Misurazioni al microscopio a forza atomica della cartilagine in arti axolotl intatti e in rigenerazione

Sommario

In questo protocollo, mostriamo come preparare il tessuto axolotl per la microscopia a forza atomica (AFM) ed eseguire misurazioni dell'indentazione nella cartilagine degli arti intatta e in rigenerazione.

Abstract

Le forze meccaniche forniscono segnali importanti per la normale funzione cellulare e la formazione di pattern nei tessuti in via di sviluppo, e il loro ruolo è stato ampiamente studiato durante l'embriogenesi e la patogenesi. In confronto, si sa poco di questi segnali durante la rigenerazione animale.

L'axolotl è un importante organismo modello per lo studio della rigenerazione, data la sua capacità di ripristinare completamente molti organi e tessuti dopo una lesione, tra cui la cartilagine e l'osso mancanti. A causa del suo ruolo cruciale come principale tessuto di supporto nel corpo dei vertebrati, il recupero della funzione scheletrica durante la rigenerazione richiede sia il ripristino delle strutture mancanti che delle loro proprietà meccaniche. Questo protocollo descrive un metodo per l'elaborazione di campioni di arti axolotl per la microscopia a forza atomica (AFM), che è il gold standard per sondare le proprietà meccaniche di cellule e tessuti ad alta risoluzione spaziale.

Sfruttando le capacità rigenerative dell'axolotl, questo studio ha misurato la rigidità della cartilagine degli arti durante l'omeostasi e due fasi della rigenerazione degli arti: l'istolisi tissutale e la condensazione della cartilagine. Dimostriamo che l'AFM è uno strumento prezioso per ottenere informazioni sulla ristrutturazione dinamica dei tessuti e sui cambiamenti meccanici che si verificano durante la rigenerazione.

Introduzione

Lo scheletro, in particolare la cartilagine e le ossa, fornisce il principale supporto meccanico per i tessuti molli del corpo nei vertebrati. Pertanto, è probabile che qualsiasi danno al sistema scheletrico comprometta notevolmente la funzionalità e persino la sopravvivenza. Nell'uomo, le fratture ossee sono una delle lesioni traumatiche più comuni¹, la maggior parte delle quali si ripara nel giro di poche settimane, ma il 5%-10% di queste avrà ritardi nella guarigione o non si riprenderà mai completamente ^2,3. Inoltre, gli esseri umani non sono in grado di riprendersi da un'estesa perdita di ossa o cartilagine ^4,5. Alcune salamandre, tuttavia, possono rigenerare una varietà di strutture corporee, compresi gli arti interi⁶, rendendole un modello ideale per lo studio della rigenerazione scheletrica.

L'axolotl (Ambystoma mexicanum) è un tipo di salamandra in cui la rigenerazione degli arti è stata ampiamente studiata. Questo processo avviene in quattro fasi principali sequenziali ma sovrapposte: 1) guarigione della ferita, 2) infiammazione/istolisi, 3) formazione del blastema e 4) crescita/differenziazione del blastema (rivisto in ^7,8). Dopo l'amputazione, i cheratinociti che delimitano il sito della lesione migrano rapidamente, chiudendo la ferita e formando l'epitelio della ferita (WE). Durante l'infiammazione e l'istolisi che ne conseguono, gli agenti patogeni vengono eliminati, i detriti e le cellule danneggiate vengono eliminati e la matrice extracellulare (ECM) sotto la superficie di amputazione viene rimodellata⁹. L'istolisi tissutale è essenziale per la rigenerazione degli arti¹⁰, dove la secrezione di enzimi proteolitici è cruciale non solo per il rimodellamento complessivo della MEC, ma anche per rilasciare le cellule che danno origine al blastema e alle molecole bioattive libere sequestrate nella MEC stessa⁸. Infatti, studi in molti contesti rigenerativi e organismi modello hanno dimostrato che le proprietà uniche del materiale della MEC durante l'istolisi sono in grado di indurre processi di dedifferenziazione o di dirigere la migrazione delle cellule verso il sito della lesione (rivisto in¹¹). Inoltre, il riassorbimento del tessuto calcificato durante le fasi avanzate dell'istolisi si è dimostrato fondamentale per una corretta integrazione degli elementi scheletrici degli arti di nuova formazione¹². Dopo la fase di istolisi, il blastema si forma sotto l'epitelio della ferita (WE) come accumulo di progenitori indifferenziati e multi-lineage derivanti da cellule di tessuto maturo dedifferenziate o cellule staminali residenti. Le cellule di Blastema proliferano e si differenziano in tutti i tipi di cellule mancanti. Infine, avviene la morfogenesi degli arti, dove il tessuto scheletrico viene rigenerato attraverso la condensazione di condroprogenitori derivati da cellule perischeletriche e fibroblasti dermici transdifferenziati 13,14,15.

Sebbene molti degli indizi biochimici che regolano i cambiamenti nell'identità cellulare e nella composizione della ECM siano stati identificati 10,13,14,16,17,18, le proprietà meccaniche dei tessuti durante le diverse fasi della rigenerazione degli arti, così come la loro influenza nella rigenerazione, sono rimaste in gran parte inesplorate. Molti studi hanno dimostrato che le cellule percepiscono e integrano segnali meccanici che regolano il loro destino e il loro comportamento in diversi contesti (rivisto in^19,20). Pertanto, integrare le nostre conoscenze cellulari e molecolari sulla rigenerazione degli arti con misurazioni meccaniche dei tessuti migliorerà notevolmente la nostra comprensione di questi processi.

Sono state sviluppate diverse tecniche che consentono la caratterizzazione meccanica e la manipolazione della forza di campioni biologici²¹. Tra queste tecniche, la microscopia a forza atomica (AFM) è diventata il gold standard in meccanobiologia, in cui le proprietà viscoelastiche dei campioni biologici vengono sondate ad alta risoluzione spaziale mediante indentazione con un sensore di forza ultrasensibile, l'AFM cantilever²². Poiché questa tecnica richiede il contatto diretto con il campione, in genere vengono generate fette di tessuto, che in alcuni casi possono essere difficili. Pertanto, le condizioni di preparazione devono essere adattate e ottimizzate per ogni particolare campione in modo che possa rimanere il più vicino possibile alle condizioni fisiologiche e che vengano generati artefatti minimi²³. Questo protocollo descrive come misurare la rigidità tissutale negli arti axolotl utilizzando l'AFM, concentrandosi sui tessuti cartilaginei in condizioni integre, durante l'istolisi e negli stadi di condensazione della cartilagine (Figura 1 e Figura 2). Questo metodo può essere ampliato anche per la misurazione di altri tipi di tessuto.

Protocollo

Gli axolotl (Ambystoma mexicanum) sono stati coltivati nella struttura di Axolotl del Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD) della Dresden University of Technology (TUD). Una descrizione completa delle condizioni di allevamento può essere trovata in²⁴. In breve, gli ambienti sono stati mantenuti a 20-22 °C con un ciclo giorno/notte di 12/12 ore. Tutte le procedure di manipolazione e chirurgiche sono state eseguite in conformità con le linee guida del comitato etico locale e sono state approvate dalla Landesdirektion Sachsen, Germania.

Questo studio ha utilizzato axolotl bianchi (d/d) per tutti gli esperimenti, un ceppo mutante presente in natura privo di pigmentazione corporea (pochi o nessun melanoforo e xantofori), con iridofori solo nell'iride degli occhi. Questo studio ha utilizzato axolotl che misurano 8-15 cm dal muso alla coda (5-7 mesi) senza pregiudizi specifici per sesso.

1. Preparazione

1. Preparare una soluzione madre di benzocaina al 10% (p/v) che verrà utilizzata per l'anestesia e l'eutanasia degli axolotl (vedi sotto). Per questo, mescolare in un flacone volumetrico 50 g di benzocaina con etanolo al 100% fino a raggiungere il limite di 500 ml.
2. Preparare una soluzione madre di benzocaina allo 0,03% (p/v).
   1. Per 1 L, miscelare 50 mL di soluzione salina tamponata con Tris (TBS) 10x con 30 mL di benzocaina al 10% (p/v) e 5 mL di soluzioni Holtfreter al 4000% (p/v) con 915 mL di acqua distillata e mescolare per una notte con un'ancoretta magnetica.
   2. Per 1 L di soluzione 10x TBS, mescolare 24,2 g di base Trizma e 90 g di NaCl con 990 mL di acqua deionizzata. Mescolare bene con un'ancoretta magnetica. Quindi, aggiungere circa 10 ml di HCl concentrato (12 M o 37%) e regolare per pH 8.
   3. Per 1 L di soluzione di Holtfreter al 4000% (p/v), miscelare 158,4 g di NaCl, 11,13 g di MgSO_{4.7H 2}O, 5.36 g di CaCl_{2.2H 2}O e 2.88 g di KCl con acqua deionizzata fino a 1 L.
3. Preparare una diluizione di benzocaina funzionante allo 0,01% (p/v) nell'acqua del serbatoio di contenimento per l'anestesia diluendo la soluzione madre allo 0,03% (p/v) 1:3.
   1. Per 1 L di soluzione, utilizzare 333 mL della soluzione madre di benzocaina più 666 mL di acqua del serbatoio di contenimento.
4. Preparare una soluzione madre di tartrato di butorfanolo da 5 mg/mL per l'analgesia. Per questo, mescolare 100 mg di sale di butorfanolo (+)-tartrato con 20 ml di acqua ultrapura. Conservare le aliquote a 4 °C.
5. Il giorno delle amputazioni, preparare di fresco 0,5 mg/L di soluzione di lavoro di butorfanolo tartrato per ridurre il dolore dell'animale dopo le procedure chirurgiche diluendo la soluzione madre 1:10.000 nell'acqua del serbatoio di contenimento.
   1. Per gli animali di lunghezza inferiore a 8 cm, miscelare 20 μL di soluzione madre in 200 mL di acqua del serbatoio di contenimento.
   2. Per gli animali più grandi, mescolare 60 μL di soluzione madre in 600 mL di acqua del serbatoio di contenimento.
6. Preparare una soluzione salina sterile tamponata con fosfato di anfibio (APBS), una soluzione di PBS all'80% (v/v) e mantenerla a temperatura ambiente (RT) mescolando 800 mL di DPBS con 200 mL di acqua deionizzata.
7. Preparare 1 mg/mL di soluzione madre di insulina. Per questo, mescolare 250 mg di insulina in polvere con 25 ml di HCl 0,1 M e agitare lentamente fino a quando non si scioglie. Durante l'agitazione, aggiungere 225 ml di APBS fino a quando la soluzione non è limpida. Filtrare in modo sterile e conservare aliquote da 4 mL a -20 °C.
8. Preparare il terreno di coltura sterile (tutte le % (v/v): 62,5% terreno L15, 10% FBS inattivato termicamente, 1% penicillina/streptomicina, 1% insulina, 1% L-glutammina) e mantenere a 4 °C fino al giorno dell'uso. Il giorno dell'esperimento, equilibrare a RT prima dell'uso.
   1. Per 400 mL di terreno di coltura, utilizzare 250 mL di terreno L15, 40 mL di FBS inattivato termicamente, 4 mL di penicillina/streptomicina, 4 mL di soluzione di insulina (dal passaggio 1.7), 4 mL di L-glutammina e 98 mL di acqua sterile deionizzata. Preparare in condizioni sterili e con un filtro sterile dopo aver miscelato tutti i componenti. Preparare 15 mL di aliquote.
9. Preparare l'agarosio al 2,5% e al 3% (p/v) a basso punto di fusione (lmp) in una soluzione APBS e riscaldare a 70 °C per sciogliere completamente l'agarosio. Preparare le aliquote in provette da 1,5 mL e conservare a 4 °C fino al giorno dell'uso.
   1. Per 20 mL di lmp-agarosio al 2,5% (p/v), mescolare 0,5 g di lmp-agarosio con 20 mL di APBS in una provetta da 50 mL e riscaldare a bagnomaria a 70 °C fino a quando l'agarosio non si è completamente sciolto. La soluzione deve diventare chiara e trasparente. Preparare le aliquote ancora calde.
   2. Per 20 mL di lmp-agarosio al 3% (p/v), mescolare 0,6 g di lmp-agarosio con 20 mL di APBS e procedere come sopra.
   3. (Opzionale): Per 20 mL di lmp-agarosio all'1% (p/v), mescolare 0,2 g di lmp-agarosio con 20 mL di APBS e procedere come sopra.
      NOTA: Il tempo di fusione dipende dalla concentrazione dell'lmp-agarosio e può variare approssimativamente da 15 a 40 minuti.
10. Per l'amputazione e il montaggio dei tessuti, utilizzare uno stereoscopio a campo chiaro.
11. Assembla piastre di Petri in plastica da 100 mm di diametro, pinze, bisturi e forbici chirurgiche per amputazioni e raccolta di tessuti.
12. Preparare piastre di Petri in plastica da 35 mm di diametro per le misurazioni dell'indentazione.
13. Preparare cilindri lunghi ~1 cm di diametro di ~1 cm. Per questo, scaldare un tagliacartone sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen e tagliare un tubo da 15 ml con la lama riscaldata.
14. Tagliare piccoli quadrati di 1 cm² di parafilm e conservare.
15. Preparare un blocco metallico o freddo a -20 °C lasciandolo in freezer per almeno 1 h.
16. Preparare le pipette di plastica Pasteur.
17. (Facoltativo): Preparare la soluzione fissativa di MEMFa (acido 3-(N-morfinolino)propansulfonico [MOPS] 0,1 M pH 7,4, Glicole etilenico-bis (2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico [EGTA] 2 mM, MgSO₄·7H₂O 1 mM, 3,7% formaldeide). Per questo, aggiungere 10,465 g di MOPS, 0,123 g di MgSO₄·7H₂O, 2 mL di 0,5 M EDTA pH 8,0 e aggiungere acqua fino a 45 mL. Aggiungere 5 mL di formaldeide al 37% (p/v) per un volume totale di 50 mL.

2. Reagenti

1. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i reagenti utilizzati per questo lavoro, ma possono essere utilizzati anche altri fornitori commerciali.

3. Amputazione di axolotl e rigenerazione degli arti

1. Prima di tutte le procedure sperimentali, anestetizzare l'animale in benzocaina allo 0,01% (p/v) diluita in acqua del serbatoio di contenimento (fase 1.3) per 20 minuti, assicurandosi che gli animali siano profondamente anestetizzati e non rispondano agli stimoli tattili.
2. Rimuovere l'axolotl dall'anestesia e adagiarlo sopra una capsula di Petri da 100 mm contenente un fazzoletto di carta inumidito con acqua contenente anestesia. Orientare l'arto perpendicolarmente all'asse del corpo e posizionare la piastra sotto lo stereoscopio per una migliore visualizzazione.
   NOTA: Qui è stato utilizzato uno stereoscopio con una lampada compatta a collo d'oca.
3. Amputare l'arto con un bisturi sterile affilato immediatamente distalmente all'area calcificata della regione zeugopodiale (radio/ulna) (Figura 1A).
   NOTA: Aderendo al principio del benessere animale 3R, si raccomanda di utilizzare gli arti che sono stati inizialmente rimossi dall'amputazione come controlli intatti.
4. Lasciare l'animale sul piatto e coprirlo con una carta velina umidificata imbevuta di acqua contenente benzocaina per 15 minuti per consentire la coagulazione del sangue e la chiusura della ferita.
5. Riportare gli animali in una vasca contenente acqua di contenimento fresca con analgesici (butorfanolo tartrato, 0,5 mg/L, dal passaggio 1.5).
6. Spostare gli animali nella vasca originale contenente acqua fresca di contenimento 24 ore dopo il trattamento analgesico post-operatorio.
7. Consentire agli animali di rigenerarsi fino allo stadio di interesse desiderato.
   NOTA: Gli arti analizzati sono stati raccolti il giorno dell'amputazione per la fase intatta e 5 giorni dopo l'amputazione (dpa) per la fase di istolisi negli animali di 5 mesi. Lo stadio di condensazione della cartilagine è stato misurato a 21 dpa negli animali di 7 mesi.

4. Montaggio ed elaborazione dei tessuti per le misurazioni

1. Riscaldare le provette da 1,5 mL contenenti il 2,5% o il 3% (p/v) di lmp-agarosio (dal passaggio 1.9) su un termoblocco a 70 °C fino a quando l'agarosio non si è completamente sciolto. Sostituire i tubi con un termoblocco diverso a 37 °C e lasciare che la temperatura si equilibri prima dell'uso.
   NOTA: In questo caso, il 2,5% di lmp-agarosio è stato utilizzato per misurare i tessuti rigeneranti e il 3% per i tessuti intatti.
2. Coprire un lato dei cilindri lunghi 1 cm (dal passaggio 1.13) con uno dei pezzi di parafilm (passaggio 1.14) in modo che siano completamente sigillati sul fondo.
3. Equilibrare 15 mL di aliquote di terreno di coltura a RT (dal passaggio 1.8)
4. Anestetizzare gli animali immergendoli in acqua contenente anestetico (benzocaina allo 0,01% (p/v) diluita nell'acqua del serbatoio di contenimento) per almeno 20 minuti.
5. Visualizzare gli arti sotto uno stereoscopio con un software che consente misurazioni quantitative. Misurare la lunghezza della struttura di interesse e calcolare la quantità di tessuto che deve essere rimossa dall'estremità distale dell'arto fino a raggiungere la sezione di interesse.
6. Per rigenerare gli arti, raccoglierli tagliandoli con un bisturi e/o forbici chirurgiche all'altezza del gomito e sezionando il tessuto in eccesso dall'arto. Lasciare il fazzoletto nella soluzione APBS mentre si prepara il passaggio successivo. Assicurarsi che il taglio sia trasversale (90°) all'asse inferiore del braccio per creare una superficie uniforme. Per gli arti intatti, rimuovere la mano tagliando la regione carpale.
7. Sopprimere gli animali esponendoli a una dose letale di anestesia (0,1% benzocaina) per almeno 20 minuti. Per questo, aggiungere il volume richiesto di soluzione di benzocaina al 10% (p/v) per raggiungere una concentrazione dello 0,1% (p/v).
   1. Se gli animali sono stati anestetizzati in 100 ml di soluzione di benzocaina allo 0,01% (p/v), aggiungere 900 μl della soluzione di benzocaina al 10% (p/v).
8. Sciacquare gli arti immergendoli in una soluzione APBS.
9. Assicurarsi che le pipette Pasteur e il blocco termico (stabilizzato a 37 °C con aliquote di agarosio) siano vicini alla stazione di lavoro. Estrarre il blocco freddo dal congelatore a -20 °C e posizionare sopra il cilindro con l'estremità ricoperta di parafilm rivolta verso il basso.
10. Afferrare l'arto sezionato e rimuovere delicatamente il liquido in eccesso con carta velina. Posizionare l'arto su un piatto pulito, aggiungere sopra l'lmp-agarosio fuso e muovere brevemente l'arto nell'agarosio per spostare l'APBS rimanente dalla superficie della pelle.
11. Lavorando velocemente, posizionare l'arto all'interno del cilindro, assicurandosi che sia orientato verticalmente, con l'area di interesse rivolta verso l'alto.
12. Tenendo delicatamente l'arto con una pinza, aggiungere lmp-agarosio all'interno del cilindro fino a coprire completamente il tessuto. Rimuovere delicatamente la pinza prima che l'agarosio si solidifichi.
13. Togliere il cilindro dal blocco freddo e lasciare solidificare completamente l'agarosio a RT per circa 30 s.
14. Portare immediatamente il blocco di agarosio contenente tessuto nella sala del vibratomo, insieme alle aliquote del terreno di coltura sterile e all'APBS, a RT.
15. Rimuovere il parafilm dal fondo del cilindro e attaccare l'agarosio contenente il tessuto al tavolino del vibratomo con colla cianoacrilica. Assicurarsi che sia l'agarosio che il campione siano incollati al tavolino.
16. Immergere il tavolino in APBS per il sezionamento.
    NOTA: I tessuti intatti includono l'osso/cartilagine più rigidi, mentre i tessuti rigeneranti sono più morbidi. Pertanto, i parametri del vibratomo devono essere regolati di conseguenza. Questo studio ha utilizzato i seguenti parametri: tessuti intatti (ampiezza 1,2 mm e velocità 0,1 mm/s) e tessuti rigeneranti (ampiezza 0,9 mm e velocità 0,4 mm/s).
17. Iniziare a sezionare l'agarosio in brevi passaggi (ad esempio, con incrementi di 100 μm) fino a raggiungere la punta del tessuto. Quindi, sezionare il blocco di tessuto fino a rimuovere la porzione distale di tessuto (calcolata al punto 4.5). In questo modo, una sezione trasversale dell'area di interesse sarà facilmente accessibile.
    NOTA: La sezione di tessuto rimossa conterrà la superficie immediatamente adiacente a quella sondata con AFM e può servire come riferimento per la struttura del tessuto. Pertanto, può essere utilizzato per analisi complementari dirette o fissato per la successiva colorazione (vedere paragrafo 6).
18. Rimuovere con cautela il blocco contenente il tessuto dal tavolino del vibratomo con una lama di rasoio e rimuovere ogni traccia di colla. Incollare immediatamente il blocco su una piastra di Petri di plastica da 35 mm con colla adesiva per tessuti chirurgici e aggiungere circa 2 mL di terreno di coltura a RT per assicurarsi che il tessuto sia completamente coperto.
    NOTA: La superficie del tessuto esposto nel blocco di agarosio è la superficie da sondare.

5. Misurazioni con AFM

1. Almeno 1 giorno prima delle misurazioni, preparare il cantilever per le misurazioni.
   NOTA: Per questo lavoro, i cantilever in silicio senza punta sono stati funzionalizzati con perle di polistirene (diametro 20 μm) e il legame a sbalzo è stato lasciato rafforzare per almeno 1 giorno prima di essere utilizzato per le misure di indentazione.
   1. Fissare le perline ai cantilever utilizzando la colla epossidica con un tempo di lavorazione di 5 minuti.
   2. Abbassare rapidamente il cantilever con un contatto minimo su un vetrino rivestito di colla in modo che si formi una piccola goccia di colla all'estremità e portarlo subito dopo a contatto con un cordone adatto.
   3. Tenere premuto il contatto cantilever-tallone per ~10 minuti prima di sollevare il cantilever con un tallone legato dalla superficie.
2. Calibrare il cantilever prima delle misurazioni.
   NOTA: Il cantilever modificato è stato calibrato prima di ogni serie di esperimenti con il metodo del rumore termico utilizzando le procedure integrate del software AFM.
3. Inserire la piastra di Petri con il blocco di tessuto (dal passaggio 4.18) e il terreno di coltura nel supporto della piastra di Petri dell'AFM e acquisire un'immagine panoramica in microscopia a campo chiaro (Figura 1B).
   NOTA: Per i test di indentazione, viene utilizzata una configurazione dotata di un tavolino motore sopra un microscopio ottico verticale. Montare la testa AFM e posizionare il cantilever sopra il tessuto e portare il cantilever in prossimità della superficie.
4. Scegli la regione specifica di interesse e registra una serie di curve forza-distanza (Figura 2A).
   NOTA: Sono stati utilizzati setpoint di forza relativa di 2-25 nN per raggiungere profondità di indentazione comparabili di ~1-4 μm per tessuti di diversa rigidità, con una velocità di avvicinamento e retrazione di 7,5 μm/s, lunghezza z di 50 μm, dimensione della griglia 70 μm x 70 μm con 3 x 3 punti.
5. Per ogni regione sondata, acquisire un'immagine di microscopia in campo chiaro per associare i valori ottenuti a ciascuna particolare regione nella sezione dell'arto.
6. Per tutti i campioni, sondare almeno 3 regioni diverse per tipo di tessuto.
   NOTA: In tutti i casi, questo studio ha misurato 4 regioni al centro della cartilagine e 3 regioni alla periferia della regione della cartilagine e ha tenuto il tessuto al microscopio per un massimo di 1 ora.
7. Una volta terminate le misurazioni dell'indentazione, scartare o fissare il tessuto per ulteriori analisi.
   NOTA: I campioni sono stati fissati dopo aver concluso le misurazioni ponendoli in provette da 2 mL contenenti soluzione di MEMFa e fissati per una notte a 4 °C. È stato utilizzato MEMFa (passaggio 1.17), ma può essere utilizzata anche la soluzione di formaldeide al 4% (p/v) in PBS.

6. (Facoltativo) Trattamento di sezioni di tessuto adiacenti

1. Se le sezioni di tessuto adiacenti vengono utilizzate per la successiva colorazione, posizionarle immediatamente dopo il sezionamento in una piccola provetta da 2 ml contenente fissativo e fissare per una notte a 4 °C.
   1. Per rivelare l'architettura tissutale attraverso la marcatura del citoscheletro di actina e dei nuclei, lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuno per rimuovere il fissativo e colorare con una soluzione contenente falloidina coniugata Alexa Fluor 488 (1:250) e Hoechst 33258 (1:10000) in PBS per 1 ora a RT su una piattaforma a dondolo.
   2. Successivamente, immobilizzare i campioni colorati sopra piastre con fondo di vetro utilizzando lmp-agarosio all'1% (p/v) in APBS stabilizzato a 37 °C (dal passaggio 1.9). Assicurati che la superficie di interesse sia rivolta verso il vetro. Una volta che l'agarosio si solidifica, coprire i campioni con PBS per prevenire la disidratazione.
      NOTA: I campioni intatti e quelli di istolisi vengono sottoposti a imaging con un microscopio confocale invertito (ingrandimento 10x e sezioni ottiche da 8 μm). Le immagini nella Figura 1C sono proiezioni massime di 8 sezioni ottiche.
2. Se la sezione di tessuto adiacente viene utilizzata per l'analisi immediata a valle che richiede tessuto fresco (come l'estrazione dell'RNA, l'incubazione con coloranti vivi, ecc.), assicurarsi di lavorare rapidamente e di utilizzare un terreno di coltura cellulare (dal passaggio 1.8) per garantire la massima integrità tissutale possibile.

7. Analisi e visualizzazione dei dati

1. Per calcolare il modulo di Young apparente, analizzare le curve forza-distanza utilizzando il modello Hertz/Sneddon (Eq.1) per un penetratore sferico utilizzando il software di elaborazione dati JPK/Bruker, assumendo un rapporto di Poisson di 0,5.
   (Eq.1)
   Dove R: raggio del penetratore, E: modulo elastico, ν: rapporto di Poisson, a: raggio dell'area di contatto circolare tra il penetratore e il campione, δ: profondità di indentazione.
2. Per l'analisi viscoelastica, analizzare le parti di avvicinamento delle curve forza-indentazione in PyJibe 0.15.0 con l'estensione "Hertz model corrected for viscoelasticity using Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM)" (scritto da Paul Müller, https://github.com/AFM-analysis/PyJibe)²⁵. La funzione di adattamento si basa su un modello descritto da Abuhattum et ^al.26, che integra elementi del modello di Kelvin-Voigt-Maxwell.
   1. Pre-elaborare le curve di indentazione della forza per stimare il punto di contatto utilizzando un adattamento a tratti con una linea (linea di base) e una funzione di adattamento polinomiale per la parte di avvicinamento.
   2. Adattare le curve forza-indentazione al "modello di Hertz corretto per la viscoelasticità utilizzando il modello Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM)". Dall'adattamento, ottenere il modulo di Young non rilassato, il modulo di Young apparente e la viscosità apparente. Il modello fornisce anche a Maxwell tempi di rilassamento e indentazione.
      NOTA: In diverse curve di indentazione della forza analizzate (in particolare il tessuto intatto), i tempi di rilassamento di Maxwell erano significativamente maggiori o inferiori al tempo di indentazione, il che indica un comportamento piuttosto elastico o un comportamento meccanico di Kelvin-Voigt, rispettivamente.
3. Esporta tutte le misurazioni in un foglio di calcolo e calcola i moduli di Young apparenti mediani per tipo di tessuto e campione.
4. Tracciare e analizzare statisticamente i dati con un software appropriato.
   NOTA: In questo caso viene utilizzato GraphPad Prism e, nella descrizione dei risultati, lo studio si riferisce alla media ± SD dei moduli di Young apparenti mediani per campione (visualizzati nella Figura 2D-F).
5. Visualizza le sezioni ottiche dalle immagini confocali proiettandole con la funzione di proiezione massima delle Fiji. Regola la luminosità e il contrasto di ogni singolo canale per una visualizzazione ottimale delle colorazioni fluorescenti.
6. Genera un pannello di figure con il software appropriato.
   NOTA: Affinity Designer viene utilizzato per generare i pannelli e il modello nella Figura 1A viene disegnato utilizzando Affinity Designer.

Risultati

Utilizzando il protocollo sopra descritto, abbiamo misurato il modulo di Young apparente dei tessuti degli arti axolotl cartilaginei in condizioni omeostatiche ("intatte"), durante l'istolisi precoce della cartilagine e le successive fasi di condensazione della cartilagine (Figura 1A). Abbiamo anche sondato le proprietà meccaniche degli elementi scheletrici in diverse regioni, tra cui il loro centro e la loro periferia, come mostrato nelle immagini che raffigurano la posizione a sbalzo (Figura 1B). Per visualizzare l'architettura tissutale e correlarla con le misurazioni della rigidità, le sezioni trasversali del tessuto o il blocco tissutale in cui sono state eseguite le misurazioni sono state fissate e colorate per i filamenti e i nuclei di actina rispettivamente con Alexa Fluor 488 coniugato Falloidina e Hoechst (Figura 1C). Negli arti intatti, il radio è chiaramente più grande dell'ulna, ma entrambi gli elementi scheletrici cartilaginei hanno una morfologia simile, con nuclei rotondi uniformemente distribuiti al centro, circondati da un anello di nuclei appiattiti corrispondenti al pericondrio²⁴. Durante la fase di islisi, sono stati rilevati cambiamenti drammatici nell'architettura dei tessuti, con nuclei disorganizzati e meno densamente impacchettati all'interno degli elementi scheletrici. Nella fase successiva di condensazione della cartilagine, i nuclei si organizzano di nuovo, con una chiara delimitazione tra la cartilagine di nuova formazione e i tessuti rigeneranti circostanti. Tuttavia, in questa fase, la maggior parte dei nuclei sono appiattiti e non ci sono chiare differenze morfologiche tra il centro e la periferia.

Quando sono state misurate le sezioni trasversali di entrambi gli elementi scheletrici presenti nella regione zeugoporale (radio e ulna), sono stati rilevati moduli di Young apparenti indistinguibili negli arti intatti, con valori mediani rispettivamente di 10,95 ± 11,69 kPa e 15,71 ± 6,49 kPa (Figura 2D, a sinistra), il che concorda con le loro somiglianze anatomiche (Figura 1C). È interessante notare che l'analisi del centro della cartilagine rispetto alla periferia ha mostrato che, in condizioni intatte, i moduli di Young apparenti al centro erano più alti che alla periferia, con valori mediani rispettivamente di 16,48 ± 6,86 kPa contro 7,53 ± 4,63 kPa (Figura 2E, a sinistra). Il giorno 5 dopo l'amputazione, corrispondente alla fase di istolisi, i moduli apparenti di Young nel radio e nell'ulna diminuirono considerevolmente (0,03 ± 0,02 kPa e 0,13 ± 0,09 kPa, rispettivamente, Figura 2D, a destra), ma anche le differenze tra il centro e la periferia scomparvero, con moduli mediani di Young rispettivamente di 0,11 ± 0,07 kPa e 0,27 ± 0,34 kPa (Figura 2E, a destra). Quando si analizzano le proprietà della cartilagine durante una fase di rigenerazione successiva, nel momento in cui la cartilagine inizia a condensarsi, è stato rilevato un aumento significativo dei moduli di Young apparenti, raggiungendo valori intermedi tra la fase intatta e quella islitica (0,77 ± 0,29 kPa, Figura 2F).

Come si può vedere nelle curve di esempio fornite (Figura 2B), l'isteresi si è verificata tra la maggior parte delle coppie di curve di avvicinamento e di retrazione, indicando una risposta viscoelastica del tessuto sotto forza. Abbiamo inoltre deciso di analizzare le proprietà viscoelastiche dei diversi tessuti in modo più dettagliato. Poiché le misurazioni oscillatorie su più frequenze richiedono molto tempo e sono in qualche modo critiche per quanto riguarda la conservazione dell'integrità dei tessuti, specialmente durante la mappatura di più regioni tissutali, abbiamo utilizzato un metodo precedentemente pubblicato da Abuhattum et al. che consente di adattare la parte di avvicinamento delle curve forza-distanza prima della retrazione immediata del cantilever²⁶. Il modello si basa su elementi del modello di Kelvin-Voigt Maxwell ed è stato precedentemente applicato per l'analisi delle proprietà viscoelastiche di cellule e idrogel²⁶, nonché del tessuto pancreatico²⁷. I moduli mediani non rilassati (intatti: 23,05 kPa, istalisi: 0,20 kPa e cartilagine condensata: 1,60 kPa) e i moduli di Young apparenti (intatti: 17,54 kPa, istolisi: 0,07 kPa e cartilagine condensante: 1,54 kPa) derivati per i tessuti nei diversi stadi di rigenerazione hanno rivelato differenze significative (Figura 2G-H). Nel complesso, è stata osservata una risposta prevalentemente elastica dei tessuti alla deformazione alla velocità di deformazione scelta, come si evince dalla grande somiglianza tra moduli elastici non rilassati e apparenti (Figura 2G,H). Valori mediani di viscosità apparente significativamente più bassi sono stati ottenuti per lo stadio islitico (0,72 Pa·s) rispetto agli stadi di cartilagine intatta (2,06 Pa·s) e condensata (2,32 Pa·s) (Figura 2I). Come previsto, i moduli apparenti di Young dell'analisi di PyJjibe (Figura 2H) erano in alto accordo con i valori ottenuti dal software di elaborazione dati JPK (Figura 2F).

In conclusione, la caratterizzazione meccanica riflette la ristrutturazione dinamica dei tessuti durante il processo di rigenerazione. Queste misurazioni sono in accordo con le osservazioni anatomiche, in cui la rigidità tissutale diminuisce insieme alle alterazioni osservate nell'architettura dei tessuti (Figura 1C) e viene gradualmente riacquistata durante la rigenerazione.

Figura 1: Misurazioni dell'indentazione della cartilagine degli arti axolotl durante la rigenerazione. (A) Rappresentazione schematica delle fasi di rigenerazione. La linea tratteggiata indica il sito approssimativo della sezione trasversale generata dal vibratomo in cui sono state eseguite le misurazioni. (B) Immagini rappresentative delle misurazioni del centro (in alto) e della periferia (in basso) nella cartilagine degli arti. La punta nera è il cantilever. Barra della scala: 100 μm. (C) Architettura tissutale negli arti intatti (a sinistra), nei tessuti sottoposti a istolisi (al centro) e nella cartilagine condensata (a destra). Verde: nuclei (Hoechst), magenta: filamenti di actina (Falloidina). Barra della scala: 500 μm. C' Regione ingrandita delineata nel pannello. Barra di scala: 100 μm. Le griglie di indentazione di 70 μm x 70 μm sono indicate da quadrati tratteggiati bianchi (al centro) e gialli (periferia). Nei pannelli B e C, le lettere R e U indicano rispettivamente il raggio e l'ulna. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Misurazione della rigidità della cartilagine durante la rigenerazione degli arti axolotl con AFM. (A) Schemi dell'esperimento di indentazione AFM mostrati come forza in funzione del tempo (sopra) e forza in funzione della distanza tra il penetratore e il campione (sotto). Le curve di attacco e di retrazione vengono visualizzate rispettivamente in blu e rosso. Il punto di contatto è visualizzato da una linea tratteggiata verticale nera. Le curve forza-indentazione sono state adattate all'interno della parte di avvicinamento della curva, utilizzando il modello Hertz/Sneddon (software di elaborazione dati JPK e Pyjibe) o l'estensione del modello KVM viscoelastico in Pyjibe. (B) Curve forza-distanza rappresentative da misurazioni AFM in arti intatti e in rigenerazione durante gli stadi di istolisi e cartilagine condensata. La percentuale di curve analizzabili (cioè senza artefatti) è indicata nell'angolo in alto a destra di ogni curva. (C) Esempi di artefatti tipici nelle curve forza-indentazione, ad esempio, a causa di un contatto non corretto del penetratore con la superficie. Gli esempi mostrati corrispondono a arti intatti, ma tipi equivalenti di artefatti sono stati osservati in tutte le condizioni. Per B-C: le curve forza-distanza rappresentative sono state adattate e visualizzate utilizzando Pyjibe. La curva azzurra rappresenta la parte di avvicinamento della curva e la curva rosso chiaro è la parte di retrazione. La linea blu più scura è l'adattamento Hertz/Sneddon applicato per un penetratore sferico. I rispettivi residui dell'accoppiamento sono mostrati di seguito per le curve forza-distanza in basso. I residui tracciati rappresentano la differenza tra i valori di adattamento e quelli effettivi. (D) Moduli apparenti di Young del radio e dei centri dell'ulna misurati in arti intatti e sottoposti a istolisi. (E) Moduli apparenti di Young del centro della cartilagine rispetto alla periferia (Peri) negli arti intatti e durante l'istolisi. (F) Moduli di Young apparenti misurati per il centro della cartilagine negli stadi di rigenerazione analizzati. Per D-F: ogni punto è derivato da una curva forza-distanza analizzata con successo e i punti più grandi corrispondono ai valori mediani per campione. I moduli di Young sono stati ottenuti utilizzando l'adattamento del modello Hertz/Sneddon del software JPK Bruker. (G-I) Modulo non rilassato (G), modulo di Young apparente (H) e viscosità apparente (I) calcolati utilizzando PyJibe (estensione KVM) dalle misurazioni del centro della cartilagine nelle fasi di rigenerazione analizzate. Ogni punto è derivato da una curva forza-distanza analizzata con successo. Le linee corrispondono ai valori mediani di tutte le misurazioni per condizione. Per D-I: Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn. Lettere diverse rappresentano condizioni statisticamente diverse tra loro (p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui, dimostriamo una tecnica per la misurazione della rigidità della cartilagine negli arti axolotl con AFM. Tuttavia, questo metodo può essere ampliato anche per sondare altri tipi di tessuto. Un passaggio chiave per il successo delle misure AFM è la preparazione del campione, che si è rivelata particolarmente impegnativa con i campioni di axolotl. Abbiamo scoperto che sondare la superficie del tessuto che era ancora incorporato nel blocco di agarosio era il modo migliore per preservare l'integrità dei tessuti. Questo perché la pelle dell'axolotl secerne alti livelli di muco sulla superficie dell'epidermide, il che impedisce l'incorporazione stabile della sezione di tessuto affettata nell'agarosio.

Alcuni campioni possono comportare ulteriori sfide, come un'elevata adesività. Abbiamo riscontrato questo problema, in particolare nei campioni in fase di istolisi, che erano relativamente cedevoli e adesivi. Su questi campioni, abbiamo anche osservato più curve forza-distanza in cui la parte di indentazione aveva un aspetto "frastagliato", indicando che il cordone stava deformando la superficie del campione in modo non continuo (Figura 2C), ad esempio, a causa del cedimento della superficie sotto sforzo. Tali curve forza-distanza dovettero essere scartate poiché non potevano essere adattate al modello Hertz-Sneddon. Per ridurre l'adesione, la passivazione del penetratore può essere utile²⁸, cioè rivestendo il cordone del penetratore con agenti che ne riducono la viscosità, come il polietilenglicole (PEG) o l'albumina sierica bovina. Inoltre, è possibile utilizzare modelli alternativi per l'adattamento delle curve forza-distanza, ad esempio il modello JKR (Johnson-Kendall-Roberts)²⁹. Poiché i tessuti qui analizzati hanno mostrato variazioni relativamente grandi nei moduli elastici di più di un ordine di grandezza per le regioni tissutali adiacenti e le diverse condizioni testate, ciò ha reso difficile la selezione di un singolo cantilever/penetratore ideale (costante della molla/dimensione del penetratore). Le variazioni piuttosto ampie nella rigidità dei tessuti hanno anche richiesto un adattamento della forza di contatto applicata al fine di mantenere la profondità di indentazione comparabile e all'interno di un intervallo adeguato (circa il 5%-25% del diametro del penetratore).

Un altro parametro critico per preservare le proprietà meccaniche del tessuto nel modo più fisiologico possibile è mantenere la massima integrità dei tessuti. Ciò è stato garantito dalla misurazione di campioni freschi che sono stati immediatamente elaborati dopo la raccolta e mantenuti a una temperatura adeguata in un terreno di coltura cellulare stabilizzato a pH.

Recentemente, altri gruppi hanno eseguito misure di microindentazione in elementi scheletrici axolotl utilizzando metodi alternativi di elaborazione del campione³⁰. Tuttavia, in questi esperimenti, il tessuto è stato precedentemente congelato e i pezzi scheletrici rigeneranti sono stati sezionati manualmente dai tessuti circostanti per misurarli in situ. Fino a quando non sarà dimostrato empiricamente, non è chiaro se queste manipolazioni abbiano un effetto sull'integrità del tessuto cartilagineo e sulle proprietà meccaniche. Sono state riportate anche analisi dei muscoli delle salamandre e dei blastemi^31,32. In questi casi, tuttavia, la pelle è stata rimossa e i campioni non sono stati sezionati; Pertanto, sono state ottenute solo informazioni dalla superficie immediatamente sotto l'epitelio rimosso. Sebbene questo tipo di quantificazione sia accurata, fornisce piuttosto informazioni sulla superficie laterale del muscolo, ignorando così le informazioni meccaniche provenienti dagli strati muscolari interni. Abbiamo utilizzato un penetratore da 20 μm, il che significa che le misurazioni non erano in massa come le misure di microindentazione riportate 30,31,32, ma piuttosto su scala cellulare ed extracellulare. Pertanto, otteniamo una risoluzione che riflette i segnali meccanici a cui le cellule sono effettivamente esposte, oltre a rivelare l'eterogeneità dei tessuti (Figura 2D-I).

Nelle misurazioni, sono stati rilevati valori di moduli di Young apparenti più bassi nella periferia degli elementi scheletrici intatti, il che implica che il pericondrio axolotl è più cedevole della cartilagine. Tuttavia, non possiamo escludere che siano stati sondati anche i tessuti adiacenti agli elementi scheletrici a causa dell'impostazione della griglia di 70 μm x 70 μm. Durante la fase istalitica, tali differenze non sono state osservate, suggerendo che l'istolisi negli arti rigeneranti dell'axolotl può progredire in modo equivalente nella cartilagine, nel pericondrio circostante e nei tessuti vicini. Il radio e l'ulna condividono una struttura simile ma presentano differenze anatomiche significative, come il radio che ha un diametro maggiore e l'ulna che è più lunga²⁴. Tuttavia, un'analisi comparativa della loro rigidità non è stata finora riportata, ad eccezione della loro risposta al carico meccanico con scopi medici³³. Qui, descriviamo le misure di indentazione in sezioni trasversali di questi due elementi scheletrici in arti intatti e in rigenerazione. Mostriamo che non esistono differenze significative nella rigidità tra i raggi e le ulne negli arti axolotl, il che è in accordo con le densità minerali ossee equivalenti rilevate nelle controparti umane³⁴. Tuttavia, è stata osservata una tendenza dei moduli di Young apparente inferiori nel radio, in particolare durante l'istolisi. Per determinare se questa osservazione è biologicamente significativa, sarebbe preferibile un numero maggiore di campioni. Sulla base dei dati ottenuti in questo studio, proponiamo un minimo di 5 campioni per condizione. Durante la fase di istalisi, entrambi gli elementi scheletrici diventano più conformi, il che è in accordo con il rimodellamento della ECM descritto in questa fase⁹. Infine, le misurazioni ottenute in questo studio implicano che la rigidità della cartilagine aumenta gradualmente durante la successiva fase di condensazione della cartilagine. Queste osservazioni concordano con le misurazioni dell'indentazione recentemente riportate nelle ossa intatte e nella cartilagine condensata²⁹, nonché con la valutazione in vivo delle proprietà meccaniche della cartilagine con la microscopia confocale^{Brillouin 35}.

Nel complesso, questo lavoro espande il potenziale dell'AFM come strumento prezioso per studiare le proprietà meccaniche degli arti axolotl. Con questa tecnica, miriamo a integrare la nostra conoscenza dell'espressione genica e delle traiettorie di transdifferenziazione cellulare^16,13 al fine di comprendere meglio come la meccanica dei tessuti sta modellando e influenzando il processo rigenerativo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Affinity Designer	Affinity	versione 1.10.4	Per l'assemblaggio di figure
Agarosio Low Melt	Roth	6351.1	Per la preparazione del campione
Alexa Fluor 488 Falloidina	Invitrogen	A12379	Per colorare il tessuto
Axiozoom	Zeiss		Per l'immagine samplea sotto l'AFM
Benzocaina	Sigma-Aldrich	E1501	Per anestetizzare gli animali
Butorfanolo (+)-tartrato sale	Sigma-Aldrich	B9156	Come analgesico
Cantilever	NanoWorld	Arrow TL1	Per misure di indentazione AFM
Configurazione Cellhesion 200 dotata di uno stadio motore	JPK/Bruker		Per misure di indentazione AFM
Ingresso CellSense Per			l'imaging in stereoscopio Olympus UC90
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	Per pulire campioni e sezioni sotto vibratomo
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	versione 2.9.0/1.53t	Per l'elaborazione delle immagini
GraphPad Prism	GraphPad Software	(versione 8.4.3)	Per rappresentare graficamente e analizzare statisticamente i dati
FBS inattivato termicamente	Gibco	10270-106	Per cella terreno di coltura
Colla istoacrilica (2-butil-cianoacrilato)	Braun		Per incollare il campione su piastre di Petri
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	Per colorare i tessuti
Insulina	Sigma-Aldrich	I5500	Per terreno di coltura cellulare
Microscopio confocale invertito	Zeiss	780 LSM	Per visualizzare sezioni di tessuto
Microscopio confocale invertito	Zeiss	980 LSM	Per l'imaging di sezioni di tessuto Software di
elaborazione dati JPK/Bruker	JPK/Bruker	SPM 6.4	Per analizzare le curve forza-distanza
L15 medium (Leibovitz)	Sigma	L1518	Per terreno di coltura cellulare
L-Glutammina	Gibco	25030-024	Per terreno di coltura cellulare
Penicillina/Streptomicina	Gibco	15140-122	Per cellula Terreno di coltura
Perline di polistirene ( 20 & Micro; m di diametro); )	microParticelle		Per le misure di indentazione AFM
Pyjibe	scritto da Paul Mü ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	Per analisi viscoelastiche
Stereoscopio Olympus SX10	Olympus	SX10	Per amputazioni di arti e montaggio di tessuti
Stereoscopio Olympus UC90	Olympus	UC90	Per imaging
Vibratomo Leica	VT	1200S	Per il sezionamento di tessuti