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Articolo metodologico

Un adattamento economico di un reattore a microonde commerciale per la sintesi di peptidi in fase solida

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DOI:

10.3791/66937

⸱

22 novembre 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Fairfield University

In questo articolo

Sommario

Viene presentato un apparecchio semplice, economico e innovativo per l'esecuzione di sintesi di peptidi in fase solida in un reattore a microonde commerciale.

Abstract

Viene presentato un apparato autocostruito per eseguire la sintesi di peptidi in fase solida (SPPS), assistita da irradiazione e riscaldamento a microonde. A differenza dei recipienti di reazione SPPS convenzionali, che drenano il solvente e i sottoprodotti attraverso una fritta situata sul fondo del recipiente, l'apparato presentato impiega un tubo di dispersione del gas sotto vuoto per rimuovere il solvente, i sottoprodotti e i reagenti in eccesso. Lo stesso tubo di dispersione del gas fornisce l'agitazione del gas azoto delle perle SPPS durante le fasi di reazione di accoppiamento e deprotezione. Il riscaldamento a microonde è utile per gli accoppiamenti SPPS di residui stericamente ostacolati, come l'acido alfa-aminoisobutirrico (Aib), un residuo di amminoacidi alfa,alfa-dialchilati. Questo apparecchio autocostruito è stato utilizzato per preparare, con metodi manuali Fmoc SPPS, peptidi eptamerici e ottamerici dominati dal residuo Aib, che è notoriamente difficile da accoppiare in condizioni standard di temperatura ambiente e reagenti. Inoltre, i tipici reattori SPPS a microonde commerciali sono dedicati esclusivamente alla sintesi SPPS, rendendoli inaccessibili agli utenti non SPPS. Al contrario, l'apparato presentato preserva la versatilità del reattore a microonde per l'accelerazione convenzionale delle reazioni chimiche a microonde, poiché l'apparato è banalmente rimosso dal reattore a microonde commerciale.

Introduzione

L'introduzione da parte di Merrifield della sintesi peptidica in fase solida SPPS negli anni '60 ha rivoluzionato le sintesi peptidiche e chimiche ed è stata giustamente premiata con un premio Nobel per la chimica 1,2. Nei decenni successivi, molti ricercatori hanno perfezionato le tecniche originali di Merrifield, portando a due alternative che dominano le pratiche SPPS: a base di fluorenilmetossicarbonile (FMOC) e a base di terz-butil ossicarbonile (BOC)3. La scissione finale del peptide dalla resina solida in FMOC richiede un cocktail contenente acido trifluoracetico, rispetto all'HF per le tecniche BOC, rendendo i metodi basati su FMOC la scelta preferita di molti laboratori.

I metodi SPPS all'avanguardia sono occasionalmente messi alla prova dalle sequenze desiderate. Negli ultimi anni, ci sono stati progressi che hanno superato alcune preoccupazioni idiosincratiche dell'aggregazione4, della formazione di dichetopiperazina5 e dei residui di amminoacidi N-metilati 6. Nel tentativo di ottimizzare la resa dell'accoppiamento, sono stati esplorati migliaia di reagenti e additivi di accoppiamento7. In particolare, l'attivazione dell'acido carbossilico tramite COMU 8,9 o fluoruri acidi 10,11,12, insieme ad additivi come l'ossima13 e l'idrossibenzotriazolo (HOBt), sono stati sviluppati per accoppiamenti particolarmente impegnativi come quelli che coinvolgono residui α,α-dialchilati.

Altri metodi non basati su reagenti sono stati impiegati per aumentare le rese per accoppiamenti difficili, tra cui tempi di reazione prolungati, "doppio accoppiamento" e riscaldamento, in particolare riscaldamento a microonde 14,15,16. In effetti, i sintetizzatori peptidici automatizzati disponibili in commercio che impiegano il riscaldamento a microonde sono tra le unità di maggior successo commerciale sul mercato in quanto accelerano le velocità di reazione, sembrano migliorare la purezza finale dei peptidi e ridurre al minimo lo spreco di solventi. Sfortunatamente, queste unità possono essere costose, costando in alcuni casi oltre $ 100.000.

Il nostro laboratorio è interessato alla preparazione di varianti di peptidi contenenti il residuo fortemente elicogenico dell'acido alfa-aminoisobutririco (Aib)17,18,19. A causa dell'ostacolo sterico derivante dalla dialchilazione del suo alfa-carbonio, l'Aib è notoriamente difficile da accoppiare. I metodi sopra menzionati (fluoruri acidi, riscaldamento a microonde20), così come l'intelligente chimica SPPS "dipeptide"21, sono stati utilizzati per adattare SPPS alle sfide di accoppiamento di Aib. La preparazione non resinosa dei dimeri Aib, migliorando al contempo la resa complessiva, richiede una chimica umida aggiuntiva e temperature elevate (50 °C)21. Inoltre, abbiamo evitato l'impiego di fluoruri acidi di Aib a causa della natura tossica degli agenti fluoruranti. Purtroppo, il nostro laboratorio non dispone di un sintetizzatore SPPS automatizzato dedicato basato su microonde, con recipienti di reazione dedicati per il necessario drenaggio dei sottoprodotti SPPS. Tuttavia, un recente rapporto del gruppo di Clayden che mostra un successo spettacolare nella preparazione di oligomeri basati su AIB utilizzando SPPS e irradiazione a microonde22 ci ha stimolato ad adattare l'unità a microonde CEM Discover SP del nostro laboratorio per le sintesi SPPS.

Per prima cosa abbiamo studiato l'accessorio disponibile in commercio di CEM per convertire il reattore a microonde in un'unità SPPS/microonde manuale23. A parte il costo, questo accessorio richiederebbe l'impegno della nostra unità a microonde per il solo SPPS manuale. Gli altri utenti del laboratorio non avrebbero più accesso alle eccellenti capacità dell'unità a microonde. Pertanto, nel nostro caso, l'implementazione dell'accessorio commerciale è stata ritenuta inaccettabile.

Invece, abbiamo assemblato, attraverso componenti relativamente economici, un apparato per eseguire SPPS assistita da microonde su scala millimolare. Il protocollo seguente descrive l'utilizzo di componenti semplici e relativamente economici per eseguire SPPS manuale assistito da microonde.

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Protocollo

1. Assemblare l'apparecchio (Figura 1)

NOTA: Tutti i componenti per il montaggio dell'apparecchio si trovano nella Tabella dei Materiali.

  1. Montare l'uscita del vuoto.
    1. Collegare 2" di tubo in teflon da 1/8" al lato destro del "Tee" (Figura 1, parte etichettata "1") in etilene tetrafluoroetilene (ETFE).
    2. Collegare il tubo in teflon da 1/8" a una valvola (Figura 1, parte etichettata "2") in ETFE.
    3. Collegare 100 cm di tubo in teflon all'altro lato della valvola (Figura 1, parte etichettata "2").
    4. Inserire questo tubo attraverso l'apertura da 1/8" di un tappo di gomma e utilizzare questo tappo per tappare un pallone di Erlenmeyer a braccio laterale (Figura 1A, parte etichettata "8") collegato al vuoto (pompa domestica o modesta).
  2. Montare l'ingresso dell'azoto gassoso.
    1. Collegare 2" di tubi in teflon da 1/8" al lato sinistro del "Tee" in ETFE (Figura 1, parte etichettata "1").
    2. Collegare il tubo in teflon da 1/8" a una valvola in ETFE (Figura 1, parte etichettata "3").
    3. Collegare 100 cm di tubo in teflon da 1/8" all'altro lato della valvola EFTE (Figura 1, parte etichettata "3").
    4. Infilare l'estremità più lontana del tubo in teflon da 1/8" attraverso un tappo di gomma e utilizzare questo tappo per collegarlo a un tubo tygon collegato a una bombola di azoto dotata di un regolatore (Figura 1A, parte etichettata "7").
    5. Con la valvola a spillo del regolatore chiusa, utilizzare la valvola a membrana del regolatore (Figura 1A, parte etichettata "7"). per raggiungere una pressione di 5-10 psi.
  3. Montare l'aspiratore/gorgogliatore.
    1. Collegare lo stelo del "Tee" (Figura 1, parte etichettata "1") a un tubo in teflon da 1/8" di lunghezza di 100 cm.
    2. Inserire questo tubo attraverso un micro-setto (Figura 1, parte etichettata "6") precedentemente forato con un ago.
    3. Inserire il tubo fino in fondo in un tubo di dispersione del gas. Utilizzare il micro-setto per formare una tenuta tra il tubo di dispersione del gas (Figura 1, parte etichettata "4") e il tubo in teflon.
    4. Inserire la provetta di dispersione del gas nel recipiente di reazione della provetta (Figura 1, parte etichettata "5")., e posizionare la provetta nel suo supporto (Raffigurato nella Figura 1B), che è esterno al reattore a microonde.
      NOTA: Durante le reazioni chimiche, la provetta verrà inserita nel reattore a microonde. Durante l'aggiunta di soluzioni di reazione e lavaggi con solvente, la provetta viene tenuta all'esterno del reattore a microonde.
  4. Collegare l'attenuatore del recipiente aperto al reattore a microonde. L'apparecchio dovrebbe ora essere pronto per l'uso.

2. Preparare i reagenti

  1. Preparare soluzioni di aminoacidi FMOC. Per una scala di 0,100 mmol, preparare 0,2 M FMOC-AA-OH in DMF. Ogni ciclo di accoppiamento utilizzerà 2,5 mL di soluzioni di amminoacidi.
  2. Preparare il reagente di accoppiamento diisopropilcarbodiimmide (DIC). Preparare 1,0 m DIC in DMF. Ogni accoppiamento utilizzerà 1,0 mL di soluzione DIC.
  3. Preparare la soluzione additiva Oxyma Pure. Preparare 0,5 M ossima in DMF. Ogni accoppiamento utilizzerà 1,0 mL di soluzione di ossima.
  4. Preparare la soluzione di deprotezione. Preparare una soluzione di morfolina/DMF al 20% v/v. Ogni ciclo di deprotezione richiede 7 mL di soluzione. Eseguire due esecuzioni di rimozione della protezione per ogni rimozione della protezione di fmoc.

3. Preparazione della resina peptidica

  1. Misurare la massa appropriata di resina SPPS Wang, 100-200 mesh, polistirene reticolato con divinilbenzene all'1% e posizionare la resina secca nel recipiente di reazione della provetta. Ad esempio, per una sintesi su scala di 0,100 mmol, una resina con un carico di 0,500 mmol g-1 richiederebbe 200 mg di resina.
  2. Aggiungere 3 mL di solvente DMF alla resina e gonfiare la resina a temperatura ambiente per 15 minuti. Per questa fase, assicurarsi che l'alimentazione dell'azoto gassoso sia "on/open" per l'agitazione e che la valvola del vuoto (Figura 1, etichettata "2") sia "off/closed". Utilizzare la valvola a spillo dell'alimentazione dell'azoto (Figura 1A, etichettata 7) per ottenere un leggero gorgogliamento all'interno della soluzione.
    NOTA: Questa impostazione dovrebbe essere appropriata per tutte le ulteriori agitazioni da parte dell'azoto gassoso.
  3. Dopo 15 minuti di rigonfiamento della resina, aspirare il solvente DMF sotto vuoto: chiudere la valvola N2 (Figura 1, etichettata "3"). Aprire la valvola per il vuoto (Figura 1, etichettata "2") e aspirare il solvente DMF. Quando il solvente è quasi rimosso, aprire la valvola N2 (Figura 1, etichettata "3").
  4. Ripetere i passaggi 3.2 e 3.3 2 volte per gonfiare completamente la resina.

4. Rimozione FMOC

NOTA: Le resine sono disponibili precaricate con una varietà di amminoacidi protetti da FMOC precaricati come residui C-terminali. Pertanto, la rimozione dell'FMOC è solitamente il primo passo dopo il rigonfiamento della resina.

  1. Con il recipiente di reazione in provetta esterno al reattore a microonde e la valvola del vuoto (Figura 1, etichettata "2") chiusa, aggiungere 7 mL di piperidina/DMF al 20% o morfolina/DMF al 20% direttamente nella provetta.
  2. Aprire la valvola dell'azoto (Figura 1, etichettata "3") per agitare le perline.
    NOTA: Le resine SPPS sono disponibili precaricate con il residuo C-terminale, protette da FMOC.
  3. Inserire la provetta contenente le perle nel reattore a microonde tramite l'attenuatore "a recipiente aperto" (Figura 1B, porta metallica del reattore).
  4. Riscaldare a 90 °C per 2 minuti utilizzando il microonde in modalità dinamica: impostare l'obiettivo di temperatura a 90 °C, potenza 50 W, tempo di mantenimento = 2.0 min (vedere il file supplementare 1 per un rapporto sulla deprotezione all'interno del microonde). Monitorare la temperatura tramite il sensore a infrarossi del microonde; Il microonde ridurrà la potenza per mantenere la temperatura di reazione.
  5. Rimuovere la provetta contenente le perle dal reattore a microonde.
  6. Aspirare la soluzione DMF e i sottoprodotti di reazione sotto vuoto: chiudere la valvola N2 (Figura 1, etichettata "3"). Aprire la valvola per il vuoto (Figura 1, etichettata "2"). Quando la soluzione è quasi rimossa, aprire la valvola N2 (Figura 1, etichettata "3").
  7. Chiudere la valvola del vuoto (Figura 1, etichettata "2"). Aggiungere 3 ml di DMF per risciacquare la provetta e la provetta di dispersione del gas.
  8. Aspirare il lavaggio con solvente DMF sotto vuoto: chiudere la valvola N2 (Figura 1, etichettata "3"). Aprire la valvola per il vuoto (Figura 1, etichettata "2"). Quando la soluzione è quasi rimossa, aprire la valvola N2 (Figura 1, etichettata "3").
  9. Ripetere i passaggi 4.7 e 4.8 due volte, per un totale di tre lavaggi con solvente DMF.
  10. Ripetere i passaggi di rimozione FMOC 4.1-4.9 per un totale di due passaggi successivi di deprotezione.

5. Accoppiamento di amminoacidi FMOC

  1. Posizionare il recipiente di reazione della provetta nel suo supporto esterno al reattore a microonde.
  2. Aggiungere manualmente 2,5 mL di amminoacido FMOC 0,2 M (eccesso molare 5x), 1,0 mL di soluzione di agente di accoppiamento DIC 1,0 M (eccesso molare 10x) e 1,0 mL di soluzione additiva ossima 0,5 M (eccesso molare 5x) alla resina nella provetta.
  3. Aprire la valvola dell'azoto (Figura 1, etichettata "3") per ottenere l'agitazione delle perle.
  4. Inserire la provetta contenente le perle nel reattore a microonde tramite l'attenuatore a recipiente aperto (Figura 1B, porta metallica del reattore). Riscaldare la soluzione a 100 °C per 10 minuti. Utilizzando il microonde in modalità dinamica, impostare l'obiettivo di temperatura a 100 °C, 60 W di potenza, tempo di mantenimento = 10.0 min (vedere Supplemental File 1 per un rapporto sull'accoppiamento all'interno del microonde). Monitorare la temperatura tramite il sensore a infrarossi del microonde; Il microonde ridurrà la potenza per mantenere la temperatura di reazione.
  5. Rimuovere la provetta contenente le perle dal reattore a microonde.
  6. Aspirare il solvente DMF e i sottoprodotti di reazione sotto vuoto: chiudere la valvola N2 (Figura 1, etichettata "3"). Aprire la valvola per il vuoto (Figura 1, etichettata "2"). Quando la soluzione è quasi rimossa, aprire la valvola N2 (Figura 1, etichettata "3").
  7. Chiudere la valvola del vuoto (Figura 1, etichettata "2"). Aggiungere 3 ml di DMF per risciacquare la provetta e la provetta di dispersione del gas.
  8. Aspirare il lavaggio con solvente DMF sotto vuoto: chiudere la valvola N2 (Figura 1, etichettata "3"). Aprire la valvola per il vuoto (Figura 1, etichettata "2"). Quando la soluzione è quasi rimossa, aprire la valvola N2 (Figura 1, etichettata "3").
  9. Ripetere i passaggi 5.7 e 5.8 2 volte per un totale di tre lavaggi con solvente DMF.

6. Ripetere i cicli peptidici SPPS

  1. Ripetere tutti i passaggi dei paragrafi 4 (Rimozione FMOC) e 5 (Accoppiamento degli amminoacidi FMOC) fino ad ottenere un peptide della sequenza desiderata.
    NOTA: Assicurarsi di aggiungere soluzioni di reagenti all'esterno del reattore a microonde, a temperatura ambiente, direttamente nel recipiente di reazione della provetta. Assicurarsi inoltre che l'agitazione dell'azoto sia avviata prima di posizionare la provetta nel reattore a microonde.

7. Scissione peptidica

  1. Trasferisci la resina in una siringa di plastica fritta.
  2. Preparare un cocktail di scissione composto da acido trifluoroacetico (TFA) al 95%, acqua al 2,5% e silano triisopropilico al 2,5% (TIPS) a un volume di 1 ml/100 mg di resina.
  3. Scindere il peptide per 2 ore a temperatura ambiente agitando continuamente o occasionalmente.
  4. Precipitare il prodotto peptidico in 10 mL di etere etilico ghiacciato.
  5. Risospendere il pellet in una quantità minima di MeCN/0,1% TFA acquoso e liofilizzare durante la notte.

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Risultati

Esempi di sequenze peptidiche preparate con il nostro apparato sono mostrati in Figura 2 e Figura 3. La tabella 1 riassume le soluzioni, i parametri delle microonde e i lavaggi che abbiamo impiegato. La conferma della spettrometria di massa MALDI-TOF è mostrata nelle figure. Il recupero di massa di questi peptidi è stato superiore all'80%. Significativamente, tutte queste sequenze hanno accoppiamenti multipli tr...

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Discussione

L'apparato qui presentato invoca un metodo semplice, innovativo ed economico per rimuovere il solvente, i reagenti in eccesso e i prodotti di scarto, nonché per aggiungere l'agitazione del gas azoto, durante la SPPS assistita da microonde. A differenza dei recipienti SPPS convenzionali, che invocano una fritta sul fondo del recipiente, l'apparato presentato invoca un tubo di dispersione del gas sotto vuoto per aspirare il recipiente. Il recipiente di reazione è quindi una normale provett...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori sono grati per il sostegno delle sovvenzioni INSPIRE della Fairfield University, il supporto del Dipartimento di Chimica e Biochimica della Fairfield University e l'assistenza della dottoressa Dorothy Szobcynski per la sua esperienza nella gestione del laboratorio. Inoltre, gli autori sono grati ai professori Jillian Smith-Carpenter e Aaron Van Dyke per le discussioni riguardanti i peptidi e la sintesi organica. Gli autori apprezzano il sostegno del Publication Fund del College of Arts & Sciences della Fairfield University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CEM Discover SP Reattore a MicroondeCEMFuori produzione.  Recentemente sostituito nella linea di prodotti dalla Discover 2.0
Diisopropilcarbodiimide (DCC)TCI America
Dimetilformamide (DMF)Chimici Termoscientifici
Tubo a dispersione gassosa, micro,  ChemglassCG-207-02Porosità media
Microscopio settoChemGlassCG-3022-20Settum tipo "tubo NMR"
MorfolinaChimici Termoscientifici
Amminoacidi protetti da N-Fmoc
Oyxma PureTCI America
Fiaschetta Ehrlenmeyer da arma secondariaFornitori assortitiRaccolta dei rifiuti
"Tee"IdexP-713ETFE
Tubo in teflon 1/8",  Restek25306OD x 0,063" diametro diametrale, 3 m
provetta (supporto per il contenitore di reazione esterno al microonde) & nbsp;Fornitori assortiti(30 x 175)
Provetta (recipiente a reazione)Corning Glass9820-25XPyrex 25 x 200 mm, senza bordo 
ValvolaIdexP-721ETFE (2x)
Wang SPPS Resin, divinilbenzene reticolato all'1%, mesh 100-200Tecnologia Chimica Avanzata

Riferimenti

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