Utilizzo di oligonucleotidi sintetici modificati per il dosaggio degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici

Sommario

Qui viene presentato un protocollo per il dosaggio degli enzimi metabolizzanti degli acidi nucleici, utilizzando esempi di enzimi ligasi, nucleasi e polimerasi. Il test utilizza oligonucleotidi marcati in fluorescenza e non marcati che possono essere combinati per formare duplex che imitano i danni all'RNA e/o al DNA o gli intermedi di percorso, consentendo la caratterizzazione del comportamento enzimatico.

Abstract

La disponibilità di una gamma di oligonucleotidi sintetici modificati da fornitori commerciali ha permesso lo sviluppo di saggi sofisticati per caratterizzare diverse proprietà degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici che possono essere eseguiti in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare standard. L'uso di etichette fluorescenti ha reso questi metodi accessibili ai ricercatori con apparecchiature standard per elettroforesi PAGE e un imager abilitato alla fluorescenza, senza utilizzare materiali radioattivi o richiedere un laboratorio progettato per lo stoccaggio e la preparazione di materiali radioattivi, ad esempio un Hot Lab. L'aggiunta opzionale di modifiche standard come la fosforilazione può semplificare la configurazione del saggio, mentre l'incorporazione specifica di nucleotidi modificati che imitano i danni al DNA o gli intermedi può essere utilizzata per sondare aspetti specifici del comportamento enzimatico. Qui vengono dimostrate la progettazione e l'esecuzione di saggi per interrogare diversi aspetti dell'elaborazione del DNA da parte di enzimi utilizzando oligonucleotidi sintetici disponibili in commercio. Questi includono la capacità delle ligasi di unirsi o delle nucleasi di degradare diverse strutture ibride di DNA e RNA, l'uso differenziale del cofattore da parte della DNA ligasi e la valutazione della capacità di legare il DNA degli enzimi. Vengono discussi i fattori da considerare nella progettazione di substrati nucleotidici sintetici e viene fornito un set di base di oligonucleotidi che possono essere utilizzati per una serie di saggi enzimatici di ligasi, polimerasi e nucleasi degli acidi nucleici.

Introduzione

Tutte le forme di vita richiedono enzimi di elaborazione dell'acido nucleico per eseguire processi biologici fondamentali, tra cui la replicazione, la trascrizione e la riparazione del DNA. Le principali funzionalità enzimatiche per queste vie sono le polimerasi, che generano copie di molecole di RNA/DNA, le ligasi che si uniscono ai substrati polinucleotidici, le nucleasi che le degradano, e le elicasi e le topoisomerasi, che fondono duplex di acidi nucleici o ne modificano la topologia 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Inoltre, molti di questi enzimi forniscono strumenti molecolari essenziali per applicazioni come il clonaggio, la diagnostica e il sequenziamento ad alto rendimento 11,12,13,14,15.

Le caratteristiche funzionali, la cinetica e le specificità del substrato di questi enzimi possono essere determinate utilizzando substrati di DNA/RNA marcati prodotti mediante ricottura di oligonucleotidi. Il tracciamento dei substrati e dei prodotti è stato tradizionalmente ottenuto introducendo un'etichetta radioattiva (³²P) all'estremità del filamento 5', che può quindi essere rilevata da una pellicola fotografica o con un sistema di imaging al fosforo^16,17. Mentre i substrati radiomarcati offrono il vantaggio di una maggiore sensibilità sperimentale e non alterano le proprietà chimiche di un nucleotide, i potenziali rischi per la salute derivanti dal lavoro con i radioisotopi hanno incoraggiato lo sviluppo di marcature di acidi nucleici non radioattivi per fornire un'alternativa più sicura per la rilevazione di DNA e RNA 18,19,20. Tra questi, il rilevamento della fluorescenza, incluso il rilevamento diretto della fluorescenza, la fluorescenza risolta nel tempo e i saggi di trasferimento di energia/estinzione della fluorescenza si distinguono come i più versatili 21,22,23,24. L'ampia gamma di fluorofori consente diversi design di substrati di DNA/RNA con reporter unici su ciascun oligonucleotide²⁵. Inoltre, la stabilità dei fluorofori, rispetto ai radioisotopi, consente agli utenti di produrre e conservare quantità significative di substrati di DNA marcati in fluorescenza¹⁹. Questi substrati marcati con fluorofori possono essere incubati con la proteina di interesse, insieme a diverse combinazioni di cofattori metallici e nucleotidici, per analizzare il legame e/o l'attività enzimatica. La visualizzazione del legame o dell'attività può essere osservata utilizzando vari canali di coloranti fluorofori con un sistema di imaging su gel. Poiché con questa tecnica saranno visibili solo gli oligonucleotidi marcati in fluorescenza, qualsiasi aumento o diminuzione delle dimensioni dell'oligonucleotide marcato sarà facile da seguire. I gel possono anche essere colorati in seguito, con coloranti coloranti per acidi nucleici per visualizzare tutte le bande di DNA presenti sul gel.

Le ligasi degli acidi polinucleici sono enzimi che uniscono frammenti di DNA/RNA, catalizzando la sigillatura delle rotture mediante la formazione di un legame fosfodiestere tra i terminali del DNA fosforilato 5' e l'OH 3' del DNA. Possono essere divisi in due gruppi in base al loro requisito di substrato nucleotidico. Le ligasi NAD-dipendenti altamente conservate si trovano in tutti i batteri²⁶, mentre gli enzimi ATP-dipendenti, strutturalmente diversi, possono essere identificati in tutti i domini della vita ^8,27. Le DNA ligasi svolgono un ruolo importante nell'elaborazione dei frammenti di Okazaki durante la replicazione, oltre ad essere coinvolte in varie vie di riparazione del DNA, come la riparazione per escissione di nucleotidi e basi, attraverso la sigillatura di intaccature spontanee e intaccature che rimangono dopo la riparazione ^8,10. Diverse DNA ligasi mostrano diverse capacità di unire diverse conformazioni di rotture del DNA, tra cui intaccature in un duplex, rotture a doppio filamento, disallineamenti e lacune, nonché ibridi di RNA e DNA 28,29,30. Una vasta gamma di substrati legabili può essere assemblata mediante ricottura di oligonucleotidi con un fosfato 5' per generare termini 5' e 3' giustapposti in un duplex di acido nucleico 31,32,33. Il metodo di analisi più comune è la risoluzione mediante urea PAGE in un formato di saggio end-point; Tuttavia, le recenti innovazioni hanno incluso l'uso dell'elettroforesi su gel capillare, che consente un'elevata produttività³⁴, la profilazione spettrometrica di massa³⁵, nonché un saggio beacon molecolare omogeneo, che consente il monitoraggio risolto nel tempo³⁶.

Il primo passo in una reazione di legatura è l'adenilazione dell'enzima ligasi da parte dell'adenosina trifosfato (ATP) o della nicotinammide adenina dinucleotide (NAD), risultando in un intermedio enzimatico covalente. Il secondo passo della reazione è l'adenilazione del substrato dell'acido nucleico all'estremità 5' del sito di nick, che è seguita dalla legatura dei filamenti di nick dell'acido nucleico. Molti enzimi ligasi che sono espressi in modo ricombinante in E. coli sono purificati nella forma adenilata e, quindi, sono in grado di legare con successo gli acidi nucleici senza l'aggiunta di un cofattore nucleotidico. Ciò rende difficile determinare quale particolare tipo di cofattore nucleotidico sono necessari per la legatura degli acidi nucleici. Oltre a descrivere i saggi per valutare l'attività della DNA ligasi, viene presentato anche un metodo per determinare in modo affidabile l'uso del cofattore de-adenilando l'enzima utilizzando substrati non marcati.

Le nucleasi sono un gruppo ampio e diversificato di enzimi che modificano il DNA/RNA e RNA catalitici che scindono i legami fosfodiestere tra gli acidi nucleici³⁷. Le funzionalità dell'enzima nucleasi sono necessarie nella replicazione, riparazione e processazione dell'RNA del DNA e possono essere classificate in base alla loro specificità zuccherina per DNA, RNA o entrambi. Le endonucleasi idrolizzano i legami fosfodiestere all'interno di un filamento di DNA/RNA, mentre le esonucleasi idrolizzano i filamenti di DNA/RNA un nucleotide alla volta dall'estremità 3' o 5' e possono farlo sia dall'estremità 3' a 5' che da 5' a 3' del DNA³⁸.

Mentre molte proteine nucleasi sono aspecifiche e possono essere coinvolte in più processi, altre sono altamente specifiche per una particolare sequenza o danno al DNA ^6,39,40. Le nucleasi sequenza-specifiche sono utilizzate in un'ampia gamma di applicazioni biotecnologiche, come la clonazione, la mutagenesi e l'editing del genoma. Le nucleasi popolari per queste applicazioni sono le nucleasi di restrizione⁴¹, le nucleasi a dita di zinco⁴², le nucleasi effettrici simili ad attivatori trascrizionali e, più recentemente, le nucleasi CRISPR ingegnerizzate guidate dall'RNA⁴³. Recentemente sono state identificate nucleasi danno-specifiche, come la nucleasi EndoMS, che ha specificità per i mismatch nel DNA attraverso il suo dominio ^5,44 della nucleasi RecB-like mismatch-specific. I saggi di attività nucleasica, storicamente, sono stati eseguiti come saggi discontinui con substrati radiomarcati; Tuttavia, oltre agli altri inconvenienti, questi non consentono l'identificazione del sito che viene tagliato da una proteina nucleasi, cosa possibile quando si utilizzano substrati marcati in fluorescenza ^45,46. Più recentemente, sono stati sviluppati saggi di nucleasi continua che funzionano utilizzando diversi coloranti di DNA che interagiscono con il DNA in stati diversi; ad esempio, emettendo un segnale fluorescente più elevato quando interagisce con il dsDNA rispetto al suo stato non legato, o legandosi specificamente a RNA corti⁴⁷. Altri saggi di nucleasi continua utilizzano forcine di DNA con un gruppo fluoroforo sul 5' e un quencher sull'estremità 3' in modo che la fluorescenza aumenti man mano che l'oligonucleotide viene degradato a causa di una separazione del fluoroforo e del quencher⁴⁸. Sebbene questi saggi consentano di caratterizzare la cinetica delle proteine che degradano il DNA, richiedono una conoscenza preliminare della funzione e del substrato dell'enzima e sono anche limitati agli enzimi che modificano la conformazione del DNA per causare una differenza nel legame del colorante. Per questo motivo, i saggi endpoint che risolvono i singoli prodotti nucleasici sono ancora auspicabili per fornire informazioni sulle modifiche del DNA causate dall'attività proteica.

Qui, viene presentata una procedura dettagliata per la progettazione di oligonucleotidi DNA/RNA marcati in fluorescenza che possono essere miscelati e abbinati per generare substrati per testare l'attività di nuovi enzimi nucleasi, polimerasi e ligasi. La convalida di questo set di base di sequenze oligonucleotidiche semplifica la progettazione sperimentale e facilita la profilazione economica di un'ampia gamma di funzionalità enzimatiche senza la necessità di acquistare un gran numero di substrati su misura. Viene fornita una procedura dettagliata per l'esecuzione di un saggio enzimatico standard di elaborazione del DNA con questi substrati, utilizzando l'esempio dell'attività della DNA ligasi e vengono descritte le modifiche per il saggio e l'analisi degli enzimi nucleasi e polimerasi. Inoltre, viene fornito un test modificato per determinare la specificità del cofattore dell'enzima DNA ligasi con elevata precisione e vengono utilizzate sonde a doppia marcatura per valutare l'assemblaggio di legature multicomponente. Infine, vengono discusse le modifiche al formato del saggio di base per consentirne l'utilizzo per determinare le interazioni proteina-DNA con gli stessi substrati mediante il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA).

Protocollo

1. Progettazione e acquisto di oligonucleotidi

NOTA: Progettare oligonucleotidi a singolo filamento da assemblare e ricuocere nei duplex desiderati. Uno o più filamenti in un duplex devono avere una porzione fluorescente per tracciare l'elaborazione degli oligonucleotidi da parte dell'enzima di interesse. Nella Tabella 1 viene fornito un set di base di sequenze a singolo filamento che possono essere assemblate per una vasta gamma di attività.

1. Incorporare le modifiche specifiche necessarie per l'enzima di interesse come descritto di seguito.
   1. Per i substrati della DNA ligasi (Figura 1): assemblare il substrato più semplice da tre oligonucleotidi: un filamento donatore fosforilato 5' (NL2), un filamento accettore marcato con FAM 5' (NL1) e un complemento che collega i due (NL3).
      1. Assicurarsi che i fili che forniscono il termine 5' dell'intaccatura legabile siano fosforilati prima dell'assemblaggio della miscela master del substrato nel passaggio 2. Ordinalo come modifica su NL2 (come indicato nella Tabella 1) o usa la fosforilazione enzimatica con la polinucleotide chinasi T4 dopo aver risospeso gli oligonucleotidi.
      2. Include la fosforilazione 5'-terminale di NL6 e NL8, che comprendono il complemento di rotture a doppio filamento raffigurate nella Figura 1A (NL6/NL7 e NL8/NL9) in quanto questo assomiglia molto al substrato naturale prodotto da un'endonucleasi di restrizione. Utilizzare un substrato a doppia marcatura per determinare le estensioni relative della legatura per assemblaggi in più parti (vedere il passaggio 6).
      3. Modificare il filamento del complemento per produrre disallineamenti (NL10) e lacune (NL11).
         NOTA: Le variazioni sul substrato intaccato semplice sono illustrate nella Figura 1A. È possibile utilizzare altre sequenze per produrre una gamma ancora più ampia di disallineamenti o spazi più lunghi variando la posizione sottolineata.
      4. Sostituire gli oligonucleotidi del DNA con gli oligonucleotidi dell'RNA.
         NOTA: Le variazioni sul substrato semplice intaccato sono illustrate nella Figura 1B. Una gamma più ampia di duplex DNA/RNA può essere generata da combinazioni aggiuntive del set di basi qui fornito per generare, ad esempio, rotture a doppio filamento contenenti sia RNA che DNA. Un esempio di questa variazione è fornito nel passaggio 6 di seguito, in cui viene utilizzata una strategia a doppia etichetta.
   2. Per i substrati della DNA polimerasi: assemblare gli oligonucleotidi NL1 e NL3 elencati nella Tabella 1 per fornire un semplice saggio di estensione del primer. Studiare ulteriori aspetti dell'attività della polimerasi introducendo modifiche nei filamenti NL1 (primer) o NL3 (modello).
      1. Incorporare analoghi di base danneggiati nell'oligonucleotide NL3 prima della posizione 20 per determinare la capacità di bypassare le lesioni danneggiate sul filamento stampo.
      2. Incorporare analoghi di base danneggiati nell'oligonucleotide NL1 in posizione 20 per determinare la capacità di estendere un primer danneggiato.
      3. Utilizzare RNL1 o RNL3 nel duplex per studiare l'estensione di un primer di RNA o l'uso di un modello di RNA.
   3. Per i substrati nucleasi (Figura 2): assemblare gli oligonucleotidi per fornire una gamma non esaustiva di substrati a doppio e singolo filamento (Figura 2Ai), nonché una gamma di giunzioni sbattute e allargate (Figura 2Aii) e substrati danneggiati (Figura 2B).
      1. Per sondare le attività della ribonucleasi, sostituire iterativamente NL1, NL2 e NL3 con RNL1, RNL2 e RNL3. Utilizzare versioni aggiuntive di RNA di HJ5 e HJ6 per espandere ulteriormente questo set.
      2. Utilizzare oligonucleotidi MD5, MD6 e MD9 che hanno una modifica posizionata centralmente che imita il danno ossidativo, un intermedio di riparazione abasico o un prodotto di deaminazione (Figura 2B). I substrati rileveranno la scissione del filamento in questa posizione. Etichettare il filamento NL3 del complemento con un fluoroforo ortogonale come TAMRA per rilevare la scissione del doppio filamento (vedere il passaggio 6).
      3. Utilizzare la marcatura ortogonale del complemento per rilevare il taglio a doppio filamento nei siti non corrispondenti sia sulla sonda (NL5 e ND9) che sui filamenti del complemento (MD10 e NL10).
2. Ordina oligonucleotidi sintetici che incorporano fluorofori pertinenti e altre modifiche da un fornitore commerciale.
   NOTA: Per i saggi descritti sono disponibili una scala di sintesi da 100 nM e la purificazione HPLC successiva alla sintesi.

2. Assemblaggio e ricottura di duplex di acidi nucleici

1. Risospensione e diluizione di oligonucleotidi
   1. Prima dell'apertura, centrifugare gli oligonucleotidi liofilizzati nelle loro provette da 2 ml alla massima velocità in una centrifuga da banco per 2-5 minuti per assicurarsi che l'acido nucleico si trovi sul fondo della provetta.
   2. Preparare un master stock di 100 μM risospendendo gli oligonucleotidi nel tampone TE [10 mM di tris(idrossimetil)amminometano (Tris), 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)). Assicurarsi che gli oligonucleotidi siano completamente risospesi mediante vortice delicato ripetuto e breve centrifugazione a piena velocità.
   3. Preparare un materiale da 10 μM diluendo un'aliquota di stock master con tampone TE. Diluire il brodo da 10 μM con acqua ultrapura (acqua MQ) per preparare materiali di lavoro con concentrazioni di 0,5 μM, 0,7 μM o 2,5 μM come da Tabella 2.
2. Assemblaggio e ricottura delle miscele master di reazione
   1. Utilizzare le scorte di lavoro per la composizione delle miscele madri di reazione utilizzando le combinazioni fornite nella tabella 2 e i volumi indicati nella tabella 3. Per il test standard della DNA ligasi e la maggior parte degli altri test qui descritti, la composizione finale del tampone è 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM Ditiotreitolo (DTT) con 10 mM Mg come catione bivalente.
   2. Ricuocere gli oligonucleotidi in una provetta per PCR o microcentrifuga riscaldandoli a 95 °C per 5 minuti utilizzando un blocco riscaldante o un termociclatore. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente per 30 minuti (volumi <1 mL) a 1 h (volumi >1 mL). Per oligonucleotidi più lunghi (>40 nt), eseguire un raffreddamento più lento utilizzando un termociclatore con una rampa di discesa da 95 °C a 25 °C per 45 minuti, oppure far galleggiare il tubo contenente la miscela di ricottura in un becher da 1 litro di acqua bollente e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente per una notte.
   3. Aggiungere cofattori nucleotidici e altri componenti tampone sensibili al calore alla miscela master dopo il raffreddamento a temperatura ambiente. Utilizzare la miscela di reazione finale direttamente per il saggio mediante l'aggiunta di enzima (vedere la fase 3 di seguito) o conservare a -20 °C per un uso futuro.

3. Configurazione standard del saggio

1. Assemblaggio e avvio della reazione di saggio
   1. Combinare 22,5 μl della miscela master del substrato di interesse con 2,5 μl della DNA ligasi o di un altro enzima di interesse in una provetta per PCR. Esegui le reazioni in doppio o triplice copia, soprattutto se i risultati saranno quantitati.
   2. Includere un controllo senza proteine (solo tampone) nei campioni di analisi. A questo punto non includere controlli di cofattori, se necessario.
      NOTA: Gli enzimi possono essere conservati a -20 °C in glicerolo al 50% v/v, consentendo loro di essere pipettati direttamente dalla soluzione. Assicurarsi che le soluzioni enzimatiche con glicerolo siano ben miscelate prima dell'aggiunta, pipettando per miscelare o agitando delicatamente.
2. Trasferire immediatamente le reazioni in una macchina per PCR a 25 °C e incubare per 30 minuti. Variare la temperatura e la durata a seconda delle condizioni ottimali per l'attività enzimatica.
3. Estinguere le reazioni aggiungendo 5 μL di colorante di carico (95% di formammide, acido etilendiamminotetraacetico 0,5 M (EDTA), blu di bromofenolo) e incubare a 95 °C per 5 minuti.

4. Analisi dei risultati dei saggi

1. Preparare i gel Tris-Borato-EDTA (TBE)-Urea PAGE come descritto di seguito.
   1. Preparare una scorta di acrilammide al 20%, 7 M di urea e 1x soluzione di TBE. Per il set di oligonucleotidi qui descritto, utilizzare la soluzione di acrilammide/bis in un rapporto 29:1 per una risoluzione ottimale.
   2. Per un gel, combinare 10 mL di acrilammide al 20% e una soluzione di urea 7 M con 100 μL di APS (10%) e 3 μL di tetrametiletilendiammina (TMED) e gettare in una rotella di gel.
2. Dopo che il gel si è solidificato, eseguire i campioni sul gel di urea TBE a 45 - 55 °C.
   1. Pre-rotolare il gel in 1x tampone TBE per 30 minuti a 10 mA per gel con riscaldamento esterno.
   2. Rimuovere l'urea in eccesso nei pozzetti del gel sciacquando con 1x TBE utilizzando una pipetta da pascolo.
   3. Caricare 10 μL di ciascuna reazione e far funzionare a 10 mA per 1,0-1,5 ore con riscaldamento esterno.
3. Visualizza il gel sull'imager con le impostazioni corrette per il fluoroforo scelto. Per la FAM, utilizzare un set di filtri che fornisca eccitazione/emissione a 495/519 nm, che viene memorizzato come preimpostato nella maggior parte degli imager.
4. Quantificare l'intensità della banda del prodotto e del substrato utilizzando il software di elaborazione delle immagini con l'imager o un programma esterno come ImageJ^49,50 e calcolare la percentuale del prodotto utilizzando la formula
   
   Dove P è il valore integrato della banda del prodotto e S è l'area integrata della banda del substrato. Nel caso della reazione della DNA ligasi, la banda del prodotto funziona a 40 nucleotidi (nt) e la banda del substrato a 20 nt.

5. De-adenilazione della DNA ligasi per testare la specificità del cofattore

1. Preparazione di master mix di reazione
   1. Preparare una serie della miscela master contenente l'oligonucleotide NL1 marcato con FAM come descritto nella Tabella 4. Preparare un secondo set contenente l'oligonucleotide NL1 senza etichetta FAM, come descritto nella Tabella 4.
   2. Separatamente, riscaldare entrambi i duplex di DNA a 95 °C per 5 minuti e raffreddare per 30 minuti a 1 ora a 25 °C. Non aggiungere cofattore nucleotidico a nessuna delle due miscele master.
2. Assemblaggio e inizio della reazione di de-dedenilazione
   1. Preparare una singola reazione di de-dedenilazione per ogni tipo/concentrazione di cofattore da testare combinando 10 μl della miscela master non marcata con 2,5 μl di enzima ligasi.
   2. Preparare provette aggiuntive come controllo senza cofattori e senza controllo proteico (2,5 μL di tampone aggiunti al posto dell'enzima).
   3. Incubare le reazioni a una temperatura specifica per l'attività ottimale dell'enzima, per 1-2 ore. Il tempo di incubazione può essere aumentato se l'enzima è ancora adenilato.
3. Esegui la reazione di legatura con il cofattore.
   1. Aggiungere 10 μl della miscela master marcata e 2,5 μl dei cofattori nucleotidici desiderati (ad es. ATP, NAD, ADP o GTP) direttamente alla reazione dedeninilata (concentrazione finale di 0,1-1 mM).
   2. Aggiungere 2,5 μl di tampone di reazione al controllo del cofattore senza nucleotidi.
   3. Incubare le reazioni per lo stesso periodo di tempo e temperatura utilizzati in precedenza. Spegni e visualizza come descritto nel passaggio 4.

6. Utilizzo di substrati a doppia marcatura per la legatura splinted o l'assemblaggio in più parti

1. Progettare e acquistare un oligonucleotide con una porzione fluorescente che abbia uno spettro di eccitazione/emissione diverso dal fluoroforo già utilizzato.
   1. Nella configurazione qui descritta, utilizzare l'oligonucleotide NL2 (TAMRA) con 5-carbossitetrametilrodamina (TAMRA) all'estremità 3' (Tabella 1).
2. Assemblare la miscela master come descritto di seguito.
   1. Combinare i componenti della reazione descritti al punto 2, compresi i rapporti equimolari di tutti gli oligonucleotidi utilizzati nell'assemblaggio, nonché i cationi tampone e bivalenti.
   2. Ricottura mediante riscaldamento a 95 °C per 5 min e raffreddamento a 25 °C per 30 min - 1 h. Aggiungere il cofattore e l'enzima e incubare come descritto nel passaggio 3.
3. Eseguire e visualizzare i campioni come descritto al punto 4 utilizzando i canali appropriati per la coppia di fluorofori nel substrato. Nel caso di FAM e TAMRA, si tratta dei canali della fluoresceina (FITC) e della tetrametilrodamina (TRITC) presenti sulla maggior parte degli imager.

7. Valutazione del legame del DNA mediante Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) su gel nativo

1. Preparare un gel TBE PAGE nativo al 10% come descritto di seguito.
   1. Combinare 2,5 mL di acrilammide al 40%, 1 mL di 10x TBE, 100 μL di APS al 10%, 3 μL di TMED e 6,5 mL di acqua MQ e gettare in una rotella di gel.
2. Assemblare la reazione di legame come descritto di seguito.
   1. Assemblare il substrato EMSA secondo la Tabella 5 in modo che l'EDTA (10 mM) sia incluso e gli ioni metallici siano omessi.
   2. Combinare 20 μl della master mix del substrato EMSA con 5 μl di proteina in una provetta per PCR. Includere un campione di controllo senza proteine. Incubare per 30 minuti a 25 °C.
3. Analizza mediante elettroforesi nativa come descritto di seguito.
   1. Aggiungere ai campioni 5 μl di colorante da carica nativo 5x (100 mM EDTA, 0,25% blu bromofenolo, 25% v/v glicerolo e acqua MQ fino a 1 mL).
   2. Caricare sul gel preparato e far funzionare a 60 V per 2-3 ore con raffreddamento mediante circolazione dell'acqua fino a quando il fronte del colorante si trova alcuni cm sopra l'estremità del gel.
   3. Visualizza e analizza i gel come descritto nel passaggio 4.

Risultati

Legatura mediante DNA ligasi
L'attività enzimatica della DNA ligasi si tradurrà in un aumento delle dimensioni dell'oligonucleotide marcato in fluorescenza quando visualizzato su un gel di urea PAGE. Nel caso dei substrati per la legatura del DNA e dell'RNA elencati nella Tabella 2, ciò corrisponde a un raddoppio delle dimensioni da 20 nt a 40 nt (Figura 3A). L'attività enzimatica ottimale può essere determinata modificando condizioni come la temperatura, la concentrazione proteica o il tempo di incubazione (Figura 3B), i cofattori nucleotidici, i cofattori metallici (Figura 3C). Le attività relative di una ligasi su diversi substrati possono essere confrontate in parallelo (Figura 3D).

La quantificazione delle bande di prodotto e di substrato è espressa come percentuale del substrato totale legato e, come mostrato nella Figura 3, può essere utilizzata per valutare l'attività specifica dell'enzima o per determinare l'attività ottimale come la preferenza cationica bivalente, la temperatura o il pH.

La DNA ligasi batterica DV-1-1-Lig (Figura 3) è in grado di legare substrati di DNA intaccati e non corrispondenti e può utilizzare sia magnesio che manganese per l'attività di legatura, con una preferenza per il magnesio. Ulteriori dettagli su questo enzima sono forniti in⁵¹.

Estensione del primer mediante DNA polimerasi
L'attività della DNA polimerasi attraverso l'estensione del primer marcato in fluorescenza da 20 nt si tradurrà in un aumento delle dimensioni fino a 40 nt quando si utilizza il set di oligonucleotidi qui presentato (Figura 4A). I prodotti parzialmente estesi appariranno come una scala di prodotti fino alle dimensioni del modello (Figura 4B e Figura 4C). Il saggio di estensione del primer qui raffigurato (Figura 4C) ha portato alla sintesi completa del filamento di primer.

Degradazione da parte della nucleasi
L'attività della nucleasi si traduce in una riduzione delle dimensioni dell'oligonucleotide marcato in fluorescenza quando visualizzato su un gel di urea PAGE. Le nucleasi con attività endonucleasica specifica possono produrre un singolo prodotto di 20 nt (Figura 5A-C). Le nucleasi con attività esonucleasica daranno luogo a oligonucleotidi marcati in fluorescenza di dimensioni variabili (Figura 5D-F). Qui vengono mostrati i risultati di una proteina nucleasica batterica del metagenoma antartico, che mostra un'attività endonucleasica specifica sul substrato del sito abasico a doppio filamento e un'attività esonucleasica non specifica sul substrato a filamento singolo (Figura 5C e Figura 5F, rispettivamente).

Saggio di deadenilazione della ligasi e di utilizzo del cofattore nucleotidico
Molti enzimi ligasi espressi in modo ricombinante vengono purificati in uno stato già adenilato da ATP o NAD recuperato dal loro ospite 51,52,53,54,55. La rimozione di questo intermedio covalente di AMP è necessaria per un'identificazione accurata dell'intervallo dei cofattori nucleotidici che l'enzima può utilizzare per la legatura dei substrati degli acidi nucleici⁵¹. Il turnover dell'enzima adenilato ligasi con substrato non marcato in assenza di un cofattore nucleotidico esogeno esaurisce l'intermedio di adenilazione. Utilizzando substrati di DNA marcati in fluorescenza e aggiungendo il cofattore nucleotidico solo nella seconda fase, qualsiasi prodotto di legatura visibile quando si utilizza un canale fluorescente (Fluoresceina-FITC) sull'imager su gel è il risultato dell'adenilazione con il cofattore nucleotidico aggiunto in questa fase.

I saggi di attività messi a punto con una DNA ligasi batterica espressa in un sistema di E. coli mostrano che è stata purificata in una forma pre-adenilata e ha mostrato una capacità di fondo di legare il DNA intaccato senza alcun cofattore aggiuntivo (Figura 6Ai-ii). L'aggiunta di ATP all'adenilato ligasi aumenta la quantità di prodotto legato formatosi nella reazione, ma questo non è sempre affidabile in quanto questa attività basale potrebbe dare un'impressione errata dell'uso di cofattori ad ampio spettro o ulteriori aggiunte di cofattori nucleotidici a una reazione potrebbero inibire la legatura del substrato. Incubando prima la ligasi con una versione non marcata del substrato di DNA intaccato, l'AMP viene capovolto e non si osserva alcuna legatura sul substrato di intaccatura del DNA marcato a meno che non venga aggiunto ATP alla reazione. Il secondo saggio di attività (Figura 6B) mostra che la DNA ligasi dededenilata ha migliorato l'attività di legatura sul substrato di nick DNA con l'aggiunta di ATP e ADP. C'è anche un certo miglioramento nella legatura con l'aggiunta di GTP, che è maggiore della legatura di fondo osservata nel controllo senza cofattori. La legatura osservata nelle reazioni con NAD è paragonabile alla legatura osservata nelle reazioni di controllo senza cofattore, il che esclude il NAD come cofattore per la legatura.

Risultati del test a doppia marcatura
I fluorofori ortogonali possono essere utilizzati per stabilire l'attività in diverse parti di un substrato complesso. L'esempio in Figura 7 mostra l'attività di una DNA ligasi R2D⁵⁶ descritta di recente rispetto alla DNA ligasi T4 su un duplex DNA/RNA spleccato. La legatura dell'accettore di DNA alla sezione del substrato del donatore di RNA è stata rilevata utilizzando il 6-FAM, mentre la legatura dell'accettore di RNA a un donatore di DNA è stata rilevata con il 5-TAMRA (Figura 7A). L'estensione relativa della legatura del DNA a entrambe le estremità del substrato dell'RNA potrebbe essere valutata dalla presenza di una banda di prodotti con fluorescenza in entrambi i canali 6-FAM e 5-TAFRA, che appare in giallo nell'immagine composita, mentre i singoli 6-FAM e 5-TAMRA sono rispettivamente verdi e gialli (Figura 7B). Come dettagliato in una precedente pubblicazione⁵⁶, solo la R2D ligasi è stata in grado di legare il DNA all'estremità 5' dell'RNA, mentre entrambe le ligasi sono state in grado di legare il DNA all'estremità 3' dell'RNA. Quando si legano entrambe le molecole di DNA all'RNA in miscele a reazione singola, la R2D ligasi può legare gli oligo di DNA a entrambe le estremità dell'RNA, poiché una banda si sposta verso l'alto e si osserva un cambiamento di colore verso il giallo (Figura 7C).

Il secondo esempio nella Figura 8 utilizza un approccio di doppia marcatura per dimostrare la legatura di più oligonucleotidi a pH diversi. Il substrato, assemblato da una miscela di sette oligonucleotidi, è stato utilizzato per mostrare la capacità della ligasi R2D di assemblare frammenti corti. Il filamento 5' ha un filamento 14 nt marcato con fluoroforo FAM, mentre il filamento del complemento ha un fluoroforo TAMRA all'estremità 3' dell'oligonucleotide 16 nt. Il successo della legatura può essere visto da ulteriori bande più alte per l'oligo FAM (verde) e l'oligo TAMRA (rosso). La sovrapposizione di entrambi i fluorofori conferisce alla banda nucleotidica in giallo filamenti completamente legati della stessa dimensione.

Risultati del legame al DNA da un enzima DNA ligasi mediante EMSA
Il legame dell'enzima DNA ligasi a un DNA intaccato fosforilato si traduce in un complesso che funziona a un peso molecolare più elevato rispetto al solo oligonucleotide (Figura 9A). Qui, viene mostrato il legame di una DNA ligasi batterica ATP-dipendente al substrato di DNA intaccato. Ad alte concentrazioni proteiche, la maggior parte del substrato di DNA marcato è legato e visibile nelle bande di peso molecolare più elevate; a concentrazioni proteiche più basse, predomina il substrato libero del DNA (Figura 9B).

Figura 1: Schemi dei diversi substrati di acidi nucleici progettati per testare l'attività enzimatica della ligasi. Le stelle rappresentano la marcatura con la 6-carbossifluoresceina al terminale 5' (5' FAM). I filamenti marcati sono indicati da una linea nera o blu scuro/rosso (nel caso di duplex DNA/RNA), mentre le porzioni non marcate di duplex di substrato sono indicate da una linea grigia o azzurra/rossa (nel caso di duplex DNA/RNA). I filamenti etichettati sono di 20 nt e, se i filamenti sono legati, formano un prodotto di 40 nt. I siti fosforilati 5' sono indicati da una P in un cerchio. I filamenti di oligonucleotidi sono etichettati e i nomi sono citati nella Tabella 1 e nella Tabella 2. (A) Progettazione di substrati di DNA a doppio filamento con diversi tipi di rotture, utilizzati per testare l'attività enzimatica delle DNA ligasi. (B) Progettazione di substrati a doppio filamento di RNA e RNA/DNA che incorporano DNA e oligonucleotidi di RNA. I substrati contengono un singolo sito di intaccatura e vengono utilizzati per testare la capacità delle ligasi di sigillare le rotture di RNA/DNA duplex. La linea rossa rappresenta gli oligonucleotidi di RNA e le linee blu rappresentano gli oligonucleotidi di DNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Schemi dei diversi substrati di acidi nucleici progettati per testare l'attività enzimatica della nucleasi. Le stelle rappresentano la marcatura con la 6-carbossifluoresceina al terminale 5' (5' FAM). I filamenti etichettati sono indicati da una linea nera, mentre le porzioni non etichettate di duplex di substrato sono indicate da una linea grigia. I siti fosforilati 5' sono indicati da una P in un cerchio. I filamenti di oligonucleotidi sono etichettati e i nomi sono citati nella Tabella 1 e nella Tabella 2. (A) Progettazione di sottofondi con porzioni a doppio e singolo filamento. (B) Il design dei substrati di DNA a doppio filamento viene modificato per generare lembi a singolo filamento all'estremità 3' o 5' (Flapped 3', flapped 5' o Flapped both Estremità (swideed)). (C) Progettazione di substrati a doppio filamento che incorporano basi danneggiate o disallineamenti in una posizione centrale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Test dell'attività di legatura di una DNA ligasi batterica ATP-dipendente DV-1-1-Lig. (A) Schema dei saggi enzimatici per l'attività della ligasi su substrati di DNA con risultati analizzati su un gel PAGE di urea TBE. Le stelle rappresentano la marcatura con la 6-carbossifluoresceina al terminale 5' (5' FAM). I filamenti etichettati sono indicati da una linea nera, mentre le porzioni non etichettate di duplex del substrato che non sono visibili durante l'analisi sono indicate da linee grigie. (B) Quantificazione della legatura mediante DV-1-1-Lig su DNA intaccato in diversi punti temporali. L'attività contro ciascun substrato è stata svolta in duplicato. Le reazioni sono state incubate per diversi periodi di tempo (0,5 ore, 1 ora, 2 ore, 3 ore e 4 ore) a 25 °C, con una concentrazione proteica finale di 4 μM, una concentrazione finale di ATP di 1 mM e una concentrazione finale di ioni magnesio di 10 mM. (C) Legatura del substrato di DNA intaccato con magnesio (Mg) o manganese (Mn). Le reazioni sono state condotte per 3 ore, a 25 °C, con concentrazioni finali di ATP di 1 mM e concentrazioni finali di ioni metallici di 10 mM. (D) Risultati della legatura su diversi substrati di DNA. Le reazioni sono state effettuate per 8 ore, a 20 °C, con una concentrazione proteica finale di 2 μM, una concentrazione finale di ATP di 1 mM e una concentrazione finale di magnesio di 10 mM. L'aggiunta di proteine alla reazione è indicata da un simbolo più (+). Le reazioni di controllo sono indicate da C e l'assenza di proteine contenute è indicata da un simbolo meno (-). Il prodotto (40 nt) e il substrato (20 nt) sono indicati da frecce rosse. I risultati dei saggi di attività sono stati visualizzati utilizzando un sistema di imaging. Le bande sono state quantificate mediante l'integrazione dell'intensità utilizzando il software ImageJ⁴⁹ e i grafici sono stati generati utilizzando un software di grafica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Saggio della DNA polimerasi. (A) Schema del saggio di estensione del primer su un substrato di DNA. Le stelle rappresentano la marcatura con la 6-carbossifluoresceina al terminale 5' (5' FAM). I filamenti etichettati sono indicati da una linea nera, mentre le porzioni non etichettate di duplex del substrato che non sono visibili durante l'analisi sono indicate da linee grigie. (B) Schema di un atteso risultato del gel TBE Urea PAGE che mostra un aumento della lunghezza del primer marcato con l'aggiunta di nucleotidi. (C) Esempio di estensione del primer con l'enzima DNA polimerasi del frammento di E. coli Klenow. L'aggiunta di proteine alla reazione è indicata da un simbolo più (+). Corsia 1, 12,5 U; Corsia 2, 2,5 U; Corsia 3, 1.25U. Le reazioni di controllo sono indicate da una C e l'assenza di proteine contenute è indicata da un simbolo meno (-). Le reazioni sono state eseguite per 15 minuti a 25 °C e contenevano 5 mM di MgCl₂, 50 mM di Tris pH 8,0, 50 mM di NaCl₂, 1 mM di DTT e 0,25 mM di dNTP. Il prodotto (40 nt) e il substrato (20 nt) sono indicati da frecce rosse. I risultati dei saggi di attività sono stati visualizzati utilizzando un sistema di imaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Test dell'attività di una nucleasi batterica del metagenoma antartico utilizzando diversi substrati, metalli e temperature di incubazione. (A) Attività endonucleasica schematicamente specifica di una proteina nucleasica sul substrato abasico (indicato da una x). Le stelle rappresentano la marcatura con la 6-carbossifluoresceina al terminale 5' (5' FAM). Le linee nere rappresentano i filamenti etichettati e le linee grigie rappresentano i filamenti di DNA non etichettati. Il taglio specifico da parte della nucleasi è mostrato sul lato destro del sito abasico, ma può verificarsi anche sul lato sinistro. (B) Schema di un gel di urea denaturante che mostra il substrato non tagliato (40 nt) in assenza di proteina indicata da un simbolo meno (-) e il prodotto tagliato (20 nt), in presenza di una nucleasi indicata da un simbolo più (+). (C) Un esempio di un gel PAGE di urea TBE che mostra i risultati dell'attività specifica della nucleasi endonucleasica su un substrato di DNA a doppio filamento con un sito abasico. Il test è stato effettuato con una concentrazione proteica di 1,0 μM e 1 mM di MgCl₂. Sono state effettuate due reazioni di controllo a 20 °C, una senza proteine (pozzetto 1) e una senza metallo (pozzetto 2). Le reazioni sono state incubate per 5 ore a temperature crescenti da 1 °C a 50 °C, come indicato sopra l'immagine del gel. L'aggiunta della proteina è indicata da un simbolo più (+) e l'assenza della proteina è indicata da un simbolo meno (-). Il substrato e il prodotto sono indicati da frecce rosse. (D) Schema che mostra l'attività esonucleasica non specifica di una proteina nucleasi su un substrato a singolo filamento. Le stelle rappresentano la marcatura con la 6-carbossifluoresceina al terminale 5' (5'FAM). Le linee nere rappresentano i fili etichettati. Il taglio non specifico della nucleasi provoca filamenti marcati di lunghezza variabile (<39 nt). (E) Schema che rappresenta un gel di urea denaturante che mostra un substrato non tagliato (40 nt), dove non è stata aggiunta alcuna proteina (-), e che mostra un substrato tagliato di lunghezza variabile, dove la proteina è stata aggiunta (+) che può derivare dall'attività di un'esonucleasi non specifica. (F) I gel TBE urea PAGE mostrano un esempio di attività esonucleasica non specifica della stessa nucleasi del metagenoma antartico con un substrato a singolo filamento. Il saggio è stato effettuato a 20 °C per 4 ore con proteine a una concentrazione finale di 1,5 μM e una concentrazione finale dello ione metallico a 10 mM. Lo ione metallico utilizzato è indicato sopra l'immagine. L'aggiunta della proteina è indicata da un simbolo più (+) e l'assenza della proteina è indicata da un simbolo meno (-). Il substrato (40 nt) è indicato dalla freccia rossa e i prodotti di diverse lunghezze sono indicati dalla pinza rossa. I risultati di tutte le reazioni nucleasali sono stati visualizzati utilizzando un sistema di imaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Risultati della legatura di un substrato di DNA intaccato da versioni adenilate e de-adenilate di una DNA ligasi batterica. (A) i) Quantificazione della legatura da parte dell'enzima adenilato e de-adenilato ligasi, con e senza ATP. I punti sul grafico rappresentano le medie di ogni replica di reazione. Sono incluse le barre di errore standard. ii) TBE urea PAGE gel che mostra i risultati della legatura sul substrato del nick DNA da parte dell'enzima ligasi adenilato e de-adenilato, con e senza ATP. Le reazioni sono state eseguite in triplicato. L'enzima de-adenilato è stato pre-incubato per 2 ore a 25 °C con substrato di nick DNA non marcato ed enzima 0,1 μM, seguito da un'incubazione di 1 ora con substrato di nick DNA marcato. L'enzima adenilato non è stato pre-incubato con il substrato non marcato. L'ATP (1 mM) è stato aggiunto alle reazioni insieme all'aggiunta di substrato di DNA marcato. (B) i) Quantificazione della legatura da parte della de-adenilata ligasi su nick DNA con diversi cofattori (ATP, NAD, ADP e GTP). I punti sul grafico rappresentano le medie di ciascuna concentrazione. Le barre di errore di deviazione standard sono incluse. ii) PAGINA TBE urea che mostra i risultati della legatura da parte della ligasi, con e senza l'aggiunta di diversi cofattori. L'attività contro ciascun substrato è stata svolta in duplicato. Le reazioni sono state pre-incubate per 2 ore a 25 °C con substrato di DNA intaccato non marcato, 4 μM di proteina e 5 mM di ione magnesio, seguite da un'incubazione di 4 ore con l'aggiunta di substrato di DNA intaccato marcato, 5 mM di magnesio e diversi cofattori alla concentrazione finale di 1 mM. L'aggiunta di proteine alla reazione è indicata da un simbolo più (+). Sono state utilizzate reazioni di controllo che non contenevano proteine (controlli, C) o cofattori (nessun cofattore). Il prodotto (40 nt) e il substrato (20 nt) sono indicati da frecce rosse. I risultati dei saggi di attività sono stati visualizzati utilizzando un sistema di imaging. Le bande sono state quantificate mediante l'integrazione dell'intensità utilizzando il software ImageJ⁴⁹. I grafici sono stati generati utilizzando un software di grafica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Legatura di brevi oligonucleotidi di DNA marcati con fluorescenza alle due estremità di un oligo di RNA fosforilato 5', posizionato mediante modelli di DNA. (A) Schema della legatura del DNA-RNA con splintaggio di DNA che mostra come i possibili prodotti di legatura possono essere visualizzati utilizzando una strategia di doppia marcatura. (B) Schema dei possibili prodotti che si prevede di vedere su un gel Urea-PAGE ripreso in due canali. (C) Risultati sperimentali della doppia legatura fluoroforica. Le reazioni di legatura sono state testate utilizzando la DNA ligasi T4 e la ligasi R2D, sia in reazioni isolate in cui il DNA è stato legato all'estremità 5' (corsia 2-4) o all'estremità 3' (corsia 5-7) dell'RNA, sia in una singola reazione in cui entrambi gli oligonucleotidi del DNA sono stati legati nella stessa miscela di reazione (corsia 8-10). Nessun controllo proteico (NPC) non aveva enzimi aggiunti. Le condizioni di reazione e gli oligonucleotidi specifici utilizzati in questo esempio sono gli stessi indicati in⁵⁶. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Legatura di più segmenti corti di oligonucleotidi con tre varianti R2D a pH diverso. (A) Schema della strategia di legatura in più parti. (B) Gel rappresentativo che mostra la dipendenza dal pH di un assemblaggio in più parti, ripreso con canali FAM e TAFRA. Corsia C senza controllo enzimatico, corsie 1-3 pH 6,0, corsia 4-6 pH 6,5, corsia 7-9 pH 7 e corsia 10-12 pH 7,5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Risultati dell'EMSA. Gel TBE PAGE schematico e nativo di un saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) che visualizza l'attività di legame di una DNA ligasi ATP-dipendente (proveniente dai dati del metagenoma delle Dry Valleys di^McCmurdo, Antartide) su un substrato di DNA. (A) Schema dell'attività di legame di EMSA/DNA da parte di una DNA ligasi su substrato di nick DNA. I risultati del legame sono visualizzati su un gel TBE PAGE non denaturante. I substrati del DNA legati all'enzima ligasi migrano più lentamente attraverso il gel, mentre i substrati privi di enzimi migrano più velocemente, determinando uno spostamento delle dimensioni della banda (caselle gialle) visualizzate sul gel. Poiché i substrati vengono visualizzati su un gel non denaturante, gli oligonucleotidi rimarranno ricotti, consentendo al filamento marcato con FAM (stella gialla) di essere presente sia su substrati liberi che legati. Un gradiente di concentrazione proteica può essere utilizzato per determinare la concentrazione proteica per un legame ottimale. (B) Visualizzazione di un EMSA su un gel nativo TBE PAGE, che mostra la capacità di legare una DNA ligasi ATP-dipendente a un substrato di DNA nick a diverse concentrazioni proteiche. L'enzima è stato incubato con substrato di DNA intaccato per 30 minuti a 25 °C, con una concentrazione finale di ATP di 1 mM e 40 mM di EDTA. Sono state utilizzate tre diverse concentrazioni proteiche (5,5 μM, 2,3 μM e 1,5 μM). Le reazioni sono state eseguite su un gel TBE nativo al 10 %, con colorante nativo di caricamento nelle reazioni. I campioni contenenti proteine sono stati esauriti in triplicati per diverse concentrazioni proteiche. Le corsie di controllo contengono substrato di DNA intaccato con 1 mM, ATP finale e EDTA ma nessuna proteina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Sequenze di oligonucleotidi del substrato di DNA utilizzate per costruire i substrati del saggio. I danni sono indicati in grassetto e sottolineati. Le posizioni di discrepanze e spazi vuoti nel duplex finale sono sottolineate. Abbreviazioni: 5' 6-carbossifluorescien (5' FAM), 8-Oxo-deossiguanosina (8OxodG), abasico tetroidrofurano (dSpacer). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Combinazioni di oligonucleotidi utilizzate per assemblare miscele master per diversi saggi enzimatici. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Messa a punto delle miscele master del saggio con un massimo di quattro oligonucleotidi. Vedere la Tabella 2 per le combinazioni di oligonucleotidi da utilizzare per i diversi substrati di analisi e il testo per i dettagli sulle condizioni di reazione. Come minimo, è necessario un oligonucleotide marcato: porzioni aggiuntive del duplex sono indicate da parentesi. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: Componenti per una master mix marcata e non marcata per la realizzazione di nick DNA duplex. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 5: Impostazione dei master mix EMSA per diverse combinazioni di duplex. Vedere la Tabella 3 per le combinazioni di oligonucleotidi da utilizzare per diversi substrati EMSA e il testo per i dettagli sulle condizioni di reazione. I substrati EMSA sono progettati utilizzando gli stessi oligonucleotidi utilizzati per i saggi di attività. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Passaggi critici nel protocollo
Progettazione e acquisto di oligonucleotidi: Quando si acquistano gli oligonucleotidi per la formazione di duplex, è essenziale considerare la progettazione della sequenza. Si consiglia di utilizzare uno strumento di analisi degli oligo per prevedere le proprietà della sequenza nucleotidica, come il contenuto di GC, la temperatura di fusione, la struttura secondaria e il potenziale di dimerizzazione, prima di ordinare⁵⁷.

Assemblaggio e ricottura di duplex di acidi nucleici: quando si preparano duplex RNA/RNA-DNA, è necessario prestare attenzione a prevenire la contaminazione da RNasi utilizzando reagenti e acqua privi di RNasi o aggiungendo un inibitore dell'RNAsi (a condizione che l'enzima in esame non sia esso stesso un RNAsi). L'attrezzatura, i guanti e lo spazio sul banco devono essere trattati con una soluzione di decontaminazione con RNasi prima di assemblare le miscele master per evitare la degradazione degli oligonucleotidi⁵⁸. Le scorte principali degli oligonucleotidi di RNA possono essere costituite in lotti più piccoli in caso di contaminazione.

Le DNA ligasi richiedono sempre un cofattore nucleotidico, ATP o NAD, a una concentrazione finale compresa tra 0,1 e 1 mM. Le DNA polimerasi richiedono dNTP per la sintesi dei filamenti, e questi vengono solitamente aggiunti in rapporti equimolari a 50 μM di ciascuno. Quando si preparano le miscele master per duplex di ligasi e polimerasi, i cofattori nucleotidici, come ATP, NAD e dNTP, devono essere aggiunti alla miscela master dopo che la miscela è stata riscaldata e raffreddata a temperatura ambiente, poiché sono sensibili al calore.

Il tampone 10x per la ricottura degli oligonucleotidi richiede l'aggiunta di DTT, che ha un'emivita breve e idealmente deve essere preparato fresco o congelato prima dell'uso. Aliquote più piccole del tampone 10x possono essere preparate in anticipo e conservate a 4 °C, con l'aggiunta di DTT prima dell'uso.

Le bobine di oligonucleotidi e le miscele master devono essere conservate a -20 °C per un uso a lungo termine e gli oligonucleotidi o le miscele marcati in fluorescenza devono essere avvolti in un foglio di alluminio per prevenire il fotosbiancamento del fluoroforo. Per evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo che possono compromettere l'integrità dell'oligonucleotide, si consiglia di preparare e utilizzare volumi più piccoli (>1 mL).

Impostazione del test e analisi dei risultati: l'inclusione di controlli è essenziale per la corretta interpretazione dei risultati del test. Un controllo senza proteine (substrato di DNA con soluzione tampone) dovrebbe essere utilizzato per garantire che l'attività apparente sul substrato sia il risultato dell'enzima. Nel caso della nucleasi, la degradazione del substrato esogeno causerà bande di basso peso molecolare o laddering nel controllo, mentre nel caso della ligasi o della polimerasi, la denaturazione duplex incompleta risulterà in una banda ad alto peso molecolare nel controllo. Un controllo positivo delle dimensioni del prodotto previsto è fornito nella tabella 2 e dovrebbe essere incluso per verificare la corretta dimensione del prodotto.

I parametri importanti per il successo dell'elettroforesi del prodotto del saggio sono stati descritti in un precedente protocollo⁵⁹. Questi includono la garanzia che la percentuale di acrilammide sia appropriata per le dimensioni del substrato e l'uso di un colorante di caricamento appropriato a seconda delle dimensioni del substrato e del tipo di gel richiesto per la visualizzazione dei risultati. Il colorante tracciante blu bromofenolo ha una dimensione approssimativa di un oligonucleotide a 10 basi ed è quindi adatto per il set di oligonucleotidi qui descritto; Tuttavia, se c'è una banda di colorante che si sovrappone al prodotto fluorescente o alle bande del substrato quando si utilizzano nucleotidi più corti, il colorante tracciante può essere sostituito con xilene cianolo, che scorre più lentamente⁶⁰.

Per garantire una buona risoluzione delle bande di substrato/prodotto, il serbatoio del gel deve essere riscaldato esternamente utilizzando un bagno d'acqua o facendo funzionare un volume elevatotage (ad es. 180 V). Pre-eseguire i gel di urea PAGE per almeno 30 minuti e lavare i pozzetti con una pipetta per rimuovere l'urea in eccesso è essenziale per ottenere bande nitide e diritte adatte alla quantificazione.

Per la quantificazione di substrati e prodotti, un intervallo compreso tra il 20% e l'80% del materiale totale deve essere convertito in prodotto per consentire un'integrazione accurata delle bande di gel fluorescenti. Se si analizza un nuovo enzima, si consiglia di eseguire un gradiente di concentrazioni proteiche per consentire di effettuare misurazioni successive in questo intervallo. Molti imager a fluorescenza sono dotati di funzioni integrate di integrazione della banda che possono essere utilizzate a questo scopo. Se si utilizza un programma esterno come ImageJ⁴⁹, assicurarsi che l'immagine del gel venga esportata in alta qualità in formato tiff.

Modifiche e risoluzione dei problemi della tecnica
Progettazione e acquisto di oligonucleotidi: Gli oligonucleotidi forniti in questo protocollo sono utili punti di partenza e possono essere ampliati, come suggerito nella sezione metodi, alterando le sequenze di oligonucleotidi e incorporando modifiche.

Impostazione standard del saggio e analisi dei risultati: gli esperimenti pilota sono essenziali quando si testa l'attività di un nuovo enzima poiché le condizioni di reazione ottimali variano tra le diverse proteine; I parametri indicati nel presente protocollo sono da intendersi solo come punto di partenza. Fattori quali la concentrazione dell'enzima, la temperatura di reazione, la durata dell'incubazione, il cofattore e la composizione del tampone/pH possono essere variati durante la master mix e l'assemblaggio della reazione del saggio. Le concentrazioni di cofattori sono particolarmente importanti in quanto un eccesso di cofattori nucleotidici o ioni metallici può essere inibitorio ed è consigliabile testare un intervallo di concentrazioni di ciascuno. Per le DNA polimerasi, le concentrazioni raccomandate di dNTP variano da 20 a 200 μM totali, tuttavia, alte concentrazioni di dNTP diminuiscono la fedeltà⁶¹. Allo stesso modo, le ligasi polinucleotidiche sono tipicamente analizzate con un cofattore nucleotidico 0,1-1,0 mM, ma concentrazioni eccessive causano l'adenilato del DNA accumulato e l'inibizione della reazione⁶².

Il protocollo standard qui utilizza Mg come catione bivalente; tuttavia, alcuni enzimi sono più attivi con il manganese (Mn) o lo zinco (Zn). Le miscele master contenenti Mn o Zn devono essere preparate con un tampone a pH più basso (<7,5) e i metalli devono essere aggiunti dopo il riscaldamento. Le miscele master devono essere utilizzate lo stesso giorno per evitare precipitazioni e inibizione dell'attività enzimatica.

Gli additivi, inclusi gli agenti di affollamento come il polietilenglicole (PEG) o gli stabilizzanti come l'albumina sierica bovina, possono essere utilizzati per aumentare l'attività di alcuni enzimi^63,64. Questi dovrebbero essere aggiunti dopo la fase di ricottura a causa della loro termolabilità. Tutti i reagenti di origine biologica devono essere di grado di biologia molecolare per evitare l'introduzione di nucleasi contaminanti.

Il volume del tampone di quench della formammide utilizzato in questo protocollo è adatto per il set di base di oligonucleotidi. Tuttavia, per gli oligonucleotidi più lunghi, il volume della formammide deve essere aumentato tra 10 μl e 20 μl per garantire la completa separazione dei filamenti, e le reazioni quenched possono essere raffreddate a scatto su ghiaccio e conservate a 4 °C fino all'elettroforesi.

Con alcuni enzimi, lo stretto legame della proteina al substrato/prodotto può precludere la migrazione degli oligonucleotidi nel gel durante l'elettroforesi, specialmente quando l'enzima viene utilizzato ad alte concentrazioni. Ciò apparirà come una mancanza di bande prodotto/substrato sul gel e spesso un accumulo di materiale fluorescente (prodotto e/o substrato complessato con proteine) nei pozzetti. Per interrompere questi complessi, la miscela del saggio può essere trattata con proteinasi K prima dell'aggiunta del tampone di quench, oppure può essere aggiunto dodecil solfato di sodio (SDS) durante il quenching.

L'attività della DNA ligasi produce due bande discrete, che sono semplici da quantificare. È possibile utilizzare lo stesso metodo per quantificare l'attività dell'endonucleasi su substrato di danno al DNA dove è previsto un singolo prodotto a 20 nucleotidi o saggi EMSA dove gli stati legati/non legati sono chiaramente distinti. La quantificazione accurata dell'attività della polimerasi e della nucleasi processiva è difficile mediante l'integrazione in banda e, in generale, si raccomanda di utilizzare il saggio in tempo reale con sonde o beacon, come descritto nell'introduzione.

De-adenilazione e specificità del cofattore della DNA ligasi: potrebbe essere necessaria una certa ottimizzazione di questo protocollo per rimuovere tutta l'attività di fondo, che verrà poi ripristinata dall'aggiunta del/i cofattore/i nucleotidico/i. Se l'attività di fondo della ligasi persiste dopo la de-adenilazione (vista come legatura nel controllo senza cofattori), il tempo di incubazione della fase di de-dedenilazione può essere aumentato o la concentrazione di ligasi diminuita. Assicurarsi che il duplex del DNA senza etichetta sia più concentrato della proteina (> 4:1::substrate: proteina). Se l'aggiunta di un cofattore in presenza di DNA marcato non ripristina la legatura per nessuno dei cofattori testati, è possibile che l'enzima si sia denaturato e che la fase di de-dedenilazione debba essere abbreviata. Per una nuova ligasi o un nuovo lotto di enzima ricombinante, è utile determinare l'entità della legatura di fondo con l'enzima adenilato in assenza di ulteriori cofattori nucleotidici. Ciò comporta l'impostazione di un'altra reazione in cui vengono incubati contemporaneamente 10 μL di master mix non marcato, 10 μL di master mix marcato e 2,5 μL di un enzima fresco che non è stato dededenilato.

Utilizzare substrati a doppia etichettatura: Questo protocollo richiede la progettazione e l'acquisto di un oligonucleotide con una porzione fluorescente che ha uno spettro di eccitazione/emissione diverso da quello del fluoroforo originariamente utilizzato e quindi l'assemblaggio di questo in un duplex in modo che i due fluorofori ortogonali tagghino porzioni diverse del substrato. In caso di dubbio, sono disponibili un certo numero di visualizzatori spettrali online per il controllo degli spettri di eccitazione ed emissione, ad esempio FPbase Spectra Viewer e BD Spectrum Viewer, che possono essere utilizzati per verificare sia la compatibilità della coppia di fluorofori che le impostazioni dell'imager più appropriate. Le impostazioni specifiche utilizzate per la visualizzazione del gel dipenderanno dal modello dell'imager e dai fluorofori utilizzati. L'immagine composita registrerà il segnale da entrambi i canali sul singolo gel e la banda in cui entrambi i fluorofori sono attaccati allo stesso prodotto verrà visualizzata come un colore intermedio. Immagini separate dai singoli canali possono essere analizzate per quantificare l'entità della legatura o della degradazione su filamenti marcati in modo differenziale.

Limiti della tecnica
Sebbene lavorare con substrati marcati in fluorescenza abbia molti vantaggi, come bassi rischi per la salute, ci sono alcune limitazioni che si devono considerare quando si lavora con questi tipi di substrati etichettati. Uno di questi è il costo relativamente elevato dell'ordinazione di questi oligonucleotidi con marcature fluorofore o modifiche, come l'aggiunta di basi danneggiate, rispetto alla radiomarcatura interna. Un altro è che sono necessarie apparecchiature e software di imaging specializzati per il rilevamento dei trefoli etichettati. Tuttavia, queste caratteristiche sono ora incluse nella maggior parte dei nuovi sistemi di imaging su gel. Si dovrebbe anche considerare il potenziale dei fluorofori di alterare le proprietà di legame delle proteine di interazione bersaglio. La fluoresceina e il suo derivato FAM sono comunemente usati per marcare gli oligonucleotidi e sono sensibili alle variazioni di pH e di estinzione delle basi nucleotiche⁶⁵. Queste limitazioni devono essere attentamente considerate quando si decide il tipo e il posizionamento dei fluorofori sull'oligonucleotide per la progettazione duplex.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di acrilammide/bis al 30% (29:1)	BioRad	1610156
Adenosina trifosfato (ATP)	Molti fornitori
Persolfato di ammonio (APS)	Molti fornitori
Centrifuga da banco	Molti fornitori
Borato	Molti fornitori
di bromofenolo	Molti fornitori
Ditiotreitolo (DTT)	Molti fornitori
Sistema di elettroforesi con bagno d'acqua circolante	Molti fornitori
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Molti fornitori
Imager a fluoresnenza, ad es. iBright FL1000	Thermo Fisher Scientific	A32752
Formamide	Molti fornitori
Sistema di colata di gel	Molti fornitori
Blocco riscaldante	Molti fornitori
Cloruro di magnesio	Molti fornitori		Altri ioni metallici possono essere preferiti a seconda della proteina studiata
Provette per microcentrifuga (1,5 mL)	Molti fornitori
Micropipette e punte	Molti fornitori		1 mL, 0,2 mL, 0,02 mL, 0,002 mL
Nicotinamide adenina dinucleotide (NAD+)	Molti fornitori
Oligonucleotidi	Integrated DNA Technologies	NA	Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript e altri forniscono anche queste
pipette per pascoli	Molti fornitori
PCR thermocycler	Molti fornitori
Provette PCR	Molti fornitori
RNAse away	ThermoFisher	7002PK	Necessario solo quando si lavora con gli oligo di
RNA RNasi AWAY	Merck	83931-250ML	Tensioattivo per la rimozione dell'RNAsi contaminazione sulle superfici
acqua priva di RNAsi	New England Biolabs	B1500L	Necessario solo quando si lavora con oligo di RNA
Cloruro di sodio	Molti fornitori
SUPERasi IN Inibitore della RNasi	Thermo Fisher Scientific	AM2694	Inibitore dell'RNAsi ad ampio spettro (a base di proteine)
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	Questo può essere utilizzato per post-colorazione di gel e visualizzare oligonucleotidi non marcati
Tetrametiletilendiammina (TMED)	Molti fornitori
Tris, o tris(idrossimetil)amminometano	Molti fornitori
Acqua ultrapura (Milli-Q)	Merck
urea	Molti fornitori
Vortex	Molti fornitori