo unico per valutare la fisiologia polmonare, la progressione della malattia e gli interventi terapeutici nel tempo. Rappresenta quindi un miglioramento rispetto alle tradizionali tecniche precliniche, tra cui l'istologia, le analisi biochimiche, le modalità di imaging ionizzante e le misurazioni invasive della meccanica polmonare. Inoltre, la risonanza magnetica ^{Xe 129}per piccoli animali rimane un sottocampo di ricerca in attivo sviluppo e il bilanciamento della fisica dell'imaging pertinente con i requisiti preclinici rappresenta di per sé notevoli opportunità di ricerca. Infine, man mano che la risonanza magnetica ^{clinica 129}Xe diventa più ampiamente accettata e utilizzata clinicamente, le opportunità per gli studi traslazionali da topo a uomo e viceversa continueranno a crescere nel tempo.

Figura supplementare 1: Uno schema elettrico per la custodia magnetica per il trasporto. Un solenoide in filo di rame smaltato, L1, è collegato in parallelo a V1, una batteria al piombo sigillata ricaricabile da 12 Volt. La resistenza del resistore R1 può essere selezionata per controllare la corrente attraverso V1 e L1. Una spia LED di segnalazione del pannello, R2 e D1, è anche cablata in parallelo con V1. Un interruttore on-off a levetta, S1, è collegato in serie con V1. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Risultati della taratura del ventilatore per l'azoto. Il volume emesso da 30 respiri è stato misurato in triplice copia. È stata eseguita una regressione lineare per determinare la pressione di azionamento necessaria per produrre volumi di gas rilevanti. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Foglio informativo sulle impostazioni della pressione del ventilatore. I risultati della pendenza e dell'intercetta della regressione lineare di ciascun gas sono utilizzati nell'equazione S1. Questa equazione è stata utilizzata per determinare la pressione motrice necessaria per produrre un volume corrente di 10 ml/kg di peso corporeo ideale per miscele di gas del 70% N₂ + 30% O₂ e del 70% ¹²⁹Xe + 30% O₂ per i pesi animali pertinenti. Clicca qui per scaricare questo file.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 1 mL	fisher scientific	Codice prodotto: 14-955-464	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464
Cilindro graduato da 10 mL	Cole-Parmer	UX-34502-69	https://www.coleparmer.com/i/cole-parmer-essentials-graduated-cylinder-glass-hexagonal-base-10-ml-2-pk/3450269?PubID=UX&persist=true&ip=no& gad_source=1& gclid=CjwKCAi A6KWvBhAREiwAFPZM7h3do -ssjascARuVviKd7V7kC5ztdIB6 _70DnMr-K3qk9RKeJ7-IrhoCeT 0QAvD_BwE
18 G - cateteri PFTE venosi (non sterili)	Terumo Surflo	SROX1832CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-18-x-1-25inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source= google& utm_medium=google_ shopping& gad_source=1& gclid= CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEsoW 4oTvZkAgWQCda6ocVtQlulVrG 2536FNbu5soMVSFN8xK_g1Uh pXIRoCGwoQAvD_BwE
20 G - cateteri PFTE venosi (non sterili)	Terumo Surflo	SROX2051CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-20-x-2inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source =google& utm_medium=google_ shopping& gad_source=1& gclid= CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEsoW 87ggCkgToD_XF_UgpQBTpmN dgSNfCml6TkDKlW8k27Dq_daR itPuhoCnBQQAvD_BwE
22 G - cateteri PFTE venosi (non sterili)	Terumo Surflo	SROX2225CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-22-x-1inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source= google& utm_medium=google_ shopping& gad_source=1& gclid =CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEso W9IM6mpee6m7e-lBfR8dZhSN KYbMUs7qgEU4gYCRTW_rJAs W_lGkthoCm30QAvD_BwE
Sacchetti di tedlar da 400 ml	Jensen Inert Products	GST-001S-3507TJC	NA
60 mL siringa	fisher scientific	Catalogo n.14-955-461	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955461
70% di alcol	Cole-Parmer	UX-80024-34	https://www.coleparmer.com/i/labchem-isopropyl-alcohol-70-v-v-500-ml/8002434?PubID=UX&persist=true&ip= no& gad_source=1& gclid=CjwKC AiA6KWvBhAREiwAFPZM7gGh p8g7MBHBBKadaRCAwfEMgV gna5fhYRsuXIuqoqOiToCC4fem nhoCGMEQAvD_BwE
Dewar per azoto liquido	Terra	Universal 4LDB	https://www.laboratory-equipment.com/tw-4ldb-liquid-nitrogen-dewar-ic-biomedical.html?srsltid=AfmBOooxwMtOA1Z2TweR P8V5Iy5EvYT3alZuzoiY 3UF3Ib9RgFnDxVTfWP0
Lubrificante per gli occhi	Refresh	AGGIORNAMENTO P.M.	https://www.refreshbrand.com/Products/refresh-pm
Luce a fibre ottiche	AmScope	HL250-AY	https://amscope.com/products/hl250-ay?tw_source=google & tw_adid=& tw_campaign= 16705014684& gad_source= 1& gclid=CjwKCAiA6KWvBhA REiwAFPZM7p-DpyvHJaGxR pAD1385hzGf1oPdKHHLFDR Sp8yrtxry11SNJeJnKxoCtAoQ AvD_BwE
Gaussmeter	Apex		https://www.apexmagnets.com/magnets/accessories/ht-digital-gaussmeter-with-peak-hold-can-display-gauss-or-tesla
Recipiente di vetro (phantom)	Ace Glass	8648-24	https://aceglass.com/results.php?t=8648-24&t=8648-24
Termoforo	Deposito Ufficio	9206211	Pure Enrichment PureRelief Express Designer Series Termoforo 12 x 15 Palm Aqua - Office Depot
Iperpolarizzatore	Polarean	9820	https://polarean.com/xenon-mri-platform/
Scheda per intubazione	Hallowell EMC	000A3467	https://hallowell.com/product/rodent-tilting-workstand/
Forniture per intubazione	Elenco delle parti pubblicato altrove	NA	https://app.jove.com/t/50318/a-simple-method-of-mouse-lung-intubation
Cilindro allo xeno arricchito isotopicamente	Isotopi di Linde	XE-129(1%)N2(10%)HE CGMP 302SZ	NA
Azoto liquido	Linde	NI LC160-22	https://www.lindedirect.com/store/product-detail/nitrogen_n2_nitrogen_liquid _lc160_22_psi_ni_lc160_22 /ni-lc160-22?cat_id=negozio& node=b89
Slip luer maschio	Cole-Parmer	UX-21943-27	https://www.coleparmer.com/i/diba-omnifit-t-series-solvent-waste-cap-adapter-polypropylene-male-luer-slip-x-1-16-id-hose-barb-5-pk/2194327
Manometro	Grainger	3T294	https://www.grainger.com/product/3T294?gucid=N:N:PS: Pagato:GGL:CSM-2295:4P7A1P: 20501231& gad_source=1& gclid =CjwKCAiAi6uvBhADEiwAWiyR dltxrPJmmcm0bFiYLuPrB25HV QFdEfKMBqvgJBNdQUs3DZ7b TLr8CRoCanAQAvD_BwE& gclsrc = aw.ds
Minivent ventilatore	harvard apparecchio	73-0044	https://www.harvardapparatus.com/minivent-ventilator-for-mice-single-animal-volume-controlled-ventilators.html
Topo orecchio perforatore	fisher scientifico	13-812-201	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-animal-ear-tag-punch/13812201
Topo abbassalingua	Strumenti medici	VRI-617	https://medical-tools.com/shop/rodent-tongue-depressor.html
Bilancia per topi	Cole-Parmer	UX-11712-12	https://www.coleparmer.com/i/adam-equipment-cqt2000-core-portable-balance-2000g-x-1g-220-v/1171212?PubID=UX&persist=true&ip=no&gad _source=1& gclid=CjwKCAiA6K WvBhAREiwAFPZM7iYnAG5Ilc Z5DZWrdJ6wcLDZSCSfNJHOH m2PQOpyyWe0TjFa75R3tBoCjB sQAvD_BwE
scanner MRI	Bruker	7T Biospec sistema orizzontale	https://www.bruker.com/de/products-and-solutions/preclinical-imaging/mri/biospec.html
Multimetro	Home Depot	1007898529	https://www.homedepot.com/p/Klein-Tools-600-Volt-Digital-Multi-Meter-Manual-Ranging-MM325/320822947
Abbondanza naturale xenon	Linde Isotopi	UN 2036	NA
Ago	fisher scientific	305194	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-precisionglide-hypodermic-needles-20/148266C?keyword=true
Porta siringa sicuro	per aghi fisher scientific	NC2703873	https://www.fishersci.com/shop/products/ndlsafe-ii-syr-uncap-deca/NC2703873#?keyword=needlesafe
Bombola di azoto	Linde	NI M-K	https://www.lindedirect.com/store/product-detail/nitrogen_n2_nitrogen_nf_k/ni-m-k?cat_id=shop&node=b89
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