Articolo metodologico

Targeting genico retrovirale mediato da CRISPR/Cas9 per lo studio della differenziazione Th17 in vitro

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DOI:

10.3791/66966

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15 novembre 2024

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1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo per la trasduzione retrovirale dell'RNA guida in cellule T primarie da topi transgenici Cas9, fornendo un'alternativa efficiente per l'editing genetico nello studio del differenziamento Th17.

Abstract

Le cellule T helper che producono IL-17A, note come cellule Th17, svolgono un ruolo fondamentale nella difesa immunitaria e sono implicate nelle malattie autoimmuni. Le cellule T CD4 possono essere stimolate con antigeni e cocktail di citochine ben definiti in vitro per imitare la differenziazione delle cellule Th17 in vivo. La ricerca è stata condotta ampiamente sui meccanismi di regolazione della differenziazione Th17 utilizzando il saggio di polarizzazione Th17 in vitro .

I metodi convenzionali di polarizzazione Th17 in genere comportano l'ottenimento di cellule T CD4 naive da topi geneticamente modificati per studiare gli effetti di geni specifici sulla differenziazione e la funzione Th17. Questi metodi possono richiedere molto tempo e denaro e possono essere influenzati da fattori estrinseci cellulari degli animali knockout. Pertanto, un protocollo che utilizza la trasduzione retrovirale dell'RNA guida per introdurre il knockout genico nelle cellule T primarie di topo knockin CRISPR/Cas9 funge da approccio alternativo molto utile. Questo articolo presenta un protocollo per differenziare le cellule T primarie naive in cellule Th17 dopo il targeting genico mediato da retrovirus, nonché i successivi metodi di analisi della citometria a flusso per saggiare l'efficienza dell'infezione e della differenziazione.

Introduzione

Le cellule Th17, un sottoinsieme unico di cellule T helper CD4+, sono vitali per l'eradicazione di batteri e funghi extracellulari e svolgono un ruolo significativo in varie malattie autoimmuni 1,2,3. Evidenze emergenti suggeriscono che le cellule Th17 mostrano eterogeneità, funzionando sia in condizioni patogene che non patogene, influenzate da fattori ambientali e genetici. Chiarire i processi regolatori che controllano la differenziazione delle cellule Th17, la plasticità e l'eterogeneità è fondamentale per l'avanzamento di strategie immunoterapeutiche più efficaci.

Gli animali geneticamente modificati sono stati ampiamente utilizzati per svelare i regolatori chiave della differenziazione e delle funzioni delle cellule Th17. L'uso di animali geneticamente modificati comporta una manipolazione completa in vivo, fornendo autenticità e studio sistematico del suo ruolo in condizioni fisiologiche o modelli di malattia. Tuttavia, lo screening ad alto rendimento con questo approccio è in gran parte impraticabile. I saggi di polarizzazione in vitro forniscono un'alternativa per lo studio della differenziazione cellulare Th17. È stato dimostrato che l'interleuchina 6 (IL-6) in combinazione con il fattore di crescita trasformante β1 (TGFβ1) promuove lo sviluppo di cellule Th17 non patogene, mentre IL-6, IL-1β e IL-23 sono implicate nel guidare la differenziazione delle cellule Th17 patogene (pTh17)4,5.

L'emergere della tecnologia CRISPR/Cas9 ha facilitato l'editing preciso del genoma su basi specifiche. Se combinato con la trasduzione retrovirale, questo approccio fornisce un metodo genetico potente, efficiente ed economico per lo screening e lo studio funzionale dei potenziali regolatori nelle cellule Th17 6,7. In questo studio, abbiamo migliorato la procedura per la trasduzione retrovirale all'interno del sistema di polarizzazione Th17. Utilizzando un sistema retrovirale, abbiamo infettato cellule T naive attivate prestabilite che esprimono Cas9 da topi. Le cellule sono state trasdotte con costrutti di RNA guida (gRNA) guidati dal promotore U6, insieme a geni che codificano proteine reporter fluorescenti sotto il controllo del promotore EF1a per facilitare il knockout del gene bersaglio. Quindi, le cellule T trasdotte sono state coltivate in specifiche condizioni di citochine per indurre la differenziazione in cellule Th17. In particolare, l'eliminazione di RoRγt ha ridotto significativamente la produzione di IL-17A rispetto al gruppo di controllo. L'efficacia di questo sistema dipende dall'ottimizzazione della produzione di retrovirus e delle condizioni di trasduzione per le cellule T primarie attivate, fornendo un approccio rapido e pratico per lo studio di geni specifici nella differenziazione e nella funzione di Th17.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico per il Benessere degli Animali Sperimentali, dall'Ospedale Renji, dalla Scuola di Medicina dell'Università Jiao Tong di Shanghai e sono conformi alle linee guida istituzionali.

1. Produzione retrovirale

  1. Preparazione del costrutto retrovirale
    1. Utilizzare lo strumento CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) per progettare l'sgRNA per il knockout8 di RORγt. Specificare il genoma di riferimento come Mouse GRCm38 e scegliere la sequenza PAM come NGG (per SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA) basata sul sistema di guida CRISPRko. Convalidare il nome del gene bersaglio o altri formati di geni bersaglio e inviare l'input valido per ottenere candidati sgRNA. Impostando gli altri parametri sui valori predefiniti, impostare il target dell'sgRNA su RORγt (Rorc, Gene ID: 19885) per disturbare la differenziazione di Th17 e selezionare l'sgRNA non mirato (abbr. sgNT, sequenza: GCGAGGTATTCGGCTCCGCG) dalle librerie GeCKO v2 del mouse.
      NOTA: Questo strumento offre una gamma di opzioni cliccabili per la progettazione di RNA guida, consentendo una comoda personalizzazione per soddisfare requisiti specifici.
      1. Inserisci il nome del gene bersaglio nella casella di ricerca sotto la colonna Ricerca rapida del gene. Il sistema visualizzerà l'ID del gene e il nome completo del gene bersaglio per garantire una selezione accurata.
        NOTA: Sono disponibili opzioni aggiuntive per convalidare diversi formati di geni bersaglio.
    2. Scegliere un sgRNA mirato sulla sequenza Rorc (abbr. sgRorc) in base all'alto rango combinato e all'ordine di scelta per evitare corrispondenze fuori bersaglio e aumentare l'efficacia sul bersaglio (sequenza sgRorc: GTCATCTGGGATCCACTACG). Sintetizzare due oligonucleotidi per sgRorc e sgNT: per l'oligo in avanti, aggiungere la sequenza "gttttagagctagaaatagcaagttaaaat" all'estremità 5' di ciascuna sequenza guida; Per l'oligo inverso, aggiungere la sequenza "tttcgtcctttccacaagatatataaagc" all'estremità 3' di ciascuna sequenza guida.
      NOTA: In genere, esistono più opzioni per le sequenze di sgRNA. È essenziale selezionare 2 o 3 sequenze di sgRNA che hanno come bersaglio lo stesso genotipo per valutare la loro efficienza di knockout. Nei nostri esperimenti preliminari, sono stati selezionati per il confronto due gRNA bersaglio di Rorc (sgRNA sequence1: GTCATCTGGGATCCACTACG; sgRNA sequence2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). I risultati sperimentali hanno indicato che il gRNA presentato nel metodo attuale (sgRNA sequence1) mostra una maggiore efficienza di knockout tra i due.
    3. Amplificare le sequenze codificanti sgRorc e sgNT utilizzando la DNA polimerasi in PCR con i primer di cui sopra e clonarle nel vettore pMX-U6-MCS (tra le regioni del promotore U6 e lo scaffold del gRNA) in frame con la proteina fluorescente mCherry, rispettivamente9. Impostare il sistema di reazione (50 μL) come da Tabella 1. Questi primer sono costituiti da una sequenza di sgRNA (3'), che può inserire l'sgRNA nel vettore, e da un segmento di sequenza vettoriale (5'), che può amplificare il frammento vettoriale a lunghezza intera. Inoltre, progettare i primer diretti e inversi con una sovrapposizione di circa 18 bp all'interno della regione dell'sgRNA (ma non completamente sovrapposti), facilitando l'assemblaggio del vettore di clonazione linearizzato durante il processo di legatura.
      NOTA: Si dovrebbe ottenere un frammento vettoriale linearizzato nel sito della sequenza di sgRNA con primer mediante PCR di circa 5.551 kd.
    4. Purificare il costrutto utilizzando un kit di estrazione del gel e circolarizzarlo utilizzando un kit di clonazione. Utilizzare i prodotti di ricombinazione per i saggi di trasformazione.
    5. Prelevare i singoli cloni dalle piastre e verificare le sequenze codificanti sgRorc o sgNT tramite sequenziamento di prima generazione, utilizzando il primer del promotore U6 (sequenza: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA).
    6. Selezionare il singolo clone desiderato per l'amplificazione nel brodo LB. Estrai DNA plasmidico di alta qualità dalle cellule batteriche utilizzando un kit di plasmidi privo di endotossine.
      NOTA: Assicurati che la soluzione plasmidica sia di alta qualità. Si raccomanda che la concentrazione della soluzione plasmidica sia di almeno 1 μg/μL.
  2. Preparazione delle celle di confezionamento
    1. Preparare le cellule Platinum-E (Plat-E) utilizzando la seguente procedura: coltura di cellule Plat-E con terreno di Eagle's Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 unità/mL di penicillina e 0,1 mg/mL di streptomicina in un piatto di coltura di 10 cm. Di seguito verrà indicato come terreno di coltura cellulare .
      NOTA: Per ottenere la corretta efficienza di trasfezione, si consiglia di utilizzare cellule nella fase di crescita logaritmica con meno di 15 numeri di passaggio.
    2. Dividere una piastra completa di cellule Plat-E da 10 cm (~2,6 × 107 cellule) in un rapporto corretto in una nuova piastra da 10 cm 1 giorno prima della trasfezione per ottenere una confluenza cellulare di circa l'80% il giorno successivo, che è la condizione ottimale per la trasfezione. Eseguire il passaggio delle cellule per una nuova piastra da 10 cm con un rapporto 1:3 (seminare ~8 × 106 celle in una nuova piastra da 10 cm il giorno prima della trasfezione).
      NOTA: Il rapporto di divisione dipende dalle condizioni di crescita delle cellule, con una maggiore efficienza di trasfezione ottenibile nelle cellule che mostrano una crescita robusta. Eseguiamo il passaggio delle celle per una piastra di 10 cm con un rapporto 1:3. Per diverse piastre di coltura cellulare, come una piastra di 6 cm, si consiglia di seminare 1,5 × 10cellule Plat-E il giorno prima della trasfezione.
  3. Trasfezione
    1. Un'ora prima della trasfezione, sostituire il terreno di coltura cellulare con 8 mL di terreno sierico ridotto senza rosso fenolo con il 5% di FBS, ma senza penicillina-streptomicina, poiché potrebbe interferire con il reagente di trasfezione. Riscaldare il siero ridotto a 37 °C prima dell'uso.
    2. Preparare la miscela di trasfezione contenente la miscela 1 e la miscela 2: la miscela 1 include 18 μg di DNA plasmidico (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry/pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) e 6 μg di pCL-Ecotropic Retroviral Vector (pCL-Eco) in 1.000 μl di terreno sierico ridotto. La miscela 2 contiene 48 μl di reagente di trasfezione in 1.000 μl di terreno sierico ridotto. Aggiungere il mix 2 goccia a goccia nel mix 1 e mescolare delicatamente e accuratamente. Incubare il complesso per 15-20 minuti a 20-25 °C.
    3. Far gocciolare con cura la miscela nelle celle Plat-E, facendo roteare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme. Incubare le cellule a 37 °C sotto il 5% di CO2 per 6-12 ore.
    4. Sostituire il terreno con 10 mL di terreno di coltura cellulare fresco e continuare a incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 per 48 ore.
    5. Valutare l'efficienza della trasfezione nelle cellule Plat-E rilevando il tag del vettore retrovirale, che funge da proxy, tramite microscopia a fluorescenza o citometria a flusso.
      NOTA: Un forte segnale di fluorescenza mCherry (la fluorescenza positiva supera l'80%) è stato rilevato in una percentuale considerevole di cellule Plat-E trasfettate con il vettore pMX-U6-MCS, indicando una trasfezione riuscita.
    6. Raccogliere il surnatante di coltura contenente il virus e centrifugare a 1.500 × g per 10 minuti per rimuovere i frammenti cellulari. Aliquotare il surnatante virale 1 mL per flaconcino e conservare a -80 °C.
      NOTA: La filtrazione è un metodo alternativo per rimuovere i detriti cellulari. Si consiglia di utilizzare un filtro per siringa con una dimensione dei pori di 0,45 μm e una membrana in polietersulfone (PES) per ridurre al minimo la ritenzione di particelle virali sulla membrana del filtro.

2. Infezione retrovirale delle cellule T CD4 + attivate e differenziazione Th17

  1. Preparare e attivare le cellule T CD4+ naive primarie
    1. Rivestire ogni pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti con 2 μg/mL di anti-CD3e e 4 μg/mL di anti-CD28 in PBS sterile da 500 μL, avvolgere la piastra in parafilm per prevenire l'evaporazione e la contaminazione, quindi incubare la piastra a 4 °C durante la notte (o 37 °C per 1-2 ore prima di piastrare) le cellule T CD4+ naive.
      NOTA: Questo passaggio è necessario per eseguire la stimolazione legata alla piastra per le cellule T di topo prima di eseguire la trasduzione virale.
    2. Il giorno successivo, sopprimere i topi di 6-8 settimane che esprimono Cas9 (topi R26-CAG-Cas9) mediante asfissia da CO2 e sterilizzarli con etanolo al 70%.
    3. Raccogliere la milza di topo e metterla in PBS con FBS al 2% e EDTA 100 μM (tampone FACS).
    4. Macinare la milza con vetro smerigliato sterilizzato (lato opaco) nel tampone FACS, omogeneizzare il tessuto in una sospensione unicellulare e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta da 50 mL.
      NOTA: Assicurati di macinare il tessuto delicatamente e costantemente per mantenerlo umido. Macinare violentemente il tessuto può influire notevolmente sulla sopravvivenza cellulare.
    5. Centrifugare la sospensione di cellule spleniche a 800 × g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di tampone di lisi dei globuli rossi. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi aggiungere il tampone FACS per raggiungere un volume totale di 15 ml. Centrifugare gli splenociti a 800 × g per 5 min.
    6. Risospendere gli splenociti e filtrarli attraverso un colino cellulare da 40 μm. Regolare il volume finale a 1 mL per l'isolamento delle cellule T CD4+ .
    7. Isolare le cellule T CD4+ utilizzando kit di reagenti commerciali seguendo le istruzioni nel manuale.
    8. Etichettare le cellule T CD4+ con una miscela di anticorpi fluorescenti (CD4, CD25, CD44 e CD62L) a 4 °C per 30 minuti, lavare le cellule con tampone FACS e isolare le cellule T CD4+ naive utilizzando un selezionatore di celle a flusso. Ciò si tradurrà nell'ottenimento di cellule T CD4+CD25-CD62Lad altoCD44e a basso naïve T basso.
    9. Rimuovere il surnatante di stimolazione legato alla piastra dalla piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti (preparata al punto 2.1.1) e sciacquare ciascun pozzetto due volte con 500 μl di PBS. Piastra 1 x 106 cellule T CD4+ naive in 1 mL di terreno di coltura linfocitaria in un pozzetto della piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti. Incubare le cellule nell'incubatore cellulare.
      NOTA: Il terreno di coltura linfocitaria contiene il 10% di FBS, 100 unità/mL di penicillina e 0,1 mg/mL di streptomicina, 1 mM di piruvato di sodio, 10 mM di HEPES e 50 μM di β-ME nel terreno RPMI 1640.
  2. Infezione retrovirale
    1. Dopo 18-24 ore, raccogliere ogni pozzetto di cellule attivate nella provetta da 1,5 mL. Centrifugare a 800 × g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
    2. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di miscela per l'infezione (10 μg/mL di bromuro di esadimetrina, 10 mM di HEPES nel surnatante virale) e aggiungere 1 mL di miscela in un nuovo pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 48 pozzetti. Nel frattempo, salva un numero sufficiente di cellule come controllo negativo (non trasdotto).
      NOTA: È possibile avere meno di 1 x 106 cellule T CD4+ attivate naive per pozzetto, ma non è consigliabile utilizzare meno di 0,5 x 106 cellule per pozzetto. Inoltre, nessuna cellula deve essere seminata nei pozzetti periferici della piastra di coltura a 48 pozzetti.
    3. Avvolgere la piastra con parafilm e centrifugare a 800 x g per 90 min a 32 °C. Impostare l'accelerazione e la decelerazione a 3. Dopo la centrifugazione, rimuovere il parafilm, incubare le cellule nell'incubatore per 4 ore e procedere con le fasi di differenziazione.
  3. Differenziazione delle cellule infette in cellule Th17
    1. Preparare le cellule presentanti l'antigene (APC) durante l'infezione retrovirale. Innanzitutto, ottenere splenociti da topi wild-type seguendo le istruzioni dai passaggi da 2.1.2 a 2.1.4. Risospendere gli splenociti con 1 mL di terreno di coltura linfocitaria con 50 μg/mL di mitomicina in una provetta da 15 mL. Incubare gli splenociti a 37 °C sotto il 5% di CO2 per 1 ora.
    2. Un'ora dopo, aggiungere PBS fino a 15 mL per lavare gli splenociti, centrifugare a 800 x g per 5 min, scartare il surnatante, risospendere gli splenociti con 1 mL di terreno di coltura linfocitaria e contare il numero di cellule. Le cellule APC sono state preparate con successo.
    3. Dopo le 4 ore di incubazione cellulare (come al punto 2.2.3), raccogliere le cellule T CD4+ trasdotte in provette da 1,5 mL e centrifugare a 800 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule infette in 600 μL di PBS per lavarle. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
    4. Posizionare 0,5 × 106 cellule T CD4+ trasdotte in 1 mL di terreno di coltura linfocitaria con 1,5 x 106 cellule APC in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti. Integrare con 2 μg/mL di anti-CD3e, 2 μg/mL di anti-CD28 e cocktail di differenziazione cellulare Th17, che contiene 10 μg/mL di anti-IFNγ, 10 μg/mL di anti-IL-12/IL23 p40, 10 μg/mL di anti-IL4, 2,5-3 ng/mL di hTGF-β e 20-30 ng/mL di IL-6. Colture di cellule per 2 giorni.
    5. Raccogliere ogni pozzetto di cellule nelle provette da 1,5 mL, centrifugare a 800 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Aggiornare solo 1 mL di terreno di coltura linfocitario con 3 ng/mL di TGF-β e 30 ng/mL di IL-6. Posizionare le cellule in un nuovo pozzetto di piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti per un periodo di coltura prolungato. Analizza le cellule 2 giorni dopo il cambio del mezzo.

3. Valutazione dell'efficienza di trasduzione e dei risultati di differenziazione

  1. Dopo due giorni di cambio del terreno, raccogliere le cellule e centrifugare a 800 × g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Trattare le cellule differenziate con 50 ng/mL di forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA), 500 ng/mL di ionomicina e 5 μg/mL di brefeldina A in 500 μL di terreno di coltura linfocitaria in un nuovo pozzetto di piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti a 37 °C in incubatore per 4 ore. Prelevare metà delle cellule per l'analisi della citometria a flusso e lisare l'altra metà delle cellule con il tampone di estrazione dell'RNA per l'analisi qPCR.
  2. Per analisi di citometria a flusso
    1. Raccogliere le cellule in provette da 1,5 mL. Aggiungere 1 mL di tampone FACS nelle provette e centrifugare a 800 × g per 5 minuti per lavare le cellule.
    2. Risospendere il pellet cellulare con una miscela di anticorpi fluorescenti (CD4 e colorante di vitalità fissabile in 100 μL di PBS) e colorare le cellule a 4 °C per 30 minuti.
    3. Lavare le cellule con 300 μL di PBS e fissarle con 300 μL di formaldeide (FA) tamponata con fosfato al 2% a 4 °C per almeno 60 min.
    4. Un'ora dopo, lavare le cellule con PBS, risospenderle con 600 μL di tampone di permeabilizzazione 1x e centrifugare a 800 × g per 5 minuti.
    5. Eliminare il surnatante e colorare con l'anti-IL-17A in 100 μL di tampone di permeabilizzazione 1x per 60 minuti a temperatura ambiente o 4 °C durante la notte.
    6. Il giorno successivo, lavare le cellule con 1x tampone di permeabilizzazione e risospenderle in 200 μL di PBS. Analizzare le cellule mediante citometria a flusso10. Vedere la sezione Risultati rappresentativi.
  3. Per l'analisi qPCR, estrarre l'RNA seguendo le istruzioni del kit di estrazione dell'RNA. Trascrivere l'RNA in cDNA per la conservazione o la successiva analisi qPCR. La progettazione di questi primer dovrebbe aderire ai principi generali di progettazione dei primer qPCR, mirando anche specificamente alla regione che attraversa il sito indel previsto, dove si è verificata la scissione mediata da gRNA. Qualsiasi riduzione dell'efficienza di amplificazione o perdita di segnale in questo sito può fungere da indicatore di knockout riuscito. I primer qPCR sono i seguenti:
    Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT.
    IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

Risultati

Nello studio, abbiamo clonato il bersaglio dell'sgRNA in Rorc e le sequenze codificanti non mirate all'sgRNA nel vettore pMX-U6-MCS con la proteina fluorescente mCherry (Figura 1A, B). La produzione di retrovirus è stata effettuata secondo il protocollo delineato nella Figura 2. La trasfezione è stata avviata il giorno 0 e il prelievo retrovirale è avvenuto il giorno 2. L'efficienza di trasfezione può essere testata dall'intensità di fluorescenza di mCherry (Figura 1C). Prima di raccogliere il virus, le cellule T CD4+ naive sono state selezionate e attivate. Queste cellule T CD4+ attivate sono state quindi infettate utilizzando l'infezione da spin, seguita dalla continuazione delle fasi di differenziazione come descritto. Infine, l'efficienza della trasduzione e i risultati della differenziazione sono stati valutati utilizzando l'analisi di citometria a flusso e l'analisi qPCR.

La Figura 3 illustra la strategia di gating applicata per lo smistamento delle cellule T CD4+ naive. Dopo aver selezionato la popolazione cellulare principale e le cellule singoletto (come mostrato nei primi due gate della Figura 3), le cellule FVD-CD4+ sono state gated per distinguere le cellule T CD4 nelle cellule polarizzate in cellule Th17 da quelle nelle APC. Infine, l'IL-17A prodotta dalle cellule T CD4 rappresenta l'efficienza di differenziazione Th17, che indicava l'efficienza di knockout. La percentuale di cellule mCherry-positive riflette l'efficienza dell'infezione retrovirale, mentre l'efficienza del knockout è indicata dalla percentuale di cellule IL-17A-positive. Per migliorare la vitalità cellulare e ridurre al minimo la durata dello smistamento, gli splenociti sono stati arricchiti utilizzando un kit di isolamento delle cellule T CD4+ di topo, ottenendo un'efficienza di arricchimento superiore al 90%.

L'efficienza dell'infezione da retrovirus, indicata dalla presenza di cellule mCherry-positive, è tipicamente di circa il 40% (Figura 4A). Sebbene l'efficienza dell'infezione possa essere aumentata attraverso la concentrazione del virus, questo approccio va a scapito di una durata sperimentale prolungata e di costi più elevati. Nei nostri esperimenti, le cellule infette coltivate senza il cocktail di differenziazione cellulare Th17 sono servite come controllo negativo della differenziazione Th17, designato come Th0. Come controllo positivo è stato utilizzato un sgRNA non mirato, denominato sgNT. Per l'editing genico, abbiamo impiegato il gRNA mirato al gene RORγt (sgRNA-Rorc), che ha ridotto significativamente l'efficienza di differenziazione di Th17 (Figura 4A). Questo intervento ha anche portato a una sostanziale diminuzione dei livelli di espressione di Rorc e IL-17a (Figura 4B).

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Figura 1: Esempio di sgRNA sub-clonato in un vettore retrovirale ed efficienza di trasfezione. Il vettore pMX-U6-MCS è stato utilizzato come costrutto iniziale. Lo scaffold del gRNA, insieme alle sequenze di sgRNA (la parte arancione) che hanno come bersaglio il sito (A) scramble e (B) Rorc, sono stati inseriti a valle del promotore U6 (la parte verde come sezione per il sequenziamento con primer U6). Le posizioni dei primer contenenti sgRNA e dei siti di primer di sequenziamento sono indicate sotto il vettore circolare I nomi completi delle abbreviazioni sul plasmide sono i seguenti. Abbreviazioni: AmpR = resistenza all'ampicillina, alla carbenicillina e agli antibiotici correlati; LTR = ripetizione terminale lunga; MMLVψ = segnale di impacchettamento del virus della leucemia murina di Moloney; gag = gene gag troncato del virus della leucemia murina di Moloney (MMLV) privo del codone iniziale. (C) Imaging al microscopio di mCherry in cellule Plat-E trasfettate con DNA plasmidico. Barra della scala: 500 px. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Illustrazione schematica del protocollo. Il giorno prima della trasfezione, la densità delle cellule Plat-E deve essere regolata in un intervallo adeguato. Il giorno successivo (giorno 0), eseguire la trasfezione e sostituire il terreno 12 ore dopo. Il giorno 1, ordina e attiva le cellule T naive dai topi che esprimono Cas9. Successivamente (giorno 2), raccogliere il surnatante di coltura contenente il virus e combinarlo con le cellule T attivate per la trasduzione retrovirale. Le cellule infette vengono quindi differenziate in cellule Th17 per 3-4 giorni e analizzate utilizzando FACS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Strategia di gating per lo smistamento delle cellule T naïve ai CD4. La colorazione superficiale è stata eseguita sulle cellule T CD4 arricchite per marcare CD4, CD25, CD44 e CD62L. La strategia di gating impiegata è stata la seguente: inizialmente, i linfociti sono stati gated in base ai parametri di dispersione diretta e laterale. Successivamente, le singole cellule sono state identificate utilizzando FSC-H e FSC-W. Le cellule CD4+CD25- sono state quindi gated per escludere le cellule T regolatorie (Treg). Infine, sono state identificate le cellule T naiveCD44 basse CD62Lalte. Le cellule T isolate CD4+ naïve sono state raccolte per esperimenti successivi. Abbreviazioni: FSC = dispersione in avanti; SSC = dispersione laterale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Esempio di trasduzione riuscita di cellule T attivate e differenziazione di Th17. (A) L'efficienza di differenziazione di Th17 è ridotta in modo significativo, il che è modificato dal gRNA RORγt (gating on mCherry+ IL-17a+ popolazione). (B) Espressione relativa dell'mRNA di Rorγt e IL-17a in Th0 (cellule infette coltivate senza cocktail di differenziazione cellulare Th17), sgNT (sgRNA non bersaglio) e sgRNA-Rorc (sgRNA che ha come bersaglio il gene RORγt ). p < 0,001 (test t di studente a due code non accoppiato; i dati sono presentati come media ± SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Componenti della reazione PCRProgramma PCR
ComponenteVolume (μL)PassoTemp.OreCiclo
2 × Phanta Mix (Dye Plus)25195 ºC3 minuti1
ddH2020295 ºC15 secondi
Primer-F (10 μM)2356 ºC15 secondi
Primer-R (10 μM)2472 ºC5 minuti 30 secondiVai al passaggio 2
35 ×
Modello (~30 ng)1572 ºC5 minuti1
612 ºC∞

Tabella 1: Componenti di reazione PCR e programma PCR per la costruzione di vettori di gRNA.

Discussione

L'editing del genoma CRISPR/Cas9 tramite somministrazione retrovirale è un metodo robusto per esplorare i ruoli delle cellule T helper. Questo protocollo offre un approccio rapido ed efficace all'esame di specifici geni coinvolti nel differenziamento e nella funzione Th17. Diversi passaggi critici devono essere seguiti attentamente per ottenere risultati ottimali. Innanzitutto, per una maggiore efficienza di knockout genico, i gRNA devono essere selezionati con cura. Dato il rischio di effetti off-target nell'editing genico CRISPR/Cas9, è prudente scegliere 2-3 gRNA con punteggi elevati, come identificato nella sezione 1.1.1 del protocollo, per ulteriori esperimenti11,12. In secondo luogo, un alto titolo virale è essenziale per il successo dell'infezione. La corretta manutenzione della linea di celle di confezionamento Plat-E è fondamentale. Le cellule dovrebbero raggiungere circa l'80% di confluenza il giorno della trasfezione, poiché sia un numero inadeguato che eccessivo di cellule comprometterà i titoli virali. Se le cellule Plat-E non sono disponibili, la co-trasfezione delle cellule 293T del rene embrionale umano con il vettore pCL-Eco può anche produrre titoli virali elevati13,14. Mantenere un'elevata concentrazione di plasmidi di almeno 1 μg/μL è importante per ottenere un titolo virale elevato. È essenziale raccogliere la sospensione virale prima che diventi giallo limone poiché il virus mostra sensibilità all'alterazione del pH. Pertanto, il pH del terreno di coltura deve essere regolato attentamente entro un intervallo appropriato. Il virus deve essere conservato a -80 ºC per mantenere la sua integrità e protetto da ripetuti cicli di gelo-scongelamento15.

In terzo luogo, per ottenere un'elevata efficienza di infezione, le cellule primarie devono essere adeguatamente attivate. Un'attivazione cellulare inadeguata compromette significativamente l'efficienza dell'infezione virale16. Prima dell'infezione virale, lo stato di attivazione delle cellule T deve essere confermato al microscopio, poiché le cellule attivate mostrano dimensioni notevolmente maggiori rispetto alle cellule inattivate. Vale la pena notare che il nostro protocollo di differenziazione Th17 è stato specificamente ottimizzato per i mouse C57BL/6, quindi potrebbero essere necessari aggiustamenti per altri ceppi di topi. In quarto luogo, per ottenere i risultati desiderati di differenziazione del Th17, è fondamentale mantenere condizioni cellulari ottimali. Durante l'infezione da spin, è importante posizionare le cellule nei pozzetti vicino al centro per aiutare a mantenere la vitalità cellulare. Dopo l'infezione da spin, l'incubazione delle cellule per 4 ore (fase 2.2.4 del protocollo) è fondamentale per il loro recupero. Inoltre, durante il trasferimento delle cellule, il pipettaggio delicato è importante per mantenere la vitalità cellulare. Diverse condizioni di stimolazione possono influenzare la differenziazione di Th17. In questo esperimento, l'incorporazione di cellule presentanti l'antigene nel sistema di differenziazione ha migliorato significativamente l'efficienza di differenziazione rispetto alla stimolazione anti-CD3e e anti-CD28 legata alla piastra. Infine, è fondamentale garantire che tutte le citochine utilizzate rimangano funzionali durante il trasporto e lo stoccaggio. Le citochine possono perdere rapidamente stabilità in cicli ripetuti di congelamento-disgelo o in soluzioni di ricostituzione inappropriate. Il trattamento a freddo e aliquote uguali sono necessari affinché le citochine mantengano funzioni durante le procedure.

Questo protocollo per la generazione di cellule Th17 knockout per geni specifici ha diverse limitazioni. In primo luogo, è difficile raggiungere la completa efficienza di trasduzione nelle cellule T primarie di topo. Alcune cellule potrebbero non subire il knockout genico previsto durante la differenziazione Th17. In secondo luogo, le cellule T primarie hanno una durata di vita limitata in vitro. Dopo circa una settimana, queste cellule tendono a morire, ponendo sfide per gli esperimenti successivi. In terzo luogo, il nostro protocollo si basa su topi transgenici Cas9 e quando abbiamo tentato di incorporare la sequenza Cas9 nel plasmide principale, ciò ha comportato una significativa riduzione dei titoli virali. Infine, notiamo che questo protocollo non è adatto per analizzare le funzioni dei geni coinvolti nelle prime fasi dell'attivazione naive delle cellule T CD4+ , poiché tali cellule devono essere attivate prima della trasduzione retrovirale.

Nonostante i suoi limiti, questo protocollo è stato applicato con successo in vari studi, facilitando l'esplorazione dei principali regolatori genetici coinvolti nel differenziamento Th17. Consente di valutare i cambiamenti nell'efficienza di differenziazione Th17 in seguito al knockout di geni bersaglio nelle cellule T attivate. Inoltre, questo protocollo è adatto per valutare altri aspetti della funzione delle cellule Th17, tra cui la proliferazione cellulare, la sopravvivenza, la stabilità dei fattori di trascrizione, la secrezione di citochine e le risposte immunitarie. Inoltre, il nostro laboratorio ha dimostrato la sua efficacia nella trasduzione e differenziazione retrovirale delle cellule T regolatorie indotte (iTreg). Sebbene non tutti i tipi di cellule T siano stati testati, questo protocollo può essere applicabile anche in altri sottogruppi, come le cellule T Th1, Th2 e CD8+ . Nel complesso, questa tecnica funge da strumento prezioso per condurre knockout genici nelle cellule immunitarie, offrendo un potenziale significativo per la scoperta di segnali genetici critici che regolano le funzioni immunitarie.

Dichiarazioni

Gli autori affermano che non ci sono conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo Dou Liu, Dongliang Xu e Pinpin Hou della struttura principale dello Shanghai Immune Therapy Institute per il loro supporto nell'utilizzo degli strumenti. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China 31930038, U21A20199, 32100718 e 32350007 (a Linrong Lu); 32100718 (a Xuexiao Jin); Gruppo di ricerca innovativo di università locali di alto livello a Shanghai SHSMU-ZLCX 20211600 (a Linrong Lu); Programma di incubazione interna RJTJ24-QN-076 (a Zejin Cui). La Figura 2 è stata preparata con Figdraw.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5 M EDTA (pH 8,0)SolarbioE1170
Piastra di coltura per cellule e tessuti da 100 mmBIOFILTCD010100
1 M Hepes (acido libero, sterile)SolarbioH1090
Piastra per coltura cellulare e tissutale a 24 pozzettiNEST702002
Piastra per coltura cellulare e tissutale a 48 pozzettiNEST748002
Brefeldin Una soluzione (1.000x)BioLegend420601
Anticorpo CD4 anti-topo Brilliant Violet 650 (RM4-5)BioLegend100546
Anticorpo monoclonale CD3e (145-2C11), grado funzionale, eBioscienceInvitrogen16-0031-82
CD44 Anticorpo monoclonale (IM7), PE, eBioscienceInvitrogen12-0441-83
CD62L (L-Selectina) Anticorpo monoclonale (MEL-14), APC, eBioscienceInvitrogen17-0621-82 
Contatore di celluleNexcelom BioscienceCellometer Auto 2000
Cell Strainer (40 μ m)biosharpBS-40-CS
Filtro cellulare (70 μ m)biosharpBS-70-CS
nbsp;eppendorf5425  Centrifuga R
 eppendorf5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master MixVazymeQ411-02
ClonExpress II Kit di clonazione in un solo passaggioVazymeC112
DH5α Cellule competentiSangon BiotechB528413
Direct-zol RNA MiniprepZYMO RESEARCHR2050
DMEM MediumBasalMediaL110KJ
EasySep Mouse CD4+ Kit di isolamento delle cellule TSTEMCELL19852
eBioscience Colorante di vitalità fissabile eFluor 660Invitrogen65-0864-18
Kit di mini plasmidi EndoFree IITIANGENDP118-02
Reagente di trasfezione ExFectVazymeT101-01
Siero fetale bovino, Premium PlusGibcoA5669701
FITC anti-topo IL-17A Anticorpo (TC11-18H10.1)BioLegend506907
Soluzione di formaldeideMacklinF864792
HiScript IV RT SuperMix per qPCR?+gDNA?VazymeR423-01
IonomicinaBeyotimeS1672
Mitomicina CMaokang Biotechnology7/7/1950
Topo GRCm38NCBIRefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM Siero ridotto MediumGibco31985070siero ridotto Medium
Pacific Blue anti-topo Anticorpo CD4 (RM4-5)BioLegend
PE/Cianina7 anticorpo CD25 anti-topo (PC61)BioLegend102015
PE/Cianina7 anti-topo CD4 (GK1.5)BioLegend100422
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122
PMA/TPA BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9 mouseCentro per organismi modello di ShanghaiN. di cat. NM-KI-00120
Proteina ricombinante umana TGF-beta 1 (CHO-Expressed), CFR& D Systems11409-BH
Analizzatore di cellule di ricerca murina ricombinantePeproTech216-16
BD BiosciencesBD LSRFortessa
Selezionatore di cellule di ricercaSONYMA900
RPMI 1640 MediumBasalMediaL210KJ
SimpliAmp Termociclatore PCR Sistemabiosistemi applicatiA24811
Soluzione di piruvato di sodio (100 mM)Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF Anticorpo CD28 purificato anti-topo (37.51)BioLegend102121
Ultra-LEAF IFN purificato anti-topo-γ Anticorpo (XMG1.2)BioLegend505847
Ultra-LEAF Anticorpo IL-4 purificato anti-topo (11B11)BioLegend504135
Ultra-LEAF Anticorpo IL-12/IL-23 p40 purificato (C17.8)BioLegend505309
β-Mercaptoetanolo (50 mM)SolarbioM8211
&100531 di

Riferimenti

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