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Articolo metodologico

Estrazione di RNA in provetta singola su un singolo animale per il confronto dei livelli relativi di trascrizione tramite qRT-PCR nell'esemplare di Tardibius expsibius

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DOI:

10.3791/66935

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3 gennaio 2025

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara, 2Neuroscience Research Institute, University of California, Santa Barbara

In questo articolo

Sommario

Questo lavoro presenta un metodo di estrazione rapida dell'RNA e di confronto del livello di trascrizione per analizzare l'espressione genica nel tardigrado Hypsibius exemplaris. Utilizzando la lisi fisica, questo metodo ad alto rendimento richiede un singolo tardigrado come materiale di partenza e si traduce in una robusta produzione di cDNA per la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR).

Abstract

Il tardigrado Hypsibius exemplaris è un organismo modello emergente rinomato per la sua capacità di sopravvivere a condizioni ambientali estreme. Per esplorare i meccanismi molecolari e le basi genetiche di tale estrema tolleranza, molti studi si basano sul sequenziamento dell'RNA (RNA-seq), che può essere eseguito su popolazioni che vanno da grandi coorti a singoli animali. La reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR) e l'interferenza dell'RNA (RNAi) vengono successivamente utilizzate rispettivamente per confermare i risultati dell'RNA-seq e valutare i requisiti genetici per i geni candidati. Tali studi richiedono un metodo efficiente, accurato e conveniente per l'estrazione dell'RNA e la misurazione dei livelli relativi di trascrizione mediante RT-PCR quantitativa (qRT-PCR). Questo lavoro presenta un efficiente metodo di estrazione dell'RNA a singolo tardigrado e a provetta singola (STST) che non solo isola in modo affidabile l'RNA dai singoli tardigradi, ma riduce anche il tempo e i costi necessari per ogni estrazione. Questo metodo di estrazione dell'RNA produce quantità di cDNA che possono essere utilizzate per amplificare e rilevare più trascritti mediante PCR quantitativa (qRT-PCR). Il metodo è validato analizzando i cambiamenti dinamici nell'espressione di geni che codificano per due proteine regolate dallo shock termico, la proteina da shock termico 70 β2 (HSP70 β2) e la proteina da shock termico 90α (HSP90α), rendendo possibile valutare i loro livelli di espressione relativa in individui esposti al calore utilizzando la qRT-PCR. STST integra efficacemente i metodi esistenti di estrazione dell'RNA di massa e singolo tardigrado, consentendo un esame rapido ed economico dei livelli trascrizionali individuali di tardigrado mediante qRT-PCR.

Introduzione

I tardigradi sono piccoli animali multicellulari rinomati per la loro capacità di sopravvivere a condizioni estreme che sono letali per la maggior parte delle altre formedi vita. Ad esempio, questi animali possono sopravvivere quasi 1000 volte la dose di radiazioni ionizzanti che è letale per l'uomo 2,3,4,5,6,7,8,9,10, essiccazione quasi completa 11,12,13,14,15, congelamento in assenza di aggiunta crioprotettori 16,17,18 e, nel loro stato essiccato, anche il vuoto dello spazio19,20. Grazie alla loro capacità unica di sopravvivere in ambienti estremi, questi animali sono diventati modelli fondamentali per comprendere l'estrema tolleranza in organismi complessi e multicellulari 1,21,22,23.

La manipolazione genetica stabile di questi straordinari animali, compresa la transgenesi e la modificazione genica germinale, è rimasta sfuggente fino a poco tempo fa24,25. Pertanto, la maggior parte degli esperimenti per rivelare i meccanismi molecolari dell'estremotolleranza vengono eseguiti attraverso la profilazione trascrizionale tramite sequenziamento dell'RNA. Esistono molti set di dati utili e informativi per il sequenziamento dell'RNA per i tardigradi in varie condizioni estreme, che vanno dalla radiazione 8,9,26,27,28, allo stress da calore 29, allo stress da congelamento12 e all'essiccazione 27,30,31,32,33. Alcuni di questi studi hanno utilizzato metodi di estrazione e purificazione dell'RNA di massa per illuminare la nostra comprensione molecolare dell'estremotolleranza. Tuttavia, l'estrazione di massa di trascritti di RNA da molti animali impedisce l'analisi della variazione nell'espressione genica tra gli individui, perdendo così la potenziale ricchezza di set di dati più raffinati. È importante sottolineare che questi studi spesso analizzano popolazioni eterogenee di animali che includono sia animali che sopravvivono a fattori di stress ambientale sia quelli che non lo fanno. Pertanto, questi studi sono confusi dalla media dei dati di espressione provenienti da stati di risposta multipli e potenzialmente drammaticamente diversi. Per affrontare questo problema, Arakawa et al., 201634 hanno sviluppato un'elegante pipeline di RNA-seq a basso input che applica un kit di estrazione dell'RNA seguito da una fase di amplificazione PCR lineare utilizzando 34,35,36 o più animali 30,37,38 come input. Questi studi sono stati fondamentali per la nostra comprensione dell'estrematolleranza tardigrada22. È interessante notare che questo protocollo è stato applicato anche alla qRT-PCR utilizzando sette animali come materiale di partenza24.

Nella maggior parte degli organismi modello, dopo aver identificato potenziali bersagli tramite RNA-seq, la qRT-PCR viene quindi eseguita per confermare i cambiamenti trascrizionali identificati dall'RNA-seq e valutare il decorso temporale dell'espressione dei geni candidati in modo ad alta risoluzione. Per testare la funzione dei geni identificati, tali studi sono spesso seguiti da knockdown mediato da RNAi di bersagli molecolari39,40 e analisi della capacità extremotollerante12,41. L'efficacia di ciascun knockdown dell'RNAi è tipicamente confermata dalla qRT-PCR monitorando direttamente la diminuzione dell'abbondanza dei trascritti. Tuttavia, l'RNAi è un processo ad alta intensità di lavoro nei tardigradi poiché ogni dsRNA deve essere somministrato tramite microiniezione manuale di individui39,40. A causa della natura a basso rendimento di questa strategia, un metodo di estrazione dell'RNA rapido e a basso costo adattato per la qRT-PCR da singoli animali sarebbe molto prezioso per la ricerca sui tardigradi. Sebbene siano stati sviluppati metodi precedenti per estrarre l'RNA da singoli tardigradi, questi protocolli non hanno combinato la loro estrazione con la qRT-PCR, basandosi invece su metodi basati sulla densità ottica 12,40,41. Motivati da queste sfide, abbiamo cercato di sviluppare un protocollo che produca in modo affidabile RNA in quantità e qualità che possa essere utilizzato per la qRT-PCR da un singolo H. exemplaris.

Adattato da un protocollo di estrazione dell'RNA di un singolo animale sviluppato per Caenorhabditis elegans42, STST è ottimizzato per H. exemplaris. Il metodo di estrazione consiste in sei rapide fasi di congelamento-scongelamento, che interrompono fisicamente la cuticola, consentendo l'estrazione dell'RNA e la successiva sintesi del cDNA. Il metodo STST riduce il tempo di estrazione di oltre 24 volte rispetto ai metodi di estrazione dell'RNA di massa, come descritto da Boothby, 201843, e del 30% rispetto ai kit di estrazione di RNA tardigrado singolo, come descritto da Arakawa et al., 201634. Inoltre, il numero di interazioni campione-sperimentatore è diminuito da 5 a solo 1 rispetto alle preparazioni del kit di estrazione dell'RNA, riducendo così il rischio di contaminazione da ribonucleasi esogene. Quando si interrogano geni altamente espressi, il metodo STST produce cDNA sufficiente per 25 reazioni quantitative di RT-PCR per singolo tardigrado, richiedendo solo 1 μL del volume totale di cDNA di 25 μL per reazione. Tuttavia, le concentrazioni del modello devono essere determinate empiricamente per i trascritti di abbondanza inferiore.

L'efficacia del metodo STST per l'analisi dei cambiamenti dinamici nell'espressione genica è stata valutata studiando l'espressione differenziale dei geni che codificano per la proteina da shock termico-90α (HSP90α) e la proteina da shock termico 70β2 (HSP70β2) in risposta a uno shock termico a breve termine a 35°C per 20 minuti. Sia HSP70β2 che HSP90α nella maggior parte degli organismi eucariotici sono rapidamente sovraregolati dopo un'esposizione a breve termine allo shock termico (20 min)42. L'analisi in H. exemplaris ha rivelato che sia gli RNA codificanti HSP70β2 che HSP90α estratti da singoli tardigradi trattati termicamente hanno mostrato aumenti statisticamente significativi dell'espressione in seguito a breve esposizione al calore. Questi risultati dimostrano che il protocollo STST può essere utilizzato per analizzare i cambiamenti dinamici nell'espressione genica nei singoli animali nel tempo.

Il metodo di estrazione STST dovrebbe integrare i metodi sperimentali esistenti come l'RNA-seq, facilitando l'estrazione rapida ed economica dell'RNA e il successivo confronto dei livelli di trascrizione mediante qRT-PCR. Questo metodo sarà utile anche per valutare l'efficienza e la penetranza dell'RNAi in individui iniettati manualmente in modo più quantitativo rispetto alla sola densità ottica. Infine, a causa delle loro strutture cuticolari e caratteristiche fisiche simili, è probabile che questo metodo sarà efficace anche per analizzare l'espressione genica in altre specie di tardigradi44.

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Protocollo

figure-protocol-1
Figura 1: Tubazione a tubo singolo per l'estrazione dell'RNA da un singolo tardigrado. (A) Schema che mostra il protocollo per l'estrazione dell'RNA da un singolo tardigrado, inclusi sei cicli di congelamento-disgelo e successiva sintesi del cDNA. I campioni possono essere successivamente utilizzati per la RT-PCR e la qRT-PCR. (B) Immagine del cono della micropipetta utilizzato per la rimozione dell'acqua. Barra della scala: 2 mm. (C) Immagine in campo chiaro di un tardigrado in un piccolo volume d'acqua (linea tratteggiata). La rimozione della maggior parte dell'acqua, nella misura indicata, è necessaria per il successo dell'estrazione e impedisce la diluizione del tampone di lisi. Barra di scala: 50 μm. (D) Immagine che mostra l'immersione dei campioni in azoto liquido utilizzando una lunga pinza per congelare e scongelare rapidamente i campioni in modo sicuro. Alcuni dei contenuti sono stati creati in BioRender. Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511 Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOTA: La Figura 1A mostra uno schema della procedura. Per le procedure dettagliate di coltivazione di tardigradi e alghe, fare riferimento ai rapporti precedentemente pubblicati 45,46,47.

1. Sterilizzazione dell'acqua di sorgente

  1. Versare 2 L di acqua di sorgente da una brocca d'acqua da 5 galloni (vedere la Tabella dei materiali per le specifiche) in una bottiglia di vetro da 2 L adatta all'autoclave.
  2. Posizionare il tappo sulla bottiglia sicura per autoclave e sigillare con una piccola quantità di nastro adesivo per autoclave. Non stringere la bottiglia; Posizionare il tappo sopra.
  3. Autoclavare l'acqua di sorgente per 50 minuti con ciclo umido senza fase di essiccazione.
  4. Lasciare che l'acqua raggiunga la temperatura ambiente (RT) e sigillare saldamente il tappo prima di riporlo a RT.

2. Estrazione di micropipette in vetro (con un estrattore per pipette)

  1. Fissare una micropipetta di vetro (diametro esterno: 1 mm, diametro interno: 0,58 mm, lunghezza: 10 cm) su un estrattore per micropipette. Evitare il contatto con il filamento riscaldante, in quanto ciò altererebbe la forma della pipetta e danneggerebbe il filamento.
    1. Determinare empiricamente l'estrazione della pipetta per ogni filamento ed estrattore di pipette. Tuttavia, per fungere da punto di partenza per l'ottimizzazione, utilizzare 78 °C e un singolo passo di trazione del peso di trazione di 182,2 g.
  2. Lasciare che il filamento si riscaldi e separare per gravità la micropipetta di vetro in due micropipette di vetro con punte acuminate (Figura 1B).
  3. Conservare queste micropipette di vetro estratte in una capsula di Petri chiusa da 100 mm con cera o argilla per tenerle in posizione ed evitare che le punte affilate si rompano.

3. Estrazione di micropipette in vetro (senza estrattore per pipette)

  1. Accendere un bruciatore Bunsen o un'altra fonte di fiamma controllata a bassa temperatura.
  2. Prendi una micropipetta di vetro con un'estremità in ogni mano.
  3. Tenere il centro della micropipetta di vetro sulla fiamma fino a quando il vetro inizia a sciogliersi. Quindi, separa rapidamente le due estremità. Questo creerà due punte affilate molto delicate.
  4. Rompere leggermente la punta con un paio di pinze fini sterili.
  5. Conservare queste micropipette di vetro estratte in una capsula di Petri chiusa da 100 mm con cera o argilla per tenerle in posizione ed evitare che le punte affilate si rompano.

4. Estrazione dell'RNA

  1. Ottenere 0,5 L di azoto liquido in un contenitore crio-sicuro.
    ATTENZIONE: L'azoto liquido è criogenico e può causare ustioni se esposto alla pelle o agli occhi. Durante la manipolazione, utilizzare indumenti protettivi, occhiali antispruzzo, guanti in nitrile, crio-guanti, camice da laboratorio e scarpe chiuse. Assicurarsi che il contenitore sia sicuro per l'azoto liquido prima di trasportare il liquido. Per questo passaggio potrebbe essere possibile anche utilizzare un bagno di ghiaccio secco all'etanolo.
  2. Preparare la master mix di sintesi del cDNA: una soluzione da 10 μL contenente 1 μL di primer per esamero casuale, 2 μL di DNasi, 4 μL di tampone RT 5x, 1 μL di miscela enzimatica, 1 μL di H2O e 1 μL di dNTP da 10 mM. Conservare questa soluzione in ghiaccio.
  3. Preparare il tampone di lisi tardigrado (5 mM Tris (pH = 8), 0,5% (v/v) Detergente 1, 0,5% (v/v) Detergente 2, 0,25 mM EDTA in acqua sterile priva di nucleasi).
    NOTA: Questa soluzione può essere conservata sul piano di lavoro per 6 mesi. Tuttavia, mantenere la sterilità ed evitare potenziali fonti di contaminazione dell'RNAsi.
  4. Aliquotare abbastanza tampone di lisi per le estrazioni (2 μL/tardigrado).
  5. Aggiungere l'inibitore dell'RNAsi alla soluzione tampone di lisi tardigrada a una concentrazione finale di 4 U/μL.
  6. Agitare e far girare la soluzione a RT su una centrifuga da banco ad una velocità di 2000 x g per 5 s prima di conservare la soluzione in ghiaccio.
  7. Rimuovere dalla coltura il numero di tardigradi necessario per l'esperimento utilizzando una pipetta P1000 sterile con punta filtrante e metterli in una capsula di Petri sterile da 35 mm.
    NOTA: In questo modo è possibile elaborare un numero qualsiasi di tardigradi. Di solito, tre tardigradi per condizione vengono elaborati per l'estrazione.
  8. Lavare i tardigradi tre volte, utilizzando 1 ml di acqua di sorgente sterile autoclavata e una pipetta P1000 sterile con filtro. Il pipettaggio lento su e giù aiuta a rimuovere i contaminanti algali.
  9. Utilizzando un microscopio da dissezione con un ingrandimento da 25x a 50x, trasferire un singolo tardigrado da questa coltura lavata a una nuova piastra di Petri sterile da 35 mm utilizzando una pipetta P10 sterile con filtro.
  10. Utilizzare una pipetta P200 sterile con filtro per lavare il singolo tardigrado in 100 μL di acqua sterile priva di nucleasi.
    NOTA: Questa fase di lavaggio viene utilizzata per rimuovere ulteriormente i contaminanti, comprese le ribonucleasi.
  11. Trasferire il tardigrado lavato sul fondo di una provetta PCR pulita e sterile in 1-2 μL di acqua sterile priva di nucleasi utilizzando una pipetta P10 sterile con filtro, assicurandosi che il tardigrado non si attacchi al lato della punta.
  12. Visualizza il tardigrado con un microscopio da dissezione a un ingrandimento di 25x.
  13. Per facilitare la rimozione dell'acqua dall'acqua, rompere leggermente la punta della micropipetta di vetro estratta all'esterno del tubo. Assicurati che il foro sia abbastanza grande da tirare su l'acqua ma non il tardigrado.
  14. Usando l'azione capillare di una micropipetta di vetro tirata, rimuovere l'acqua fino a quando l'animale non è circondato da una piccola bolla d'acqua di circa due lunghezze tardigrade di diametro.
  15. Monitorare il processo di rimozione dell'acqua tramite il cannocchiale da dissezione per assicurarsi che il livello dell'acqua sia appropriato e che il tardigrado rimanga idratato.
    NOTA: La Figura 1C offre un esempio della quantità di acqua da rimuovere. Questo è un passaggio fondamentale. Una piccola bolla d'acqua circonderà il tardigrado per evitare che si secchi, ma quanta più acqua in eccesso possibile dovrebbe essere rimossa per evitare la diluizione del tampone di lisi. Per un esempio dei livelli dell'acqua rimanenti, fare riferimento alla Figura 1C.
  16. Immediatamente dopo aver rimosso l'acqua, aggiungere 2 μL di tampone di lisi tardigrada sul fondo della provetta, agitare brevemente e centrifugare la provetta a RT per 5 s a 2000 x g su una centrifuga da tavolo.
  17. Posizionare immediatamente i campioni contenenti i tardigradi in un rack per provette PCR e assicurarsi che siano tenuti ben saldi dal rack.
  18. Afferrare il rack utilizzando un paio di pinze lunghe e grossolane e immergere delicatamente il rack contenente i campioni nell'azoto liquido fino a quando non è completamente congelato (Figura 1D).
  19. Togliete la griglia dall'azoto liquido e mettetela immediatamente sul ghiaccio. Lasciare scongelare il campione (richiede da ~45 s a 1 min). Monitorare il campione ogni 15 s rimuovendolo dal ghiaccio e ispezionandolo visibilmente. Una volta che il campione è visibilmente trasparente, passare al passaggio successivo.
  20. Ripetere i passaggi 4.18-4.19 altre cinque volte. Per la massima lisi ed estrazione sono necessari un totale di sei cicli di congelamento-scongelamento (Figura 2A, B).
  21. Una volta completato il congelamento-scongelamento, posizionare i campioni sul ghiaccio e procedere immediatamente alla fase successiva. Non congelare i campioni a questo punto per la conservazione, poiché ciò ridurrà l'RNA disponibile per la preparazione del cDNA.

5. Sintesi del cDNA

  1. Aggiungere 2 μL di master mix di sintesi di cDNA alla provetta PCR contenente lisato tardigrado. Muovere brevemente la provetta e farla girare a RT a 2000 x g per 5 s con una centrifuga da tavolo prima di riposizionare i campioni sul ghiaccio.
  2. Posizionare i campioni in un termociclatore e incubare a 25 °C per 10 minuti per ricuocere i primer, a 55 °C per 30 minuti per eseguire la trascrizione inversa e, infine, inattivare gli enzimi a 85 °C per 5 minuti.
  3. Dopo l'incubazione, posizionare immediatamente la provetta sul ghiaccio e diluire il campione fino a un volume totale di 25 μl aggiungendo 21 μl di acqua sterile priva di nucleasi. Per le trascrizioni con un numero di copie basso, modificare questa fase di diluizione come determinato empiricamente.

6. qPCR

  1. Determinare la temperatura di ricottura del set di primer utilizzando l'RNA totale preparato da quantità maggiori di tardigradi, ad esempio il metodo di estrazione di massa presentato in Boothby, 201843.
  2. Eseguire un gradiente di temperatura PCR per determinare la temperatura di ricottura ottimale prima di eseguire qRT-PCR (per tutte le impostazioni PCR utilizzate in questo protocollo, fare riferimento alla Tabella 1 e alla Tabella 2).
  3. Scongelare un tubo di colorante indicatore super mix con ghiaccio e isolare dalla luce. Posizionare una piastra qPCR a 96 pozzetti sul ghiaccio e posizionare 5 μL di super mix, 2 μL di acqua, 1 μL di ciascun primer (10 μM) e 1 μL di prodotto cDNA nel numero di pozzetti desiderati.
  4. Sigillare la piastra PCR con la piastra sigillante ed eseguire la qRT-PCR utilizzando una temperatura di ricottura appropriata per il set di primer (per tutte le impostazioni qRT-PCR utilizzate in questo documento, fare riferimento alla Tabella 3).

7. Quantificazione e interpretazione dei risultati

  1. Confrontare quantitativamente i risultati con uno o più geni di controllo, la cui espressione dovrebbe essere costante nelle condizioni imposte. Per questo studio è stato utilizzato il gene dell'actina.
  2. Ottenere e confrontare i valoriC t o la soglia del ciclo per ciascun pozzetto con i valori Ct delle reazioni geniche di controllo. Calcola la variazione di piega nell'espressione genica utilizzando la seguente equazione:
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
    NOTA: L'espressione genica del fold è tracciata per ogni trascritto e tardigrado come 2-(ΔΔCt)48.
  3. Per ottenere una stima approssimativa del numero di trascrizione dal valoret C, utilizzare la seguente equazione:
    figure-protocol-5
    Dove N è il numero di trascritti e 2 è l'efficienza presunta della PCR o l'aumento della fluorescenza per ciclo di PCR48.

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Risultati

Sviluppo e ottimizzazione dell'estrazione di RNA a singolo tardigrado
Adattando il protocollo di Ly et al., 201542 per l'estrazione dell'RNA nei tardigradi, il sistema STST è ottimizzato per massimizzare la quantità e la qualità del preparato (Figura 1A). La RT-PCR è stata eseguita per i trascritti di actina, quantificando la resa del trascritto amplificando una regione di 527 bp che copre gli esoni 1 e 2 (le sequenze per questi primer possono esse...

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Discussione

Questo studio presenta un metodo efficiente per l'estrazione di RNA per la qRT-PCR a singolo tardigrado. Il confronto diretto della metodologia STST con un singolo kit di estrazione dell'RNA tardigrado esistente ha rivelato che l'estrazione dell'RNA STST produce quantità >200 volte superiori di trascritti di RNA di actina, riduce il costo a meno di un dollaro per campione e riduce il tempo necessario per l'estrazione del 30%. Per applicare l'STST a una questione biologica rilevante, abbi...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non dover divulgare conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Vogliamo riconoscere la NIH Ruth Kirschstein Fellowship # 5F32AG081056-02 e la Errett Fisher Post-Doctoral Fellowship, che ha sostenuto la dottoressa Molly J. Kirk, la Crowe Family Fellowship, che ha sostenuto Chaoming Xu, e una borsa di studio del Senato accademico dell'Università della California, Santa Barbara, e le sovvenzioni NIH #R01GM143771 e #2R01HD081266, che hanno sostenuto questi sforzi di ricerca. Gli autori riconoscono anche l'uso del Laboratorio di Nanostrutture Biologiche all'interno del California NanoSystems Institute, supportato dall'Università della California, Santa Barbara, e dall'Università della California, Ufficio del Presidente.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10 µ L Puntali barriera Premium a basso legante, in rack, steriliGenesee Scientific23-401Indicati come pipetta P 10 sterile con punta filtrante  Punte
1000 µ L  Puntali per pipette di alta qualità, a basso binding, in rack, steriliGenesee Scientific23-165RSPipetta P 1000 sterile con punta a filtro. Punte
200 µ L  Puntali barriera premium a basso legame, in rack, steriliGenesee Scientific23-412indicati come pipetta P 200 sterile con punta filtrante  Punte
4 stelle dritto forte pinzetta a punta media Excelta 00-SA-DCIndicato come pinza lunga
Rack PCR a 96 pozzetti con coperchio assortito, 5 rack/unitàGenesee Scientific27-202AIndicato come rack PCR
Andwin Scientific  NASTRO AUTOCLAVE SENZA PIOMBO 3M 1"Thermo Fisher Scientific NC0802040indicato come nastro per autoclave 
Nastro per autoclaveThermo Fisher ScientificAB1170Indicato come PCR Plate Seals
Benchling V8BenchlingN/AIndicato come Benchling 
BioRadHard-Shell Piastra PCR a 96 pozzettiBioRad HSS9641Indicato come piastra PCR 
Camice da laboratorio BULWARK FR: Grainger 26CF64indicato come camice da laboratorio
C1000 Touch Bio-rad Thermocycler BioRad1851148indicato come termociclatore 
Termociclatore C1000 Touch Bio-rad con modulo ottico CFX BioRad1845097indicato come termociclatore qPCR 
Chloroccoccum hypnosporum.  Carolina152091indicata come Algae
Corning  Bottiglie riutilizzabili PYREX per la conservazione dei terreniThermo Fisher Scientific06-414-1EIndicato come 2 L Bottiglia di vetro autoclave
Daigger & Azienda Vortex-Genie 2 Miscelatore da laboratorio Thermo Fisher Scientific 3030Acome Vortexer 
Direct-zol Micro Prep Ricerca Zymo R2060Indicato come kit di estrazione dell'RNA 
Dumont 5 pinzette per biologiaStrumenti per la scienza fine 11254-20Denominato pinza fine
EDTA Fisher ScientificS311-500 Denominato EDTA 
Figi v 2.14.0/1.54f ImageJ,N/Aindicato come filamento FIJI/ImageJ
per pippette Puller Tritech ResearchPC-10Hindicato come filamento
Fisherbrand Economy Impact GogglesFisher Scientific19-181-501indicato come Splash Goggles 
Micropipetta in vetro D.E. 1mm ID 0,58, Lunghezza 10 cmTriTech ResearchGD-1 Indicato come micropipetta di vetro
Hypsibius exemplaris Z151 CeppoCarolina133960Indicato come Tardigrades o H. exemplaris
Azoto Liquido Dewar 1 LAgar Scientific AGB7475Indicato come contenitore crio-sicuro 
Kit di sintesi del cDNA Maxima H Minus First Strand Thermo Fisher ScientificK1651indicato come cDNA Synthesis Master Mix 
Estrattore per micropipette in vetro a doppio stadio Narishige Ricerca Tritech  PC-10Indicato come estrattore per micropipette 
Guanti in nitrileFisher Scientific17-000-314Indicati come guanti in nitrile 
PIASTRA DI PETRI, PS, 35/10 mm, CON SFATATIGrenier627102Indicato come piastra di Petri da 35 mm.
PIPETMAN P10, 1– 10 µ L, espulsore di metalloGilsonF144055Mindicato come P 10 pipetta
PIPETMAN P1000, 100– 1000 µ L, espulsore di metalloGilsonF144059Mindicato come P 1000 pipetta
PIPETMAN P200, 20– 200 µ L, Eiettore di metalloGilson F144058Mindicato come P 200 pipetta
libbra questa argilla da modellare a 4 colori Eccedenza scientifica americana 96517P001Indicato come argilla 
Prisma v10.0 GraphPadN/Ariferito a un prisma 
Provette per PCR da 0,2 mL senza RNAsi, 8 strisce con tappo.InvitrogenAM12230indicato come promega
inibitore della ribonucleasi della RNasinaprovettaN2111indicato come inibitore dell'RNAsi 
Acqua di sorgente Nestlé Pure Life44221229indicato come acqua di sorgente
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBIO RAD1725271indicato come Indicator Dye Super Mix 
Sistema stereo-microscopio con ottica e illuminazione TriTech ResearchSMT1indicato come microscopio da dissezione
Supertek Scientific  Tirrill BurnersThermo Fisher ScientificS09572Bindicato come Bunsen Burner 
Centrifuga da tavoloQualitron  DW-41-115-NEWIndicato come centrifuga da tavolo 
Tempshield  Cryo-GlovesFisher Scientific11-394-305indicato come Cryo Gloves 
Thermo Scientific  Piastre di Petri NuncThermo Fisher Scientific08-757-099Indicate come piastre di Petri da 100 mm 
Tris baseFisher ScientificT395-500 Indicato come Tris o Tris Base 
Triton X-100Fluka93443Indicato come Detersivo 1 
TWEEN 20Sigma aldrichP1379-500 Indicato come Detersivo 2
Acqua - Certificata PCR/RT-PCR, priva di nucleasiGrowcellsPCPW-0500denominata acqua sterile priva di nucleasi
indicato in sterile per PCR

Riferimenti

  1. Møbjerg, N., Neves, R. C. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol Part A Mol Integr Physiol. 254, 110890(2021).
  2. Jönsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. Int J Radiat Biol. 81 (9), 649-656 (2005).
  3. Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. Int J Radiat Biol. 82 (12), 843-848 (2006).
  4. Bruckbauer, S. T., Cox, M. M. Experimental evolution of extremophile resistance to ionizing radiation. Trends Genet. 37 (9), 830-845 (2021).
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