Articolo metodologico

Estrazione continua liquido-liquido di acidi grassi a catena media dal brodo di fermentazione mediante membrane a fibra cava

DOI:

10.3791/66956

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9 agosto 2024

 ,  , 
1Department of Food Science and Technology, University of Georgia, 2New Materials Institute, University of Georgia, 3Institute for Integrative Agriculture, Office of Research, University of Georgia

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

È stato sviluppato un sistema di estrazione liquido-liquido (LLE) che coinvolge membrane a fibre cave per estrarre in modo continuo e selettivo gli acidi grassi a catena media (MCFA) dal brodo di fermentazione. Il sistema LLE raggiunge elevate specificità MCFA da brodi contenenti acidi grassi a catena corta e alcoli. Inoltre, gli MCFA sono concentrati in una soluzione di strippaggio per facilitare il recupero del prodotto.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli acidi grassi a catena media (MCFA; lunghezze di carbonio: C6-C12) sono sostanze chimiche di alto valore che servono una varietà di applicazioni industriali, tra cui antimicrobici verdi, ingredienti alimentari, additivi per mangimi animali, cosmetici, profumi, prodotti farmaceutici e lipidi strutturati. Attualmente, la maggior parte degli MCFA sono prodotti da olio di palma e di cocco originario del sud-est asiatico e del Sud America. L'approccio convenzionale alla raccolta dei frutti di palma e cocco provoca notevoli danni ecologici in queste regioni. Pertanto, i ricercatori stanno sviluppando approcci biologici (ad esempio, fermentazioni di precisione e in coltura aperta) per generare MCFA in modo più sostenibile utilizzando substrati di basso valore (ad esempio, metanolo, etanolo, lattato) o rifiuti organici come materia prima. L'allungamento della catena microbica (CE) è una piattaforma di fermentazione a coltura aperta a rapida maturazione che converte gli acidi grassi a catena corta (SCFA; lunghezze di carbonio: C1-C5) in un sottoinsieme di questi MCFA a tassi rilevanti a livello industriale. Tuttavia, l'estrazione continua in situ dei prodotti MCFA è necessaria non solo per evitare l'inibizione del prodotto, ma anche per facilitare il recupero degli MCFA in forma pura e utilizzabile. L'estrazione liquido-liquido (LLE) utilizzando membrane a fibre cave e miscele di estratti mirate ha dimostrato un approccio robusto per estrarre selettivamente i prodotti MCFA da brodi di fermentazione contenenti SCFA. Qui, l'applicazione di LLE per la rimozione continua dell'MCFA è dimostrata utilizzando CE come sistema di fermentazione di riferimento e il 3% (p/v) di ossido di triottilfosfina in olio minerale come sistema estrattore. Gli acidi grassi che vanno dall'acido valerico (C5) all'acido caprilico (C8) vengono rimossi selettivamente dai brodi contenenti SCFA e concentrati ad alti titoli in una soluzione alcalina semi-batch per la lavorazione a valle.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli acidi grassi a catena media (MCFA) sono sostanze chimiche di alto valore che comprendono lunghezze di catena che vanno da sei (C6) a dodici (C12) atomi di carbonio. Gli MCFA hanno applicazioni industriali negli alimenti, nei mangimi per animali, nei prodotti farmaceutici, nei cosmetici, nelle fragranze, negli agenti antimicrobici e nella sintesi chimica 1,2,3. Attualmente, la maggior parte degli MCFA deriva da olio di palma e di cocco proveniente dal sud-est asiatico e dal Sud America 4,5. Il grave danno ecologico associato alla produzione di olio di palma e di cocco è ben riconosciuto dalle parti interessate e dal pubblico in generale. I ricercatori stanno esplorando approcci biologici (ad esempio, fermentazioni di precisione e in coltura aperta) per generare MCFA in modo più sostenibile utilizzando substrati di basso valore o rifiuti organici come materia prima 6,7. Un modo sostenibile per produrre MCFA è l'upcycling dei flussi di rifiuti organici utilizzando un processo chiamato allungamento della catena microbica (CE). Questo bioprocesso di fermentazione secondaria è simile alla digestione anaerobica in quanto sfrutta la versatilità dei microbiomi anaerobici a coltura aperta, ma invece di promuovere la formazione di metano, i sistemi CE sopprimono deliberatamente la via metanogenica. In un microbioma in cui il carbonio non può essere ridotto al massimo a CH4, né l'H2 mantenuto al di sotto di 10-4 atm dagli archaea che consumano idrogeno, la reazione di ossidazione β che normalmente scomporrebbe i carbossilati a catena più lunghi in acetato (ad esempio, C6 → C4 → C2) può essere invertita (ad esempio, C2 → C4 → C6, ecc.), purché un composto ridotto (ad esempio, donatore di elettroni) come etanolo o lattato8. In questo metabolismo, la molecola di acido grasso che subisce l'allungamento funge da accettore di elettroni. Pertanto, invece di generare un prodotto con una lunghezza di carbonio di uno (CH4) come nella digestione anaerobica, il processo CE genera MCFA con lunghezze di carbonio comprese tra sei e otto. Un mercato ampio e in crescita è pronto a ricevere queste piattaforme chimiche ecologiche. Tuttavia, finora, il processo CE non ha dimostrato di produrre MCFA con lunghezze di carbonio superiori a otto atomi di carbonio a tassi apprezzabili.

L'estrazione efficiente di questi MCFA è importante non solo per il recupero del prodotto desiderato, ma anche per prevenire l'inibizione del prodotto e spingere il microbioma verso la produzione di più MCFA1. All'aumentare della concentrazione di MCFA, il metabolismo dell'MCFA viene inibito e diventa meno termodinamicamente favorevole. Rimuovendo continuamente gli MCFA, i tassi di produzione vengono mantenuti. Inoltre, poiché gli SCFA fungono da sottostrutture per il processo di allungamento della catena, non devono essere rimossi dal brodo di fermentazione. Le miscele di estratti mirate dovrebbero estrarre selettivamente i prodotti MCFA dai brodi di fermentazione contenenti SCFA.

In questo caso, viene dimostrato un approccio robusto e pratico per estrarre continuamente MCFA dal brodo di fermentazione contenente SCFA utilizzando un sistema di estrazione liquido-liquido (LLE) comprendente un estrattore idrofobo a membrana a fibra cava in polipropilene, una soluzione di estratto organico selettivo (ossido di triottilfosfina [TOPO]9,10,11) e un estrattore a membrana a fibra cava all'indietro. A monte del sistema LLE è installato un filtro di protezione delle celle per trattenere la biomassa e mitigare le incrostazioni della membrana. Gli MCFA vengono estratti in avanti, nella loro forma protonata, dal brodo di fermentazione acquoso (tipicamente con un set point di pH <5,8) in una soluzione di estratto organico (cioè 3% TOPO (p/v) in olio minerale) e quindi estratti all'indietro in una soluzione di stripping alcalino (pH = 9), dove depronano e si concentrano a titoli elevati per la lavorazione a valle. I particolari set point di pH sono essenziali perché determinano il gradiente di concentrazione tra ogni fase del processo LLE, garantendo un trasferimento netto di MCFA dal brodo di fermentazione alla soluzione di stripping. LLE che utilizza membrane di estrazione in avanti e all'indietro raggiunge alti tassi di estrazione riducendo al minimo la co-estrazione di alcoli e SCFA. L'adiuvante a solvente organico, TOPO, consente la formazione di complessi MCFA. Questi complessi sono più solubili nelle fasi organiche rispetto all'acqua, con conseguente elevata selettività MCFA. Il processo LLE evita anche i numerosi svantaggi associati agli approcci esistenti, che saranno discussi nella sezione Discussione. L'implementazione a lungo termine utilizzando questo approccio LLE è stata dimostrata in diversi studi 9,10,11. Sebbene questo approccio sia particolarmente adatto per applicazioni che coinvolgono la produzione di MCFA tramite l'allungamento della catena microbica, è utile anche in altre applicazioni che richiedono la separazione selettiva di composti con proprietà chimiche simili perché il sistema di estrazione organica può essere personalizzato.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I reagenti, i materiali di consumo e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Costruzione e integrazione del bioreattore e del sistema di estrazione liquido-liquido

  1. Preparare la soluzione di estrazione in fase organica e il serbatoio.
    1. Preparare 2 L di soluzione di estrazione in fase organica sciogliendo 60 g di ossido di triottilfosfina (TOPO) in olio minerale utilizzando una piastra di agitazione magnetica e un agitatore.
    2. Aggiungere la soluzione di estrazione in un serbatoio di vetro da 2 L (ad es. bottiglia Schott).
    3. Posizionare il serbatoio su una piastra di agitazione magnetica (Figura 1A). La velocità di miscelazione consigliata durante il funzionamento continuo LLE è di 150-250 giri/min.
  2. Preparare un tappo a tre porte per il serbatoio della soluzione di estrazione.
    1. Collegare un tubo pescante alla prima porta che funga da porta di uscita che fornisce la soluzione di estrazione alla membrana di estrazione diretta (FEM) (Figura 1B).
    2. Fissare una seconda porta che funga da porta di ritorno per la soluzione di estrazione dalla membrana di estrazione all'indietro (BEM) (Figura 1C).
    3. Aggiungere una terza porta, aperta all'atmosfera, per smorzare le fluttuazioni di pressione causate dalla pompa a membrana.
  3. Collegare la pompa a membrana alle membrane di estrazione.
    1. Posizionare un azionamento della pompa a velocità variabile da 100 giri/min dotato di una testa della pompa a membrana in politetrafluoroetilene (PTFE) adiacente al serbatoio (Figura 1D).
    2. Collegare la porta di uscita del serbatoio della soluzione di estrazione (Figura 1A) all'ingresso della pompa a membrana e quindi l'uscita della pompa a membrana all'ingresso lato mantello alla base del FEM (Figura 1B) utilizzando il tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 16, 18).
    3. Collegare l'uscita lato mantello nella parte superiore del FEM all'ingresso lato mantello alla base del BEM (Figura 1C) utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 18).
    4. Collegare l'uscita lato mantello nella parte superiore del BEM alla porta di ritorno sul serbatoio della soluzione di estrazione (Figura 1A) utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. misura 16, 18).
      NOTA: Questo componente del sistema trasferisce gli MCFA estratti dal brodo di fermentazione nel FEM alla soluzione di stripping nel BEM.
  4. Preparare la soluzione di strippaggio in fase acquosa e il serbatoio.
    1. Preparare 3,25 L di soluzione di strippaggio in fase acquosa prelevando una soluzione di acido borico 0,5 M e regolandola a pH 9 utilizzando NaOH.
    2. Versare la soluzione in un serbatoio di vetro da 3,5 L con un'ancoretta magnetica.
    3. Posizionare il serbatoio su una piastra di agitazione magnetica (Figura 1E).
  5. Preparare un tappo a quattro porte per il serbatoio della soluzione di stripping.
    1. Collegare un tubo pescante alla prima porta che funga da porta di uscita che fornisce la soluzione di strippaggio al BEM.
    2. Applicare una seconda porta comprendente un raccordo a Y per (1) fungere da porta di ritorno della soluzione di strippaggio dal BEM e (2) fungere da flusso di trascinamento per le aggiunte di NaOH dal sistema di controllo del pH.
    3. Aggiungere una terza porta, aperta all'atmosfera, per tenere conto dell'aumento di volume causato dalle aggiunte di NaOH e dall'accumulo di MCFA.
    4. Fornire una quarta porta per alloggiare la sonda di pH del regolatore di pH.
  6. Installare un sistema di controllo del pH nel serbatoio della soluzione di stripping.
    1. Integrare un sistema di controllo del pH con un set point di pH 9 con il serbatoio della soluzione di stripping (Figura 1F). Utilizzare 5 M NaOH come soluzione base con il regolatore di pH per contrastare gli MCFA raccolti.
    2. Inserire la sonda di pH attraverso la porta del serbatoio della soluzione di strippaggio e sospenderla nella soluzione di stripping.
      NOTA: Questo sistema di controllo del pH non richiede una soluzione acida.
  7. Preparare le porte di connessione del bioreattore.
    1. Designare due porte, una porta di uscita e una porta di ritorno, sul bioreattore per il collegamento con il sistema di estrazione liquido-liquido (LLE) (Figura 1G, H).
    2. Collegare un tubo pescante alla porta di uscita. Il brodo ricco di MCFA verrà pompato dal bioreattore alla porta di uscita nel sistema LLE.
      NOTA: Il brodo entra prima nel filtro a membrana a fibra cava prima delle membrane di estrazione per rimuovere le cellule e altri solidi per evitare incrostazioni.
    3. Inserire un raccordo a T sulla porta di ritorno per ricevere: (1) brodo impoverito MCFA riciclato dal FEM e (2) retentato contenente cellule dal filtro a membrana a fibra cava.
  8. Installare il filtro a membrana a fibra cava.
    1. Posizionare un azionamento della pompa a velocità variabile da 300 giri/min adiacente al bioreattore (Figura 1I).
    2. Fissare la membrana idrofila a fibra cava (Figura 1J) a un supporto ad anello sopra la pompa peristaltica.
    3. Impilare due teste della pompa peristaltiche sull'azionamento della pompa, grandi (ad es. taglia 17) e piccole (ad es. taglia 16).
      NOTA: La testa della pompa più grande è collegata al filtro a membrana a fibra cava per garantire che la portata del permeato sia maggiore della portata che alimenta il FEM. Se così non fosse, il permeato verrebbe consumato più velocemente di quanto viene prodotto, provocando la formazione di un vuoto.
    4. Collegare la porta di uscita del bioreattore all'ingresso della testa della pompa grande utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 17).
    5. Collegare l'uscita della testa della pompa grande al filtro a membrana idrofila a fibra cava all'ingresso del tubo lato tubo alla base del filtro utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 17).
    6. Tappare la porta superiore del filtro sul lato del guscio per impedire l'afflusso d'aria.
      NOTA: Il brodo ricco di MCFA (contenente cellule) scorrerà attraverso i tubi a fibra cava e tornerà al bioreattore. Il brodo limpido (privo di cellule) passerà attraverso la membrana idrofila in polietersulfone (PES) da 0,2 μm e si raccoglierà sul lato del guscio del filtro.
  9. Collegare il FEM.
    1. Fissare il primo modulo a membrana idrofobica a fibra cava (FEM) a un supporto ad anello sopra la pompa (Figura 1B).
    2. Collegare il filtro a membrana idrofila a fibra cava (Figura 1J) all'uscita lato mantello all'ingresso della testa della pompa piccola utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. dimensioni 16, 18).
    3. Collegare l'uscita della piccola testa della pompa al FEM all'ingresso lato tubo alla base del modulo utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 16, 18).
    4. Collegare il manometro (Figura 1K) e la valvola limitatrice di flusso (Figura 1L) all'uscita lato tubo del FEM utilizzando un raccordo di accoppiamento e un raccordo a T.
    5. Collegare l'uscita lato tubo del FEM alla porta di ritorno del bioreattore utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 18).
      NOTA: Questo componente del sistema trasferisce gli MCFA dal brodo di fermentazione limpido alla soluzione di estrazione e quindi restituisce il brodo limpido al bioreattore.
  10. Collegare il BEM.
    1. Posizionare un azionamento della pompa a velocità variabile da 300 giri/min dotato di una testa della pompa peristaltica (ad es. taglia 16) adiacente al bioreattore (Figura 1M).
    2. Fissare il secondo modulo a membrana idrofobica a fibra cava a un supporto ad anello sopra la pompa peristaltica (Figura 1C).
    3. Collegare la porta di uscita del serbatoio della soluzione di strippaggio all'ingresso della pompa peristaltica e l'uscita della pompa all'ingresso lato tubo alla base del BEM utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 16, 18).
    4. Collegare il manometro e la valvola limitatrice di flusso all'uscita lato tubo del BEM utilizzando un raccordo di accoppiamento e un raccordo a T.
    5. Collegare l'uscita lato tubo nella parte superiore del BEM alla porta di ritorno del serbatoio della soluzione di strippaggio utilizzando un tubo flessibile della pompa (ad es. taglia 16, 18).
      NOTA: Questo componente del sistema trasferisce gli MCFA dalla soluzione di estrazione alla soluzione di strippaggio nel BEM e quindi restituisce la soluzione di strippaggio al suo serbatoio.

2. Avvio del funzionamento del sistema di estrazione liquido-liquido

  1. Adescare e far circolare le linee di fase acquosa.
    1. Accendere la pompa peristaltica/BEM della soluzione di strippaggio (Figura 1M) e impostare la velocità della pompa per ottenere una portata costante tra 25-250 mL·min-1. Il BEM può ospitare una gamma relativamente ampia di portate. Iniziare inizialmente con una portata prudentemente elevata per garantire un'estrazione sufficiente dell'MCFA. La portata può essere ridotta in modo incrementale in un secondo momento durante il funzionamento per prolungare la durata dell'attrezzatura della pompa e dei tubi.
      NOTA: La velocità del flusso non deve essere così bassa da consentire un accumulo di MCFA nel brodo del bioreattore (vedere Risultati rappresentativi).
    2. Chiudere lentamente la valvola a spillo all'uscita sul lato guscio del BEM (Figura 1C) per stabilire una contropressione di ~5 psig.
    3. Accendere il bioreattore/pompa peristaltica FEM (Figura 1I) e impostare la velocità della pompa per ottenere una portata costante tra 25-250 mL·min-1. Il FEM può ospitare una gamma relativamente ampia di portate. Iniziare inizialmente con una portata prudentemente elevata per garantire un'estrazione sufficiente dell'MCFA. La portata può essere ridotta in modo incrementale in un secondo momento durante il funzionamento per prolungare la durata dell'attrezzatura della pompa e dei tubi.
      NOTA: La velocità del flusso non deve essere così bassa da consentire un accumulo di MCFA nel brodo del bioreattore (vedere la sezione Risultati rappresentativi).
    4. Chiudere lentamente la valvola a spillo all'uscita del FEM sul lato del guscio (Figura 1B) per stabilire una contropressione di ~5 psig.
    5. Controllare visivamente le linee di ritorno per garantire un flusso costante e che le linee siano state adescate.
    6. Verificare che il brodo limpido sia raccolto all'interno del lato del guscio del filtro a membrana a fibra cava (Figura 1J).
      NOTA: Ci vorranno diverse ore per riempire il FEM e stabilire un flusso costante tra il filtro a membrana a fibra cava e il FEM. La velocità del flusso non deve essere così bassa da consentire un accumulo di MCFA nel brodo del bioreattore (vedere la sezione Risultati rappresentativi).
  2. Adescare e far circolare le linee di fase organiche.
    1. Accendere la pompa a membrana della soluzione di estrazione in fase organica (Figura 1D) e impostare la velocità della pompa per ottenere una portata costante tra 5,0-50 mL·min-1. Iniziare inizialmente con una portata conservativamente bassa per ridurre al minimo la pressione nell'estrazione in fase organica e ridurre al minimo il rischio di cross-over. Se necessario, la portata può essere aumentata in modo incrementale in un secondo momento durante il funzionamento per migliorare l'efficienza di estrazione
    2. Attendi che il FEM e il BEM siano pieni.
    3. Controllare visivamente la porta di ritorno sul serbatoio della soluzione di estrazione per garantire un flusso costante.
    4. Verificare che nessuna soluzione in fase organica attraversi le linee della soluzione di strippaggio o del brodo di fermentazione. Se si verifica un cross-over, si possono vedere piccole goccioline della fase organica. In tal caso, diminuire la velocità della pompa a membrana e aumentare leggermente la contropressione al FEM o al BEM, a seconda dei casi. Non superare i 10 psig.
      NOTA: Per evitare l'incrocio della membrana, è importante stabilire il flusso e la contropressione all'interno delle linee di fase acquosa prima di adescare le linee di fase organica.
  3. Estrarre continuamente gli MCFA dal bioreattore.
    1. Il sistema LLE dovrebbe essere completamente operativo. Consentire al sistema di funzionare continuamente durante il funzionamento del bioreattore.
    2. Misurare quotidianamente le concentrazioni di MCFA nel bioreattore per garantire un'estrazione sufficiente di MCFA. Se si verificano concentrazioni elevate di MCFA nel bioreattore, ciò di solito indica velocità di flusso insufficienti del brodo di fermentazione attraverso il FEM. Può anche indicare una diminuzione del flusso della membrana a causa di incrostazioni e necessità di manutenzione (vedere passaggio 2.6).
      NOTA: Le concentrazioni di SCFA e MCFA possono essere misurate tramite gascromatografia secondo il metodo descritto da Ge et al.11.
  4. Monitorare l'accumulo di MCFA nel serbatoio della soluzione di stripping.
    1. Misurare quotidianamente la concentrazione di MCFA all'interno della soluzione di strippaggio durante il ciclo batch. Il sistema LLE trasferisce continuamente gli MFCA dal bioreattore alla soluzione di stripping, aumentando la concentrazione di MCFA nel tempo. Il processo può essere eseguito per periodi prolungati per produrre titoli MCFA elevati. Il tasso di produzione volumetrica degli MCFA (mM C·L-1·d-1) può essere stimato utilizzando l'equazione 111.
      NOTA: Tasso di produzione volumetrico = figure-protocol-1 (Eq. 1)
      dove:
      Cb,n= concentrazione di MCFA nel brodo di fermentazione il giorno n, mM C
      Cs,n= concentrazione di MCFA nella soluzione di strippaggio il giorno n, mM C
      Cs,n-1= concentrazione di MCFA nella soluzione di strippaggio il giorno n-1, mM C
      Vs,n= Volume della soluzione di strippaggio il giorno n, L
      Vb,n= Volume di brodo di fermentazione (volume del bioreattore) il giorno n, L
      HRTn= Tempo di ritenzione idraulica del bioreattore il giorno n, d
      Tn= Giorno n, d
      Tn-1= Giorno n-1, d
    2. Per garantire un funzionamento stabile, calcolare periodicamente la velocità di estrazione (mM C·d-1) del sistema LLE misurando la variazione della concentrazione di MCFA tra i punti temporali di misurazione e applicando l'equazione 211.
      NOTA: figure-protocol-2 (Eq. 2)
      dove:
      Cs,n= concentrazione di MCFA nella soluzione di strippaggio il giorno n, mM C
      Cs,n-1= concentrazione di MCFA nella soluzione di strippaggio il giorno n-1, mM C
      Vs,n= Volume della soluzione di strippaggio il giorno n, L
      Tn= Giorno n, d
      Tn-1= Giorno n-1, d
    3. Per mantenere un'adeguata velocità di trasferimento dalla soluzione di estrazione, sostituire la soluzione di strippaggio con un nuovo lotto prima che la concentrazione di MCFA raggiunga l'80% di saturazione.
      NOTA: La solubilità massima dell'acido n-caproico è di 10,3 g· L-1 a 25 °C e quello dell'acido n-caprilico è 0,67 g· L-1 a 25 °C.
  5. Sostituire la soluzione di stripping.
    1. Spegnere la pompa a membrana (Figura 1D).
    2. Spegnere la pompa peristaltica della soluzione di strippaggio (Figura 1M).
    3. Utilizzare il tubo clamps per clamp l'ingresso lato tubo e l'uscita lato tubo del BEM.
    4. Spegnere il sistema di controllo del pH e rimuovere il tappo del serbatoio della soluzione di strippaggio mantenendo i collegamenti delle porte attaccati (se possibile).
    5. Rimuovere il serbatoio della soluzione di strippaggio (Figura 1E).
    6. Sostituire il serbatoio della soluzione di strippaggio con un nuovo lotto di soluzione acquosa di acido borico 0,5 M regolata a pH 9 utilizzando NaOH (vedere il passaggio 1.4). Riattaccare il tappo al serbatoio.
    7. Rimuovere il tubo clamps dall'ingresso lato tubo e dall'uscita lato tubo del BEM.
    8. Accendere la pompa peristaltica della soluzione di strippaggio (Figura 1M), seguita dalla pompa a membrana (Figura 1D). Il funzionamento del sistema è ora ripristinato.
  6. Manutenzione della membrana.
    1. Rimuovere il FEM e il BEM dal sistema LLE una volta ogni tre mesi per la pulizia. Tre mesi è una frequenza di pulizia stimata in modo prudente.
      NOTA: A seconda dell'applicazione, gli utenti possono pulire le membrane più o meno frequentemente. I segni di una diminuzione delle prestazioni della membrana sono descritti nella sezione Risultati rappresentativi. Durante la manutenzione, le pompe e il regolatore di pH devono essere spenti. Le istruzioni per la pulizia devono essere fornite dal produttore della membrana.
    2. Drenare i liquidi dal sistema LLE in contenitori separati, iniziando con le linee di soluzione di estrazione in fase organica, seguite dalle linee di brodo di fermentazione e dalle linee di soluzione di stripping.
    3. Una volta pulite e reinstallate le membrane, rimettere i liquidi nei rispettivi serbatoi.
    4. Riavviare il sistema LLE utilizzando l'approccio descritto sopra (vedere i passaggi 2.1-2.2).

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I risultati positivi dell'estrazione di MCFA sono indicati da un accumulo costante di prodotti MCFA nella soluzione di stripping in fase acquosa alcalina (Figura 2) e da concentrazioni relativamente stabili di MCFA nel brodo di fermentazione (dati non mostrati). La Figura 2 illustra tre cicli semi-batch della soluzione di strippaggio durante il funzionamento continuo LLE. Un ciclo comprende due fasi: la fase di sostituzione del lotto (Figura 2: Giorno 24, Giorno 46 e Giorno 68) e la fase di accumulo MCFA (Figura 2: Giorni 0-24, Giorni 25-46, Giorni 47-68). Per questo particolare sistema di fermentazione e LLE, la durata del ciclo è stata di circa 20-24 giorni. Tuttavia, la durata del ciclo varia da un'applicazione all'altra, poiché dipende da molteplici fattori, tra cui il volume del bioreattore, la produttività biologica, il volume della soluzione di stripping, l'area della membrana a fibra cava e le velocità di ricircolo dei liquidi all'interno del sistema LLE. Durante un ciclo batch, la soluzione di strippaggio può cambiare colore da limpido a bruno-giallastro a causa della co-estrazione di basso livello di vari piccoli acidi organici (ad es. acido umico, acidi fulvici) presenti nel brodo di fermentazione (Figura 3). Gli esiti negativi dell'estrazione di MCFA sono indicati da un lento accumulo di prodotti MCFA nella soluzione di stripping e da elevate concentrazioni di MCFA nel brodo di fermentazione rispetto alla linea di base prestabilita.

La produttività biologica del caproato è generalmente superiore a quella del caprilato durante questi processi di fermentazione; Pertanto, è comune che il caproato si accumuli a una velocità maggiore nella soluzione di strippaggio rispetto al caprilato. Inoltre, è normale che gli SCFA, come l'acetato e il butirrato, si raccolgano nella soluzione di strippaggio in quantità inferiori, come mostrato nella Figura 2. Il TOPO nell'olio minerale ha una maggiore affinità per gli MCFA rispetto agli SCFA, il che provoca la rimozione selettiva degli MCFA. Gli studi di Saboe et al.12, Kaur et al.13, Carvajal-Arroyo et al.14 e Ge et al.11, hanno dimostrato l'elevata selettività del Topo per gli acidi grassi in molteplici applicazioni che coinvolgono soluzioni acquose. Il rapporto di partizionamento tra MCFA e SCFA durante il secondo ciclo batch è mostrato nella Figura 4. Ci si può aspettare rapporti di partizionamento MCFA:SCFA superiori a 40:1 per diversi giorni in un ciclo batch. Il rapporto di partizionamento MCFA:SCFA si stabilizzerà man mano che il processo di estrazione si avvicina a uno stato pseudo-stazionario. Se non è possibile raggiungere un rapporto >40 dopo diversi giorni, ciò suggerisce che l'estrattore TOPO si è degradato o eluito. In tal caso, è necessario preparare una nuova soluzione di estrazione (vedere il passaggio 1.1). Se il rapporto diminuisce dopo la fase di plateau, ciò suggerisce che gli MCFA si sono accumulati oltre l'80% del loro punto di saturazione. In tal caso, è necessario preparare una nuova soluzione di strippaggio (vedere il passaggio 1.4)

Una bassa efficienza di estrazione MCFA può essere causata da portate insufficienti all'interno del sistema LLE. Nella Figura 5, la velocità di pompaggio è stata ridotta nella linea di circolazione del brodo di fermentazione e della soluzione di stripping per illustrare l'impatto della diminuzione dei tassi di ricircolo del liquido sull'efficienza di estrazione dell'MCFA. L'efficienza di estrazione è definita come la percentuale di MCFA estratta nella soluzione di stripping rispetto al totale degli MCFA prodotti dal bioreattore più gli MCFA estratti dal LLE. Ci si può aspettare un'efficienza di estrazione superiore all'85% durante il normale funzionamento (Figura 5, Giorno 1-14). Quando la velocità della pompa è bassa (Figura 5, Giorno 14), l'efficienza di estrazione diminuisce in risposta. Quando viene ripristinata una velocità adeguata della pompa, possono essere necessari diversi giorni prima che l'efficienza di estrazione si riprenda. Ciò potrebbe essere causato da una riduzione della concentrazione allo stato stazionario di MCFA nella soluzione di estrazione causata dal differenziale nelle velocità di estrazione della soluzione di strippaggio (superiore) rispetto al brodo di fermentazione (inferiore).

Diversi altri fattori possono contribuire a ridurre l'efficienza di estrazione, tra cui (1) incrostazioni sulla membrana, (2) flusso di fluido limitato in ogni fase del sistema LLE a causa di blocchi, (3) formazione di sacche di gas nei contattori a membrana e (4) consentire alle concentrazioni di MCFA nella soluzione di stripping di avvicinarsi ai loro punti di saturazione. L'incrostazione della membrana è indicata da una riduzione del flusso della membrana nel tempo rispetto alle condizioni iniziali. Sebbene la formazione di biofilm sia improbabile nel FEM, possono verificarsi incrostazioni a causa dell'accumulo di detriti cellulari e altri solidi sospesi. Inoltre, mentre il BEM è asettico, il flusso può essere ostruito a causa della precipitazione di sali di acidi grassi all'interno del contattore a membrana o del tubo nel tempo. Tuttavia, la manutenzione ordinaria e la pulizia dei contattori a membrana (vedere il passaggio 2.6) dovrebbero evitare lo sviluppo di problemi di incrostazioni e precipitazione salina. A volte si formano sacche di gas sul lato superiore del guscio dei contattori a membrana a causa di un posizionamento errato. I contattori a membrana devono essere leggermente inclinati rispetto alla verticale per garantire che la porta di uscita sul lato del guscio si trovi nel punto più alto, consentendo al gas che si forma di fuoriuscire dal contattore. Il flusso del fluido nel sistema LLE è configurato per fluire dal basso verso l'alto degli appaltatori per aiutare a svuotare le sacche di gas. Infine, il trasferimento di MCFA dalla soluzione di estrazione alla soluzione di strippaggio nel BEM è diminuito a concentrazioni molto elevate di MCFA nella soluzione di strippaggio. Questo problema può essere risolto sostituendo la soluzione di strippaggio più frequentemente.

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Figura 1: Panoramica del sistema di estrazione liquido-liquido. Un rendering schematico che mostra i principali componenti del sistema, i vari circuiti dei fluidi e le direzioni del flusso. I principali componenti del sistema sono etichettati come segue: (A) serbatoio della soluzione di estrazione in fase organica, (B) membrana a scambio diretto, (C) membrana a scambio inverso, (D) pompa a membrana della soluzione di estrazione, (E) serbatoio della soluzione di stripping in fase acquosa, (F) sistema di controllo del pH, (G) porta di uscita del bioreattore, (H) porta di ritorno del bioreattore, (I) pompa peristaltica a membrana a scambio diretto e filtro a membrana a fibra cava, (J) filtro a membrana a fibra cava, (K) manometro, (L) valvola a spillo e (M) pompa peristaltica per soluzione di stripping. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Accumulo di acidi grassi nella soluzione di stripping. Dati che mostrano le concentrazioni di acidi grassi a catena corta e di acidi grassi a catena media durante tre cicli batch della soluzione di strippaggio durante l'operazione di estrazione liquido-liquido continuo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Cambiamento di colore della soluzione di stripping dopo l'estrazione. Una fotografia che mostra il cambiamento di colore della soluzione di strippaggio in fase acquosa prima (cioè pre-batch) e dopo (cioè dopo il batch) di un ciclo batch. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Rapporti di acidi grassi nella soluzione di stripping. Dati che mostrano il rapporto tra acidi grassi a catena media e acidi grassi a catena corta durante un ciclo batch della soluzione di strippaggio durante l'operazione di estrazione liquido-liquido continuo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Effetto delle portate della membrana sull'efficienza di estrazione. Dati che mostrano l'effetto di portate insufficienti attraverso la membrana di scambio in avanti e all'indietro sull'efficienza di estrazione degli acidi grassi a catena media durante il funzionamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Gli MCFA prodotti biologicamente si trovano comunemente in miscele insieme a vari composti organici, tra cui SCFA e alcoli2. Di conseguenza, è necessario un processo di separazione selettiva per recuperarli e utilizzarli in modo efficace. Il sistema LLE qui sviluppato estrae selettivamente gli MCFA da queste miscele in modo continuo, conservando SCFA e alcoli. Questa funzionalità rende il sistema LLE particolarmente adatto per applicazioni di fermentazione, come l'allungamento della catena microbica, dove MCFA, SCFA e alcoli costituiscono i metaboliti primari8. In particolare, il sistema LLE consente al processo di allungamento della catena di procedere rimuovendo gli MCFA, impedendo l'inibizione del prodotto1, lasciando gli SCFA e i reagenti alcolici nel brodo di fermentazione per la successiva conversione biologica. Il sistema LLE può essere personalizzato per altre applicazioni modificando la specifica soluzione di estrazione. Ad esempio, l'estrazione continua degli SCFA prodotti durante la fermentazione potrebbe essere ottenuta utilizzando lo stesso sistema LLE rimuovendo il TOPO dalla miscela di soluzione di estrattore.

Pertanto, l'importanza del metodo LLE risiede nel fornire una tecnica di estrazione MCFA più robusta per queste applicazioni di bioprocesso e biotecnologia rispetto ad altri metodi. L'estrazione bifasica in situ con liquidi non miscibili è un altro approccio all'estrazione di MCFA dal brodo di fermentazione15. Tuttavia, questo approccio è relativamente inefficiente. Tra la fase acquosa (cioè il brodo di fermentazione) e la fase organica si formano strati di emulsione, limitando fortemente le velocità di trasferimento di massa. La minima miscelazione del fluido interfacciale tra gli strati di fase limita anche il trasferimento di massa. Un altro svantaggio è che le cellule microbiche sono a diretto contatto con la fase organica, causando trascinamento, inibizione e morte cellulare15. Infine, l'estrazione bifasica in situ richiede una manutenzione frequente per rimuovere e sostituire la fase organica.

L'applicazione di alti tassi di diluizione all'interno del bioreattore è un altro metodo per evitare l'inibizione del prodotto16. Alti tassi di diluizione possono raggiungere un'elevata produttività mantenendo alte concentrazioni di reagenti nel bioreattore. Tuttavia, questo approccio è svantaggioso perché contribuisce al dilavamento della biomassa, alla generazione di grandi volumi di effluenti e alle elevate perdite di substrato (ad esempio, SCFA e alcoli), con conseguenti basse rese. Questi svantaggi possono essere mitigati utilizzando la biomassa immobilizzata e il riciclaggio degli effluenti, ma questi interventi si aggiungono alla complessità del sistema17. Infine, la concentrazione di MCFA nel flusso di prodotti è diluita, rendendo l'MCFA inefficiente e costoso.

Un nuovo approccio di estrazione potrebbe comportare la distillazione continua degli MCFA con un'unica membrana di estrazione diretta che separa fisicamente la fase organica e quella acquosa, trattenendo e proteggendo così la biomassa microbica. Gli MCFA verrebbero estratti selettivamente nella fase organica e quindi distillati. Il raffinato potrebbe essere continuamente riciclato nella membrana di estrazione. La distillazione continua, tuttavia, è tecnicamente impegnativa, soprattutto in laboratorio, e può causare il deterioramento o la perdita dell'estrattore chimico durante il funzionamento a lungo termine. La distillazione può anche causare la degradazione termica della fase organica e dei prodotti MCFA18.

Il processo LLE evita molti degli svantaggi associati a questi approcci alternativi incorporando diverse caratteristiche critiche e fasi di elaborazione. In primo luogo, il filtro a membrana idrofila a fibra cava ha il duplice scopo di proteggere le cellule della biomassa (i biocatalizzatori) dall'esposizione alla soluzione estrattore nel FEB, fornendo al contempo un filtrato chiaro ricco di MCFA che riduce le incrostazioni e l'accumulo di solidi nel sistema LLE. In secondo luogo, per evitare il cross-over del liquido, abbiamo incorporato valvole a spillo per creare una contropressione sul lato del tubo di ciascun contattore a membrana. Questa precauzione mantiene un leggero gradiente di pressione transmembrana, impedendo la fuoriuscita indesiderata del solvente organico idrofobo dal lato del guscio al lato acquoso del tubo nel FEM e nel BEM. Inoltre, i flussi di liquido sono configurati per fluire in parallelo dalla base alla sommità del FEM e del BEM per evitare l'intrappolamento di bolle di gas che potrebbero accumularsi all'interno dei moduli a membrana, riducendo l'efficienza di trasferimento e causando il carry-over. Inoltre, questo metodo utilizza una pompa a membrana con una testa pompante in PTFE chimicamente resistente per pompare la soluzione estrattore corrosiva contenente MCFA, salvaguardando il sistema dalla corrosione e dai guasti che potrebbero compromettere il processo di estrazione. Infine, la soluzione di stripping alcalino a pH controllato mantiene un gradiente di pH che consente il trasferimento continuo di MCFA attraverso il sistema LLE ad alte velocità dal bioreattore al serbatoio della soluzione di stripping, dove gli MCFA si deprotonano e si accumulano ad alti titoli, facilitando il recupero del prodotto a valle.

Questo metodo LLE è appropriato per l'estrazione continua di MCFA da bioreattori su scala di laboratorio (fino a un volume di lavoro di 6 L) ed è stato convalidato per il funzionamento a lungo termine in diversi studi 1,9,11,19. Il metodo LLE può essere applicato anche per applicazioni su larga scala14 (ad esempio, bioreattori su scala pilota), ma richiede membrane e apparecchiature per la movimentazione dei fluidi su scala proporzionale. Tuttavia, il metodo presenta alcune limitazioni, principalmente nell'area della manutenzione e della complessità del sistema. Poiché il processo è progettato per funzionare in modo continuo, i moduli a membrana e le pompe devono essere sottoposti a manutenzione frequentemente, con conseguenti notevoli tempi di fermo. Un altro svantaggio è che la soluzione di strippaggio richiede quantità relativamente grandi di NaOH e acido borico. Inoltre, gli MCFA sono corrosivi e causano il deterioramento di alcuni componenti del sistema LLE nel tempo. Ad esempio, i connettori in plastica e l'alloggiamento della membrana possono diventare fragili, richiedendo la sostituzione durante il funzionamento. Infine, la rete di movimentazione dei fluidi nel sistema LLE è complessa e coinvolge molti punti di connessione che possono sviluppare perdite. La maggior parte di queste limitazioni e inconvenienti, tuttavia, sono tipici dei processi di separazione continua a membrana e dovrebbero essere previsti.

Nel complesso, questo protocollo LLE offre un approccio robusto ed efficiente per l'estrazione selettiva di MCFA, che ha implicazioni per l'avanzamento della ricerca in diversi campi. Il metodo potrebbe trovare molte applicazioni rilevanti nel campo della fermentazione di precisione per il recupero in situ di prodotti metaboliti extracellulari durante la fermentazione. L'LLE potrebbe essere un'alternativa a basso costo agli approcci convenzionali di lavorazione a valle (DSP), come la centrifugazione post-corsa, la micro e ultrafiltrazione o le estrazioni con solvente eseguite in lotti. In effetti, la DSP rappresenta spesso un importante fattore di costo nei processi di fermentazione industriale. L'estrazione continua del prodotto mediante LLE può anche consentire fermentazioni continue, migliorando notevolmente la produttività delle operazioni e l'efficienza in termini di esecuzione rispetto agli approcci batch convenzionali o alimentati. Inoltre, la ricerca futura potrebbe studiare mezzi di estrazione diversi dai solventi organici, come i solventi eutettici profondi o i liquidi ionici. Infine, il sistema LLE descritto in questo protocollo era destinato a scopi sperimentali in un ambiente di laboratorio; Pertanto, c'è ancora un notevole spazio per studi di ottimizzazione per ridurre il fabbisogno energetico, l'area della membrana e le rese e i tassi di estrazione complessivi.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Non vi è alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano ringraziare il supporto tecnico e finanziario fornito dalla Stazione Sperimentale Agricola dell'Università della Georgia. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare Samuel Ogundipe, il Dr. Ronald Pegg e il Dr. Joon Hyuk Suh per il loro aiuto nell'analisi dei campioni di processo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Flacone da 10 L Duran218018658
Flacone da 3,5 L Duran218016957
acido borico, 99,5%, ThermoScientific (Fisher Scientific)327132500
Idrofilo MINIKROS 20CM 0.2UM PES 1MM 1.5TC X 3/4TCRepligenN02-P20U-10-N
L/S Azionamento a velocità variabile della pompa; 100 giri/minMasterFlex (VWR)MFLX07528-10
300 MFLX07528
Thomas ScientificC761Z18
CO2, alloggiamento in PP O-ring in Viton (0,5-3 gpm (0,1-0,7 m3/h)), connessioni FNPT da 1/4 poll.Agitatore magnetico 3MLC-02508X50-G453
, capacità 20 L, 110 VCole-ParmerEW-04661-29
Tubo per pompa di precisione Masterflex L/S, Tygon, misura 14MasterFlex (VWR)MFLX06402-14La dimensione specifica del tubo dipenderà dall'applicazione.
Tubo per pompa di precisione Masterflex L/S, Tygon, misura 16MasterFlex (VWR)MFLX06402-16Le dimensioni specifiche del tubo dipendono dall'applicazione.
Tubo per pompa di precisione Masterflex L/S, Tygon, misura 17MasterFlex (VWR)MFLX06402-17Le dimensioni specifiche del tubo dipendono dall'applicazione.
Tubo per pompa di precisione Masterflex L/S, Tygon, misura 18MasterFlex (VWR)MFLX06402-18La dimensione specifica del tubo dipende dall'applicazione.
Testa della pompa standard MasterFlex L/S per tubi di precisione L/S 14, alloggiamento in policarbonato, rotore CRSMasterFlex (VWR)MFLX07014-20Le dimensioni specifiche della testa della pompa dipendono dall'applicazione.
Testa della pompa standard MasterFlex L/S per tubi di precisione L/S 14, alloggiamento in policarbonato, rotore CRSMasterFlex (VWR)MFLX07014-20Le dimensioni specifiche della testa della pompa dipendono dall'applicazione.
Testa della pompa standard MasterFlex L/S per tubi di precisione L/S 16, alloggiamento in policarbonato, rotore CRSMasterFlex (VWR)MFLX07016-20Le dimensioni specifiche della testa della pompa dipendono dall'applicazione.
Testa della pompa standard MasterFlex L/S per tubi di precisione L/S 17, alloggiamento in policarbonato, rotore CRSMasterFlex (VWR)MFLX07017-20Le dimensioni specifiche della testa della pompa dipendono dall'applicazione.
Testa della pompa standard MasterFlex L/S per tubi di precisione L/S 18, alloggiamento in policarbonato, rotore CRSMasterFlex (VWR)MFLX07018-20La dimensione specifica della testa della pompa dipende dall'applicazione.
Testa della pompa a membrana in PTFE MasterFlex, da 10 a 100 mL/minMasterFlex (VWR)MFLX07090-62
Regolatore di temperatura Oakton 220 pH/ORP, spettro 1/8 DINProdotti da laboratorio664-12595-E1
Regolatore di temperatura Oakton 220 pH/ORP, 1/8 DINSpectrum Prodotti da laboratorio664-12595-E1
Adattatore da BNC femmina Oakton a filo spellatoSpectrum Laboratory Prodotti664-12592-E1
Sonda di pH con connettore BNCThermoScientific10010-788Qualsiasi sonda di pH con connettore BNC sarà sufficiente.
Valvola di regolazione del flusso di precisione, polipropilene bianco, 1/4 NPT maschio x maschioMcMaster-Carr7792K57
ProConnex  Kit di raccordi - ARepligenACPX-KT2-01NCompatibile con filtro idrofilo MINIKROS
di raccordi ProConnex - BRepligenACPX-KT1-01NCompatibile con filtro idrofilo MINIKROS
Pellet di idrossido di sodio per analisiSigma Aldrich1.06498
Manometro in acciaio inossidabile 0-60 psi Acciaio inossidabile 1/4" NPT 2,5" QuadranteNAXJ-219Qualsiasi manometro comparabile che copra l'intervallo 0-60 psig sarà sufficiente.
Ossido di triottilfosfina (TOPO) Sigma-Aldrich346187-100G
L/S Olio minerale leggero, NF (4 litri)giri/min Agitatore magnetico magnetico 3M LC-0250X50 Kit

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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