Articolo metodologico

Elettroporazione basata su substrato poroso con monitoraggio dell'impedenza elettrica transepiteliale

DOI:

10.3791/66971

⸱

27 settembre 2024

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 3Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'elettroporazione del substrato poroso (PSEP) abbina un'erogazione costante e ad alta produttività con un'elevata vitalità cellulare. L'introduzione delle misure dell'impedenza elettrica transepiteliale (TEEI) fornisce informazioni sui processi intermedi del PSEP e consente la somministrazione senza marcatura. Questo articolo illustra un metodo per eseguire contemporaneamente esperimenti di consegna PSEP e analisi delle misure TEEI.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'elettroporazione del substrato poroso (PSEP) è un metodo emergente di elettroporazione che fornisce un'elevata produttività e un'erogazione costante. Come molti altri tipi di somministrazione intracellulare, la PSEP si basa fortemente sui marcatori fluorescenti e sulla microscopia fluorescente per determinare il successo della consegna. Per ottenere informazioni sulle fasi intermedie del processo di elettroporazione, è stata sviluppata una piattaforma PSEP con monitoraggio integrato dell'impedenza elettrica transepiteliale (TEEI). Le cellule vengono coltivate in inserti disponibili in commercio con membrane porose. Dopo un periodo di incubazione di 12 ore per consentire la formazione di un monostrato cellulare completamente confluente, gli inserti vengono inseriti in un terreno di trasfezione situato nei pozzetti del dispositivo PSEP. I monostrati cellulari vengono quindi sottoposti a una forma d'onda definita dall'utente e l'efficienza di erogazione viene confermata attraverso la microscopia a fluorescenza. Questo flusso di lavoro può essere notevolmente migliorato con le misure TEEI tra microscopia a impulsi e a fluorescenza per raccogliere dati aggiuntivi sul processo PSEP, e questi dati TEEI aggiuntivi sono correlati a metriche di consegna come l'efficienza e la fattibilità della consegna. In questo articolo viene descritto un protocollo per l'esecuzione di misure PSEP con TEEI.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'elettroporazione è una tecnica in cui le cellule sono esposte a un campo elettrico, creando pori temporanei nella membrana cellulare attraverso i quali i carichi, tra cui proteine, RNA e DNA, possono passare 1,2. La versione più utilizzata è l'elettroporazione di massa (BEP). La BEP viene eseguita riempiendo una cuvetta con un elettrolita contenente milioni di cellule, esponendo l'elettrolita ad alta tensione e consentendo al carico di entrare nelle cellule attraverso la diffusione o l'endocitosi1. Ci sono molti vantaggi per BEP, tra cui un'elevata produttività e numerosi sistemi disponibili in commercio. Tuttavia, ci sono limitazioni all'erogazione del BEP. Il posizionamento incoerente delle celle rispetto agli elettrodi e la schermatura del campo elettrico dalle celle adiacenti causano una significativa variabilità nell'esposizione al campo elettrico durante BEP 3,4. L'alta tensione richiesta per la BEP ha anche un impatto negativo significativo sulla vitalità delle celle5. Sin dal suo inizio nel 20116, c'è stato un crescente interesse per un metodo di elettroporazione chiamato elettroporazione del substrato poroso (PSEP), anche se a volte viene indicato con altri nomi, tra cui elettroporazione localizzata e nano- o micro-elettroporazione 1,7,8. A differenza della sospensione cellulare di BEP, il PSEP viene condotto su cellule aderenti a un substrato poroso. Non solo uno stato aderente è preferito per la maggior parte delle linee cellulari umane9, ma i pori nel substrato si concentrano anche sulla corrente elettrica, localizzando il potenziale elettrico transmembrana (TMP) in regioni specifiche della membrana cellulare10,11. Questa localizzazione consente una significativa riduzione della tensione applicata, diminuendo il danno e aumentando la vitalità cellulare. Questa combinazione di effetti aiuta a controllare lo sviluppo dei pori della membrana cellulare, risultando in un'erogazione più coerente ed efficiente 1,5,12.

Uno studio recente ha introdotto un dispositivo PSEP con un array di elettrodi placcati in oro a sei pozzetti per contenere inserti a membrana porosa13 disponibili in commercio (Figura 1A, B), una pratica che è stata introdotta per la prima volta da Vindis et al.14. Il dispositivo è in grado di applicare impulsi e misurare l'impedenza elettrica attraverso il monostrato cellulare, nota come impedenza elettrica transepiteliale (TEEI), in tempo reale13. L'interfaccia utente del dispositivo consente il controllo completo della forma d'onda e della polarità dell'elettroporazione. È importante sottolineare che le misurazioni dell'impedenza in tempo reale possono essere utilizzate per prevedere i risultati della somministrazione senza la necessità di costosi reagenti o marcatori fluorescenti, un concetto noto come consegna senza etichetta15.

La piattaforma PSEP è costituita da due principali componenti elettrici personalizzati: il corpo principale del dispositivo, che ospita il generatore di impulsi e l'apparecchiatura di misurazione TEEI, e l'array di elettrodi, dove vengono inseriti i substrati porosi e avviene l'elettroporazione. I diagrammi per tutta l'elettronica personalizzata e i componenti stampati in 3D sono disponibili all'indirizzo GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. Oltre all'elettronica personalizzata, è necessario anche un computer per il corretto funzionamento della piattaforma. Il software personalizzato richiede l'esecuzione di MATLAB (versione 2021a o successiva) e Microsoft Excel per l'archiviazione e l'accesso ai dati per l'analisi. Il programma controlla l'elettronica personalizzata e fornisce l'interfaccia utente grafica (GUI) per la regolazione delle impostazioni. Questi programmi sono stati resi disponibili anche su GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.

I dati preliminari suggeriscono che questo processo è possibile per diversi tipi di cellule aderenti (Figura 1C), ma questo articolo discuterà solo la preparazione delle cellule A431 utilizzando parametri che sono stati trovati ottimali per questa linea cellulare da Brooks et al.13. Inoltre, poiché il carico di ioduro di propidio (PI) è citotossico, vengono eseguiti due esperimenti, il primo con un terreno di trasfezione PI ad alta concentrazione per quantificare l'efficienza di somministrazione e il secondo con solo terreni di coltura cellulare per misurare il TEEI su scale temporali più lunghe. Questi esperimenti utilizzano forme d'onda di elettroporazione identiche, consentendo di correlare i risultati (Figura 1D).

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Figura 1: Schema di assemblaggio dell'array di elettrodi e dati fondamentali. (A) Modello CAD di un inserto all'interno di un pozzetto dell'array di elettrodi. (B) Modello CAD dell'array di elettrodi. (C) Aumento dell'impedenza dovuto al PSEP per linee cellulari selezionate, n = 3 per linea cellulare. Barra di errore: errore standard della media. (D) Efficienza della consegna vs. TEEI aumenta i dati di correlazione. L'efficienza di somministrazione è stata calcolata dividendo il numero di cellule marcate nelle immagini PI e calceina dagli esperimenti di somministrazione per il numero totale di cellule identificate con Hoechst. Il numero di celle è stato determinato utilizzando una pipeline CellProfiler personalizzata, n = 6 per tensione. Barra di errore: (asse x e y) errore standard della media. Questa figura è riprodotta da Brooks et al.13 con il permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione dei reagenti e coltura cellulare

  1. Preparare i terreni di coltura cellulare aggiungendo 50 ml di siero fetale bovino (FBS) e 5 ml di penicillina-streptomicina a un contenitore da 500 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Produrre undici aliquote da 50 ml per ridurre il rischio di contaminazione e conservare in frigorifero a 4 °C.
  2. Creare 1 mL di 25 μg/mL di fibronectina plasmatica umana in soluzione madre tamponata con fosfato (PBS) secondo le istruzioni del produttore.
  3. Creare 15 mL di ioduro di propidio 0,1 mg/mL in una soluzione madre DMEM per consentire esperimenti con concentrazioni di carico variabili.
  4. Coltura di cellule A431 in un matraccio T75 contenente 12 mL di terreno di coltura cellulare preparato. Le cellule sono state fatte passare ogni 1-2 giorni per mantenere la confluenza del 50%.

2. Preparazione del campione

  1. Rivestimento di fibronectina
    1. È possibile selezionare dodici inserti e due piastre a 24 pozzetti. Posizionare gli inserti in una piastra a pozzetti, creando due file da sei. Metti da parte la piastra del secondo pozzetto fino a più tardi.
    2. Creare 1.300 μL di soluzione di fibronectina da 1 μg/mL mescolando 52 μL di soluzione madre di fibronectina e 1.248 μL di PBS in una provetta da 1,5 mL.
    3. Distribuire 100 μl della soluzione di fibronectina in ciascun inserto. Incubare gli inserti nella piastra a pozzetti a 37 °C per 3 ore.
  2. Regolazione della concentrazione cellulare per ottimizzare la densità cellulare
    1. Circa 1 ora prima del completamento dell'incubazione della fibronectina, rimuovere il pallone T75 di cellule A431 dall'incubatore per l'estrazione delle cellule.
    2. Rimuovere il terreno nel pallone con un aspiratore e lavare con 5 ml di PBS. Rimuovere il PBS allo stesso modo e aggiungere 3 ml di tripsina. Incubare per 3-4 minuti prima di picchiettare il lato del pallone per staccare completamente le cellule.
    3. Aggiungere 6 mL di terreno di coltura cellulare al pallone, mescolando energicamente con una pipetta per staccare le cellule rimanenti, e trasferire il contenuto in una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare a 100 x g e 20 °C per 5 min.
    4. Rimuovere il terreno di coltura cellulare e la tripsina dalla provetta da centrifuga utilizzando un aspiratore, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare. Aggiungere 1 mL di terreno alla provetta da centrifuga e pipettare avanti e indietro (senza produrre bolle) per rompere il pellet cellulare e risospendere le cellule.
    5. Pipettare 10 μl di sospensione cellulare, 40 μl di terreno di coltura cellulare e 50 μl di colorante blu di tripano in una provetta da 200 μl, utilizzando una pipetta per miscelare accuratamente.
    6. Rimuovere 10 μl della miscela di colorante e iniettarla in un emocitometro. Contare le cellule utilizzando la diluizione del 10% della miscela di coloranti per stimare la conta totale delle cellule nella provetta da centrifuga da 15 mL.
      NOTA: Per questo protocollo, assumere una concentrazione di 5.000.000 di cellule/mL.
    7. Moltiplicare la densità di semina desiderata per la superficie della membrana dell'inserto, dividere per le cellule contate/mL nella sospensione e moltiplicare per 1.000 per calcolare i microlitri di sospensione cellulare necessari per inserto.
      1. Per trovare la quantità totale di sospensione cellulare richiesta, moltiplicare questa cifra per 10 (per garantire un numero sufficiente di cellule per 9 campioni, poiché 3 dei 12 inserti saranno controlli privi di cellule) e arrotondare per eccesso al numero intero più vicino. In questo caso, per questo esperimento sono necessari un totale di 135 μl di sospensione cellulare.
    8. Creare 2.000 μl di soluzione cellulare regolata mescolando i 135 μl della sospensione cellulare precedentemente calcolati con 1.865 μl di terreno di coltura cellulare in una provetta da centrifuga separata da 15 mL.
  3. Cellule di semina
    1. Rimuovere la fibronectina in eccesso da ciascun inserto una volta completata l'incubazione della fibronectina.
    2. Lavare gli inserti due volte aggiungendo 100 μl di acqua distillata sterile a ciascun inserto. Rimuovere l'acqua seguendo lo stesso ordine in cui è stata aggiunta per garantire un tempo di lavaggio costante tra gli inserti.
    3. Lavare nuovamente l'inserto aggiungendo 100 μL di terreno di coltura cellulare a ciascun inserto. Rimuovere il supporto seguendo lo stesso ordine in cui è stato aggiunto per garantire un tempo di lavaggio costante tra gli inserti.
    4. Inserti per campioni cellulari
      1. Seminare le cellule pipettando 200 μL di soluzione cellulare regolata in ciascun inserto. Per garantire una confluenza costante tra gli inserti, miscelare la soluzione cellulare nella provetta da centrifuga prima della distribuzione e mescolare nuovamente all'interno di ciascun inserto dopo la distribuzione.
    5. Inserti di controllo negativo
      1. Pipettare 200 μL di terreno di coltura cellulare in ciascun inserto. Per mantenere la coerenza con i foglietti illustrativi dei campioni cellulari, utilizzare la pipetta per miscelare i terreni di coltura cellulare all'interno di ciascun inserto.
  4. Etichettatura e incubazione
    1. Tracciare una linea che divida la piastra del secondo pozzetto in due colonne larghe tre pozzetti (per le condizioni eseguite in triplice copia) utilizzando un pennarello indelebile. Separa ogni colonna in righe. Etichettare ogni regione della griglia con i parametri pertinenti.
    2. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura cellulare a ogni pozzetto per ricevere un inserto per l'esperimento. Trasferire gli inserti dalla piastra a pozzetti di preparazione nella posizione appropriata nella piastra a pozzetti per esperimenti etichettata e incubare a 37 °C per almeno 12 ore.

3. Procedura sperimentale

  1. Esperimento di consegna
    1. Pipettare 1,5 mL della soluzione PI 0,1 mg/mL in ciascun pozzetto dell'array di elettrodi. Posizionare un inserto in ciascun pozzetto dell'array di elettrodi, inserendo i piedini dell'inserto nelle scanalature di allineamento in modo che l'inserto sia a filo con la superficie superiore del pozzetto (Figura 1A, B).
    2. Avvitare il circuito stampato (PCB) dell'elettrodo superiore alla parte superiore dei pozzetti dell'array di elettrodi e collegare l'array di elettrodi al dispositivo PSEP.
    3. Posizionare la matrice di elettrodi nell'incubatore a 37 °C per almeno 1 ora per consentire alla temperatura di stabilizzarsi.
    4. Fare clic sul menu a discesa accanto a "Membrana" nell'angolo in alto a sinistra della GUI e fare clic su 400 nm GBO. Ripetere questo passaggio per "Elettrolita", "Celle", "Densità di semina cellulare" e "Durata cella", selezionando rispettivamente DMEM, A431, 200 e 12.
      NOTA: Questi valori sono solo a scopo di registrazione e non influiscono sul funzionamento del dispositivo. Assicurarsi di regolare questi valori se necessario per il corretto tracciamento dei dati.
    5. Digitare 1 nel campo di modifica Post Pulse Time Duration (min) sul lato destro della GUI per modificare il tempo di misurazione post-impulso predefinito a 1 min. Lasciare tutte le altre impostazioni nello stato predefinito.
      NOTA: I parametri predefiniti dell'impulso creano una forma d'onda quadra con 30 volt, 20 Hz, durata di 1 ms e 200 impulsi. I parametri di misurazione TEEI predefiniti sono 0,5 volt e 100 Hz, 1.000 Hz, 10.000 Hz e 100.000 Hz.
    6. Fare clic sul pulsante Esegui e inserire i nomi appropriati per i pozzetti 1-3 e 4-6 quando richiesto. Fare clic su OK per avviare l'esperimento.
    7. Rimuovere l'array di elettrodi dall'incubatore e trasferire nuovamente gli inserti nelle posizioni originali nella piastra del pozzetto dell'esperimento al termine dell'esecuzione del programma.
    8. Miscelare 2 μl di Hoechst 33342 e 5 μl di calceina AM con 123 μl di terreno di coltura cellulare in una provetta da 200 μl.
    9. Pipettare delicatamente 10 μL della soluzione colorante in ciascun inserto post-impulso e riposizionare gli inserti nell'incubatore per 5 minuti.
    10. Trasferire la piastra a pozzetti nel supporto per piastre di un microscopio a fluorescenza con un obiettivo di ingrandimento 5x. Immagine utilizzando il campo chiaro e la fluorescenza di ogni colorazione. Centrare l'inserto sull'obiettivo prima di attivare la fotocamera.
      NOTA: Le lunghezze d'onda di eccitazione per PI, calceina AM e Hoechst 33342 sono rispettivamente di 558 nm, 495 nm e 353 nm. Le lunghezze d'onda di emissione sono rispettivamente di 575 nm, 519 nm e 465 nm.
  2. Esperimento di misurazione TEEI
    1. Pipettare 1,5 mL di terreno di coltura cellulare in ciascun pozzetto dell'array di elettrodi. Posizionare gli inserti del campione cellulare nei pozzetti 1-3 e gli inserti di controllo nei pozzetti 4-6, inserendo i piedini dell'inserto nelle scanalature di allineamento in modo che l'inserto sia a filo con la superficie superiore del pozzetto.
    2. Avvitare il PCB dell'elettrodo superiore alla parte superiore dei pozzetti dell'array di elettrodi e collegare l'array di elettrodi al dispositivo PSEP.
    3. Posizionare la matrice di elettrodi nell'incubatore a 37 °C per almeno 1 ora per consentire alla temperatura di stabilizzarsi.
    4. Fare clic sul menu a discesa accanto a "Membrana" nell'angolo in alto a sinistra della GUI e fare clic su 400 nm GBO. Ripetere questo passaggio per "Elettrolita", "Celle", "Densità di semina cellulare" e "Durata cella", selezionando rispettivamente DMEM, A431, 200 e 12.
      NOTA: Questi valori sono solo a scopo di registrazione e non influiscono sul funzionamento del dispositivo. Assicurarsi di regolare questi valori se necessario per il corretto tracciamento dei dati.
    5. Lasciare tutte le impostazioni rimanenti nello stato predefinito.
      NOTA: I parametri predefiniti dell'impulso creano una forma d'onda quadra con 30 volt, 20 Hz, durata di 1 ms e 200 impulsi. I parametri di misurazione TEEI predefiniti sono 0,5 volt e 100 Hz, 1.000 Hz, 10.000 Hz e 100.000 Hz.
    6. Fare clic sul pulsante Esegui e inserire i nomi appropriati per i pozzetti 1-3 e 4-6 quando richiesto. Fare clic su OK per avviare l'esperimento.
    7. Rimuovere l'array di elettrodi dall'incubatore e trasferire nuovamente gli inserti nelle posizioni originali nella piastra del pozzetto dell'esperimento al termine dell'esecuzione del programma.
    8. Miscelare 2 μL di Hoechst 33342, 5 μL di calceina AM e 10 μL di PI con 113 μL di terreno di coltura cellulare in una provetta di reazione da 200 μL.
    9. Pipettare 10 μl di soluzione colorante in ciascun inserto post-impulso e riposizionare gli inserti nell'incubatore per 5 minuti.
    10. Trasferire la piastra a pozzetti nel supporto della piastra di un microscopio per immagini a fluorescenza con una lente dell'obiettivo 5x. Immagine utilizzando il campo chiaro e la fluorescenza di ogni colorazione. Centrare l'inserto sull'obiettivo prima di attivare la fotocamera.
      NOTA: Le lunghezze d'onda di eccitazione per PI, calceina AM e Hoechst 33342 sono rispettivamente di 558 nm, 495 nm e 353 nm. Le lunghezze d'onda di emissione sono rispettivamente di 575 nm, 519 nm e 465 nm.

4. Analisi dei dati

  1. Analisi dei dati delle immagini con la pipeline CellProfiler
    1. Usare il flusso di lavoro CellProfiler personalizzato fornito in GitHub:https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI per elaborare le immagini dell'esperimento di consegna e di misurazione TEEI.
  2. Analisi TEEI
    1. Fare clic sulla scheda Analisi nella GUI.
    2. Spostare l'indicatore del tipo di impedenza su TEEI nella parte inferiore della GUI.
    3. Fai clic sulla freccia nella casella in alto a sinistra per visualizzare tutti i nomi degli esperimenti nel file di dati. Seleziona tutti i dati del campione di cellule dall'esperimento di misurazione TEEI.
    4. Fai clic sulla freccia nella casella successiva a destra per visualizzare tutti i nomi degli esperimenti nel file di dati. Selezionare tutti i dati dell'inserto di controllo dalla misurazione TEEI.
    5. Fare clic su Esegui. Apparirà una figura di base contenente i dati del campione di cella selezionato alla frequenza di misurazione più bassa.
    6. Nella casella delle opzioni di esempio sul lato destro della GUI, fare clic sulla freccia per visualizzare tutti i dati di inserimento selezionati. I valori anomali possono essere rimossi selezionando i dati appropriati e facendo clic su Rimuovi di seguito.
      NOTA: tutti i dati che sono stati rimossi dall'analisi con l'ultimo clic del pulsante Rimuovi possono essere recuperati dal pulsante Annulla .
    7. Fare clic su Fine per passare alla figura successiva quando nella figura vengono visualizzati i dati desiderati.
    8. Ripetere i passaggi 4.2.6 e 4.2.7 per i dati del campione di cella rimanente e per i dati di controllo. Quando il set di dati finale è stato confermato facendo clic su "Fine", verrà visualizzata la figura completa dell'analisi.
    9. Salvate la figura dell'analisi.

Risultati

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Il protocollo fornito stabilisce un metodo per l'utilizzo delle misure TEEI per esaminare i processi intermedi di elettroporazione e fare previsioni di consegna, in particolare per la linea cellulare A431 e il carico PI. Sebbene la modifica di questo protocollo sia discussa più avanti nell'articolo, è importante notare ora che, sebbene i valori specifici possano cambiare, le tendenze generali nella risposta rimangono coerenti. Ad esempio, i dati TEEI che scendono al di sotto del basale iniziale corrispondono alla morte cellulare, mentre l'aumento massimo del valore TEEI al di sopra del minimo corrisponde all'efficienza di consegna13. Queste tendenze generali e le loro implicazioni sono esaminate di seguito.

Come mostrato nella Figura 2A, durante l'utilizzo della piattaforma PSEP può emergere una serie di tendenze di misurazione TEEI e imaging cellulare. Il risultato ideale di questo protocollo è quello di produrre una curva simile ai dati di salute ottimizzati mostrati nella Figura 2Ai. Questo è caratterizzato come il risultato ideale, in quanto non vi è alcun calo al di sotto della linea di base, indicando pochissima o nessuna morte cellulare. Inoltre, la curva sana ottimizzata ha il maggiore aumento di TEEI rispetto al minimo, indicando un alto grado di efficienza di erogazione13. Queste inferenze sono supportate dall'imaging post-PSEP del monostrato cellulare, che rivela una morte cellulare trascurabile e un monostrato cellulare sano e completamente confluente (Figura 2Aiii). Inoltre, un esperimento di consegna riuscito che utilizza forme d'onda PSEP identiche può essere caratterizzato dalle immagini mostrate nella Figura 2B. La corretta applicazione della forma d'onda dell'elettroporazione e la concentrazione del carico si traducono in un elevato grado di coerenza dell'erogazione e vitalità delle celle.

La salute e la confluenza del monostrato cellulare sono fondamentali per il successo dell'applicazione delle previsioni di consegna basate su TEEI16,17. Anche con una forma d'onda ottimizzata, un monostrato cellulare malsano o incompleto provoca una diminuzione della risposta TEEI, come illustrato dai dati non integri ottimizzati nella Figura 2Aii. Tuttavia, si noti che le immagini per questo risultato (Figura 2Avi) corrispondono ancora all'interpretazione della risposta TEEI fornita da Brooks et al.13. Non vi è alcun calo al di sotto della linea di base, indicando una morte cellulare prossima allo zero (Figura 2C, D). Inoltre, l'aumento ridotto rispetto al minimo corrisponde a un impatto negativo sull'efficienza di erogazione, poiché un minor numero di celle nel monostrato riduce l'erogazione totale di PI (Figura 2C, D).

Se viene applicata una forma d'onda non ottimizzata, è possibile vedere diminuzioni ancora più significative nella risposta TEEI. A seconda dell'energia totale e dell'intervallo di tempo in cui viene applicata, le forme d'onda non ottimizzate possono produrre risultati che vanno dalla diminuzione dell'efficienza all'annichilazione quasi totale del monostrato di celle (Figura 2Ai, iii, v). Sia le curve non ottimizzate che quelle molto non ottimizzate mostrano una diminuzione significativa rispetto al basale, indicando una sostanziale morte cellulare. Tuttavia, forme d'onda sempre meno ottimizzate ostacolano il recupero cellulare, con conseguente riduzione dell'efficienza di erogazione.

L'efficienza di somministrazione è stata calcolata dividendo il numero di cellule marcate nelle immagini PI e calceina dagli esperimenti di somministrazione per il numero totale di cellule identificate con Hoechst. La morte è stata calcolata prendendo le cellule contrassegnate con PI negli esperimenti di misurazione TEEI e dividendo per il numero totale di cellule identificate con Hoechst. Il numero di celle è stato determinato utilizzando una pipeline CellProfiler personalizzata per entrambe le metriche.

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Figura 2: Curve di risposta TEEI e imaging per condizioni comuni. (A) (i) Dati di risposta TEEI che illustrano la variazione percentuale di TEEI per condizioni ottimizzate e non ottimizzate. (ii) Confronto della risposta TEEI tra monostrati sani e non sani in condizioni di forma d'onda ottimizzate. (iii-v) Imaging rappresentativo dei potenziali risultati per condizioni di forma d'onda ottimizzate e non ottimizzate che mostrano la morte cellulare (rosso) e le cellule viventi (verde). (vi) Imaging rappresentativo di un monostrato malsano dopo l'applicazione di condizioni di forma d'onda ottimizzate che mostrano la morte cellulare (rosso) e le cellule viventi (verde). (B) Immagini che mostrano la consegna di PI (rosso), cellule viventi (verde) e posizioni dei nuclei (blu). Tutte le immagini sono state schiarite per una maggiore chiarezza. Barre della scala: 1000 μm. (C) Il TEEI diminuisce dal basale pre-PSEP al minimo post-PSEP e aumenta dal minimo post-PSEP al picco post-PSEP per determinate tensioni. (D) Efficienza di erogazione e percentuali di morte cellulare per determinate tensioni. Le barre di errore rappresentano il SEM (n = 6). (C,D) riprodotto da Brooks et al.13 con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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La Figura 2C mostra che gli aumenti del TEEI rispetto al minimo e le diminuzioni rispetto alla linea di base sono tracciati per ciascuna tensione della forma d'onda PSEP. L'aumento del TEEI crea un arco parabolico, con un picco di circa 20 volt prima di ridursi, mentre la diminuzione del TEEI rispetto alla linea di base aumenta esponenzialmente all'aumentare della tensione. L'efficienza di erogazione e le percentuali di morte nella Figura 2D rispecchiano queste tendenze, con l'efficienza di erogazione che aumenta parabolicamente, con un picco di circa 30 V e la morte che aumenta esponenzialmente all'aumentare della tensione della forma d'onda.

Un'ipotesi per il meccanismo alla base dell'aumento del TEEI è l'elettro-osmosi attraverso i microcanali del substrato caricati negativamente, un fenomeno causato dall'applicazione di un campo elettrico18,19. Sia che la risposta TEEI sia dovuta a uno stimolo meccanico derivante dal rigonfiamento cellulare dovuto al flusso di fluido elettro-osmotico, un fattore noto per verificarsi con l'elettroporazione20, o a causa dello stimolo elettrico della forma d'onda stessa, è chiaro che la salute e la completezza del monostrato sono fondamentali per ottenere la corretta caduta di tensione attraverso la membrana cellulare necessaria per l'elettroporazione. Per questo motivo, i passaggi più critici di questo metodo sono quelli che riguardano la semina cellulare e la corretta formazione del monostrato cellulare. Ciò può essere confermato dall'imaging del monostrato cellulare e dal valore TEEI basale. Per le celle A431, il TEEI medio è di circa 7 Ω·cm², mentre le celle HEK293T hanno una media leggermente inferiore di 5 Ω·cm² (Figura 2Aii), probabilmente a causa di differenze morfologiche che causano differenze nell'area di giunzione cellula-cellula.

A causa del campo elettrico richiesto per l'elettroporazione del substrato poroso, si verificherà l'elettrolisi, causando la corrosione degli elettrodi12,21. Ciò è stato particolarmente evidente per l'elettrodo inferiore, poiché in questo esperimento è stato caricato positivamente per fornire PI caricato positivamente. Attraverso la sperimentazione, è stato determinato che il PCB inferiore potrebbe essere utilizzato circa 20 volte prima che effetti negativi significativi richiedano la sostituzione13. Per pulire l'array di elettrodi per il riutilizzo, rimuovere la coltura cellulare rimanente o il terreno di trasfezione dalle camere utilizzando un aspiratore. Riempire ogni camera per tre quarti con etanolo al 70% e posizionare il PCB dell'elettrodo superiore sull'array di elettrodi in modo che gli elettrodi superiori siano sommersi. Lasciare l'etanolo nell'array di elettrodi per almeno 10 minuti prima di rimuovere l'etanolo e mettere da parte l'array di elettrodi ad asciugare.

E' possibile riutilizzare gli inserti acquistati rimuovendo i substrati, sterilizzando l'inserto e sostituendo il substrato con uno prelevato da un'altra fonte. Gli inserti a 6 pozzetti con la stessa densità di pori e diametro sono disponibili in commercio e possono essere utilizzati per raccogliere quattro substrati sostitutivi delle dimensioni di un inserto a 24 pozzetti. Una volta sterilizzati gli inserti precedentemente utilizzati, aggiungere 10 μl di resina epossidica polimerizzata con luce ultravioletta a una nuova piastra di Petri. Immergere il lato del substrato dell'inserto nella pozza di resina epossidica per rivestire la superficie inferiore e posizionare con cura un nuovo substrato sopra il foro dell'inserto. Verificare visivamente che la resina epossidica formi un anello completo per assicurarsi che non vi siano spazi vuoti nella connessione. Polimerizzare sotto una luce UV per 30 s e conservare gli inserti ricondizionati in una piastra pulita a 24 pozzetti per evitare di danneggiare i nuovi substrati prima del riutilizzo.

Come affermato in precedenza, mentre si ipotizza che l'aumento di TEEI osservato si verifichi in più tipi di cellule, è stato dimostrato solo con le linee cellulari A431 e HEK293T13 (Figura 1C), entrambe cellule aderenti. Il metodo può essere modificato selezionando diverse linee cellulari selezionando membrane con diverse caratteristiche dei pori, sostituendo il rivestimento di fibronectina con un'altra proteina della matrice extracellulare regolando la concentrazione o modificando il carico. Tuttavia, se vengono apportate modifiche alla configurazione dell'esperimento, potrebbe essere necessario riottimizzare la forma d'onda. Per ottimizzare la forma d'onda, è possibile condurre un esperimento di misurazione TEEI in cui viene modificato un solo parametro della forma d'onda, come la tensione, tra ciascun gruppo di tre campioni. Selezionare la tensione ottimale identificando l'aumento maggiore del TEEI su almeno nove campioni sani. Ripetere questo processo per ogni parametro della forma d'onda, utilizzando i nuovi valori ottimizzati quando si passa a quello successivo. Ricorda che potrebbero esserci più optima locali per i parametri della forma d'onda (ad esempio, la tensione ottimale per la durata di un impulso potrebbe non essere la tensione ottimale per un'altra durata dell'impulso e così via).

I vantaggi dell'elettroporazione del substrato poroso sono di vasta portata. Mentre altri metodi di somministrazione intracellulare esistono da molto tempo, pochi hanno combinato un alto rendimento con un alto grado di controllo che il PSEP possiede 1,13. Inoltre, l'uso delle misure TEEI da parte della piattaforma fornisce uno sguardo alle fasi intermedie del processo di elettroporazione. Le letture TEEI indicano le condizioni delle cellule, guidano la selezione dei parametri di elettroporazione e consentono ulteriori informazioni sui comportamenti e sui meccanismi specifici delle celle 13,17. Attraverso le misurazioni TEEI, la piattaforma è anche in grado di erogare senza marcatura13, il che consente una rapida ottimizzazione con una minore necessità di costosi biomarcatori e reagenti ogni volta che viene condotto un esperimento. Questi contributi all'area della somministrazione intracellulare ne fanno un ottimo candidato come piattaforma di consegna per la ricerca biologica fondamentale e le applicazioni biomediche.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Riconosciamo il sostegno finanziario da parte della NSF (Awards 1826135, 1936065, 2143997), NIH National Institutes of General Medical Sciences P20GM113126 (Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication) e P30GM127200 (Nebraska Center for Nanomedicine), la Nebraska Collaborative Initiative e il Voelte-Keegan Bioengineering Support. Il dispositivo è stato prodotto presso la NanoEngineering Research Core Facility (NERCF), che è parzialmente finanziata dalla Nebraska Research Initiative.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta da centrifuga conica da 15 mlThermo Scientific339651
Emocitometro monouso a 2 chipBulldog BioDHC-N01
75 cm2 Fiaschetta per coltura tissutalefisherbrandFB012937
A431 CelleATCCCRL-1555
Calceina AMInvitrogenC3099
Classe II Tipo A2 Cabina di biosicurezzaLabgardNU-543-600
Componenti personalizzatiYangLabhttps://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Tubo da centrifuga monouso (50 mL)fisherbrand05-539-6
DMEMGibco11965092
Siero fetale bovinoGibcoA5670401
Sistema di aspirazione dei fluidivacuubrand20727403
HERACELL 240iThermo Scientific51026331
Hoechst 33342Thermo Scientific62249
Fibronectina al plasma umanoSigma-AldrichFIBRP-RO
Microscopio fluorescente invertitoZeiss491916-0001-000
Microscopio invertitoLabomedTCM 400
PBScytivaSH30256.02
Provetta PCR 200 µ LSarstedt72.737
Penicillina / StreptomicinaGibco15140148
Pipetta (0,2-2 µ L)fisherbrand EliteFBE00002
Pipetta (100-1000 &; micro; L)fisherbrand EliteFBE01000
Pipetta (20-200 &5; L)fisherbrand EliteFBE00200
Pipetta (2-20 &; micro; L)fisherbrand EliteFBE00020
Propidium IodureInvitrogenP1304MP
Provetta di reazione 1,5 mLSarstedt72.690.300
Sorvall ST 16R CentrifugaThermo Scientific75004240
Thincert (24 pozzetti)Greiner Bio-One662 6410,4 µ m diametro dei pori, 2x106 cm-2 densità dei pori,
piatto di coltura tissutale in PET trasparente (24 pozzetti)fisherbrandFB012929
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154-20mL
TrypsinGibco15090046

Riferimenti

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