Integrazione della valutazione comportamentale animale e della rete neurale convoluzionale per studiare l'interazione gusto-odore wasabi-alcol

Sommario

Questo articolo descrive una serie di metodi per misurare la capacità soppressiva dello sniffare bevande alcoliche sulla sensazione di bruciore indotta dal wasabi.

Abstract

Le paste di wasabi commerciali comunemente utilizzate per la preparazione del cibo contengono un composto omologo di isotiocianati chemiosensoriali (ITC) che suscitano una sensazione irritante al momento del consumo. L'impatto dell'annusare bevande alcoliche alimentari sulla sensazione di piccantezza del wasabi non è mai stato studiato. Mentre la maggior parte degli studi di valutazione sensoriale si concentra separatamente su singoli cibi e bevande, mancano ricerche sullo studio olfattivo dello sniffare liquore durante il consumo di wasabi. Qui, viene sviluppata una metodologia che combina l'uso di uno studio comportamentale animale e di una rete neurale convoluzionale per analizzare le espressioni facciali dei topi quando contemporaneamente sniffano liquore e consumano wasabi. I risultati dimostrano che il modello di deep learning addestrato e convalidato riconosce il 29% delle immagini raffiguranti il co-trattamento di wasabi e alcol appartenenti alla classe del gruppo wasabi-negativo-liquore-positivo senza la necessità di un precedente filtraggio dei materiali di formazione. L'analisi statistica dei punteggi della scala delle smorfie del topo ottenuti dalle immagini dei fotogrammi video selezionati rivela una differenza significativa (P < 0,01) tra la presenza e l'assenza di liquori. Questa scoperta suggerisce che le bevande alcoliche alimentari potrebbero avere un effetto decrescente sulle reazioni indotte dal wasabi nei topi. Questa metodologia combinatoria ha un potenziale per lo screening individuale dei composti ITC e per le analisi sensoriali dei componenti degli spiriti in futuro. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per indagare il meccanismo alla base della soppressione della pungenza del wasabi indotta dall'alcol.

Introduzione

La Wasabia japonica, comunemente nota come wasabi, ha ottenuto riconoscimenti nella preparazione del cibo ^1,2. È nota l'intensa esperienza sensoriale che suscita al momento del consumo, caratterizzata da lacrime, starnuti o tosse. Questa particolare pungenza del wasabi può essere attribuita a un composto omologo di isotiocianati chemiosensoriali (ITC). Sono sostanze fitochimiche organosolforate volatili che possono essere classificate in ω-alchenil e ω-metiltioalchilisotiocianati³. Tra questi composti, l'isotiocianato di allile (AITC) è il prodotto naturale ITC più diffuso nelle piante appartenenti alla famiglia delle Crucifere, come il rafano e la senape⁴. Le paste di wasabi commerciali sono comunemente preparate a partire dal rafano, rendendo l'AITC un marcatore chimico utilizzato per il controllo di qualità di questi prodotti commerciali⁵.

L'abbinamento di bevande alcoliche dietetiche con piatti infusi di wasabi può essere considerato un esempio di disposizione culturale⁶. Soggettivamente, questa combinazione può completare la piccantezza e il calore tra il wasabi e lo spirito, migliorando l'esperienza culinaria complessiva. La valutazione comportamentale qualitativa degli animali (QBA) è un approccio metodologico completo che esamina i cambiamenti comportamentali nei soggetti in risposta a stimoli esterni a breve o lungo termine utilizzando termini numerici⁷. Questo metodo comprende test del dolore, test motori, test di apprendimento e memoria, nonché test emotivi specificamente progettati per i modelli di roditori⁸. Tuttavia, gli studi che indagano la valutazione sensoriale sinergica della gustazione insieme all'olfatto rimangono scarsi in letteratura fino ad ora ^9,10. La maggior parte degli studi sulla sensazione chimica si limita ad esaminare separatamente il consumo individuale di cibi e bevande¹¹. Di conseguenza, c'è una carenza di ricerca sull'interazione gusto-odore che coinvolge l'atto di annusare il liquore mentre si consuma wasabi.

Poiché si ritiene che la sensazione di bruciore indotta dal wasabi sia una forma di nocicezione¹², le valutazioni comportamentali degli animali sono adatte per valutare le risposte sensoriali nocicettive negli animali roditori ^8,13,14. Un metodo per valutare la nocicezione nei topi, noto come punteggio della scala della smorfia del topo (MGS), è stato sviluppato da Langford et ^al.15,16. Questo metodo di studio comportamentale è un approccio di valutazione correlato al dolore, che si basa sull'analisi delle espressioni facciali esibite dai topi sperimentali. La configurazione sperimentale è semplice e prevede una gabbia trasparente e 2 telecamere per la registrazione video. Incorporando tecnologie avanzate 17,18,19 per l'acquisizione automatica dei dati, è possibile ottenere misure comportamentali quantitative e qualitative, migliorando il benessere degli animali durante il monitoraggio comportamentale ²⁰. Di conseguenza, la MGS ha il potenziale per essere applicata nello studio degli effetti di vari stimoli esterni sugli animali in modo ininterrotto e ad libitum. Tuttavia, il processo di assegnazione dei punteggi prevede solo la selezione di alcune (meno di 10) immagini di fotogrammi video per la valutazione da parte dei relatori ed è necessaria una formazione preliminare. L'assegnazione di un punteggio a un gran numero di immagini campione può essere laboriosa. Per superare questa sfida dispendiosa in termini di tempo, diversi studi hanno impiegato tecniche di apprendimento automatico per prevedere il punteggio MGS^21,22. Tuttavia, è importante notare che l'MGS è una misura continua. Pertanto, un modello di classificazione multiclasse sarebbe più adatto per valutare un problema logico e categoriale, come determinare se le immagini di topi che ingeriscono contemporaneamente wasabi e sniffano liquore assomigliano a quelle di topi normali.

In questo studio, è stata proposta una metodologia per studiare l'interazione gusto-odore nei topi. Questa metodologia combina studi comportamentali sugli animali con una rete neurale convoluzionale (CNN) per analizzare le espressioni facciali dei soggetti topo. Due topi sono stati osservati tre volte in condizioni comportamentali normali, durante l'esperienza della nocicezione indotta da wasabi e mentre sniffavano liquore in una gabbia appositamente progettata. Le espressioni facciali dei topi sono state videoregistrate e le immagini dei fotogrammi generate sono state utilizzate per ottimizzare l'architettura di un modello di deep learning (DL). Il modello è stato quindi convalidato utilizzando un set di dati di immagini indipendente e distribuito per classificare le immagini acquisite dal gruppo sperimentale. Per determinare l'entità della soppressione della pungenza del wasabi quando i topi hanno sniffato contemporaneamente il liquore durante il consumo di wasabi, le intuizioni fornite dall'intelligenza artificiale sono state ulteriormente corroborate attraverso la convalida incrociata con un altro metodo di analisi dei dati, il punteggio MGS¹⁶.

Protocollo

In questo studio, per la valutazione del comportamento animale sono stati utilizzati due topi maschi ICR di 7 settimane di peso compreso tra 17 e 25 g. Tutte le procedure di stabulazione e sperimentazione sono state approvate dal Comitato dell'Università Battista di Hong Kong sull'uso di soggetti umani e animali nell'insegnamento e nella ricerca. La stanza degli animali è stata mantenuta a una temperatura di 25 °C e un'umidità ambientale del 40%-70% con un ciclo luce-buio di 12 ore.

1. Design della gabbia

1. Preparare mattoni di acrilonitrile butadiene stirene in 3 diverse dimensioni per la costruzione di gabbie: 8 mm x 8 mm x 2 mm, 16 mm x 16 mm x 6 mm e 32 mm x 16 mm x 6 mm.
2. Preparare una piastra in acrilonitrile butadiene stirene (312 mm x 147 mm x 2 mm) come base della gabbia.
3. Preparare una lastra acrilica non trasparente di 239 mm x 107 mm con uno spessore di 2 mm da utilizzare come piastra inferiore.
4. Preparare una lastra acrilica trasparente di 239 mm x 107 mm con uno spessore di 5 mm da utilizzare come piastra superiore.
5. Preparare una lastra acrilica trasparente di 107 mm x 50 mm con uno spessore di 7 mm da utilizzare come piastra terminale.
6. Costruisci 2 pareti laterali opache impilando i mattoni a un'altezza di 54 mm.
7. Incorporare le lastre acriliche nella gabbia a base di acrilonitrile butadiene stirene, come illustrato nella Figura 1A.
8. Preparare una camera per chows costruita con cinque lastre acriliche trasparenti da 90 mm x 50 mm con uno spessore di 2 mm, come illustrato nella Figura 1B. Tra le 5 piastre acriliche trasparenti, utilizzare 2 piastre per i lati, 1 piastra per la parte superiore, 1 piastra per la parte inferiore e 1 piastra per il terminale.
9. Preparare una piastra in acrilico trasparente di 60 mm x 50 mm e 2 mm come piastra di introduzione al cibo e posizionarla nella camera del chow.

2. Valutazione del comportamento animale

1. Ospita i compagni di cucciolata di 2 topi maschi ICR di 7 settimane insieme in una gabbia normale.
2. Fornisci ai compagni di cucciolata di 2 topi l'accesso gratuito ai pellet di cibo e all'acqua del rubinetto per un periodo di adattamento di 1 settimana.
3. Dopo 1 settimana, introdurre i compagni di cucciolata di 2 topi con una bottiglia di etanolo (~40% v/v).
   NOTA: Assicurati che siano autorizzati ad annusare o inalare l'etanolo acquoso fornito solo su base ad libitum mentre il consumo è limitato.
4. Condurre esperimenti comportamentali utilizzando il modello murino di 9-10 settimane e la gabbia trasparente del cubicolo raffigurata nella Figura 1A.
5. Smontare tutte le lastre acriliche e le lastre di acrilonitrile-butadiene-stirene e pulirle accuratamente. Iniziate sciacquandoli con acqua ultrapura almeno 3 volte e poi asciugateli con carta assorbente. Quindi, spruzzali con etanolo al 75%, quindi puliscili con carta per lenti. Infine, lasciateli asciugare all'aria per almeno 15 minuti.
6. Pesare i topi e registrare il loro peso corporeo prima di ogni replica dell'esperimento comportamentale.
7. Preparare al momento una miscela di wasabi e burro di arachidi pesando 1 g di wasabi commerciale e 4,5 g di burro di arachidi. Mescolateli in un sacchetto di plastica con cerniera.
   NOTA: A causa della volatilità degli isotiocianati nel wasabi, è importante conservare il wasabi commerciale in un congelatore a -20 °C.
8. Pesare e fornire due paste da 0,5 g di burro di arachidi o una miscela di wasabi e burro di arachidi sulla piastra di introduzione del cibo, come illustrato nella Figura 1B, C.
9. Posizionare la piastra di introduzione del chow preparata nella camera dei chow, come illustrato nella Figura 1B, C, per consentire ai 2 topi di avere accesso ad libitum al cibo durante ogni sessione di registrazione video.
10. Riempire il solco sottostante con 30 ml di liquido, acqua pura o liquore (~42% v/v etanolo), per facilitare l'inalazione concomitante, come indicato nella Figura 1B, C.
11. Inizia a registrare utilizzando le fotocamere di 2 smartphone posizionate sui supporti del telefono di ciascun terminale.
    NOTA: Le specifiche dei video sono le seguenti: larghezza del fotogramma, 1920; altezza del telaio, 1080; velocità di trasmissione dati, 20745 kbps; Frequenza fotogrammi, 30,00 fotogrammi al secondo (fps).
12. Posizionare con cura i 2 compagni di cucciolata addestrati di topi nella piattaforma di studio comportamentale animale progettata dall'alto e fissare prontamente la gabbia con la piastra superiore.
    NOTA: Assicurarsi che questo passaggio sia completato entro 15 s.
13. Registra ogni video per 2-3 minuti.
    NOTA: Assicurati che l'intera durata dell'esperimento, dalla preparazione della miscela di burro di arachidi e wasabi al completamento della registrazione video, sia limitata a 5 minuti.
14. Ripeti l'intero esperimento 3 volte.
    NOTA: Assicurarsi che ogni replica dell'esperimento sia separata per almeno 6 ore.
15. Simula diversi scenari.
    NOTA: Ad esempio, in questo lavoro, una coppia di topi è stata utilizzata in 4 gruppi con 4 diversi scenari che sono stati imitati utilizzando l'impostazione sperimentale descritta sopra. Questi scenari includono lo scenario A per lo studio di base, lo scenario B per lo studio di controllo positivo, lo scenario C per lo studio di interazione gusto-odore wasabi-alcol e lo scenario D per lo studio di controllo negativo. La tabella 1 fornisce un riepilogo di questi scenari.

3. Riconoscimento delle immagini

Simile a molti studi sull'elaborazione delle immagini 23,24,25, un modello di classificazione è stato raggiunto addestrando una CNN. Lo script per le operazioni DL è stato scritto in Python v.3.10 su Jupyter Notebook (anaconda3). È disponibile nel seguente repository GitHub: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Per costruire e addestrare la CNN, sono state utilizzate librerie open source, tra cui numpy v.1.21.5, seaborn v.0.11.2, matplotlib v.3.5.2, cv2 v.4.6.0, sklearn v.1.0.2, tensorflow v.2.11.0 e keras v.2.11.0. Queste librerie fornivano gli strumenti e le funzionalità necessarie per sviluppare e addestrare la CNN per il riconoscimento delle immagini.

1. Esportare una serie di immagini di fotogrammi video dai clip video raccolti per generare un set di dati per l'addestramento del modello utilizzando il notebook Jupyter fornito, denominato Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb.
2. Seleziona solo le immagini con almeno 1 mouse consumando la pasta fornita. Esempi delle immagini selezionate sono forniti nella Figura 1 supplementare, nella Figura 2 supplementare, nella Figura 3 supplementare, nella Figura 4 supplementare, nella Figura 5 supplementare, nella Figura 6 supplementare e nella Figura 7 supplementare.
3. Eseguire l'aumento dei dati capovolgendo orizzontalmente le immagini generate implementando lo script fornito nel Jupyter Notebook, denominato Step2_DataAugmentation.ipynb.
4. Riserva i dati dell'immagine da ogni seconda replica per la convalida del modello CNN indipendente esterno. Usare le immagini di ogni prima e terza replica per il training e il test del modello interno.
5. Pre-elaborare i dati dell'immagine usati nella modellazione CNN eseguendo lo script nel Jupyter Notebook, denominato Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb, incluso il ridimensionamento dell'immagine, la conversione del colore nero e la normalizzazione del segnale dell'immagine.
6. Suddividi i materiali di formazione in set di dati interni di formazione e test in modo 8:2 in modo casuale.
7. Inizializzare l'architettura per CNN. Progetta il numero di output della CNN in base al numero di scenari da esaminare.
   NOTA: Ad esempio, in questo studio, la rete neurale è stata designata per classificare 3 classi. Assicurarsi che lo script per la gestione dello squilibrio dei dati sul peso della classe sia compilato.
8. Trova la combinazione di iperparametri che produce una perdita minima sui campioni di test interni per la costruzione di CNN.
9. Adotta la combinazione ottimale di iperparametri per la costruzione dell'architettura CNN.
10. Aprire i notebook Jupyter forniti Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb e Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb. Convalidare il modello raggiunto utilizzando le immagini indipendenti (originali e capovolte) della seconda replica dell'esperimento comportamentale animale.
11. Implementa il modello raggiunto e convalidato per classificare le immagini dei fotogrammi video generate dal gruppo sperimentale utilizzando Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb.
    NOTA: Ad esempio, è lo scenario C in questo lavoro.

4. Punteggio manuale della scala della smorfia del mouse

NOTA: Per convalidare le intuizioni fornite dalla previsione del modello CNN, è stato applicato un altro metodo precedentemente sviluppato e convalidato da Langford et al.¹⁶. Questo metodo prevede il punteggio dell'MGS in base alle 5 unità di azione facciale (AU) specifiche del topo: restringimento orbitale, rigonfiamento del naso, rigonfiamento delle guance, orecchie che si stringono verso l'esterno e cambio dei baffi. A ciascuna UA viene assegnato un punteggio di 0, 1 o 2, che indica rispettivamente l'assenza, la presenza moderata o la presenza evidente dell'UA. Questo sistema di punteggio consente la quantificazione e il ridimensionamento di ciascuna AU per valutare il livello di nocicezione o disagio sperimentato dai topi.

1. Cattura 3 immagini di fotogrammi video dei compagni di cucciolata che ingeriscono la pasta per ogni clip video. Assicurati che ogni fotogramma sia separato da almeno 3 secondi.
2. Codifica in modo cieco e riordina in modo casuale le immagini da diverse classi di scenari in sequenza utilizzando il file modello fornito denominato "shuffleSlides.pptm" (File supplementare 1) ed eseguendo il codice macro incorporato.
3. Invita almeno 10 relatori a valutare le immagini di esempio.
4. Addestra i panelisti a valutare i campioni di immagini utilizzando l'MGS. Fornire ai relatori materiali di formazione che includano l'articolo originale riguardante MGS e il suo manuale^15,16.
5. Calcola il punteggio MGS di ciascun soggetto animale in un fotogramma catturato facendo la media di tutti i punti di punteggio delle corrispondenti 5 AU facciali. Presentare il punteggio MGS come media ± errore di misura standard (SEM).
6. Determinare se esistono differenze statisticamente significative tra diverse classi di scenari mediante l'analisi della varianza a una via (ANOVA) con il test post-hoc di confronto multiplo di Bonferroni.
   NOTA: Un valore di P < 0,05 è considerato statisticamente significativo.

Risultati

L'obiettivo principale di questo studio è quello di stabilire un solido quadro per studiare l'interazione gusto-odore nei topi. Questo framework incorpora l'uso dell'intelligenza artificiale e della QBA per sviluppare un modello di classificazione predittiva. Inoltre, le informazioni ottenute dal DL sono convalidate in modo incrociato con una valutazione quantitativa MGS per un'analisi interna indipendente. L'applicazione principale di questa metodologia è quella di esaminare l'entità della soppressione della nocicezione invocata dal wasabi quando i topi sniffano bevande alcoliche alimentari.

Riconoscimento del 29% delle immagini di co-trattamento wasabi-alcol appartenenti alla classe del gruppo wasabi-negativo-liquore-positivo al sangue mediante il modello di deep learning
Una reazione eccessiva facciale potrebbe verificarsi negli esseri umani dopo il consumo commerciale di pasta di wasabi. Un'esperienza simile potrebbe essere osservata anche nei topi (Video supplementare 1). Poiché la nocicezione sensoriale è ben correlata con le espressioni facciali nei roditori, i comportamenti di 2 compagni di cucciolata sono stati monitorati per determinare la loro risposta quando forniti con chow contenenti o privi di wasabi commerciale. In questo studio, una CNN è stata addestrata utilizzando tecniche DL. Poiché sono state condotte 3 repliche per ogni scenario, i materiali delle immagini della 1a^{e della} 3a^{replica sono} stati utilizzati per la messa a punto degli iperparametri del modello CNN e la modellazione dell'addestramento e dei test interni. L'evoluzione dell'architettura della CNN in questo studio è dettagliata nella Tabella 2. L'architettura ottimizzata della CNN consisteva in un livello di input con una risoluzione di 268 x 268 pixel, seguito da 4 livelli di convoluzione bidimensionale, ciascuno con 8 filtri. Inoltre, per l'attività di classificazione a 3 classi sono stati incorporati 2 strati di pooling, 2 strati di dropout, uno strato di appiattimento e 2 strati densi. Fare riferimento al file supplementare 2 per l'architettura CNN.

Il modello in questo studio è stato addestrato utilizzando un set di dati di 35.486 immagini e testato su 8.872 immagini in 7 epoche. Le prestazioni del modello sottoposto a training durante l'addestramento, incluse metriche quali perdita, rapporto di precisione-richiamo, precisione e sensibilità (o richiamo), sui set di dati interni di training e test possono essere visualizzate nella Figura supplementare 8A-D. Il modello ha dimostrato la sua accuratezza, precisione e sensibilità di 1 sia per i set di addestramento interni che per quelli di test. Ciò indica che le stime del modello sono allineate con le classi effettive delle immagini sia nei set di dati di training interni che in quelli di test. Dopo l'addestramento del modello, le immagini della^{seconda replica sono} state utilizzate per garantire e convalidare in modo indipendente che l'overfitting non fosse un problema per il modello CNN raggiunto. Il modello ha mostrato la sua robustezza di previsione con i valori di accuratezza, precisione e sensibilità di 1 per 4.820 immagini nello studio di fondo (scenario A), 3.900 immagini nello studio di controllo positivo (scenario B) e 2.731 immagini nello studio di controllo negativo (scenario D). Il modello predittivo raggiunto è stato utilizzato per classificare le immagini dei fotogrammi video di topi che sniffano alcolici e consumano burro di arachidi contenente wasabi (scenario C) in diversi scenari di studio, ovvero gli scenari A, B e D. I risultati mostrano che lo 0% e il 29% delle immagini sono state classificate rispettivamente nelle classi di studio di base (scenario A, acqua pura e burro di arachidi senza wasabi) e studio di controllo negativo (scenario D, spirito cinese e burro di arachidi senza wasabi), mentre il 71% delle immagini è stato classificato come le classi del gruppo di controllo positivo (scenario C, dove erano presenti acqua pura e miscela di wasabi e burro di arachidi). Questi risultati implicano che la presenza di liquori alimentari potrebbe ridurre la nocicezione evocata dal wasabi nei topi. Per valutare ciò che la macchina ha appreso dai materiali di formazione forniti, sono state generate mappe delle caratteristiche per ogni livello di convoluzione. Come illustrato nella Figura supplementare 9A-D, è stato osservato che l'attenzione della macchina era focalizzata su una varietà di caratteristiche facciali come gli occhi orbitali, il naso, i bordi delle guance e del corpo, le orecchie e anche sulla superficie di contatto dei chow. Sulla base di queste osservazioni, è stato condotto un altro metodo di analisi dei dati, l'MGS. La MGS si concentra sulle AU facciali dei topi, consentendo una valutazione statistica e un'ulteriore convalida della capacità di soppressione della presentazione delle bevande alcoliche alla nocicezione indotta da wasabi.

Il punteggio manuale della scala delle smorfie del mouse convalida statisticamente le previsioni di Machine Learning.
L'intensità della nocicezione evocata dal wasabi è stata valutata utilizzando il punteggio MGS, che assegna punteggi che vanno da 0 a 2, con il punteggio 0 che rappresenta il meno grave e il punteggio 2 che indica la risposta più grave. In questo studio, i punteggi MGS di 24 topi (cioè 2 topi sono stati presentati nelle 12 immagini selezionate come Figura 10 supplementare, Figura 11 supplementare, Figura 12 supplementare, Figura 13 supplementare ) sono stati valutati da 22 panelisti addestrati. L'analisi della cucciolata di 2 topi, con esperimenti in triplice copiato, ha mostrato che le precisioni intra-batch e le precisioni inter-batch avevano una derivazione standard relativa che variava rispettivamente da 0%-25% e 9%-33%. Ciò indica una buona precisione e coerenza nel processo di punteggio MGS. È stata osservata una differenza significativa tra i punteggi MGS dei topi a cui è stata somministrata una pasta di burro di arachidi (Figura 3A, 0,73 ± 0,04) e quelli a cui è stata somministrata una miscela di wasabi e burro di arachidi (Figura 3B, 1,59 ± 0,11). Ciò convalida l'impostazione sperimentale per lo studio comportamentale animale e conferma l'efficacia del wasabi nell'indurre risposte nocicettive. Anche se il vapore alcolico rilasciato dalla bevanda alcolica sottostante fornita (~42% v/v di alcol) potrebbe essere irritante, il punteggio MGS (Figura 3D, 0,86 ± 0,16) non ha mostrato una differenza significativa rispetto al gruppo di controllo (Figura 3A, 0,73 ± 0,04). Tuttavia, è stata osservata una differenza significativa tra i punteggi MGS dei topi a cui è stata fornita la miscela di wasabi e burro di arachidi (Figura 3B, 1,59 ± 0,11) e quelli esposti al vapore di alcol durante il consumo di wasabi (Figura 3C, 0,95 ± 0,07) con un valore P di <0,05. Questi risultati suggeriscono che la co-applicazione di wasabi e bevande alcoliche potrebbe potenzialmente ridurre l'irritazione indotta dal wasabi, in linea con la prospettiva dell'intelligenza artificiale. Sono necessarie ulteriori indagini per esplorare l'ingrediente efficace all'interno dello spirito cinese fornito che contribuisce alla soppressione della piccantezza del wasabi, probabilmente attribuibile alla presenza di etanolo.

Esempio di codice già disponibile. Tutto il codice per l'esecuzione del riconoscimento delle immagini associato all'invio corrente è disponibile in un repository GitHub pubblico: git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git. Eventuali aggiornamenti saranno pubblicati anche sul GitHub Repository con una citazione del DOI finale di questo lavoro.

Figura 1: Configurazione sperimentale per lo studio comportamentale animale correlato al dolore. (A) L'intera configurazione per la registrazione video delle espressioni facciali di 2 topi utilizzando le telecamere su 2 smartphone posizionati sul telefono si trova in ogni terminale. (B) La camera dei chow forniva due paste da 0,5 g di burro di arachidi o una miscela di wasabi e burro di arachidi a 2 topi su base ad libitum , e 30 ml di liquido (acqua o ~42% v/v di liquore) venivano riempiti nella scanalatura sotto le paste per l'inalazione concomitante. (C) Uno sguardo più da vicino al solco che è stato riempito con 30 ml di liquido e conteneva 2 paste di miscela di wasabi e burro di arachidi. La miscela è stata preparata mescolando 1 g di wasabi commerciale in 4,5 g di burro di arachidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: L'architettura del modello di rete neurale convoluzionale e il suo input e output. Per l'addestramento sono state utilizzate immagini provenienti da 3 diversi scenari, tra cui lo scenario A per lo studio di base, lo scenario B per lo studio di controllo positivo e lo scenario D per lo studio di controllo negativo. Le immagini dello scenario C per lo studio sull'interazione gusto-odore wasabi-alcol sono state classificate negli scenari A, B o D dopo l'addestramento del modello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: I punteggi della scala delle smorfie di topo (MGS) dei topi a cui sono stati forniti diversi chow. Il punteggio MGS va da 0 a 2, dove il punteggio 0 rappresenta il meno grave e il punteggio 2 per il più grave. La scala MGS di riferimento è stata adattata da Langford et al. (2010)¹⁶. La smorfia dei topi a cui è stato fornito (A) burro di arachidi per il consumo ha ottenuto un punteggio di 0,73 ± 0,04; (B) una miscela di wasabi e burro di arachidi (1 g di wasabi commerciale in 4,5 g di burro di arachidi) per l'ingestione ha ottenuto un punteggio di 1,59 ± 0,11; (C) una miscela di wasabi e burro di arachidi per l'ingestione, mentre l'inalazione di alcol era disponibile dal fondo fornito dall'alcol fornito (~42% v/v di alcol), con un punteggio di 0,95 ± 0,07; (D) burro di arachidi per il consumo mentre l'inalazione di alcol era disponibile dal sottostante lo spirito fornito ha ottenuto un punteggio di 0,86 ± 0,16. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ns, nessuna differenza significativa tramite l'analisi unidirezionale della varianza con il test post-hoc di confronto multiplo di Bonferroni con un intervallo di confidenza del 95%. Le barre di errore rappresentavano l'errore standard delle misure (SEM). Le misurazioni in triplice copia sono state condotte per 2 topi in ogni scenario. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Riepilogo dei quattro scenari simulati nella valutazione comportamentale animale. Osservazioni: ^a La miscela è stata preparata mescolando 1 g di wasabi commerciale in 4,5 g di burro di arachidi. ^b Spirito cinese che contiene ~42% v/v di alcol. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Riepilogo delle prestazioni del modello. Gli iperparametri di una dimensione del batch di 64, il numero del filtro del 1^° strato di convoluzione 2D di 8 senza il seguente dropout, il numero del filtro del 2^° strato di convoluzione 2D di 8, il numero del filtro del 3^° strato di convoluzione 2D di 8 con 0.1 dropout, il numero del filtro del 4^° strato di convoluzione 2D di 8, e il numero di filtro dello strato denso di 64 con 0,5 dropout ha prodotto la perdita più bassa per il set di test diviso interno. Questi iperparametri sono stati poi adottati per addestrare un modello di classificazione a 3 gruppi (scenario A, B e D) per prevedere le immagini dello scenario C. Lo scenario A era per lo studio di base. Lo scenario B era per lo studio di controllo positivo. Lo scenario D era per lo studio del controllo negativo. Lo scenario C era per lo studio sull'interazione gusto-odore wasabi-alcol. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura 1 supplementare: Esempi di materiali di formazione per l'apprendimento profondo della classe dello scenario A (studio di base). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Esempi di materiali di formazione per l'apprendimento profondo della classe dello scenario B (studio del controllo positivo). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 3 supplementare: Esempi di materiali di formazione per l'apprendimento profondo della classe di scenario D (studio del controllo negativo). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 4 supplementare: Previsioni ed esempi di materiali indipendenti della classe di scenario A (studio di base) per la validazione del modello. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 5: Previsioni ed esempi di materiali indipendenti della classe dello scenario B (studio di controllo positivo) per la validazione del modello. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 6 supplementare: Previsioni ed esempi di materiali indipendenti della classe di scenario D (studio del controllo negativo) per la validazione del modello. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 7 supplementare: Previsioni e materiali di esempio della classe di scenario C (studio dell'interazione gusto-odore wasabi-alcol) per l'applicazione del modello. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 8 supplementare: Prestazioni predittive del modello di deep learning ottimale. (A) Perdita di formazione e perdita di validazione interna lungo 7 epoche; (B) Curve di precisione-richiamo, (C) Precisione e (D) Richiamo dell'addestramento e convalida interna lungo 7 epoche. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 9 supplementare: Mappe delle caratteristiche di ciascun livello di convoluzione. Mappe delle caratteristiche del primo livello (A), (B) secondo, (C) terzo e (D) ultimo livello di convoluzione negli scenari A, B e D, ordinate dall'alto al basso. Lo scenario A era per lo studio di base. Lo scenario B era per lo studio di controllo positivo. Lo scenario D era per lo studio del controllo negativo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 10: Immagini selezionate per il punteggio manuale della scala delle smorfie del mouse per lo scenario A (studio di base). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 11: Immagini selezionate per il punteggio manuale della scala delle smorfie del mouse per lo scenario B (studio di controllo positivo). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 12: Immagini selezionate per il punteggio manuale della scala delle smorfie nel mouse per lo scenario C (studio dell'interazione gusto-odore wasabi-alcol). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 13: Immagini selezionate per il punteggio manuale della scala delle smorfie del mouse per lo scenario D (studio del controllo negativo). Clicca qui per scaricare questo file.

Video supplementare 1: Smorfie di topi dopo il consumo di wasabi con la presenza o l'assenza di bevande alcoliche fornite al di sotto. Da 0 s a 8 s, il video clip presentava le normali espressioni facciali dei topi dopo aver consumato burro di arachidi. Dagli 8 ai 17 anni, illustrava le smorfie dei topi dopo l'ingestione del wasabi. I topi hanno mostrato un irrigidimento orbitale, un rigonfiamento del naso, un rigonfiamento delle guance, le orecchie che si stringevano verso l'esterno e un cambiamento dei baffi. Da 17 a 29 secondi, si presentava che la nocicezione indotta dal wasabi poteva essere soppressa quando lo spirito era disponibile al di sotto. Da 29 s alla fine, ha mostrato una raccolta di smorfie in diversi scenari descritti sopra. Si prega di notare che il video fornito viene utilizzato solo a scopo illustrativo. La sua qualità è diversa dai requisiti di qualità descritti per il riconoscimento e la modellazione delle immagini. Clicca qui per scaricare questo video.

File supplementare 1: shuffleSlides.pptm. Presentazione supplementare abilitata per macro di Microsoft PowerPoint, denominata "shuffleSlides.pptm". Questo file è stato preparato per il rimescolamento delle immagini per il test alla cieca del punteggio della scala delle smorfie del mouse. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: L'architettura della CNN. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Il metodo proposto per studiare l'interazione gusto-olfatto in questo lavoro si basa sul metodo originale di codifica comportamentale per l'espressione facciale del dolore nei topi, che è stato sviluppato da Langford et ^al.16. Diversi articoli pubblicati di recente hanno introdotto la CNN per il tracciamento automatico del volto del mouse e il successivo punteggio MGS 21,26,27,28. L'applicazione delle CNN offre un vantaggio rispetto al solo metodo originale, in quanto segue per la generazione di una serie di immagini di fotogrammi video che possono essere utilizzate per addestrare un modello di previsione. Al contrario, il metodo originale richiedeva la preselezione di un numero limitato di immagini per MGS, il che può introdurre soggettività e pregiudizi.

Tra i metodi basati sulla CNN precedentemente pubblicati, tutti sono stati sviluppati per valutare il grado di angoscia o disagio dopo un'iniezione diretta di un agente antidolorifico nella circolazione sanguigna^26,28. Uno svantaggio di questo approccio all'introduzione di farmaci è che è necessario uno sforzo significativo per filtrare le immagini dei fotogrammi video che non catturano il profilo del volto del topo. In questo studio, l'agente commerciale che causa la nocicezione wasabi viene fornito su base ad libitum. Oltre a mascherare l'ingrediente volatile AITC, il burro di arachidi è anche in grado di attirare i soggetti del mouse per presentare un chiaro gesto di visione frontale, facilitando l'acquisizione dei loro profili facciali durante la registrazione video. Inoltre, questo approccio elimina qualsiasi potenziale interferenza dovuta al dolore causato dall'inserimento dell'ago. Tuttavia, è importante notare che il movimento di ingestione dei topi può interferire con il punteggio MGS per il rigonfiamento del naso e il rigonfiamento delle guance. Per affrontare questo problema, è necessario condurre un esperimento di controllo di base fornendo ai topi burro di arachidi puro.

In alcuni algoritmi basati su CNN per lo studio del comportamento animale, solo un sottoinsieme di unità di azione facciale del topo viene selezionato dalle immagini di addestramento e programmato per essere catturato^21,22. Questi metodi computazionali si basano su caratteristiche predefinite associate alla sensazione di nocicezione, trascurando potenzialmente altre importanti caratteristiche specifiche dei singoli soggetti del topo. Di conseguenza, può portare alla perdita di informazioni. Al contrario, questo studio adotta un approccio diverso utilizzando l'intera immagine del volto del topo per addestrare un modello CNN. Questo metodo basato sull'utilizzo di sole immagini (IOU) ha dimostrato di essere più efficiente per la classificazione delle immagini²⁵. Pertanto, l'approccio di modellazione CNN proposto nel presente studio è simile ad alcuni metodi proposti che prima addestrano un modello CNN utilizzando l'intera immagine senza annotazione della regione e quindi convalidano il modello attraverso la valutazione umana manuale^27,29. Questo approccio può conservare più informazioni nelle immagini e prevenire l'introduzione della soggettività.

Tuttavia, una limitazione della configurazione sperimentale in questo lavoro è che i soggetti topo sono stati alloggiati come compagni di cucciolata di 2 piuttosto che in habitat individuali. Questa decisione è stata intenzionale, considerando che i topi sono animali sociali e in genere prosperano in contesti di gruppo. Un dato interessante è che, durante il periodo di addestramento degli animali, solo 2 cucciolate in 1 gabbia su 3 sono state addestrate ad adattarsi alla presenza dello spirito cinese. Di conseguenza, solo gli esperimenti in triplicato sono stati condotti esclusivamente su questi 2 compagni di cucciolata. Per i materiali di formazione per la modellazione CNN, è stata presa anche un'immagine individuale contenente entrambi i 2 compagni di cucciolata come campione individuale senza eseguire alcuna segmentazione. Questo approccio ci ha permesso di catturare l'interazione tra i compagni di cucciolata e analizzare collettivamente i loro comportamenti insieme alle espressioni facciali.

Simile al metodo di punteggio MGS basato su immagini, si prevede che il metodo proposto in questo studio possa essere trasferito ad altri tipi di animali, come felini e cavalli^30,31. Applicando la metodologia proposta, un metodo di introduzione di cibi che inducono cibo con l'applicazione della visione artificiale potrebbe essere un approccio per facilitare lo studio del comportamento animale, in particolare per l'interazione gusto-odore in vari animali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Etanolo assoluto (EtOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-17-5
Mattoni di acrilonitrile butadiene stirene	Jiahuifeng Flagship Store	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
Lastre di acrilonitrile butadiene stirene	Jiahuifeng Flagship Store https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html Jiahuifeng	Isotiocianato di
allile (AITC)	Sigma-Aldrich	CAS# 57-06-7
Dimetil solfossido anidro	Sigma-Aldrich	CAS# 67-68-5
Spirito cinese	Yanghe Qingci	https://www.chinayanghe.com/article/45551.html
Wasabi commerciale	S & B ALIMENTI INC.
Acido formico (FA)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5	GraphPad	https://www.graphpad.com
acetonitrile di grado HPLC (ACN)	VWR Chemicals BDH	CAS# 75-05-8
Metanolo di grado HPLC (MeOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 67-56-1
Microsoft Excel 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Microsoft PowerPoint 2016	Sistema	https://www.microsoft.com
Milli-Q Millipore		https://www.merckmillipore.com
Mouse: ICR	Laboratory Animal Services Centre (Università cinese di Hong Kong, Hong Kong, Cina)	N/A
Burro di arachidi	Skippy	https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10	Python Software Foundation	https://www.python.org
Lastre acriliche trasparenti	Taobao Store	https://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797 0& spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM EHU