Articolo metodologico

Generazione e caratterizzazione di organoidi dell'utero di ratto da cellule staminali epiteliali dell'endometrio di ratto

1.4K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/66928

⸱

2 agosto 2024

 ,  ,  ,  , 
1Meizhou Clinical Institute of Shantou University Medical College, 2Department of Pathology, Meizhou People's Hospital, 3Guangdong Engineering Technological Research Center of Clinical Molecular Diagnosis and Antibody Drugs, Meizhou Academy of Medical Sciences, Meizhou People's Hospital

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e coltivare cellule staminali epiteliali endometriali di ratto (reESC), generando organoidi endometriali di ratto. Questo metodo facilita gli studi in vitro delle malattie dell'endometrio, consentendo l'editing genetico e altre manipolazioni cellulari.

Abstract

Gli organoidi endometriali offrono preziose informazioni sullo sviluppo e la fisiopatologia delle malattie endometriali e fungono da piattaforme per i test farmacologici. Sebbene siano stati sviluppati organoidi endometriali umani e di topo, la ricerca sugli organoidi endometriali di ratto rimane limitata. Dato che i ratti possono simulare meglio alcune patologie endometriali, come le aderenze intrauterine, questo studio mirava a stabilire organoidi endometriali di ratto. Presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali endometriali di ratto (reESC) e la generazione di organoidi endometriali di ratto. Utilizzando un terreno di espansione reESCs raffinato, abbiamo isolato con successo e ampliato stabilmente le reESCs, dimostrando il loro potenziale di coltura a lungo termine. Gli organoidi generati da reESC hanno mostrato caratteristiche strutturali e funzionali tipiche dell'endometrio, inclusa la risposta ormonale. I nostri risultati hanno mostrato che gli organoidi endometriali di ratto possono essere coltivati a lungo termine con una proliferazione stabile, mantenendo la struttura ghiandolare, la polarità cellulare e le caratteristiche funzionali dell'epitelio endometriale. Questo nuovo modello di organoide endometriale derivato dal ratto fornisce una piattaforma preziosa per lo studio delle malattie endometriali e la sperimentazione di interventi terapeutici, con potenziali applicazioni in varie specie di mammiferi.

Introduzione

L'endometrio, un tessuto versatile e rigenerativo del corpo umano, subisce periodicamente la caduta, la rigenerazione e la differenziazione sotto l'influenza degli ormoni ovarici1. Le anomalie dell'endometrio sono legate a varie malattie del sistema riproduttivo femminile, come l'endometriosi, il cancro dell'endometrio e l'infertilità2. La mancanza di modelli di ricerca affidabili per l'endometrio ostacola studi approfonditi sulla patogenesi, la diagnosi clinica e il trattamento di queste malattie. Mentre le linee cellulari e i modelli animali sono comunemente utilizzati per la ricerca sull'endometrio, sfide come l'instabilità fenotipica nelle linee cellulari, le differenze interspecie nei modelli animali e altre limitazioni rendono difficile replicare la complessa struttura fisiologica e i cambiamenti funzionali dinamici nell'endometrio umano3.

Gli organoidi sono strutture tridimensionali formate dalla coltura di cellule staminali in un ambiente extracellulare, dotate di capacità di autorinnovamento e auto-organizzazione. Possono imitare la struttura e la funzione di tessuti fisiologici e patologici e sono riconosciuti come modelli preclinici di malattie umane4. Nel 2017, la costruzione di organoidi endometriali umani e di topo è stata ottenuta incorporando tessuto endometriale libero frammentato ottenuto attraverso la digestione enzimatica in un'impalcatura di matrice extracellulare, seguita dall'aggiunta di una miscela di fattori di crescita specifici e fattori di segnalazione per la coltivazione5. I risultati hanno dimostrato che gli organoidi endometriali ex vivo mostrano una capacità proliferativa stabile e a lungo termine, mantenendo la struttura ghiandolare, la polarità cellulare e le caratteristiche funzionali dell'epitelio endometriale, tra cui la secrezione di muco e la risposta ormonale6. Tuttavia, la coltura ex vivo di cellule staminali adulte che formano gli organoidi endometriali richiede un supporto strutturale simile a quello di una ghiandola, portando a sfide come la perdita di staminalità e difficoltà nel passaggio7.

Attualmente, la coltivazione di organoidi endometriali si basa sul metodo della coltura di digestione a blocchi di tessuto. In uno studio precedente, il nostro team di ricerca ha coltivato cellule staminali epiteliali endometriali umane per un periodo prolungato in vitro utilizzando un terreno di coltura primario composto principalmente da Y27632, che abbiamo impiegato per costruire organoidi endometriali8. Sulla base di questo successo, abbiamo isolato e coltivato cellule staminali epiteliali endometriali dal tessuto endometriale di ratto utilizzando un terreno di coltura composto da piccole molecole, stabilendo un sistema di coltura in vitro a lungo termine. Inoltre, abbiamo utilizzato cellule staminali epiteliali endometriali di ratto (reESC) per generare organoidi endometriali di ratto. Lo sviluppo di questo modello migliorerà i futuri studi in vitro e in vivo sulle malattie correlate all'endometrio in combinazione con modelli di ratto.

Protocollo

In questo lavoro sono stati utilizzati sei ratti femmina di Sprague-Dawley di 7/8 settimane del peso di 200-250 g. I ratti sono stati alloggiati in una struttura climatizzata per animali con accesso ad libitum a cibo e acqua. Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono gli animali sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal comitato di revisione istituzionale per gli esperimenti sugli animali presso il Comitato etico per la ricerca dell'ospedale popolare di Meizhou.

La sezione seguente delinea il processo per isolare, passare, congelare e scongelare le cellule staminali epiteliali endometriali di ratto utilizzando un raffinato mezzo di espansione reESCs (REEM) composto principalmente da Y27632, A8301 e CHIR990217 8,9. La formulazione di REEM si basa su DMEM/F12 privo di siero arricchito con concentrazioni specifiche di componenti chiave: 10 μM Y27632, 3 μM CHIR99021 e 0,5 μM A8301. I dettagli completi sui componenti sono disponibili nella tabella dei materiali. Una volta che i ratti sono stati anestetizzati con inalazione di isoflurano, dovrebbero essere implementate le successive procedure illustrate nella Figura 1.

1. Procedura chirurgica

  1. Anestetizzare il ratto mediante inalazione di isoflurano.
    1. Metti i ratti in una camera di induzione riempita con isoflurano al 3-5% mescolato con ossigeno. Confermare la corretta anestesia dall'assenza di una risposta a un pizzicamento del dito del piede e dalla perdita del riflesso raddrizzante.
    2. Una volta anestetizzati, mantenere i ratti sotto l'1-3% di isoflurano attraverso un cono nasale durante la procedura. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre il ratto è sotto anestesia.
  2. Praticare un'incisione bassa della linea mediana addominale per esporre le corna dell'utero.
    NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati prima dell'uso. L'area chirurgica del ratto viene rasata e disinfettata con una soluzione antisettica. Il chirurgo indossa guanti sterili, una maschera e un camice. La procedura chirurgica viene eseguita su un telo sterile.
  3. Eseguire incisioni longitudinali su entrambi i lati dell'utero per esporre l'endometrio interno. Usa una lama di bisturi T10 per raschiare l'endometrio fino a quando la superficie non è ruvida.
  4. Dopo la procedura chirurgica, trasferire i ratti in un'area di recupero sterile e calda con livelli di temperatura e umidità regolati e monitorarli attentamente fino a quando non riacquistano piena coscienza e possono sostenersi in una posizione sdraiata sternale. Ospitare gruppi di tre ratti post-operatori separatamente in gabbie separate. Per alleviare il dolore post-chirurgico, somministrare analgesici come la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg, per via sottocutanea); Ripetere ogni 8-12 ore per un massimo di 48-72 ore secondo necessità.

2. Lavorazione dei tessuti

  1. Metti tutti i frammenti di endometrio uterino in un piatto da 3,5 cm e lavali 3 volte con PBS.
  2. Miscelare i frammenti di endometrio uterino con 3 mL di collagenasi all'1% di tipo I (diluito in tripsina allo 0,25%/1 mM EDTA) a 37 °C per 60 min. Filtrare il tessuto non digerito utilizzando un colino cellulare da 100 μm per isolare e raccogliere il filtrato per un'ulteriore coltivazione.
  3. Seminare le cellule raccolte in piastre a 12 pozzetti in terreno REEM per un'ulteriore coltivazione. Calcolare il volume della sospensione cellulare necessaria per seminare le cellule in ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti per ottenere la densità cellulare desiderata (tipicamente ~1-2 × 105 cellule/pozzetto in 1,5 mL di REEM).
  4. Lavare le cellule raccolte al punto 2.2 per 3 volte con PBS. Dopo il lavaggio iniziale, centrifugare le celle a 300 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante; risospendere il pellet cellulare in PBS contenente l'1% di BSA (albumina sierica bovina) per ridurre al minimo il legame aspecifico e incubare per 15-30 minuti su ghiaccio.
  5. Incubare le cellule con anticorpi primari specifici per diversi marcatori (vedere la Tabella dei materiali) per 30 minuti a 1 ora a 4 °C. Diluire gli anticorpi in PBS con l'1% di BSA secondo le istruzioni del produttore.
  6. Dopo l'incubazione, lavare le cellule 2 volte con PBS per rimuovere eventuali anticorpi non legati. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule in 600 μL di PBS con l'1% di BSA per l'analisi di citometria a flusso.
  7. Configurare lo strumento con laser e filtri appropriati per i fluorofori utilizzati nell'esperimento (ad esempio, FITC, PE, APC). Utilizzare le impostazioni di diffusione diretta (FSC) e di dispersione laterale (SSC) per eseguire il gate sulla popolazione di singole cellule vive, esclusi detriti e aggregati cellulari. Calibrare il citometro a flusso utilizzando un controllo non colorato per garantire il corretto allineamento. Impostare gate specifici in base al controllo non colorato per definire popolazioni positive per ogni marcatore di interesse (la soglia è 0,02%).

3. Coltura a lungo termine di cellule staminali epiteliali endometriali di ratto

  1. Saggio di formazione di colonie
    NOTA: Questo test ha contribuito a determinare il terreno di coltura ottimale per le reESC.
    1. Seminare le reESC P0 in piastre a 6 pozzetti a una densità di 1.000 cellule/pozzetto e coltivarle per 14 giorni in REEM o REEM prive di A8301, Y27632 o CHIR99021.
    2. Trascorso il periodo di coltura, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente e successivamente colorarle con soluzione di cristallovioletto per altri 20 minuti.
    3. Quantifica il numero di cluster di cellule contenenti più di 50 cellule. Selezionare il terreno di coltura in base al quale il terreno supporta la crescita di cluster cellulari.
      NOTA: L'omissione di fattori specifici dal REEM ha comportato una diminuzione della capacità proliferativa dei reESC (Figura 1B, C). Sulla base di questi risultati, REEM è stato selezionato come terreno preferito per la coltura di reESC per ottimizzare le condizioni di coltura.
  2. Cambia il REEM ogni 2 giorni. Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, digerirle con tripsina allo 0,25%/1 mM EDTA per 5-6 minuti.
  3. Passaggio delle celle ad un rapporto di 1:3 in REEM.
  4. Saggio di proliferazione
    1. Seminare le reESC P1, P7 e P14 in piastre da 96 pozzetti a una densità di 4 × 103 cellule/pozzetto in 150 μL di REEM.
    2. Aggiungere 10 μL di reagente CCK-8 a ciascun pozzetto dopo 24, 48, 72 e 96 ore di coltura, seguite da un'incubazione di 2 ore a 37 °C.
    3. Determinare il tasso di proliferazione misurando l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
  5. Preparazione e utilizzo delle scorte congelate
    1. Preparare la soluzione madre congelata utilizzando REEM con DMSO al 10%.
    2. Raccogliere le reESC con tripsina allo 0,25%/1 mM EDTA.
    3. Risospendere il pellet cellulare in una soluzione madre congelata a una concentrazione di 1 × 106 cellule/mL. Trasferire la sospensione cellulare in provette.
    4. Congelare le provette prima a -80 °C e poi trasferirle in azoto liquido entro 24 ore.
      NOTA: Se si intende scongelare presto le cellule, si consiglia di conservare le celle congelate a -80 °C per una durata massima di 6 mesi.
    5. Preriscaldare il REEM a 37 °C.
    6. Recuperare i reESC congelati e immergerli in un bagnomaria a 37 °C per 1-2 minuti.
    7. Trasferire le reESC scongelate in piastre a 6 pozzetti con una densità di semina di 1 × 105 cellule/pozzetto in REEM.
  6. Colorazione in immunofluorescenza
    1. Seminare le reESC nella fase di crescita logaritmica su piastre u-Slide a 8 pozzetti a una densità di 2 × 103 cellule per pozzetto e coltivarle in REEM.
    2. Quando le reESC raggiungono il 90% di confluenza, fissarle con paraformaldeide al 4% per 20 minuti. Lavare i reESC con PBS 2x prima e dopo il fissaggio.
    3. Permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,2% per 10 min.
    4. Bloccare le cellule con siero di capra al 30% diluito in albumina sierica bovina al 5% (BSA) per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare i reESC con PBS 2x prima e dopo il blocco.
    5. Incubare le cellule con anticorpi primari (anti-SSEA-1 e anti-citocheratina) per 12 ore a 4 °C. Lavare le reESC con PBS 2x dopo l'incubazione.
    6. Incubare le cellule con anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare le reESC con PBS 2x dopo l'incubazione.
    7. Controcolorare le cellule con 150 μL di DAPI per marcare tutti i nuclei.
    8. Cattura immagini delle cellule colorate utilizzando un microscopio confocale invertito.

4. Determinazione di organoidi endometriali di ratto da reESC

  1. Generazione degli organoidi
    1. Quando le reESC raggiungono il 70% di confluenza, digerire le cellule con tripsina allo 0,25%/1 mM EDTA per 5-6 minuti.
    2. Risospendere 5 × 105 reESC in 500 μl di Matrigel scongelato e posizionarle in piastre a 12 pozzetti. Incubare le piastre a 37 °C per 20 minuti per consentire la gelificazione.
    3. Una volta che la miscela cellula-Matrigel si è solidificata, aggiungere 1,5 mL/pozzetto di REEM per coprire il Matrigel. Cambia il REEM ogni 2-3 giorni.
  2. Colorazione in immunofluorescenza
    1. Aspirare il REEM e aggiungere 1 mL/pozzetto di soluzione preraffreddata per la raccolta di organoidi nelle piastre a 12 pozzetti. Incubare con ghiaccio per 40-60 minuti.
    2. Raccogliere gli organoidi con una pipetta Pasteur e centrifugare a 300 × g per 3 min a 4 °C.
    3. Sciacquare gli organoidi 2-3 volte con PBS.
    4. Fissare gli organoidi con paraformaldeide al 4% per 20 min e bloccare con BSA al 5% per 60 min.
      NOTA: Lavare 2 volte con PBS prima e dopo ogni passaggio.
    5. Incubare gli organoidi per una notte a 4 °C con anticorpi primari diluiti in BSA all'1%.
    6. Incubare gli organoidi con anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente.
    7. Controcolorare gli organoidi con 200 μL di DAPI.
    8. Acquisisci immagini utilizzando un microscopio confocale invertito.
  3. colorazione HE
    1. Disidratare gli organoidi attraverso una serie di etanolo graduato: etanolo al 70% per 30 minuti; 80% di etanolo per 30 min; etanolo al 95% per 30 min; 100% etanolo per 2 x 30 min. Eliminare gli organoidi immergendoli in xilene per 2 x 30 min.
    2. Immergere gli organoidi chiarificati in paraffina fusa a 60 °C per 1 ora. Trasferire gli organoidi infiltrati di paraffina negli stampi da incasso, riempire gli stampi con paraffina fusa e posizionare gli stampi in una piastra fredda per la solidificazione della paraffina. Rimuovere i blocchi di paraffina dagli stampi dopo che la paraffina si è solidificata e tagliare la paraffina in eccesso.
    3. Montare i blocchi di paraffina sul microtomo. Tagliare sezioni spesse 5 μm e farle galleggiare a bagnomaria calda (42-45 °C) per appiattirle. Trasferire con cura le sezioni su vetrini e asciugarle su uno scaldavetrini.
    4. Deparaffinare le sezioni immergendo i vetrini nello xilene per 2 x 5 min. Reidratare attraverso una serie di etanolo graduato: etanolo al 100% per 2 x 3 min; etanolo al 95% per 3 min; etanolo al 70% per 3 min; Sciacquare in acqua distillata.
    5. Colorare con ematossilina per 5 min; Quindi, sciacquare con acqua corrente del rubinetto per 5 minuti. Differenziare in alcool acido all'1% per alcuni secondi; sciacquare in acqua corrente del rubinetto per 5 min; mettere in blu in acqua di ammoniaca allo 0,2% per 30 s; sciacquare in acqua corrente del rubinetto per 5 min; Colorare con eosina per 2 min. Disidratare attraverso etanolo graduato: etanolo al 70% per 1 minuto; etanolo al 95% per 1 minuto; 100% etanolo per 2 x 1 min. Chiarificare in xilene per 2 x 1 min.
    6. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio alle sezioni macchiate. Quindi, posizionare un vetrino coprioggetti sulla sezione di tessuto, evitando bolle d'aria. Osservare le sezioni colorate al microscopio ottico.
  4. Colorazione a fluorescenza
    1. Eseguire la deparaffinazione e la reidratazione come descritto nei passaggi 4.3.1. al punto 4.3.4.
    2. Preriscaldare la soluzione di recupero dell'antigene in un forno a microonde. Immergere i vetrini nella soluzione riscaldata per il recupero dell'antigene e mantenerli a temperatura inferiore all'ebollizione per 20 minuti. Lasciare raffreddare i vetrini nella soluzione di recupero dell'antigene per 40 minuti. Sciacquare i vetrini in acqua deionizzata per 5 minuti.
    3. Incubare i vetrini in perossido di idrogeno allo 0,3% in metanolo per 10 minuti per estinguere l'attività della perossidasi endogena. Sciacquare i vetrini per 3 x 5 minuti in PBS e incubarli in soluzione bloccante per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umidificata. Picchiettare la soluzione bloccante in eccesso ma non risciacquare.
    4. Diluire l'anticorpo primario in soluzione bloccante secondo le istruzioni del produttore. Applicare l'anticorpo primario diluito sulle sezioni di tessuto e incubare per una notte a 4 °C in una camera umidificata.
    5. Lavare le diapositive per 3 x 5 minuti in PBS. Diluire l'anticorpo secondario coniugato HRP in soluzione bloccante secondo le istruzioni del produttore. Applicare l'anticorpo secondario diluito sulle sezioni di tessuto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umidificata. Lavare i vetrini per 3 x 5 minuti in PBS per rimuovere l'anticorpo secondario non legato.
    6. Preparare la soluzione di lavoro Fluoresceina Tiramide secondo le istruzioni del kit. Applicare la soluzione di lavoro sulle sezioni di tessuto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata. Sciacquare i vetrini per 3 x 5 minuti in PBS.
    7. Ripetere il passaggio 4.4.1. fino a quando la colorazione non è stata completata con tutti e tre gli anticorpi. Applicare una goccia di terreno di montaggio fluorescente con DAPI su ogni sezione di tessuto. Posizionare con cura un vetrino coprioggetti sulla sezione di tessuto per evitare bolle d'aria. Esaminare i vetrini al microscopio confocale invertito.
  5. PCR quantitativa
    1. Raccogliere gli organoidi come descritto nei passaggi 4.2.1. al punto 4.2.3. Aspirare il PBS ed estrarre gli RNA totali dagli organoidi seguendo le istruzioni del produttore.
    2. Utilizzare qualsiasi kit di trascrizione inversa disponibile in commercio per sintetizzare il cDNA da 1 μg di RNA totale. Impostare una reazione q-PCR secondo il protocollo del produttore del kit. Vedere la Tabella dei materiali per le sequenze di primer utilizzate per la q-PCR.

5. Coltura a lungo termine di organoidi endometriali di ratto

  1. Aspirare il REEM e aggiungere 1 mL di soluzione di raccolta degli organoidi per 40 minuti per dissociare gli organoidi. Incubare su ghiaccio per mantenere l'integrità dell'organoide.
  2. Dopo l'incubazione, raccogliere gli organoidi utilizzando una pipetta Pasteur e centrifugare a 300 × g per 3 minuti a 4 °C per pellettarli per un'ulteriore lavorazione.
    NOTA: Il taglio del puntale della pipetta può essere utile per maneggiare organoidi più grandi (oltre 500 μm) senza causare danni.
  3. Risospendere gli organoidi pellettati in Matrigel, in un rapporto di 1:2 o 1:3, per l'inclusione e la successiva coltura in piastre a 12 pozzetti.
  4. Preparare la soluzione madre congelata: REEM con DMSO al 10%.
  5. Raccogliere gli organoidi, risospenderli nella soluzione madre congelata e quindi conservarli in congelatore a -80 °C o in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
  6. Per scongelare gli organoidi congelati, preriscaldare il REEM in un bagno d'acqua a 37 °C e immergere il tubo madre congelato nel bagnomaria per scongelare delicatamente gli organoidi.
  7. Dopo lo scongelamento, risospendere gli organoidi in 500 μL di Matrigel per la reinclusione e la coltura in una piastra a 12 pozzetti. Seguire i passaggi 4.1.2. al punto 4.1.3.
    NOTA: Si consiglia di conservare gli organoidi congelati a -80 °C per periodi più brevi o di trasferirli in azoto liquido per una conservazione a lungo termine.

6. Facoltativo: transizione degli organoidi alla coltura aderente

NOTA: Il protocollo menziona un metodo alternativo per ottenere reESC in coltura piatta mediante la transizione degli organoidi alla coltura aderente, consentendo la ristrutturazione della morfologia degli organoidi.

  1. Aspirare il REEM e aggiungere 1 mL di soluzione di raccolta degli organoidi per dissociare gli organoidi. Incubare su ghiaccio per mantenere l'integrità dell'organoide.
  2. Dopo l'incubazione, raccogliere gli organoidi utilizzando una pipetta Pasteur e centrifugarli per pellettarli a 300 × g per 3 minuti a 4 °C.
  3. Risospendere gli organoidi in 3 mL di REEM preriscaldato e trasferire gli organoidi risospesi in un piatto di 3,5 cm. Cambia il supporto REEM ogni 2 giorni.
  4. Quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza, digerirle con tripsina allo 0,25%/1 mM EDTA per 5-6 minuti.
  5. Ricostruire gli organoidi con reESC seguendo i passaggi da 4.1.1 a 4.1.3.

7. Coltura sequenziale di organoidi con estradiolo (E2) e progesterone (P4)

  1. Preparare le soluzioni madre di E2 e P4 in DMSO. Diluire le soluzioni madre alle concentrazioni di lavoro desiderate (E2: 10 nM; P4: 1 μM) in REEM, garantendo che la concentrazione finale di DMSO non superi lo 0,1% per evitare effetti citotossici.
  2. Organoidi di coltura in REEM come fasi 4.1.1. al punto 4.1.3. per 4 giorni. Sostituire il terreno con REEM integrato con E2 e coltura per 7 giorni. Monitora quotidianamente la crescita e la morfologia degli organoidi. Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni.
  3. Sostituire il fluido con REEM integrato con E2 e P4. Monitora quotidianamente la crescita e la morfologia degli organoidi. Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni. Continuare a coltivare gli organoidi per 7 giorni.

Risultati

Le reESC e gli organoidi dell'utero di ratto sono stati stabiliti da sei femmine di ratto Sprague-Dawley di peso compreso tra 200 g e 250 g seguendo il protocollo delineato nella Figura 1. Attingendo al successo della coltura a lungo termine di cellule staminali epiteliali endometriali umane, la formulazione di REEM consisteva prevalentemente in Y27632, A8301 e CHIR99021. Per stabilizzare le reESC in vitro, abbiamo inizialmente isolato le cellule endometriali dall'endometrio di ratto utilizzando tecniche enzimatiche e meccaniche. L'analisi della citometria a flusso nella Figura 2A ha rivelato che le cellule endometriali primarie comprendevano circa il 50% di cellule epiteliali che esprimono CD9 (49,8%), con bassi livelli di EpCAM (4,49%) e CD24 (2,64%). Il marcatore SSEA-1 per le reESC era presente al 6,58%, mentre i marcatori endoteliali CD31 (30,9%) e CD45 (70,3%) erano relativamente alti.

Tuttavia, la coltura in REEM ha portato a reESC P1 che mostrano una morfologia uniforme a spirale o poliedrica e formano strutture clonali compatte (Figura 2D). La graduale rimozione di singoli fattori da REEM ha portato a una corrispondente diminuzione della capacità proliferativa delle reESC. Il saggio di formazione dei cloni ha evidenziato il ruolo critico di Y27632 nella coltura stabile di reESC (Figura 2B, C). Al terzo passaggio, le reESC hanno mostrato un'espressione coerente di SSEA-1 e citocheratina, indicando una forte espansione delle reESC primarie durante la coltura (Figura 2F). Inoltre, le reESC hanno mantenuto una capacità proliferativa robusta e stabile anche nei passaggi tardivi (Figura 2E), dimostrando il loro successo nell'isolamento e nell'espansione nell'attuale sistema REEM.

Le colture di organoidi sono state stabilite seguendo un sistema precedentemente riportato derivato da cellule staminali endometriali umane8. Entro 3 giorni, le reESC hanno mostrato una rapida auto-organizzazione in strutture organoidi con un centro cavo, che successivamente sono aumentate di dimensioni e spessore (vedi Figura 3A). I tipici risultati della colorazione HE che illustrano la formazione di organoidi da parte delle reESC sono presentati nella Figura 3B. Queste colture di organoidi possono essere sostenute attraverso il passaging, come evidenziato dall'elevata vitalità cellulare indicata dalla colorazione Ki67 dopo sia il passaggio diretto che i cicli di congelamento-scongelamento. Inoltre, la colorazione HE è stata eseguita sulla decima generazione di organoidi e i risultati hanno mostrato che la struttura dell'organoide poteva essere mantenuta intatta (vedi Figura 3E). Inoltre, i risultati della qPCR hanno indicato che Nanog, Sox2 e Oct4 erano espressi a livelli paragonabili a quelli della generazione P1 (Figura 3F). Questa scoperta suggerisce il potenziale per la coltura a lungo termine di organoidi all'interno del sistema attuale.

Il nostro studio ha condotto un'indagine preliminare sulla risposta di strutture simili all'utero di ratto a E2 e P4. La colorazione in immunofluorescenza nella Figura 4A ha rivelato la presenza di recettori per estrogeni e progesterone. Dopo l'integrazione di E2 , questi organoidi hanno subito una transizione da una forma sferica cava a un modello di crescita interna più densamente popolato (Figura 4C). La successiva esposizione al P4 ha portato a una diminuzione della permeabilità delle strutture dense, con conseguente disintegrazione (Figura 4B). Questi risultati suggeriscono che l'E2 potenzialmente guida un'ulteriore differenziazione delle strutture uterine di ratto, mentre il P4 può innescare percorsi apoptotici.

figure-results-1
Figura 1: Procedure utilizzate per stabilire le cellule staminali epiteliali endometriali di ratto e gli organoidi dell'utero di ratto. Abbreviazione: SD = Sprague-Dawley. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Generazione e coltura a lungo termine di cellule staminali epiteliali endometriali di ratto in vitro. (A) Analisi citofluorimetrica che mostra la proporzione di cellule positive nell'endometrio di ratto. (B) Colorazione con cristallovioletto di cloni in REEM con o senza A8301, Y27632 o CHIR99021, rispettivamente. Barre di scala = 1 cm. (C) I numeri del clone in REEM con o senza fattori. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard; n = 3 donatori (***, p<0,001). (D) Immagini al microscopio ottico di cellule staminali epiteliali endometriali di ratto P1 con e senza colorazione cristallovioletto. (E) Analisi CCK-8 di cellule staminali epiteliali endometriali di ratto al passaggio 1, passaggio 7 e passaggio 14. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard, n = 3. (F) Analisi di immunofluorescenza che dimostrano l'espressione di citocheratina e SSEA-1. Abbreviazione: REEM = mezzo di espansione reESC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Generazione e coltura a lungo termine di organoidi endometriali di ratto in vitro. (A) Immagini al microscopio ottico di organoidi endometriali di ratto P1. (B) Colorazione H&E per organoidi P1 da cellule staminali epiteliali endometriali di ratto. (C) Analisi di immunofluorescenza che dimostrano l'espressione di citocheratina e SSEA-1. (D) Analisi di immunofluorescenza che dimostrano l'espressione di Ki67 e SSEA-1. (E) Colorazione H&E per organoidi di ratto P 10. (F) analisi qPCR per l'espressione di Nanog, Sox2 e Oct-4 in organoidi endometriali di ratto P1 e P10. Espressione normalizzata a GAPDH (n = 3, t-test non accoppiato a due code, n.s. = non significativo). Abbreviazione: H&E = ematossilina ed eosina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Coltura sequenziale di organoidi con E2 e P4. (A) Analisi di immunofluorescenza che dimostrano l'espressione del recettore degli estrogeni, del recettore del progestinico e di SSEA-1. (B) Panoramica delle immagini al microscopio ottico di organoidi di ratto coltivati in E2 e P4. (C) Le immagini al microscopio ottico dimostrano la trasformazione di una sfera cava in densa all'interno della cavità interna di organoidi dopo essere stati coltivati per 7 giorni in E2. Abbreviazioni: ER = recettore degli estrogeni; PR = recettore del progestinico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

In questo studio, abbiamo descritto un metodo semplice per isolare e coltivare le cellule staminali epiteliali endometriali di ratto (reESC) e perfezionato il sistema ex vivo precedentemente stabilito per le cellule staminali epiteliali endometriali umane8. Il nostro approccio utilizza un terreno di coltura a piccola molecola contenente Y27632, A8301 e CHIR99021 come componenti principali per consentire una coltura ex vivo stabile e a lungo termine. Inoltre, abbiamo generato con successo organoidi endometriali di ratto in tempo reale utilizzando reESC. Questo nuovo sistema semplifica gli attuali metodi di coltura degli organoidi endometriali, che in genere si basano su blocchi di tessuto, fornendo così una maggiore chiarezza riguardo alla linea cellulare10. È importante sottolineare che il nostro sistema facilita l'editing genetico e altre manipolazioni a livello cellulare per generare organoidi che esprimono geni specifici. Inoltre, questo sistema di organoidi consente il knockout mirato o la sovraespressione di geni specifici nell'endometrio di ratto, consentendo lo screening e la coltivazione di cellule staminali epiteliali endometriali per produrre organoidi endometriali. Questo approccio di ricerca completo chiarisce specifiche funzioni geniche sia da prospettive in vivo che ex vivo , aprendo la strada allo studio delle malattie correlate all'epitelio endometriale.

Lo screening dei farmaci è un'applicazione fondamentale degli organoidi. Tuttavia, le attuali fonti e metodi di preparazione degli organoidi sono complessi, il che porta a una significativa variabilità tra i lotti che può influire sui risultati degli studi di screening farmacologico11,12. Il nostro sistema dimostra che gli organoidi derivati da linee cellulari colte ex vivo stabili possono ridurre efficacemente le differenze tra gli organoidi formati, migliorando l'uniformità nelle configurazioni sperimentali. Inoltre, gli organoidi di ratto formati da reESC hanno dimostrato la capacità di rispondere alla stimolazione estrogenica in vitro, portando a cambiamenti morfologici, suggerendo che possono essere utilizzati come strumento per lo screening di farmaci ex vivo. Le reESC possono essere facilmente isolate dal tessuto endometriale ed espanse ex vivo con meno piccole molecole rispetto alle cellule staminali epiteliali endometriali umane. Questa caratteristica è particolarmente preziosa per studiare le proprietà delle cellule staminali, le cellule precursori, i processi di differenziazione e le interazioni con il microambiente. È importante sottolineare che questo approccio può essere estrapolato ad altre specie di mammiferi come scimmie, maiali e cani, consentendo la creazione di sistemi di coltura di organoidi endometriali che fungono da modelli fisiologicamente più rilevanti per lo studio della biologia endometriale, della funzione, delle malattie e delle risposte ai farmaci. Nonostante i suoi vantaggi, questa tecnica ha dei limiti. Una delle principali limitazioni è la dipendenza da Matrigel, una matrice extracellulare complessa e variabile che può introdurre incongruenze tra gli esperimenti. Inoltre, mentre i modelli di ratto forniscono informazioni preziose, esistono ancora differenze interspecie e i risultati potrebbero non tradursi completamente nella fisiologia e nelle patologie dell'endometrio umano. Gli studi futuri dovrebbero mirare ad affrontare queste limitazioni, potenzialmente attraverso lo sviluppo di matrici extracellulari più definite e coerenti e esplorando l'applicabilità di questo modello ad altre specie.

Nonostante i suoi vantaggi, questa tecnica ha dei limiti. Una delle principali limitazioni è la dipendenza da Matrigel, una matrice extracellulare complessa e variabile che può introdurre incongruenze tra gli esperimenti. Pertanto, una tecnica chiave in questo studio è la rimozione di Matrigel. L'uso di un digerente in gel a matrice delicato, che garantisce operazioni sul ghiaccio e un tempo di digestione sufficiente sono fondamentali per il successo. A causa del diametro maggiore della pipetta Pasteur, l'utilizzo dell'aspirazione della pipetta Pasteur può ridurre i danni agli organoidi e accelerare la digestione del gel della matrice. Ricerche successive possono confrontare diversi metodi di coltura su gel di matrice extracellulare per ottimizzare ulteriormente i sistemi di coltura e digestione degli organoidi. Gli studi futuri dovrebbero mirare ad affrontare queste limitazioni, potenzialmente attraverso lo sviluppo di matrici extracellulari più definite e coerenti e esplorando l'applicabilità di questo modello ad altre specie.

Mentre la letteratura esistente ha descritto tecniche per la coltura ex vivo di organoidi epiteliali, questo studio presenta un sistema nuovo, semplice e facilmente riproducibile per la coltivazione e l'espansione di organoidi endometriali di ratto provenienti da cellule chiare. Questo progresso è pronto a migliorare il ritmo della ricerca nel campo della biologia riproduttiva femminile.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla GuangDong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515110760).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anti-CD15 (SSEA-1)Abcamab135377Coniglio, 1:200 (IHC)
Anti-Recettore degli estrogeni alfaAbcamab32063Coniglio, 1:200 (IHC)
Anti-pan CitocheratinaAbcamab7753Topo, 1:250 (IHC)
Anti-Recettore del progesteroneAbcamab101688Coniglio, 1:200 (IHC)
Anti-Ki67Abcamab279653Mouse, 1:250 (IHC)
A8301TargetMol909910-43-6
β-estradioloMerckE8875
Kit per il conteggio delle cellule-8BeyotimeC0038
CD9BioLegend1098191:20 (FC), Pacific Blue
CD24BioLegend1018061:20 (FC), FITC
CD31BioLegend3031201:20 (FC), APC
CD45BioLegend3017031:20 (FC), PE
CHIR99021TargetMolCT99021
Cultrex Soluzione per la raccolta di organoidiR& D Systems3700-100-01
Cy3 TSA Kit sistema di fluorescenzaAPExBIOK1051
Cy5 TSA Kit sistema di fluorescenzaAPExBIOK1052
DAPISigmaD95421 μ g/mL
DMEM/F-12Invitrogen11330032
EpCAMBioLegend3698031:20 (FC),
Kit per sistema di fluorescenza PerCP Fluoresceina TSAAPExBIOK1050
IgG anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500
IgG anti-topo di capra, Alexa Fluor 555InvitrogenA-214221:500
Capra Anticorpo IgG/HRP anti-coniglioAPExBIObs-0295G-HRP
Sostituzione del siero knockoutInvitrogen10828028
MatrigelCorning356234
PrimeScript RT Master MixTakaraRR063A
ProgesteroneMerck57-83-0
Sprague-Dawley rat Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, Cina
SSEA-1BioLegend3230471:20 (FC), APC
TB Verde Veloce qPCR MixTakaraRR820A
TriZOLInvitrogen15596026CNEstrazione dell'RNA
u-Slide Piastre a 8 pozzettiIbidi80827
Y27632TargetMol146986-50-7
qPCR primer di geni bersaglio 
GenesCompanySequences
rat GAPDH FSangon biotechGACATGCCGCCTGGAGAAAC
rat GAPDH RSangon biotechAGCCCAGGATGCCCTTTAGT
rat Nanog FSangon biotechGACTAGCAACGGCCTGACTCA
ratto Nanog R Sangon biotechCTGCAATGGATGCTGGGATA
rat Sox2 FSangon biotechATTACCCGCAGCAAAATGAC
rat Sox2 RSangon biotechATCGCCCGGAGTCTAGTTCT
rat Oct4 FSangon biotechCCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
rat Oct4 RSangon biotechACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA
GG

Riferimenti

  1. Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).
  2. Garcia-Alonso, L., et al. Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro. Nat Genet. 53 (12), 1698-1711 (2021).
  3. Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Organoids - preclinical models of human disease. N Engl J Med. 380 (6), 569-579 (2019).
  4. Mulaudzi, P. E., Abrahamse, H., Crous, A. Insights on three dimensional organoid studies for stem cell therapy in regenerative medicine. Stem Cell Rev Rep. 20 (2), 509-523 (2024).
  5. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  6. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nat Cell Biol. 19 (5), 568-577 (2017).
  7. Tempest, N., Maclean, A., Hapangama, D. K. Endometrial stem cell markers: current concepts and unresolved questions. Int J Mol Sci. 19 (10), 3240(2018).
  8. He, W., et al. Long-term maintenance of human endometrial epithelial stem cells and their therapeutic effects on intrauterine adhesion. Cell Biosci. 12 (1), 175(2022).
  9. Katsuda, T., et al. Conversion of terminally committed hepatocytes to culturable bipotent progenitor cells with regenerative capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
  10. Murphy, A. R., Campo, H., Kim, J. J. Strategies for modelling endometrial diseases. Nat Rev Endocrinol. 18 (12), 727-743 (2022).
  11. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nat Cell Biol. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  12. Esfandiari, F., et al. Endometriosis organoids: prospects and challenges. Reprod Biomed Online. 45 (1), 5-9 (2022).

Ristampe e permessi

Tag

Organoidi endometrialicoltura di organoidicaratterizzazione degli organoidimalattie endometrialitest di farmaci su organoidiediting genomico di organoidiisolamento cellulareincorporazione in Matrigel
Generazione e caratterizzazione di organoidi dell'utero di ratto da cellule staminali epiteliali dell'endometrio di ratto
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.