Nuove funzionalità di Visual Dynamics 3.0

Summary

Visual Dynamics è uno strumento open source che accelera le implementazioni e l'apprendimento nella simulazione della dinamica molecolare utilizzando Gromacs. Il protocollo presentato vi guiderà attraverso i passaggi per eseguire una simulazione proteina-ligando preparata in ACPYPE con facilità e i passaggi generali verso altri modelli di simulazione.

Abstract

Visual Dynamics (VD) è uno strumento web che mira a facilitare l'uso e l'applicazione della Molecular Dynamics (MD) eseguita in Gromacs, consentendo agli utenti senza familiarità computazionale di eseguire simulazioni di breve durata per scopi di convalida, dimostrazione e insegnamento. È vero che i metodi quantistici sono i più accurati. Tuttavia, attualmente non esiste una fattibilità computazionale per eseguire gli esperimenti eseguiti da MD. Lo strumento qui descritto ha ricevuto continui miglioramenti nel corso degli ultimi due anni. Questo protocollo descriverà ciò che è necessario per eseguire una simulazione in VD con un complesso proteina-ligando precedentemente preparato in ACPYPE e alcune indicazioni generali sugli altri modelli di simulazione disponibili. Per la simulazione dettagliata, verrà utilizzata la proteina legante FK506 di Plasmodium vivax complessata con l'inibitore D5 (PDB ID: 4mgv) e verranno forniti tutti i file utilizzati. Si noti che questo protocollo indicherà ogni opzione da utilizzare per ottenere gli stessi risultati presentati, ma queste opzioni non sono necessariamente le uniche disponibili.

Introduction

Secondo la definizione IUPAC, la MD è la procedura di simulazione che consiste nel calcolare il moto degli atomi in una molecola o di singoli atomi o molecole in solidi, liquidi e gas, secondo le leggi del moto di Newton. Le forze che agiscono sugli atomi, necessarie per simulare il loro movimento, sono comunemente calcolate utilizzando i campi di forza della meccanica molecolare¹. Può essere applicato a qualsiasi fenomeno che cerchi di estrarre informazioni a livello molecolare e spesso atomico².

La MD è una delle tecniche incorporate nella bioinformatica, in particolare nella bioinformatica strutturale. Con esso è possibile ottenere caratteristiche cinetiche e termodinamiche di strutture biomolecolari. Ad esempio, stabilità macromolecolare, identificazione di siti allosterici, chiarimento dei meccanismi di attività enzimatica, riconoscimento molecolare e proprietà di complessi con piccole molecole, associazione tra proteine, ripiegamento delle proteine e sua idratazione³. Inoltre, la MD consente un'ampia gamma di studi, tra cui la progettazione molecolare (ampiamente utilizzata nella progettazione di farmaci), per determinare la struttura e il suo raffinamento (raggi X, NMR e modellazione proteica)³. I risultati ottenuti al termine di un MD sono i più ricchi e completi in termini di simulazione non quantistica⁴. La MD classica è molto più efficiente di quanto ci si potrebbe aspettare da una considerazione completa della fisica dei sistemi biomolecolari a causa del numero di approssimazioni sostanziali. In particolare, gli effetti della dinamica quantistica vengono solitamente ignorati³. Tuttavia, l'implementazione di un esperimento MD non è banale⁵. Richiede la conoscenza dell'informatica, in particolare del terminale Linux, poiché la maggior parte dei software di bioinformatica strutturale è fatta per questo. Anche con questa conoscenza, l'apprendimento dei comandi e della parametrizzazione di Gromacs è un'altra curva di apprendimento ripida.

Dalla sua prima applicazione alla biologia nel 1977⁶, molto si è evoluto grazie all'aumento dell'elaborazione computazionale e al miglioramento della codifica. Più di due decenni fa, è stato lanciato il primo software MD destinato ai problemi biologici, ovvero Gromacs⁷, AMBER⁸ e NAMD⁹.

Sin dalle loro prime versioni, questi software rimangono ancora oggi i più utilizzati e citati. Tuttavia, continuano con le stesse comuni difficoltà di implementazione che affliggono i ricercatori che non sono specialisti di computer⁵. Alcuni hanno passaggi di installazione e configurazione complessi, che a volte richiedono una conoscenza approfondita dell'hardware su cui verranno eseguiti per ottenere il massimo da esso e una documentazione tecnica altamente incentrata sul computer. È necessario un modo più semplice per interfacciarsi con loro, oltre alla riga di comando e ai parametri infiniti.

Un'interfaccia funge da intermediario tra il processo logico da eseguire e l'essere umano¹⁰. Il paradigma di esecuzione del software si è evoluto con il miglioramento delle risorse informatiche. Il primo paradigma digitale sono state le interfacce a riga di comando (CLI), seguite dall'evoluzione verso le note interfacce grafiche utente (GUI)¹¹. Seguendo il ciclo evolutivo, l'interfaccia prodotta dal World Wide Web (o semplicemente WEB) è considerata un'evoluzione delle GUI¹¹. Questi tre paradigmi attualmente coesistono a seconda degli sviluppatori. Le applicazioni CLI utilizzano comandi testuali sulla console del sistema operativo. Le applicazioni GUI, chiamate anche desktop grafici, utilizzano un'interfaccia grafica composta da finestre, pulsanti e altri componenti. È specifico e pre-programmato per un sistema operativo. La principale differenza rispetto alla CLI è l'uso del mouse come elemento aggiuntivo nell'interazione uomo-macchina¹². Le applicazioni WEB, nonostante siano confuse con un'interfaccia grafica, sono più complesse da sviluppare ma sono più versatili e di gran lunga le più agili nel funzionamento. Inoltre, essi dipendono solo da un software di interpretazione, chiamato browser, che consente all'applicazione client di comunicare con il server attraverso una rete indipendente dal sistema operativo¹³.

I software di bioinformatica strutturale utilizzano più comunemente i paradigmi CLI e GUI. Alcuni esempi di software classici che utilizzano CLI sono Modeller¹⁴ per la modellazione di similarità, Autodock¹⁵ per il docking molecolare e Gromacs¹⁶ per la dinamica molecolare. Esempi di software che adottano il tipo GUI sono SwissPDBviewer¹⁷, Pymol¹⁸, VMD¹⁹, UCSF Chimera²⁰, Autodock tools¹⁵, PyRx²¹, Biovia²², Maestro²³ e Moe²⁴, tra gli altri.

Con l'emergere delle tecnologie Hypertext Markup Language versione 5 (HTML5)²⁵, Cascading Style Sheets (CSS)²⁶ e Javascript²⁷ , tra le altre, molte applicazioni di bioinformatica strutturale potrebbero essere portate sul WEB, diventando così più accessibili. Esempi di similarity modeling WEB server sono MODWEB²⁸, che utilizza Modeller¹⁴ come back-end e Swissmodel²⁹. Esempi di server di applicazioni web per il docking molecolare sono Haddock³⁰, Swissdock³¹, Cluspro³², Dockthor³³ e altri.

Mentre l'analisi strutturale, la modellazione e le metodologie di docking si sono evolute dai paradigmi CLI alla GUI e infine al WEB, MD continua ad essere per lo più supportato dall'esecuzione della riga di comando (tipo CLI). Sono emerse alcune buone iniziative per migliorare questo panorama. Esempi di queste iniziative sono l'implementazione di plug-in in software esistenti, come il plug-in QwikMD per VMD³⁴, il plug-in GROMACS per PyMOL e l'opzione di simulazione dinamica molecolare in UCSF Chimera²⁰, alcune nuove e più semplici applicazioni CLI, come ASGARD³⁵, Gmx_qk³⁶ e CHAPERONg³⁷, e una robusta piattaforma web, BioBB-Wfs³⁸. Sebbene l'uso di questi plugin e applicazioni sia un progresso, la loro implementazione è ancora una sfida per la maggior parte dei ricercatori non qualificati. Le difficoltà più comuni includono problemi di installazione e configurazione del software MD, che spesso compromettono la piena esecuzione della simulazione⁵.

Nel 2022, il software Visual Dynamics per la simulazione computazionale basata sul web è stato reso disponibile dal Laboratório de Bioinformática e Química Medicinal presso Fiocruz Rondônia³⁹. La sua versione iniziale è stata costruita in Python e Flask, consentendo simulazioni di sistemi con proteine libere (apoenzimi) per soli 2 ns. Successivamente, è stato migliorato per includere una versione di simulazione automatizzata con ligandi preparati utilizzando PRODRG⁴⁰.

VD è stato creato per assistere tutti i ricercatori nel campo della biofisica strutturale, della biotecnologia e delle aree correlate che hanno limitazioni nella conoscenza computazionale; lo strumento consente a questi ricercatori di testare le loro ipotesi che coinvolgono simulazioni MD da qualsiasi sistema operativo e senza l'accesso a un computer ad alte prestazioni (HPC). Lo scopo di questo lavoro è quello di presentare le nuove funzionalità di Visual Dynamics versione 3.0. Inoltre, mira a introdurre un protocollo di utilizzo aggiornato per lo strumento e ad evidenziare le limitazioni da affrontare in futuro, insieme alle statistiche di utilizzo fino al momento attuale (Figura 1).

Protocol

1. Accesso al software e registrazione di un nuovo utente

1. Visita la pagina Web di Visual Dynamics (VD). Clicca sull'icona +Registrati in alto a destra per creare un account. Registrati per utilizzare il software.
   NOTA: Sono consentiti solo indirizzi e-mail istituzionali. L'utente riceverà una notifica via e-mail una volta approvata la registrazione.
2. Clicca su Accedi in alto a destra per accedere alla schermata di accesso al sistema. Compila i campi nome utente/e-mail e password e fai clic su Accedi. Dopo aver effettuato l'accesso, l'utente avrà accesso all'area di invio della simulazione. Possono anche visualizzare esercitazioni e statistiche di utilizzo per VD.

2. Presentazione della simulazione dell'apoenzima

1. Fai clic su Nuova simulazione nella barra laterale sinistra. Nella schermata che appare, fare clic sul pulsante APO, che si riferisce all'apoenzima.
2. Caricare il file gratuito protein 4mvg.pdb. Seleziona il campo di forza AMBER94 (o qualsiasi altra opzione appropriata).
   NOTA: 4mvg.pdb può essere ottenuto dal File Supplementare 1 o scaricato direttamente dalla Protein Data Bank (PDB).
3. Seleziona il modello TIP3P Water. Selezionate la casella cubica. Selezionare una distanza di 0,5 nm tra la proteina e il bordo della scatola.
   NOTA: Le opzioni selezionate sono solo suggerimenti. Tutte le altre opzioni funzionano in VD.
4. Seleziona l'opzione Esegui nei nostri server per eseguire la simulazione con i file e i parametri inviati. Dopo aver fatto clic su Esegui simulazione, l'utente vedrà l'evoluzione dei passaggi della simulazione sullo schermo e riceverà una notifica via e-mail sullo stato della simulazione al termine.

3. Presentazione della simulazione di un enzima complessato con ligando preparato in ACPYPE

1. Utilizzando UCSF Chimera²⁰, aprire il complesso proteina-ligando 4mgv.pdb⁴¹, in Seleziona, fare clic su Residuo e impostare il codice su D5I. Quindi, in File, fare clic su Salva PDB, selezionare Salva solo atomi selezionati, impostare il nome del file su ligand.pdb e fare clic su Salva.
2. Invia il file ligand.pdb generato nel passaggio precedente al server Bio2Byte ACPYPE⁴², dai file di output, ligand_NEW.itp e ligand_NEW.pdb saranno quelli utilizzati e forniti in questo esperimento.
   NOTA: i file ligand_NEW.itp e ligand_NEW.pdb possono essere ottenuti dal file supplementare 2 e dal file supplementare 3.
3. Fai clic su Nuova simulazione nella barra laterale sinistra. Fare clic sul pulsante Proteina + Ligando (preparato in ACPYPE).
4. Caricare il file gratuito protein 4mvg.pdb. Selezionare i file Ligand preparati in ACPYPE: ligand_NEW.itp e ligand_NEW.pdb. Selezionare il campo di forza AMBER94.
5. Seleziona il modello TIP3P Water. Selezionate la casella cubica. Selezionare una distanza di 0,5 nm tra la proteina e il bordo della scatola. Le opzioni selezionate sono solo suggerimenti. Tutte le altre opzioni funzionano in VD.
6. Seleziona l'opzione Esegui nei nostri server per eseguire la simulazione con i file e i parametri inviati. Dopo aver fatto clic su Esegui simulazione, l'utente vedrà l'evoluzione dei passaggi della simulazione sullo schermo e riceverà una notifica via e-mail sullo stato della simulazione al termine.

4. Accesso ai risultati della simulazione

1. Fai clic su Le mie simulazioni nella barra laterale sinistra.
2. Fare clic su Scarica file MDP per scaricare i file di configurazione della simulazione utilizzati dalla piattaforma sul computer dell'utente.
3. Scaricare gli elementi di simulazione come descritto di seguito.
   1. Fare clic su Comandi per scaricare l'elenco dei comandi eseguiti dalla piattaforma sul computer dell'utente.
   2. Fare clic su GROMACS Log per scaricare il file di registro contenente gli output dei comandi .gmx in sequenza sul computer dell'utente.
   3. Fare clic su Risultati per scaricare i file generati dai comandi .gmx, ad esempio _npt.gro, _pr.edr, _pr.tpr, _pr_PBC.gro e pr_PBC.xtc sul computer dell'utente.
   4. Fare clic su Figure Graphics per scaricare i grafici per l'analisi di ogni fase della simulazione in formato immagine e .xvg sul computer dell'utente.

Results

VD fornisce un'esecuzione di simulazione completamente autonoma che non richiede l'intervento dell'utente o risorse computazionali fornite dall'utente. Dopo aver inviato una simulazione all'esecuzione, l'utente può uscirne, spegnere i computer e la simulazione continuerà a essere eseguita. Consente inoltre agli utenti di accedere ai risultati da qualsiasi dispositivo, sia esso un laptop o un dispositivo mobile.

Come esempio di utilizzo della VD in modalità automatizzata attraverso il WEB, il test è stato effettuato per un complesso proteina-ligando preparato in ACPYPE utilizzando la struttura della proteina legante FK506 di Plasmodium vivax complessata con l'inibitore D5 (PDB ID: 4mgv)⁴¹. La preparazione ha seguito il protocollo descritto e i risultati dell'analisi sono mostrati nella Figura 2A-D.

La Figura 2A rappresenta la deviazione quadratica media (RMSD) tra la struttura iniziale della proteina e la sua simulazione nel corso di 5 ns (come fissato nel sistema). La spina dorsale proteica ha mostrato un RMSD inferiore a 2,5 Å durante la simulazione. La Figura 2B mostra il raggio di rotazione (Rg), che descrive la compattezza della proteina durante la simulazione di 5 ns. Questo grafico mostra Rg nelle tre coordinate, x, y e z, nonché il valore complessivo. La Figura 2C illustra la fluttuazione quadratica media (RMSF) che rappresenta la distanza media di fluttuazione di ciascun amminoacido nella struttura proteica durante la simulazione di 5 ns. La Figura 2D illustra la variazione di energia in kJ/mol per il sistema durante il processo di minimizzazione dell'energia utilizzando il metodo di discesa più ripida. Da questo grafico, osserviamo che il sistema si è stabilizzato con una forza massima inferiore a 1000 kJ/mol/nm.

Un altro caso d'uso è quando l'utente desidera eseguirlo sul proprio server con Gromacs installato. Questa forma di utilizzo non è stata trattata in questo protocollo in quanto richiede un livello moderato di conoscenza del terminale Linux e delle applicazioni CLI. Questo metodo utilizza VD come generatore di comandi Gromacs modificabili che ottengono lo stesso risultato di VD quando vengono eseguiti come generati. Scaricano i file MDP e il file contenente i comandi generati (Figura 3A). Tutto è disponibile in VD. Quando lo eseguono nel terminale Linux, otterranno risultati come la Figura 3B.

Figura 1: Utilizzo di VD per generare script di comando. (A) Elenco dei comandi generati nel VD quando si sceglie l'opzione di download dell'elenco dei comandi. (B) Esempio di output derivante dall'esecuzione di un comando. Basta copiare, incollare ed eseguire nel prompt locale di Linux. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Statistiche di accesso e utilizzo di Visual Dynamics. Più di 4 mila utenti IP singoli provenienti da circa 63 paesi hanno già effettuato l'accesso a VD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Esempi di grafici di output relativi all'analisi VD automatica. (A) Deviazione quadratica media (RMSD) nel corso di 5 ns. (B) Raggio di rotazione (Rg) nel corso di 5 ns. (C) Fluttuazione quadratica media (RMSF) nel corso di 5 ns. L'asse x del grafico RMSF rappresenta il numero di amminoacidi nell'enzima e il software di imaging produce con una dimensione minima. Se la proteina è più grande, l'asse x aumenterà. (D) Variazione di energia durante il processo di minimizzazione dell'energia. La variazione di energia termina quando il processo raggiunge un valore adeguato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Diagramma di flusso semplificato del processo utilizzato da Visual Dynamics per impostare una nuova simulazione. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Diagramma di flusso semplificato del processo utilizzato da Visual Dynamics per gestire l'esecuzione delle simulazioni in coda. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: File pdb proteico. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: File itp del ligando. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: File pdb del ligando. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Automatizzare i processi non è facile, ma è anche meno difficile che riprogrammare un sistema da zero. Gromacs è attualmente il software di simulazione molecolare più popolare ed è costantemente aggiornato. Il Dipartimento di Chimica Biofisica dell'Università di Groningen lo ha inizialmente sviluppato, ed è ora gestito dal Laboratorio di Scienze della Vita dell'Università di Stoccolma⁴³.

Per ogni nuovo utente, l'apprendimento delle tecniche di simulazione è un percorso lungo. VD emerge come alternativa per facilitare questo processo di apprendimento, nonché per convalidare gli esperimenti prima di investire risorse nell'esecuzione di simulazioni per periodi più lunghi. Gli utenti possono eseguire 5 ns di simulazione e quindi valutare l'utilità di estendere ulteriormente la simulazione.

L'automazione delle concatenazioni e del passaggio dei parametri ai comandi Gromacs è possibile solo attraverso il modo in cui Linux fornisce e consente la gestione del suo terminale. Una delle caratteristiche principali di VD che ha consentito l'automazione completa può essere vista nella Figura 3B. In un approccio manuale, è necessario che l'utente interagisca all'inizio dell'esecuzione per scegliere i gruppi da analizzare¹⁶. In questo caso, il gruppo 4 (Backbone) è stato selezionato come predefinito. Per bypassare questo passaggio e automatizzare l'interazione dell'utente, il comando echo "4 4" viene passato al comando .gmx dietro le quinte, insieme a uno strumento di concatenazione noto come pipe (|) nella riga di comando stessa. Questo è utile per i programmatori che vogliono sviluppare uno strumento simile a VD e consente l'automazione e l'emulazione dell'interazione con l'utente.

Attualmente, VD è limitato all'esecuzione di simulazioni con una durata di 5 ns sul server WEB. Nella versione precedente, questo limite era di soli 2 ns³⁹. Se è necessario un tempo di simulazione più lungo, si consiglia di scaricare lo script e i file MDP per l'esecuzione sulla macchina dell'utente con Gromacs installato. Le opzioni Neutralizza sistema e Ignora idrogeni sono sempre abilitate e non possono essere disabilitate. Allo stesso modo, l'opzione Usa doppia precisione è sempre disabilitata. Queste opzioni vengono visualizzate per informare l'utente. Per motivi di prestazioni, sono fissi. La versione attuale non esegue simulazioni con leganti preparati in campi di forza OPLS o CHARMM. Questa limitazione è puramente tecnica e temporanea.

Strutturalmente, VD ha due applicazioni: un front-end web, che è l'applicazione che l'utente vede, e un back-end server, che è l'applicazione che farà il duro lavoro di configurazione ed esecuzione del MD. Il front-end web è una semplice interfaccia con moduli per raccogliere ciò che gli utenti vogliono fare attraverso selezioni, interruttori e selettori di file; Il diagramma di flusso del front-end web verrà omesso per ora, come viene descritto, passo dopo passo nel protocollo.

Il back-end del server è costituito da due servizi: un'applicazione per la gestione e la configurazione dei MD e un'altra per la gestione e l'esecuzione simultanea dei MD. La Figura 1 supplementare mostra il flusso eseguito per configurare un MD e la Figura 2 supplementare mostra il flusso dell'applicazione della coda di esecuzione.

Ci sono anche altri strumenti automatizzati/web per l'esecuzione di MD oltre a Visual Dynamics, ognuno con il proprio insieme di pro e contro. ASGARD³⁵, Gmx_qk³⁶ e CHAPERONg³⁷ sono strumenti eccellenti che aiutano a facilitare l'uso di GROMACS¹⁴ , ma sono ancora applicazioni CLI che richiedono all'utente di avere un grado minimo di conoscenza della shell. BioBB-Wfs³⁸ è l'applicazione più simile a VD³⁹, offre anche molte cose che VD non offre, poiché utilizza BioBB⁴⁴, una libreria composta da wrapper attorno a strumenti MD popolari. Le schermate possono essere un po' troppo complesse per chi ha appena iniziato. Il processo è piuttosto complesso rispetto al VD. Dopo molti passaggi, viene generato un tipo di componente universale chiamato Common Workflow Language (CWL) per l'esecuzione su HPC. Tuttavia, l'utente deve avere accesso a questi server, che non è naturalmente gratuito.

L'attuale istanza pubblica di VD ha Gromacs installato per utilizzare il processore, ma può essere installato con le istruzioni per utilizzare l'unità di elaborazione grafica (GPU) della macchina, che migliora notevolmente le prestazioni di simulazione⁴⁵. Inoltre, lo script di comando generato in VD è trasparente alla GPU, il che significa che può essere eseguito su una macchina con una GPU installata senza la necessità di modificare nulla nei comandi.

A questo punto, VD è un ottimo strumento per presentare MD a qualcuno che lo conosce per la prima volta, ma potrebbe essere utilizzato al meglio da coloro che hanno familiarità con MD e Gromacs. Può essere utilizzato nelle lezioni di simulazione, dove il professore ha bisogno di un approccio rapido senza problemi di installazione o configurazione dei parametri per eseguire un esercizio. Inoltre, VD può essere utilizzato per convalidare una simulazione; Se funziona per 5 ns, è giustificabile investire nell'estensione della simulazione utilizzando i file generati all'interno VD.In generale, il gruppo sta lavorando per includere analisi più automatizzate come i legami h e l'energia di legame della meccanica molecolare di Poisson-Boltzmann (MMPBSA), cercando anche di migliorare continuamente l'usabilità.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACPYPE Server	Bio2Byte		Disponibile presso
software https://www.bio2byte.be/acpype/ GRACE	Plasma Laboratory presso il Weizmann Institute of Science		Disponibile all'indirizzo https://plasma-gate.weizmann.ac.il/Grace/
Software GROMACS Team	GROMACS Istruzioni		per l'installazione all'indirizzo https://manual.gromacs.org/current/install-guide/index.html
La struttura della proteina legante FK506 Da Plasmodium vivax complessato con l'inibitore D5	RCSB Protein Data Bank		Disponibile all'indirizzo https://www.rcsb.org/structure/4mgv Contiene già il ligando complessato alla macromolecola.