Articolo metodologico

Sistemi AAV e modelli murini per lo studio dell'espressione ectopica di Neurod1 in cellule trasdotte in tempi subacuti e cronici post-ictus ischemico

DOI:

10.3791/66965

⸱

29 novembre 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Anatomy, University of Toronto, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Donnelly Centre for Cellular and Biomedical Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive l'espressione ectopica mediata da virus di Neurod1 in seguito a ictus ischemico corticale. Neurod1 viene somministrato (1) utilizzando il sistema Cre-Flex AAV in topi wild-type durante la fase subacuta post-ictus (7 giorni) e (2) utilizzando un singolo vettore AAV in topi reporter condizionali durante la fase cronica post-ictus (21 giorni).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'espressione ectopica di fattori neurogeni in vivo è emersa come un approccio promettente per sostituire i neuroni persi nei modelli di malattia. L'uso di fattori di trascrizione neurali basici elica-loop-elica (bHLH) tramite sistemi di particelle simili a virus non propaganti, tra cui retrovirus, lentivirus e virus adeno-associati (AAV), è stato ampiamente riportato. Per gli esperimenti in vivo , gli AAV sono sempre più utilizzati a causa della loro bassa patogenicità e del potenziale di traducibilità. Questo protocollo descrive due sistemi AAV per studiare l'espressione ectopica di fattori di trascrizione in cellule trasdotte dopo ictus ischemico. In entrambi i sistemi, l'espressione di Neurod1 è controllata dal promotore corto GFAP (gfaABC(1)D), che è sovraregolato negli astrociti reattivi dopo l'ictus e nei neuroni endogeni quando combinato con l'espressione del fattore neurogeno. Nel modello di ictus ischemico descritto, l'ischemia focale è indotta iniettando endotelina-1 (ET-1) nella corteccia motoria dei topi, creando una lesione circondata da astrociti reattivi che esprimono GFAP e neuroni sopravvissuti. Iniezioni intracerebrali di AAV vengono eseguite per indurre ectopicamente l'espressione di Neurod1 nelle fasi subacuta (7 giorni) e cronica (21 giorni) post-ictus. Entro poche settimane dall'iniezione di AAV, un numero significativamente più elevato di neuroni tra le cellule trasdotte viene identificato nei topi che esprimono ectopicamente Neurod1 rispetto ai topi che ricevono virus di controllo AAV. Le strategie basate sull'AAV hanno utilizzato i risultati osservati replicati di un aumento del numero di neuroni che esprimono il gene reporter in un modello di ictus corticale da lieve a moderato. Questo protocollo stabilisce una piattaforma standard per esplorare gli effetti dell'espressione ectopica dei fattori di trascrizione forniti con sistemi basati su AAV, contribuendo alla comprensione dell'espressione del fattore neurogeno nel contesto dell'ictus.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'ictus è una delle principali cause di disabilità in tutto il mondo1. Un ictus si verifica quando il flusso sanguigno al cervello viene interrotto. Ciò può verificarsi sia attraverso un ictus emorragico (~15% dei casi), in cui un vaso sanguigno nel cervello scoppia, sia attraverso un ictus ischemico, in cui il flusso sanguigno al cervello è bloccato1. Gli ictus ischemici sono i più diffusi e rappresentano ~85% dei casi di ictus1. Un ictus riduce l'apporto di glucosio e ossigeno al cervello, portando a una rapida morte delle cellule neuronali e a una compromissione della funzione neurale.

L'ictus ischemico porta alla perdita di cellule in pochi minuti nel nucleo della lesione attraverso meccanismi di eccitotossicità, stress ossidativo e nitrosativo, disregolazione del calcio, diffusione corticale, depolarizzazione, edema, rottura della barriera emato-encefalica (BEE) e infiammazione 2,3. Le cellule nelle regioni peri-infartuali vanno incontro a morte cellulare apoptotica entro poche ore e per giorni dopo l'ictus4. L'ambiente peri-infartuale è esposto a segnali pro- e anti-infiammatori che portano all'attivazione di microglia e astrociti (astrociti "reattivi"), che svolgono ruoli diversi dopo la lesione 5,6,7,8. Gli astrociti reattivi subiscono una serie di cambiamenti fenotipici che includono la sovraregolazione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e la formazione di un bordo attorno alla lesione entro pochi giorni dall'ictus che aiuta a limitare l'estensione della lesione e influisce sulla neuroplasticità all'interno del tessuto danneggiato 8,9,10.

La riprogrammazione cellulare diretta consente la conversione di un tipo di cellula matura in un diverso tipo di cellula matura senza passare attraverso uno stato pluripotente11. Trasformare le cellule cerebrali residenti in nuovi neuroni per sostituire quelli persi a causa di lesioni rappresenta una strada interessante per il ripristino del cervello. L'ictus è un bersaglio ideale per i trattamenti basati sulle cellule, data la necessità di metodi terapeutici per sostituire i neuroni persi, ampliare il periodo terapeutico e, in ultima analisi, facilitare il recupero funzionale. A tal fine, ci sono stati molti articoli che dimostrano la riprogrammazione da astrociti a neurone (AtN) in vitro e in vivo, utilizzando una varietà di fattori di trascrizione neurogenica basic-helix-loop-helix (bHLH), tra cui Ascl1, Neurog2, Neurod1 e, più recentemente, versioni mutate di Ascl1 (Ascl1-SA6) che hanno dimostrato una migliore efficacia di riprogrammazione 11,12,13,14. È importante considerare i numerosi fattori di progettazione sperimentale che possono influenzare i risultati, l'interpretazione e il confronto tra gli studi. Ghazale et al. hanno dimostrato che l'efficienza di riprogrammazione dell'AtN variava tra diversi ceppi di topo, sierotipi di AAV e promotori quando si utilizzava lo stesso fattore di trascrizionebHLH 14. Altre considerazioni, come il modello di lesione, la regione cerebrale, il dosaggio virale, i tempi di consegna del gene, il fattore di riprogrammazione e la modalità di consegna, influenzeranno i risultati. Recenti studi hanno dimostrato che i neuroni trasdotti preesistenti sono stati erroneamente interpretati come neuroni riprogrammati15,16. Sebbene i rapporti non neghino necessariamente che si verifichi la conversione di AtN, questi studi hanno evidenziato l'importanza di esperimenti ben controllati e diversi articoli hanno formulato raccomandazioni per i prossimi passi nel campo 15,17,18,19. Ciò che risulta evidente dalla letteratura è che l'espressione ectopica dei fattori di trascrizione bHLH può migliorare gli esiti funzionali in una varietà di modelli animali di malattia/lesione neurodegenerativa 13,20,21,22,23,24.

In questo caso, questo protocollo Neurod1, un fattore di trascrizione di interesse, è espresso ectopicamente nelle cellule trasdotte13,22. Viene utilizzato il modello ben consolidato di endotelina-1 (ET-1) dell'ictus ischemico alla corteccia sensomotoria nei topi adulti. L'iniezione di ET-1 porta a vasocostrizione locale che imita la fisiopatologia dell'ictus ischemico, inclusa la compromissione funzionale 22,23,25. Il promotore corto di GFAP comunemente impiegato (gfaABC(1)D) viene utilizzato per guidare l'espressione ectopica di Neurod1 nel sito della lesione e nella regione perilesionale utilizzando due strategie virali: (1) somministrazione di AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre in topi wild-type e (2) somministrazione di AAV5-GFAP-Neurod1-Cre in topi reporter tdTom-Cre. Per comprendere ulteriormente il potenziale di espressione ectopica di Neurod1 nel cervello danneggiato da ictus, gli AAV sono stati somministrati nella fase subacuta (7 giorni) o nella fase cronica (21 giorni), dopo l'ictus. In entrambi i paradigmi, sono stati trovati un numero significativamente maggiore di neuroni marcati entro poche settimane dall'espressione ectopica di Neurod1.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo è stato approvato dall'Animal Care Committee dell'Università di Toronto e aderisce alla Guida alla cura e all'uso degli animali da esperimento (2a edizione, Canadian Council on Animal Care, 2017). Per questo studio, il reporter tdTom-Cre wild-type (C57BL/6J) e transgenico (B6. Sono stati utilizzati ceppi di topo Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 . I topi avevano 7-9 settimane e includevano sia maschi che femmine. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Chirurgia dell'ictus con endotelina-1

NOTA: Tutti gli strumenti e i materiali chirurgici vengono sterilizzati in autoclave prima dell'intervento chirurgico. Il telaio stereotassico viene sterilizzato con PREempt. Le siringhe vengono sterilizzate con PREempt, alcol al 70% e innescate con PBS sterile prima dell'intervento chirurgico. L'endotelina-1 (ET-1) viene immagazzinata nel ghiaccio durante l'intervento chirurgico.

  1. Prima di iniziare l'intervento, allestire l'area di recupero posizionando una gabbia pulita su un termoforo impostato a 37 °C. In alternativa, se si utilizza una lampada riscaldante, posizionare solo metà della gabbia sotto il fuoco.
    1. Per anestetizzare i topi usando l'isoflurano, seguire il protocollo approvato dal Comitato per la cura degli animali. Posizionare il mouse nella camera di induzione dell'anestetico e accendere l'ossigeno a 1-1,5 L/min, quindi regolare il vaporizzatore di isoflurano al 3%-5% per avviare l'anestesia.
  2. Rimuovi l'animale dalla camera una volta che si sdraia su un fianco e non può più stare in piedi, e posizionalo su una superficie pulita. Assicurarsi che l'animale sia adeguatamente anestetizzato confermando l'assenza di un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi prima e durante l'intervento.
    1. Fissare il cono nasale esteso dalla macchina anestetica sull'animale e regolare l'isoflurano all'1%-2% per il mantenimento. Ridurre al minimo l'esposizione all'isoflurano (5 minuti al 3%-5% per l'induzione e il tempo rimanente all'1%-2%), poiché la procedura può richiedere fino a 40 minuti per essere completata.
  3. Utilizzare tagliapeli di animali per rimuovere il pelo dal collo/dietro le orecchie al naso dell'animale per esporre la pelle del cranio per l'intervento chirurgico.
  4. Pesare l'animale e somministrare la dose appropriata di analgesico preoperatorio per via sottocutanea (Meloxicam (2,0 mg/kg)) in base al peso.
  5. Applicare un unguento lubrificante per gli occhi su ciascun occhio del topo per prevenire l'essiccazione della cornea durante l'anestesia.
  6. Sterilizzare l'area della pelle tagliata dal pelo (passaggio 1.3) con etanolo al 70%, seguito da alcol clorexidina due volte per formare un campo chirurgico.
  7. Trasferisci il mouse su una cornice stereotassica del topo posizionando prima il naso nel cono stereotassico, quindi stabilizza il cranio con le barre auricolari. Tenere il mouse su un termoforo impostato a 37 °C per un supporto termico durante tutta la procedura chirurgica. Mantenere l'isoflurano all'1%-2% in modo che il topo mostri una frequenza respiratoria di 1 respiro/s.
  8. Se necessario, ripetere l'applicazione della lubrificazione oculare per prevenire l'essiccazione della cornea durante la procedura. Applicare un telo chirurgico sterile sul corpo del topo, sotto le orecchie, per estendere le dimensioni del campo sterile.
  9. Praticare un'incisione verticale parallela al piano sagittale dell'animale da dietro il punto medio degli occhi fino alla parte posteriore della testa (osso parietale) con una lama di bisturi #10. Esporre il cranio ritraendo delicatamente la pelle verso i lati.
  10. Usa un cotton fioc per interrompere la fascia sul cranio e lasciare che il cranio si asciughi per esporre il bregma.
  11. Installare i bracci del manipolatore con il supporto del trapano che trasporta un trapano stereotassico ad alta velocità con una punta da trapano da .018".
  12. Praticare 3 fori di fresatura (diametro .018") con un trapano stereotassico ad alta velocità alle coordinate nella corteccia sensomotoria destra a 2,25 mm lateralmente alla bregma e +0,0 mm rostrale, +1,0 mm rostrale e -1,0 mm caudale alla bregma.
  13. Sostituire il trapano con una siringa da 26 G con un ago lungo 0.375".
  14. Caricare nella siringa 1,5 μl di 400 μM di ET-1 disciolto in PBS sterile. Per garantire un buon flusso, rilasciare un piccolo volume di ET-1 fino a quando non si può osservare una goccia sulla punta dell'ago. Utilizzare un cotton fioc sterile per rimuovere l'eccesso prima di eseguire un'iniezione.
  15. Abbassare la punta dell'ago oltre il cranio nel foro centrale della bava (nella corteccia sensomotoria destra a + 0,0 mm anteriormente e 2,25 mm lateralmente alla bregma) senza forare la dura madre. Una volta allineato, abbassare l'ago di 1 mm nel cervello.
  16. Iniettare 1 μL di ET-1 erogando 0,1 μL alla volta. Spingere in avanti lo stantuffo della siringa Hamilton per erogare 0,1 μl e attendere un minuto prima di iniettare i successivi 0,1 μl, iniettare fino a quando non è stato erogato 1 μl.
    1. Dopo che gli ultimi 0,1 μl sono stati erogati (0,1 μl x 10 iniezioni = 1 μl totale), tenere l'ago in posizione per 10 minuti per evitare il riflusso e quindi ritirarlo lentamente verso l'alto per rimuovere la siringa.
  17. Per assicurarsi che l'ago non si blocchi durante l'iniezione, rilasciare un piccolo volume di ET-1 fino a quando non si può osservare una goccia sulla punta dell'ago. Utilizzare un cotton fioc sterile per rimuovere l'eccesso prima di eseguire un'iniezione. Sterilizzare le siringhe prima di iniettare all'animale successivo PREempt, seguito da alcol al 70% e poi PBS sterile.
  18. Per chiudere la ferita, suturare insieme la pelle sovrastante del cranio utilizzando una sutura sterile in poliestere polisorbito 4-0.
  19. Somministrare un unguento antibiotico utilizzando un batuffolo di cotone sulla zona suturata per prevenire l'infezione post-operatoria.
  20. Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico e trasferirlo in una gabbia per animali pulita e preriscaldata nell'area di recupero. Spegni il vaporizzatore di isoflurano e l'ossigeno.
  21. Tenere la gabbia sopra un termoforo per tutta la durata del recupero dall'anestesia. In alternativa, se si utilizza una lampada riscaldante, posizionare il mouse sul lato della gabbia sotto la lampada in modo che il mouse possa spostarsi sul lato freddo della gabbia quando si sveglia dall'anestesia per evitare il surriscaldamento. Monitora il mouse mentre esce dall'anestesia nei prossimi 5-10 minuti.
  22. Monitorare il mouse nei successivi 3 giorni (monitoraggio del peso), fornire assistenza post-operatoria (purè di cibo umido per garantire l'idratazione) e analgesici (2 mg/kg di meloxicam, 2 volte al giorno per via sottocutanea, per 2-3 giorni) in conformità con le normative stabilite dal comitato locale per la cura degli animali.

2. Somministrazione di virus adeno-associati (AAV) (7 giorni - modello subacuto o 21 giorni - modello cronico) dopo l'ictus

ATTENZIONE: Fare riferimento alle linee guida istituzionali sulla biosicurezza per lavorare con gli AAV. Secondo le linee guida dell'Università di Toronto, questo intervento chirurgico viene eseguito in una cabina di biosicurezza di livello 2 di contenimento.

NOTA: Tutti gli strumenti e i materiali chirurgici vengono sterilizzati in autoclave prima dell'intervento chirurgico. Il telaio stereotassico viene sterilizzato con PREempt. Le siringhe sono sterilizzate con PREempt, alcol al 70% e innescate con PBS sterile. Gli AAV vengono conservati sul ghiaccio durante l'intervento chirurgico.

  1. Prima di iniziare l'intervento, allestire l'area di recupero posizionando una gabbia pulita su un termoforo impostato a 37 °C. In alternativa, se si utilizza una lampada riscaldante, posizionare solo metà della gabbia sotto il fuoco.
    1. Per anestetizzare i topi usando l'isoflurano, posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestetico e accendere l'ossigeno a 1-1,5 L/min, quindi regolare il vaporizzatore di isoflurano al 3%-5% per iniziare l'anestesia (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
  2. Rimuovi l'animale dalla camera una volta che si sdraia su un fianco e non può più stare su una superficie pulita. Assicurarsi che l'animale sia adeguatamente anestetizzato confermando l'assenza di un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi prima e durante l'intervento.
    1. Fissare il cono nasale esteso dalla macchina anestetica sull'animale e regolare l'isoflurano all'1%-2% per il mantenimento. Ridurre al minimo l'esposizione all'isoflurano (5 minuti al 3%-5% per l'induzione e il tempo rimanente all'1%-2%), poiché la procedura può richiedere fino a 40 minuti per essere completata.
  3. Pesare l'animale e somministrare la dose appropriata di analgesico preoperatorio per via sottocutanea (Meloxicam (2,0 mg/kg)) in base al peso.
  4. Applicare un unguento lubrificante per gli occhi su ciascun occhio del topo per evitare che l'essiccazione corneale sia sotto anestesia.
  5. Sterilizzare l'area della pelle tagliata con etanolo al 70%, seguito da alcol clorexidina due volte per formare un campo chirurgico.
  6. Trasferisci il mouse su una cornice stereotassica del topo posizionando prima il naso nel cono stereotassico, quindi stabilizza il cranio con le barre auricolari. Tenere il mouse su un termoforo impostato a 37 °C per un supporto termico durante tutta la procedura chirurgica. Mantenere l'isoflurano all'1%-2% in modo che il topo visualizzi la frequenza respiratoria di 1 respiro/s.
  7. Se necessario, ripetere l'applicazione della lubrificazione oculare per prevenire l'essiccazione della cornea durante la procedura. Applicare un telo chirurgico sterile sul corpo del topo, sotto le orecchie, per estendere le dimensioni del campo sterile.
  8. Se ancora presente, tagliare i punti di sutura con un paio di forbici chirurgiche e rimuovere la crosta con un paio di pinze. Ritrarre la pelle per esporre il cranio.
    NOTA: Per il modello cronico potrebbe essere necessario asportare la pelle con lama di bisturi #10.
  9. Usa un cotton fioc sterile per asciugare il cranio e individuare i fori delle sbavature.
  10. Impostare i bracci manipolatori dell'apparato stereotassico con un portaaghi che trasporta una siringa da 26 G con un ago lungo 0,375".
  11. Caricare 3,4 μL di AAV (1 x 109 copie del genoma (GC)/μL per lo studio acuto; 1 x 1010 GC/μL per lo studio cronico) nella siringa. Per garantire che il flusso sia buono, rilasciare un piccolo volume di AAV fino a quando non si può osservare una goccia sulla punta dell'ago. Utilizzare un cotton fioc sterile per rimuovere l'eccesso prima di eseguire un'iniezione.
  12. Abbassare la punta dell'ago oltre il cranio nel primo foro di bava utilizzato per ET-1 (nella corteccia sensomotoria destra a + 0,0 anteriormente e 2,25 mm lateralmente alla bregma) senza forare la dura madre. Una volta allineato, abbassare l'ago di 1 mm nel cervello. (0 AP, +2,25 ML, -1,0 DV da bregma).
  13. Iniettare 1 μL di AAV (1 x 109 GC/μL per lo studio acuto; 1 x 1010 GC/μL per lo studio cronico) dispensando 0,1 μL alla volta. Spingere in avanti lo stantuffo della siringa Hamilton per erogare 0,1 μl e attendere un minuto prima di iniettare i successivi 0,1 μl; iniettare fino a quando non è stato erogato 1 μL. Dopo che gli ultimi 0,1 μl sono stati erogati (0,1 μl x 10 iniezioni = 1 μl totale), tenere l'ago in posizione per 10 minuti per evitare il riflusso e quindi ritirarlo lentamente verso l'alto per rimuovere la siringa.
  14. Per assicurarsi che l'ago non si blocchi durante l'iniezione, rilasciare una piccola quantità di AAV fino a quando non si può osservare una goccia sulla punta dell'ago. Utilizzare un cotton fioc sterile per rimuovere l'eccesso prima di eseguire un'iniezione.
  15. Ripetere i passaggi 2.11-2.14 per le iniezioni di AAV nei due fori di bava rimanenti (nella corteccia sensomotoria destra a +1 AP, +2,25 ML, -1,0 DV; e -1 AP, +2,25 ML, -1,0 DV mm da bregma. Sterilizzare le siringhe prima di iniettare l'animale successivo con PREempt, seguito da alcol al 70% e infine PBS sterile.
  16. Per chiudere la ferita, suturare insieme la pelle sovrastante del cranio utilizzando una sutura sterile in poliestere polisorbito 4-0.
  17. Somministrare un unguento antibiotico utilizzando un batuffolo di cotone sull'area suturata per prevenire l'infezione post-operatoria.
  18. Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico e trasferirlo in una gabbia per animali pulita e preriscaldata nell'area di recupero. Spegni il vaporizzatore di isoflurano e l'ossigeno.
  19. Tieni il mouse all'interno della gabbia e sterilizza l'esterno della gabbia con PREempt e alcol al 70% prima di posizionarlo sopra un termoforo per il recupero dall'anestesia.
    1. In alternativa, se si utilizza una lampada riscaldante, posizionare il mouse sul lato della gabbia sotto la lampada in modo che il mouse possa spostarsi sul lato freddo della gabbia quando si sveglia dall'anestesia per evitare il surriscaldamento. Monitora il mouse mentre esce dall'anestesia nei prossimi 5-10 minuti.
  20. Monitorare il mouse nei successivi 3 giorni (monitoraggio del peso), fornire assistenza post-operatoria (purè di cibo umido per garantire l'idratazione) e analgesici (2 mg/kg di meloxicam, 2 volte al giorno per via sottocutanea, per 2-3 giorni) in conformità con le normative stabilite dal comitato locale per la cura degli animali.

3. Preparazione e dissezione dei tessuti

  1. Per l'eutanasia del topo, iniettare intraperitonealmente il topo con tribromoetanolo (Avertin) (conc. 12,5 mg/mL, 250 mg/BW (kg)) e attendere 2-3 minuti per l'induzione completa. Assicurarsi che l'animale sia adeguatamente anestetizzato rimuovendo il topo dalla gabbia e confermando l'assenza di un riflesso di pizzicamento delle dita.
  2. In una cappa aspirante, eseguire la perfusione transcardica26 con soluzione fisiologica seguita da paraformaldeide al 4%. Spruzzare la testa dell'animale soppresso con etanolo al 70% fino a quando non è in ammollo.
  3. Taglia la testa alla base del cranio usando un paio di forbici grandi. Taglia la pelle lungo la linea mediana dell'intero cranio usando le forbici dell'iride dritte da 4-1/2". Ritrarre la pelle per esporre il cranio.
  4. Dall'apertura della cavità spinale al collo, inserire le forbici dell'iride e tagliare il cranio lungo la sutura sagittale e interfrontale.
  5. Quindi inserire le forbici nelle due orbite oculari e tagliare la sutura frontale-nasale.
  6. Prestare particolare attenzione a non danneggiare il cervello. Aprire le placche craniche a sinistra e a destra fino a quando il cervello non è esposto.
  7. Trasferire il cervello in una fiala di scintillazione con paraformaldeide al 4%. Mantenere il cervello in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 4 ore.
  8. Il cervello viene quindi crioprotetto sostituendo il 4% di paraformaldeide con il 30% di saccarosio. Mantenere il cervello in saccarosio al 30% a 4 °C fino a quando il cervello non affonda sul fondo della fiala (~12 h).

4. Sezionamento di cervelli congelati

  1. Impostare la temperatura della camera del criostato tra -20 °C e -26 °C.
  2. Praticare un taglio coronale attraverso il cervelletto e attaccare la parte piatta e caudale del cervello su un mandrino criostato con composto a temperatura di taglio ottimale (OCT).
  3. Posizionare il mandrino con il cervello nel portadisco e allineare il bulbo olfattivo con la lama del coltello.
  4. Sezionare il cervello in fette coronali con uno spessore di 20 μm. Per evitare striature o linee di graffio sulle fette di cervello sezionate, posizionare un pezzo di nastro adesivo sulla piattaforma di sezionamento per creare un piccolo spazio tra la piastra anti-rotolamento e la piattaforma. È possibile utilizzare un pennello per regolare l'orientamento della sezione prima di catturarla su un vetrino caricato positivamente.
  5. Conservare i vetrini contenenti sezioni cerebrali a -20 °C.

5. Immunoistochimica e quantificazione

  1. Processare le sezioni per l'immunoistochimica utilizzando un anticorpo primario contro NeuN, un marcatore pan-neuronale, secondo i protocolli standard22,26.
  2. Scongelare le sezioni cerebrali crioconservate per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare le sezioni tre volte con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 5 minuti ciascuna.
  3. Incubare le sezioni in Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzarle.
  4. Preparare la soluzione bloccante (5% di siero normale di capra e 0,3% di Triton X-100 in PBS) e incubare le sezioni nella soluzione bloccante per 1 ora a temperatura ambiente.
  5. Diluire l'anticorpo primario, l'anti-NeuN di coniglio, in rapporto 1:500 nella soluzione bloccante. Incubare le sezioni con la soluzione di anticorpi primari per una notte a 4 °C.
  6. Lavare le sezioni tre volte con Triton X-100 allo 0,3% in PBS, per 5 minuti ogni lavaggio.
  7. Diluire l'anticorpo secondario, capra anti-coniglio 568 o 488, in un rapporto 1:1000 in PBS. Incubare le sezioni con la soluzione di anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
  8. Eseguire tre lavaggi con Triton X-100 allo 0,3% in PBS, per 5 minuti ciascuno. Incubare le sezioni con DAPI (1:10.000 in PBS) per 5 minuti a temperatura ambiente.
  9. Lavare le sezioni altre tre volte con PBS, per 5 minuti ciascuna. Montare le sezioni colorate su un vetrino con un mezzo di montaggio a fluorescenza e un vetrino coprioggetti. Lasciare asciugare i vetrini montati durante la notte.
  10. Immagini di vetrini colorati utilizzando un obiettivo 20x con un microscopio confocale per ottenere viste delle cellule Reporter+ attorno alla lesione dell'ictus in 3 diverse sezioni coronali (tra le regioni anatomiche dell'incrocio del corpo calloso anteriormente e l'incrocio della commessura anteriore posteriormente) per ciascun animale.
    NOTA: La distanza della diffusione AAV varierà all'interno dell'emisfero. Tuttavia, in base alla nostra esperienza e all'analisi post-processazione tissutale delle cellule Reporter+, la diffusione dell'AAV generalmente si estende da circa +3 mm a -3 mm dal bregma. Devono essere quantificate le cellule reporter+ intorno alla lesione dell'ictus (identificate dall'assenza/colorazione sparsa di NeuN) nell'area tra il punto in cui il corpo calloso attraversa la linea mediana e la commessura anteriore si collega.
  11. Per la quantificazione dei neuroni trasdotti, eseguire l'analisi di colocalizzazione. Conta manualmente il numero di cellule doppie positive (Reporter+NeuN+) e il numero totale di cellule trasdotte (Reporter+) nelle fette di cervello. Per i risultati qui presentati, sono stati contati >3 campi visivi che circondano la lesione (mediale, laterale e inferiore) da 3 sezioni coronali per topo.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esaminare gli esiti cellulari dell'espressione ectopica di Neurod1 guidata dal promotore di breve GFAP (gfaABC(1)D) in ceppi reporter tdTom-Cre wild-type (C57BL/6J) e transgenici (in particolare, B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 due sistemi basati su AAV5 sono stati utilizzati in topi con ictus ET-1 (Figura 1A-C). In un modello subacuto di ictus, Neurod1 è stato impacchettato nel sistema Cre-Flex AAV e somministrato a topi wild-type al giorno 7 dopo l'ictus (Figura 1B). Il secondo vettore Flex contiene la sequenza invertita per la GFP guidata dal promotore CAG che è affiancata da siti di ricombinazione eterotipici e antiparalleli di tipo loxP (Figura 1B). Entrambi i costrutti virali vengono iniettati insieme nello stesso momento dopo l'ictus. Una volta che Cre è espresso nelle cellule trasdotte, la GFP viene invertita e asportata nei siti di ricombinazione, orientando la sequenza nella direzione di senso, che consente l'espressione di GFP. Quindi, le cellule che esprimono Cre saranno GFP positive, indicando che sono state trasdotte dai vettori Cre-Flex. Nel modello subacuto, i topi sono stati sacrificati a 21 giorni dopo la trasduzione (cioè 28 giorni dopo l'ictus) e il numero di cellule trasdotte (GFP+), così come il numero di cellule NeuN+GFP+ (cellule trasdotte che esprimono NeuN), sono stati contati nel parenchima del cervello danneggiato dall'ictus. Come si vede nella Figura 2A, i neuroni vengono persi nel sito della lesione ischemica. La quantificazione delle cellule trasdotte nel paradigma subacuto utilizzando il sistema Cre-Flex AAV rivela un numero significativamente maggiore di neuroni marcati (cellule NeuN+GFP+/GFP+) nei topi trattati con Neurod1 rispetto ai topi di controllo Stroke-Cre (43,05 +/- 5,50% vs. 18,43 +/- 3,03% di cellule NeuN+GFP+/GFP+, in Stroke-Neurod1 vs. Topi trattati con Stroke-Cre (controllo), rispettivamente) (p = 0,0172) (Figura 2B, C).

In una serie separata di esperimenti, la conversione di AtN è stata eseguita in un modello cronico di ictus (Figura 1B, C). Il fattore di trascrizione Neurod1 è stato somministrato a topi reporter tdTom-Cre con lesioni da ictus ET-1 il giorno 21 dopo l'ictus (Figura 1C). Identico al sistema Cre-Flex utilizzato nei topi wild-type, l'espressione di Neurod1 è stata guidata dal promotore corto di GFAP. Tuttavia, in questo sistema, è stato utilizzato un singolo costrutto AAV con Cre ricombinasi dopo Neurod1 (Figura 1B). Quindi, le cellule che esprimono GFAP produrranno Cre ricombinasi, inducendo il reporter tdTom, indicando le cellule che sono state trasdotte da AAV. I topi sono stati sacrificati a 77 giorni dopo l'ictus (8 settimane dopo l'AAV) (Figura 1C). Come si vede nella Figura 3A, una lesione corticale è osservata al giorno 77 dopo l'ictus nei topi tdTom-Cre. Il numero di cellule trasdotte che esprimono il marcatore neuronale, NeuN+, è stato quantificato (percentuale relativa di (cellule NeuN+tdTom+/tdTom+) nella fase cronica post-ictus e ha scoperto che i topi che hanno ricevuto Stroke-Neurod1 avevano significativamente più neuroni marcati rispetto ai topi di controllo Stroke-Cre (74,81 +/- 4,835% vs. 53,05 +/- 5,028% NeuN+tdTom+/tdTom+ cellule in Stroke-Neurod1vs. Topi trattati con Stroke-Cre (controllo), rispettivamente) (p = 0,0355) (Figura 3B, C).

Nel complesso, i risultati dimostrano la trasduzione basale dei neuroni e un numero più elevato di cellule trasdotte che esprimono NeuN+ con la somministrazione di Neurod1 sia nella fase subacuta che in quella cronica post-ictus in topi reporter wild-type e tdTom-Cre, con due diversi sistemi basati su AAV.

figure-results-1
Figura 1: Espressione ectopica di Neurod1, vettori e linee temporali. (A) Rappresentazione grafica dell'induzione dell'ictus mediante iniezione di endotelina-1 (ET-1) nella corteccia motoria del topo. Il virus adeno-associato (AAV) è stato somministrato in 3 siti, nel sito di iniezione ET-1 e nei siti circostanti la lesione, 1 mm anteriormente e posteriormente. Pannello ingrandito che mostra le cellule trasdotte con AAV-Neurod1 nella corteccia motoria. (B) Schema dei due vettori AAV nel sistema Cre-Flex somministrati a topi wild-type (pannello superiore). Il vettore 1 di AAV5 contiene il promotore corto di GFAP, il fattore di trascrizione Neurod1 e la sequenza ricombinasi Cre affiancati da un sito loxP (triangolo nero) e da un sito lox2272 (triangolo bianco). Il vettore 2 di AAV5 trasporta la sequenza reporter del gene GFP invertita affiancata da una coppia di siti loxP e lox2272. La trasduzione di entrambi i vettori nelle cellule provoca l'escissione e l'inversione mediata da Cre, consentendo all'espressione di GFP di marcare le cellule trasdotte. Neurod1 è stato anche somministrato a topi tdTom-Cre utilizzando un vettore AAV5 (pannello inferiore). Nel vettore AAV5 1 sono raggruppati il promotore corto di GFAP, il fattore di trascrizione Neurod1 e la sequenza ricombinasi Cre. L'espressione di Cre nelle cellule trasdotte guida l'escissione del codone Stop nei siti loxP (triangolo nero), consentendo l'espressione di tdTomato. (C) Il sistema Cre-Flex è stato testato su topi wild-type con AAV iniettati nel periodo subacuto post-ictus (giorno 7 post-ictus). I topi wild-type sono stati sacrificati 21 giorni dopo la trasduzione dell'AAV (28 giorni dopo l'ictus). L'AAV è stato somministrato ai topi tdTom-Cre nel periodo cronico post-ictus (giorno 21 post-ictus) e i topi sono stati sacrificati 56 giorni dopo la trasduzione dell'AAV (77 giorni dopo l'ictus). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: La somministrazione ectopica di Neurod1 con gli AAV Cre-Flex nella fase subacuta post-ictus porta ad un aumento del numero di cellule trasdotte che esprimono NeuN. (A) Immunocolorazione delle sezioni coronali del cervello attraverso la corteccia motoria al giorno 28 dopo l'ictus da topi di controllo Stroke-Cre (a sinistra) e Stroke-Neurod1 (a destra). Si osserva una perdita neuronale nel sito della lesione (linee tratteggiate bianche). Nella corteccia si osservano cellule trasdotte (GFP+, verde), neuroni (NeuN+, rosso) e cellule NeuN+GFP+ (arancioni) colocalizzate. Barre della scala: 250 μm. (B) Immagini rappresentative del tessuto cerebrale di controllo Stroke-Cre (in alto) e Stroke-Neurod1 (in basso) che mostrano neuroni (NeuN+, rosso) e GFP+ trasdotta AAV (verde). I riquadri delineati in bianco mostrano un primo piano delle celle per ogni singolo canale. Le punte di freccia bianche indicano le cellule trasdotte da AAV (GFP+). Le frecce bianche indicano le cellule NeuN+GFP+ colocalizzate. Barre della scala: 125 μm. (C) Quantificazione delle cellule NeuN+GFP+/GFP+ in topi Stroke-Cre e Stroke-Neurod1 . N = 3 topi per gruppo. I dati sono rappresentati come media ± SEM. Test di Shapiro-Wilk (p = 0,3223). Test t non appaiato, *p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: La somministrazione ectopica di Neurod1 nei topi reporter tdTom-Cre nella fase cronica post-ictus porta ad un aumento del numero di cellule trasdotte che esprimono NeuN. (A) Immunocolorazione di sezioni cerebrali coronali attraverso la corteccia motoria al giorno 77 dopo l'ictus da topi di controllo Stroke-Cre e Stroke-Neurod1 . La perdita neuronale si osserva nel sito della lesione ischemica (linee tratteggiate bianche). Le cellule trasdotte sono marcate con tdTom (rosso) nel peri-infarto. NeuN+tdTom+ (arancione) sono cellule trasdotte che esprimono marcatori neuronali. Barre della scala: 250 μm. (B) Immagini rappresentative del tessuto cerebrale di controllo Stroke-Cre (in alto) e Stroke-Neurod1 (in basso) che mostrano neuroni (NeuN+, verde) e cellule trasdotte AAV (tdTom+, rosso). I riquadri delineati in bianco mostrano un primo piano delle celle per ogni singolo canale. Le punte di freccia bianche indicano le cellule trasdotte AAV (tdTom+). Le frecce bianche indicano le celle NeuN+tdTom+ colocalizzate. Barre della scala: 125 μm. (C) La quantificazione delle cellule NeuN+tdTom+/tdTom+ nel paradigma cronico mostra un numero significativamente maggiore di cellule trasdotte che esprimono NeuN+ (cellule NeuN+tdTom+/tdTom+) nei topi trattati con Neurod1 . N = 3 topi per gruppo. I dati sono rappresentati come media ± SEM. Test di Shapiro-Wilk (p = 0,2044). Test t non appaiato, *p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive in dettaglio due sistemi AAV e modelli murini per studiare l'espressione ectopica di Neurod1 nel contesto di un modello di ictus corticale ET-1 lieve-moderato. Una serie di passaggi critici relativi all'ictus ET-1 sono importanti da considerare per la riproducibilità e la consistenza della lesione. I fori di fresatura devono essere praticati con cura senza forare la dura madre per evitare lesioni chirurgiche involontarie. È importante utilizzare punti di riferimento coerenti, in questo caso bregma, per garantire una regione di interesse simile (corteccia sensomotoria in questo studio). Ciò è particolarmente importante per gli studi che utilizzano valutazioni comportamentali poiché la posizione e le dimensioni della lesione influenzeranno i risultati funzionali 13,22,25,27. Ancora più importante, la velocità di iniezione di ET-1 e la pressione applicata dal chirurgo sulla siringa devono essere coerenti per ottenere risultati riproducibili. Da notare che l'ago della siringa può ostruirsi e deve essere pulito tra gli animali per garantire un'erogazione ET-1 accurata. Durante l'analisi cellulare del tessuto, se non si osserva una lesione da ictus, è probabile che l'ago si sia intasato durante l'intervento chirurgico. Se il problema persiste, procurati un nuovo lotto di endotelina-1 dal produttore, poiché in passato sono stati osservati problemi di potenza dipendente dal lotto.

Le fasi della procedura chirurgica per la somministrazione di AAV sono simili a quelle del protocollo di induzione dell'ictus ET-1. Pertanto, le considerazioni di cui sopra sono fondamentali. Inoltre, il titolo virale e il volume dell'AAV devono essere coerenti per garantire che l'efficienza di trasduzione possa essere confrontata tra i gruppi. In questo protocollo, sono stati somministrati 1 x 109 GC/μL di AAV per lo studio acuto e 1 x 1010 GC/μL di AAV per lo studio cronico. È fondamentale selezionare una dose virale sufficientemente bassa da ridurre al minimo l'errata espressione artefatta, pur essendo sufficientemente alta da garantire una trasduzione cellulare sufficiente, consentendo il rilevamento delle differenze tra i gruppi sperimentali. L'intervallo di dose virale ottimale per tali studi è stato determinato essere 107-10 10 GC/μL13,24. Titoli più elevati di AAV non solo provocano un'ampia marcatura dei neuroni nel gruppo di controllo, ma hanno anche dimostrato di indurre astrocitosi, interrompere la barriera emato-encefalica e sovraregolare le risposte infiammatorie 28,29. Gli studi che indagano la somministrazione del fattore di trascrizione mediata da virus dopo l'ictus hanno utilizzato diversi siti di somministrazione per le iniezioni di AAV. Uno studio ha descritto il successo dell'etichettatura delle cellule trasdotte utilizzando una singola iniezione di AAV nel sito13 della lesione dell'ictus. Altri studi si concentrano su una o tre aree intorno all'area dell'infarto30. In questo caso, l'AAV è stato somministrato in tre posizioni, con un'iniezione alle coordinate del sito dell'iniezione ET-1 e 2 intorno al sito della lesione (un'iniezione a 1,0 mm anteriormente e un'iniezione a 1,0 mm posteriormente) con l'obiettivo di trasdurre gli astrociti reattivi nel bordo gliale perilesionale9. Durante l'analisi cellulare dei tessuti, se non si osservano o si osservano pochissime cellule fluorescenti (1-10 cellule/sezione), l'ago potrebbe essersi ostruito durante l'iniezione o l'AAV è stato congelato e scongelato troppe volte, portando all'inattivazione del virus.

L'efficienza della trasduzione è stata esaminata in momenti diversi nel modello di ictus lieve-moderato e i risultati dimostrano che un numero significativamente maggiore di neuroni viene marcato nei cervelli trattati con Neurod1 sia nei momenti subacuti che cronici post-ictus. Il lavoro mostrato qui è il primo a dimostrare la trasduzione di Neurod1 nella fase cronica post-ictus e rivela neuroni che esprimono ectopicamente Neurod1 fino a 8 settimane dopo l'ictus. Mentre i risultati che un aumento del numero di neuroni trasdotti sono stati osservati in cervelli danneggiati da ictus che hanno ricevuto Neurod1 rispetto ai vettori di controllo sono coerenti con il ruolo di Neurod1 nella conversione di AtN, l'interpretazione dei risultati cellulari richiede una solida conoscenza dei limiti del paradigma sperimentale. La stragrande maggioranza degli studi pubblicati che indagano la conversione di AtN utilizzano GFAP come promotore poiché GFAP è sovraregolato negli astrociti reattivi nelle malattie neurodegenerative, incluso l'ictus 4,31. Tuttavia, è stato dimostrato che una bassa espressione di GFAP si verifica anche nei neuroni32. Ciò è coerente con i risultati qui riportati in cui una percentuale di cellule trasdotte nel gruppo di controllo (Stroke-Cre) sono neuroni preesistenti32. In particolare, i gruppi di controllo Stroke-Cre in questo protocollo hanno mostrato un'etichettatura del 18,43 +/- 3,03% e del 53,05 +/- 5,028% delle cellule NeuN+Reporter+, che rappresenta l'etichettatura dei neuroni preesistenti, indicando l'espressione guidata dal promotore GFAP nei neuroni. Infatti, l'espressione mirata di Neurod1 dipende da una serie di fattori, tra cui il tropismo virale. È stato dimostrato che AAV5 trasduce neuroni con diversa efficienza in diverse regioni del cervello, inclusa la corteccia sensomotoria, indicando che i sierotipi AAV hanno un tropismo cellulare regionale, che deve essere considerato negli studi che inducono l'espressione ectopica dei fattori di trascrizione31,33. Anche i ceppi di topo possono influenzare la trasduzione dell'AAV14,34. Uno studio che ha confrontato la trasduzione dell'AAV nello striato di topi wild-type (C57BL/6J) e FVB/N ha rilevato un tropismo cellulare variabile e un'efficienza di trasduzione nei due ceppi34.

Un vantaggio del sistema Cre-Flex è che può essere utilizzato per la marcatura a lungo termine in topi wild-type, il che può ridurre il problema dell'espressione non specifica di Cre presente nelle linee di topo Cre-reporter15,35. Uno svantaggio del sistema Cre-Flex è che l'espressione del transgene Cre-indipendente può verificarsi a causa dello 0,1%-0,8% delle particelle virali che hanno ricombinato i siti LoxP durante la produzione virale36. Questi risultati evidenziano l'importanza degli esperimenti di tracciamento del lignaggio, ad esempio la pre-marcatura degli astrociti prima della somministrazione di AAV utilizzando la linea murina Aldh1l1-CreERT2, per garantire che la conversione di AtN non sia sovrastimata quando si riportano le conclusioni15. Gli studi hanno suggerito che l'attivazione del promotore umano della GFAP (come utilizzato in questi studi) attraverso la cis-regolazione da parte di geni a valle (come Neurod1) può provocare l'espressione di GFAP nei neuroni endogeni, portando a un numero più elevato di neuroni marcati nel gruppo di trattamento15,32. Insieme, questi studi e i risultati qui riportati evidenziano l'importanza degli esperimenti di tracciamento del lignaggio, ad esempio, la pre-marcatura di astrociti o neuroni prima della somministrazione di AAV, per differenziare tra neuroni preesistenti ed endogeni durante l'analisi15.

Nel considerare i prossimi passi che potrebbero ridurre la trasduzione neuronale, sarebbero utili diversi sierotipi di AAV e/o l'uso di un promotore astrocitario-specifico meno promiscuo19. Un numero crescente di segnalazioni che descrivono l'eterogeneità degli astrociti può avere un ulteriore impatto sulla specificità dell'espressione genica se diverse sottopopolazioni di astrociti sono più suscettibili alla conversione di AtN in generale 37,38,39,40.

Anche l'età degli animali utilizzati nei modelli preclinici di lesioni o malattie è una considerazione importante che può introdurre esiti variabili. Ad esempio, nel caso del neurotrauma, l'età può influenzare la reattività degli astrociti, il che influenzerebbe i risultati dello studio per la conversione AtN41. Inoltre, le linee reporter cre-inducibili possono perdere la specificità di espressione nel tempo, il che può influire sulle misure di esito42. Ad oggi, la riprogrammazione negli animali più anziani non è stata studiata in modo completo43.

Il protocollo descrive la somministrazione di AAV in 2 fasi post-ictus: (1) la fase subacuta (a 7 giorni) e (2) la fase cronica (a 21 giorni) post-ictus ischemico. L'espressione ectopica di Neurod1 in un modello di ictus cronico non è stata esaminata; Quindi, l'osservazione che un numero significativamente maggiore di neuroni viene marcato in questa fase avanzata ha importanti implicazioni per gli studi futuri volti a promuovere il recupero dall'ictus nell'ictus cronico. Gli studi che esaminano il potenziale dell'espressione ectopica di Neurod1 per migliorare gli esiti dell'ictus dovranno incorporare valutazioni comportamentali, poiché gli esiti funzionali dopo l'ictus sono le misure di successo clinicamente più rilevanti per un intervento terapeutico 13,22,25,27.

Attualmente non sono disponibili trattamenti per i pazienti affetti da disabilità indotte da ictus nelle fasi subacute e croniche post-ictus, ad eccezione della riabilitazione, che ha un beneficio limitato. È stato dimostrato che l'espressione forzata dei geni neurogeni bHLH nella glia migliora gli esiti funzionali post-ictus22,30. I risultati sono coerenti con gli studi di riprogrammazione di AtN che dimostrano che l'espressione ectopica di Neurod1 aumenta la trasduzione neuronale a 3 e 7 settimane dopo la somministrazione di AAV rispetto ai topi che ricevono il vettore di controllo. Ancora più importante, diversi articoli hanno delineato raccomandazioni per i controlli dello studio, la progettazione e le interpretazioni nel campo della riprogrammazione AtN 17,18,19,22. A tal fine, questo protocollo ha descritto sistemi AAV e modelli murini per l'espressione ectopica di fattori di trascrizione dopo ictus, che possono essere utilizzati per informare e far avanzare ulteriori indagini sui meccanismi cellulari alla base delle osservazioni.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Heart and Stroke Foundation, dall'Ontario Institute of Regenerative Medicine, dal Canada First Research Excellence Fund (Medicine by Design, MbD) e dal Connaught Innovation Award (Università di Toronto).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Punta da trapano #77 (.018")David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreVettore  Biolabs
Sutura Assorbibile con Ago Polysorb™ Ago in poliestere CV-15 3/8 cerchio conico misura 4 - 0 IntrecciatoCovidienGL-881
Anticorpo Anti-NeuN (coniglio) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 TopiCharles River027
Soluzione di clorexidinaPartnarPCH-020
Contec™   PREempt™ Soluzione disinfettante RTUFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
Feather Rasoio di Sicurezza Lame per MicrotomoFeather12-631P
Fisherbrand  Copri occhiali: RettangoliFisher Scientific12-545M 
mezzo di montaggio a fluorescenzaAgilent TechnologiesS3023 
Siringa HamiltonHamilton Company7634-01
Trapano stereotassico ad alta velocitàDavid Kopf Instruments1474
Soluzione Metacam (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
OCT CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreCostruttore di vettoriP190924-1001suq
Unguento Polyderm USPTARO2181908
SOMNI Scientific™   Il termoforo per la temperatura animaleFisher Scientific04-777-177
Strumenti stereotassiciDavid Kopf InstrumentsModello 902
Superfrost Plus Vetrini per microscopio, biancoFisherbrand12-550-15
tdTomato Reporter Mice Il Jackson Laboratory007914
V-1 Sistema di anestesia animale da tavolo da tavoloVetEquip901806

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).
  2. Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential. J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).
  3. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. Int J Mol Sci. 21 (20), 7609(2020).
  4. Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke. Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).
  5. Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
  6. Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).
  7. Silver, J. The glial scar is more than just astrocytes. Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).
  8. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  9. Adams, K. L., Gallo, V. The diversity and disparity of the glial scar. Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).
  10. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  11. Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application. Front Cell Dev Biol. 9, 681087(2021).
  12. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  13. Chen, Y. C., et al. A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion. Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).
  14. Ghazale, H., et al. Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo. Front Neurosci. 16, 917071(2022).
  15. Wang, L. L., et al. Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo. Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).
  16. Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo. EBioMedicine. 90, 104531(2023).
  17. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  18. Huang, L., et al. A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo. Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717(2024).
  19. Hickmott, J. W., Morshead, C. M. Glia-to-neuron reprogramming to the rescue. Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).
  20. Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 22490(2016).
  21. Guo, Z., et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  22. Livingston, J. M., et al. Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke. Biomedicines. 12 (3), 663(2024).
  23. Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair. Front Cell Neurosci. 14, 107(2020).
  24. Wu, Z., et al. Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease. Nat Commun. 11 (1), 1105(2020).
  25. Roome, R. B., et al. A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
  26. Islam, R., et al. Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1786(2024).
  27. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  28. Guo, Y., et al. High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain. Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102(2023).
  29. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).
  30. Jiang, M. Q., et al. Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. Front Aging Neurosci. 13, 612856(2021).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310(2013).
  32. Su, M., et al. Expression specificity of GFAP transgenes. Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).
  33. Kofoed, R. H., et al. Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas. J Control Release. 351, 667-680 (2022).
  34. He, T., et al. The influence of murine genetic background in adeno-associated virus transduction of the mouse brain. Hum Gene Ther Clin Dev. 30 (4), 169-181 (2019).
  35. Hu, N. Y., et al. Expression patterns of inducible cre recombinase driven by differential astrocyte-specific promoters in transgenic mouse lines. Neurosci Bull. 36 (5), 530-544 (2020).
  36. Botterill, J. J., et al. Off-target expression of cre-dependent adeno-associated viruses in wild-type c57bl/6j mice. eNeuro. 8 (6), ENEURO.0363-ENEURO.0421 (2021).
  37. Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).
  38. Kim, R. D., et al. Temporal and spatial analysis of astrocytes following stroke identifies novel drivers of reactivity. bioRxiv. , (2023).
  39. Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease. Front Aging Neurosci. 11, 59(2019).
  40. Miller, S. J. Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system. Front Cell Neurosci. 12, 401(2018).
  41. Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice. J Neuroinflammation. 17 (1), 115(2020).
  42. Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations. Sci Rep. 10 (1), 15244(2020).
  43. Gresita, A., et al. Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia. Front Aging Neurosci. 11, 334(2019).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Neurod1 ExpressionIschemic Stroke ModelGFAP PromoterAstrocyte ReprogrammingStereotaxic InjectionEndothelin 1 InjectionTransduced NeuronsMouse Stroke Model

Articoli correlati